DE3785012T2 - Mehrschichtige analytische elemente zur bestimmung von gesamtcholesterin. - Google Patents
Mehrschichtige analytische elemente zur bestimmung von gesamtcholesterin.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine Verbesserung eines trockenen, mehrschichtigen, analytischen Elements zur quantitativen Analyse von Gesamtcholesterin, das in wäßrigen Proben, wie Körperflüssigkeiten (z.B. Blut), Lebensmitteln und Getränken, enthalten ist.
- Bei der quantitativen Analyse auf Cholesterin und Cholesterinester, die in Form von Lipoproteinen in Körperflüssigkeiten, wie Blut, vorhanden sind, unter Verwendung eines trockenen, mehrschichtigen, analytischen Elements wird Blut als eine wäßrige Probe ohne Verdünnung mit Wasser, physiologischer Salzlösung, einem pH-Puffer etc. verwendet. Daher läuft die Farbreaktion in dem analytischen Element nicht rasch ab. Ferner machen Substanzen in der Körperflüssigkeit (z.B. Neutralfette im Blut) die genaue Analyse schwierig.
- In einem Versuch, das obige Problem zu lösen, wurden in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 96378/78 und 85200/86 (entsprechende englische Literaturen sind nachstehend angegeben) und in Clinical Chemistry, 28, 1159-1162 (1982) die gemeinsame Verwendung eines Alkylphenoxypolyethoxyethanols vorgeschlagen. (Der Ausdruck "OPI" bedeutet eine offengelegte, ungeprüfte Patentpublikation.) Jedoch wurde gefunden, daß die in diesen Druckschriften vorgeschlagenen Techniken die folgenden Probleme zeigen:
- (1) Die Cholesterinesteraseaktivität wird inhibiert.
- (2) Während der Lagerung vor Gebrauch besitzt das trockene, mehrschichtige, analytische Element eine starke Tendenz, Wasser zu absorbieren. Daher verringert sich die Enzymaktivität in dem Element oder geht verloren, und die Leistungsfähigkeit des Elements wird herabgesetzt.
- In Clinical Chemistry, 20, 470-475 (1974) und der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 125796/75 wird beschrieben, daß Cholesterinester effizient in einer wäßrigen Lösung unter Verwendung von Cholesterinesterase und Gallensäure oder ihres Salzes in Kombination hydrolysiert werden. Wenn diese Technik auf das trockene, mehrschichtige, analytische Element angewandt wird, ist die Ausbreitung einer wäßrigen Probe, insbesondere Blut (Vollblut, Plasma oder Serum) auf einer porösen Ausbreitungsschicht schlecht, und die Genauigkeit der Analyse nimmt drastisch ab.
- Folglich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein ausgezeichnetes trockenes, mehrschichtiges, analytisches Element zur Bestimmung von Gesamtcholesterin bereitzustellen, das eine Lösung für die vorstehenden Probleme (wie die Inhibierung der Cholesterinesteraseaktivität, die abnehmende Leistungsfähigkeit während Lagerung und die niedrige Analysegenauigkeit) bietet.
- Um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, wurde gefunden, daß durch Verwendung einer Reagenszusammensetzung für die Cholesterinanalyse, umfassend eine Kombination aus einer Gallensäure oder ihres Salzes, mit einem Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend eine Polyoxyethylenkette mit mindestens 16 (und üblicherweise mit mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten, ein trockenes, mehrschichtiges, analytisches Element erhalten werden kann, bei dem die Inhibierungen der Aktivität eines Enzyms mit Cholesterinesteraseaktivität erniedrigt wird und das eine erhöhte Lagerstabilität besitzt.
- Es wurde auch gefunden, daß, wenn eine flüssige Probe, die verschiedene Substanzen enthält, die die Färbung der Farbreagenszusammensetzung stören, wie Blut (Vollblut, Plasma oder Serum) verwendet wird, die Farbreaktion reibungslos abläuft, wenn sie in Gegenwart einer Gallensäure oder ihres Salzes und eines Alkylphenoxypolyethoxyethanols, enthaltend eine Polyoxyethylenkette mit mindestens 16 (und üblicherweise mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten durchgeführt wird, und daß als Ergebnis eine hohe optische Dichte der Färbung erhalten werden kann, welche die genaue kolorimetrische Analyse des Gesamtcholesteringehalts der Probe gestattet.
- Erfindungsgemäß wird ein verbessertes, trockenes, mehrschichtiges, analytisches Element zur Bestimmung von Gesamtcholesterin bereitgestellt, welches einen lichtdurchlässigen, wasserundurchlässigen Träger, mindestens eine hydrophile Polymerschicht (die als hydrophile Schicht bezeichnet wird) auf dem Träger und eine Ausbreitungsschicht auf der hydrophilen Polymerschicht bzw. den hydrophilen Polymerschichten umfaßt, und weiterhin eine Reagenszusammensetzung zur Analyse auf Cholesterin enthält, welche mindestens ein Enzym mit Cholesterinesteraseaktivität, Cholesterinoxidase, Peroxidase und eine Farbreagenszusammensetzung in mindestens einer Schicht der Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Polymerschicht bzw. der hydrophilen Polymerschichten enthält, wobei das Element weiterhin eine Gallensäureverbindung (mindestens eine Verbindung von Gallensäuren, Gallensäurederivaten und Salzen davon) enthält und einen Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend Polyoxyethylenketten mit mindestens 16 (und im allgemeinen mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten in mindestens einer Schicht der Ausbreitungsschicht und der hydrophilen Schicht bzw. der hydrophilen Schichten enthalten ist.
- Das erfindungsgemäße Element bildet üblicherweise ein integrales, mehrschichtiges, analytisches Element.
- Der in dieser Erfindung verwendete, lichtdurchlässige, wasserundurchlässige Träger kann irgendeiner von denjenigen sein, die allgemein in mehrschichtigen, analytischen Elementen verwendet werden. Genauer kann beispielsweise ein transparenter Träger mit einer Dicke von 50 um bis 1 mm, bevorzugt 80 um bis 300 um, aus einem Polymeren, wie Polyethylenterephthalat, Bisphenol A, Polycarbonat, Polystyrol und Celluloseestern (z.B. Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat und Celluloseacetatpropionat) verwendet werden. Sofern erforderlich, kann die Adhäsion des Trägers an die hydrophile Schicht und die anderen Schichten, die auf dem Träger vorgesehen sein sollen, dadurch verstärkt werden, daß man eine Unterschicht oder eine adhäsive Schicht, die aus den Beschreibungen der vorstehend zitierten Patentschriften bekannt sind, vorsieht.
- Eine hydrophile Schicht kann man als eine wasserabsorbierende Schicht wirken lassen, die keine Reagenskomponente enthält. Sie quillt nach Wasserabsorption auf und kann ggf. den zu detektierenden Stoff (ein gebildeter Farbstoff) aufnehmen und ihn anhäufen. Sie kann auch als detektierende Schicht funktionieren, die einen Komplexbildner mit einer negativen oder einer positiven Ladung enthält und die den zu detektierenden Stoff aufnehmen und fixieren kann und nach Wasserabsorption aufquillt. Diese Schicht kann eine pH-Pufferzusammensetzung enthalten, die den pH- Wert zur Zeit der Farbreaktion stabilisiert. Sie kann aus einem hydrophilen, polymeren Binder allein oder mit einer anderen Komponente, die darin enthalten ist, gebildet sein. Das hydrophile polymere Bindemittel ist ein natürliches oder synthetisches, hydrophiles Polymeres mit einem Quellverhältnis zur Zeit der Wasserabsorption von 150 % bis 2000 %, bevorzugt 250 % bis 1500 %, bei 30ºC.
- Beispiele für das hydrophile, polymere Bindemittel umfassen Gelatinearten (säureverarbeitete Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), Gelatinederivate (wie phthalierte Gelatine und Hydroxyacrylat-gepfropfte Gelatine), Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, wie beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 171864/84 und 108753/85 beschrieben ist.
- Die hydrophile Schicht hat im allgemeine eine Dicke im trockenen Zustand von 1 um bis 100 um, bevorzugt 3 um bis 50 um, besonders bevorzugt 5 um bis 30 um, und ist bevorzugt im wesentlichen transparent.
- Die hydrophile Schicht kann einige oder alle der folgenden Inhaltsstoffe enthalten: pH-Puffer, Enzyme, eine Farbreagenszusammensetzung und fakultativ ein Reagens (wie Ferrocyanid, das verwendet wird, um die Bildungsgeschwindigkeit der Farbe zu erhöhen und um die Farbeffizienz zu erhöhen), sie kann auch ein oder mehrere bekannte Komplexbildner, basische Polymere (wirken als basischer Puffer oder als Base), saure Polymere (wirken als ein saures Polymeres oder eine Säure) etc. enthalten. In diesem Fall wirkt die hydrophile Schicht als eine Reagensschicht oder eine farbbildende Reagensschicht.
- Beispiele für die Ausbreitungsschichten umfassen nicht-faserige, isotrope, poröse, entwickelnde Schichten, wie eine poröse Schicht, die kontinuierliche, offene Mikroporen, in denen ein Membranfilter (eine weißliche Polymerschicht) und polymere Mikroperlen, Glasmikroperlen und Diatomeenerde in einem hydrophilen, polymeren Bindemittel enthalten ist, enthält, wie beispielsweise in der japanischen Patentpublikation Nr. 21677/78 beschrieben ist, und eine poröse Schicht, die kontinuierliche, offene Mikroporen (eine dreidimensionale, teilchenförmige Gitterstrukturschicht), in denen die polymeren Mikrokugeln und Glasmikrokugeln in punktförmigem Kontakt mit einem Polymerklebstoff, der mit Wasser nicht quellbar ist, verbunden sind, enthält, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 90859/80 beschrieben ist; faserige poröse Schichten, wie Ausbreitungsschichten aus gewebtem Gewebe, wie beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 164356/80 und 66359/82 beschrieben ist; Ausbreitungsschicht aus gestricktem und gewirktem Material, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 222769/85 beschrieben ist, und eine Ausbreitungsschicht aus einem Papier, enthaltend eine organische Polymerfaser-Pulpe, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 148250/82 beschrieben ist.
- Die Ausbreitungsschicht ist auf der hydrophilen Schicht entweder direkt oder, sofern erforderlich, über eine Klebeschicht angebracht. Die Ausbreitungsschicht kann Enzyme, die Farbreagenszusammensetzung und, sofern erforderlich, Ferrocyanid und andere Reagentien teilweise oder alle zusammen enthalten.
- Von den Enzymen ist eines mit Cholesterinesteraseaktivität bevorzugt in der porösen Ausbreitungsschicht eingeschlossen.
- In das erfindungsgemäße mehrschichtige, analytische Element können Reagensschichten, lichtabschirmende Schichten, lichtreflektierende Schichten, Filtrationsschichten, semipermeable Schichten, Barrierenschichten und die Diffusion verhindernde Schichten (die Wanderung verhindernde Schichten), wie in den vorstehend zitierten Patentdokumenten beschrieben, und eine Schicht, die zwei oder mehrere Funktionen, die von einer einzigen Schicht dieser Schichten wahrgenommen werden, besitzt, eingeschlossen sein.
- Die Reagensschicht enthält Enzyme, die Farbreagenszusammensetzung und, sofern erforderlich, Ferrocyanid und andere Reagentien teilweise oder insgesamt. Sie ist eine nicht-poröse, wasserabsorbierende und bevorzugt quellbare oder eine mikroporöse, wasserpermeable Schicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine wasserabsorbierende Schicht auf einem Träger vorgesehen, und eine Reagensschicht ist darauf angebracht.
- Ein hydrophiles, polymeres Bindemittel, das in der im wesentlichen nicht-porösen, wasserabsorbierenden Reagensschicht verwendet wird, wirkt als Medium zur im wesentlichen gleichförmigen Auflösung oder Dispersion des Reagenses und besitzt mindestens eine Wirkung, Wasser von der flüssigen Analyseprobe zu absorbieren und die zu analysierende Komponente in die Reagensschicht zusammen mit dem Wasser zu transportieren. Das hydrophile, polymere Bindemittel kann irgendeines von den wasserabsorbierenden, hydrophilen, polymeren Bindemitteln, die in der vorstehenden hydrophilen Schicht verwendet werden, sein. Die im wesentlichen nicht-poröse Reagensschicht besitzt eine Dicke in trockenem Zustand im allgemeinen von 3 um bis 50 um, bevorzugt 5 um bis 30 um, und die Reagensschicht ist bevorzugt im wesentlichen transparent.
- Die mikroporöse, wasserpermeable Reagensschicht ist eine Schicht, in der ein Reagens oder eine Reagenszusammensetzung in einer Schicht mit mikroporöser Struktur aus festen, feinen Teilchen und ein hydrophiles, polymeres Bindemittel dafür, eingeschlossen sind. Die Schicht mit der mikroporösen Struktur, wie sie hier genannt wird, ist eine Schicht aus einer Struktur aus mikroporösen, feinen Teilchen aus nicht-porösen, feinen Teilchen und einem hydrophilen, polymeren Bindemittel, das die feinen Teilchen aneinander bindet, um eine mikroporöse, offenporige Struktur zu erhalten.
- Beispiele für die mikroporösen, feinen Teilchen oder die nichtporösen feinen Teilchen, die in der porösen Reagensschicht verwendet werden, sind Celluloseteilchen, wie feine Pulver oder feine Teilchen aus Cellulose oder mikrokristalliner Cellulose, feine Teilchen aus Siliciumdioxidverbindungen, wie Kieselgel und Diatomeenerde, feine Teilchen aus Silicaten, wie Zeolith, polymere Mikrokugeln, Glasmikrokugeln und verschiedene Keramikkugeln. Das hydrophile, polymere Bindemittel kann geeigneterweise aus den gleichen Polymeren, wie die wasserabsorbierenden, hydrophilen Polymeren, die in der oben beschriebenen hydrophilen Schicht verwendet werden, ausgewählt werden und die wäßrigen Latices aus Copolymeren, enthaltend etwa 2 % oder mehr hydrophile Repetiereinheiten, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 145965/84 beschrieben, können ebenfalls verwendet werden. Die mikroporöse Reagensschicht hat eine Dicke in trockenem Zustand im allgemeinen von 7 um bis 50 um, bevorzugt 10 um bis 30 um.
- Die Reagensschicht kann bekannte pH-Pufferzusammensetzungen, polymere pH-Puffer, basische Polymere, saure Polymere, polymere Komplexbildner etc. enthalten.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine wasserabsorbierende Schicht zwischen der Reagensschicht und dem Träger angebracht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Farbreagenszusammensetzung in der hydrophilen Schicht eingeschlossen, und das Enzym, die Gallensäureverbindung und der Alkylphenoxypolyethoxyethanol sind in der porösen Ausbreitungsschicht enthalten.
- Eine lichtabschirmende Schicht kann auf der Reagensschicht oder irgendeiner anderen hydrophilen Schicht angebracht sein. Die lichtabschirmende Schicht ist eine wasserpermeable oder wasserdurchdringbare Schicht aus feinen Teilchen oder Pulvern (die der Einfachheit halber als feine Teilchen bezeichnet werden) mit einer lichtabschirmenden Eigenschaft oder mit sowohl lichtabschirmenden als auch lichtreflektierenden Eigenschaften, die in einer kleinen Menge eines filmbildenden, hydrophilen, polymeren Bindemittels dispergiert und festgehalten sind. Die lichtabschirmende Schicht schirmt die Farbe der wäßrigen Flüssigkeitsprobe, insbesondere die rote Farbe des Hämoglobins, das in einer Vollblutprobe enthalten ist, die auf die Ausbreitungsschicht aufgetropft und in sie eingebracht wird, wenn die in der Reagensschicht oder der hydrophilen Schicht gebildete Farbe reflektiert wird und von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers gemessen wird, ab. Sie wirkt auch als lichtreflektierende Schicht oder als eine Hintergrundschicht.
- Beispiele für die feinen Teilchen, die sowohl lichtabschirmende als auch lichtreflektierende Eigenschaften besitzen, sind feine Teilchen aus Titandioxid (feine kristalline Teilchen mit einem Teilchendurchmesser von 0,1 um bis 1,2 um aus Titandioxid vom Rutil-, Anatase- oder Burkeittyp), feine Teilchen aus Bariumsulfat und feine Teilchen oder feine Flocken aus Aluminium. Unter diesen sind feine Teilchen aus Titandioxid und feine Teilchen aus Bariumsulfat bevorzugt.
- Beispiele für die lichtabschirmenden feinen Teilchen sind Ruß, Gasruß und Mikrokugeln aus Kohlenstoff.
- Das filmbildende, hydrophile, polymere Bindemittel kann das gleiche hydrophile Polymere, wie in der hydrophilen Schicht verwendet, und auch schwach hydrophile, regenerierte Cellulose und Celluloseacetat sein. Bevorzugte polymere Bindemittel sind Gelatine, Gelatinederivate und Polyacrylamid. Die Gelatine und die Gelatinederivate können als Gemisch mit bekannten Härtern (Vernetzungsmittel) verwendet werden.
- Die lichtabschirmende Schicht kann durch Beschichten einer wäßrigen Dispersion aus lichtabschirmenden, feinen Teilchen und einem hydrophilen Polymeren auf der Reagensschicht oder der hydrophilen Schicht und durch dessen Trocknung nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden. Das Volumenverhältnis des hydrophilen, polymeren Bindemittels zu 10 Teilen der lichtabschirmenden, feinen Teilchen in dem trockenen Zustand beträgt im allgemeinen von 2,5 bis 7,5, bevorzugt von 3,0 bis 6,5 Teilen. Wenn die lichtabschirmenden, feinen Teilchen solche aus Titandioxid sind, beträgt das Gewichtsverhältnis des polymeren Bindemittels zu 10 Teilen der feinen Titandioxidteilchen von 0,6 bis 1,8, bevorzugt 0,8 bis 1,5 Teilen. Die Dicke der lichtabschirmenden Schicht nach Trocknen beträgt im allgemeinen von 3 um bis 10 um, bevorzugt von 5 um bis 20 um.
- Eine adhäsive Schicht kann vorgesehen sein, um die Ausbreitungsschicht, die lichtabschirmende Schicht etc. zu stapeln und zu verbinden. Wenn eine poröse Ausbreitungsschicht auf der lichtabschirmenden Schicht vorgesehen ist, ist es bevorzugt, die adhäsive Schicht vorzusehen. Wenn jedoch eine Ausbreitungsschicht auf einer ein hydrophiles Polymeres enthaltenden Schicht, wie der wasserabsorbierenden Schicht, einer Reagensschicht etc. vorgesehen ist, kann die adhäsive Schicht je nach dem Typ und den Eigenschaften des hydrophilen Polymeren nicht vorgesehen sein. Die adhäsive Schicht besteht hauptsächlich aus einem hydrophilen Polymeren, das bei Benetzung mit Wasser oder bei Quellung mit Wasser die Ausbreitungsschicht unter Bildung einer integralen Struktur binden. Das in der adhäsiven Schicht verwendete hydrophile Polymere kann irgendeines der gleichen hydrophilen Polymeren, die in der oben beschriebenen, hydrophilen Schicht verwendet werden, sein. Bevozugte hydrophile Polymere, die in der adhäsiven Schicht verwendet werden, sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyvinylalkohol und Polyacrylamid. Die adhäsive Schicht besitzt in trockenem Zustand eine Dicke im allgemeinen von 0,5 um bis 20 um, bevorzugt 1 um bis 10 um. Die adhäsive Schicht kann ein grenzflächenaktives Mittel, bevorzugt ein nicht-ionisches, grenzflächenaktives Mittel, wie ein nicht-ionisches, grenzflächenaktives Mittel mit einer Kettenstruktur aus 8 bis 15 Oxyethylen- oder Oxypropylengruppen, die aneinander gebunden sind, enthalten.
- Die adhäsive Schicht kann durch Beschichten einer wäßrigen Lösung, die ein hydrophiles Polymeres und als fakultative Komponenten das grenzflächenative Mittel etc. enthält, auf die Reagensschicht, die hydrophile Schicht oder die lichtabschirmende Schicht nach einem bekannten Verfahren erzeugt werden.
- Die Farbreagenszusammensetzung zur Cholesterinanalyse, die in dem erfindungsgemäßen Element verwendet wird, umfaßt mindestens ein Enzym mit Cholesterinesteraseaktivität, Cholesterinoxidase, Peroxidase, eine Farbreagenszusammensetzung, mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gallensäuren, Gallensäurederivaten und Salzen davon, und ein Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend eine Polyoxyethylenkette aus mindestens 16 (und im allgemeinen mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten. Die Zusammensetzung kann auch ein Ferrocyanid enthalten.
- Die Cholesterinesterase (Enzymcode 3.1.1.13; nachstehend wird "Enzymcode" der Einfachheit halber als "EC" abgekürzt) ist ein Enzym, das Cholesterinester in der Analysenprobe in Cholesterin umwandelt. Cholesterinoxidase (EC 1.1.3.6) ist ein Enzym, das Cholesterin unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Peroxidase (EC 1.11.1.7) ist ein Enzym, das an einer Oxidationsreaktion der Farbreagenszusammensetzung unter Verwendung von Wasserstoffperoxid unter Bildung einer Farbe teilnimmt. Nicht nur die Enzyme, die als EC 3.1.1.13 klassifiziert sind, können als die Cholesterinesterase verwendet werden, sondern es können auch andere Enzyme mit Cholesterinesteraseaktivität entweder einzeln (beispielsweise Lipase M , hergestellt von Enzyme Development Corp. und Lipase 3000 , hergestellt von Wilson Laboratories, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 45599/1981 beschrieben) oder Kombinationen aus zwei oder mehr derartigen Enzymen, beispielsweise eine Kombination aus Lipase mit Cholesterinesteraseaktivität, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 45599/81 (z.B. Lipase M und Lipase 3000 ) mit Protease, beispielsweise Chymotrypsin (EC 3.4.21.1), Papain (EC 3.4.21.2) oder Bromelain (EC 3.4.22.4) oder Pronase verwendet werden.
- Cholesterinoxidase (EC 1.1.3.6) ist ein Enzym, das Cholesterin unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Es kann geeigneterweise aus im Handel erhältlichen Enzymen ausgewählt werden. Sofern erforderlich, kann es zusammen mit einem Coenzym, wie FAD (Flavinadenindinucleotid) verwendet werden.
- Als Peroxidase können Peroxidasen (EC 1.11.1.7), abgeleitet von einer Pflanze oder Tieren, wie in den japanischen Patentpublikationen Nrn. 45599/1981 und 5520/1982 beschrieben, und eine Peroxidase (EC 1.11.1.7) oder eine von einem Mikroorganismus abgeleitete Peroxidase, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 5035/1983 beschrieben, verwendet werden. Von diesen sind nicht-spezifische Peroxidasen, die sich von einer Pflanze oder Mikroorganismen ableiten, bevorzugt. Beispiele für die bevorzugten Peroxidasen sind aus Meerrettich und rettichextrahierte Peroxidasen und aus Mikroorganismen der Gattungen Cochliobolus und Curvularia extrahierte Peroxidasen.
- Beispiele für die Gallensäuren sind Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure und Chenodesoxycholsäure. Beispiele für die Gallensäurederivate sind Taurocholsäure, Glykolsäure, Taurodesoxycholsäure und Glycodesoxycholsäure. Die Salze der Gallensäuren und der Gallensäurederivate können beispielsweise Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze dieser Verbindungen sein. Bei dem erfindungsgemäßen, mehrschichtigen, analytischen Element ist mindestens eine Verbindung ausgewählt aus den vorstehend erwähnten Gallensäuren und Gallensäurederivaten und ihren Salzen (die im allgemeinen als Gallensäurekomponenten dieser Erfindung bezeichnet werden), in irgendeiner der Schichten enthalten. Bevorzugt ist die Gallensäureverbindung in der Schicht oder in einer Schicht neben der Ausbreitungsschicht enthalten. Besonders bevorzugt ist die Gallensäureverbindung in der gleichen Schicht zusammen mit dem Alkylphenoxypolyethoxyethanol und einem oder mehreren Enzymen mit Cholesterinesteraseaktivität enthalten.
- Die Alkylgruppen in dem Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend eine Polyoxyethylenkette mit mindestens 16 (und im allgemeinen mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten (die einfach als der Alkylphenoxypolyethoxyethanol bezeichnet wird, diese Verbindung wird auch Polyoxyethylenalkylphenylether genannt), können verschiedene Alkylgruppen, bevorzugt lineare oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 20, bevorzugter 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, und am meisten bevorzugt mit 8 oder 9 Kohlenstoffatomen, wie eine Octyl, 1,1,3,3-Tetramethylbutyl- oder Nonylgruppe, sein. Die Anzahl der Oxyethyleneinheiten in der Polyoxyethylenkette beträgt bevorzugt 16 bis etwa 60 und die durchschnittliche Anzahl der Einheiten beträgt bevorzugt 20 bis 50 und bevorzugter 30 bis 50. Die Alkylgruppe kann an jeder beliebigen Position der Phenylgruppe vorhanden sein, jedoch steht sie im allgemeinen in p- oder m-Position hinsichtlich des Sauerstoffatoms der Phenoxygruppe.
- Beispiele für den Alkylphenoxypolyethoxyethanol sind Octylphenoxypolyethoxyethanol (ein Gemisch aus den Verbindungen, die 20 bis 40 Oxyethyleneinheiten im Durchschnitt enthalten), Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 20 bis 40 Oxyethyleneinheiten im Durchschnitt), 1,1,3,3-Tetramethylbutylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 20 bis 40 Oxyethyleneinheiten im Durchschnitt). Bevorzugt ist der Alkylphenoxypolyethoxyethanol in der gleichen Schicht zusammen mit einem oder mehreren Enzymen mit Cholesterinesteraseaktivität und der Gallensäureverbindung oder in einer Schicht benachbart der Schicht, die die Enzyme und die Gallensäureverbindung enthält, enthalten. Zwei oder mehr Alkylphenoxypolyethoxyethanole können in Kombination verwendet werden, oder eine oder mehrere Alkylphenoxypolyethoxyethanole können in Kombination mit einem anderen Typ eines grenzflächenaktiven Mittels, besonders eines nichtionischen, grenzflächenaktiven Mittels, verwendet werden.
- Die Farbreagenszusammensetzung ist beispielsweise (1) eine Zusammensetzung, enthaltend ein Chromogen und einen Kuppler, und koppelt oxidativ mit dem Chromogen über Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase unter Farbbildung durch Bildung eines Chinoniminfarbstoffs oder (2) ein Leucofarbstoff, der durch Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Farbstoffs oxidiert wird.
- Beispiele für den Chromogen sind 4-Aminoantipyrin (sog. 4-Aminopenazon, d.h. 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on), beschrieben in Ann. Clin. Biochem, 6, 24-27 (1969), trisubstituierte 4-Amino-3- pyrazolin-5-one, wie 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on) und 1-(3,5-Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 54962/1984 und 4-Aminoantipyrinanaloga, wie 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4- dimethylamino-3-pyrazolin-5-on, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 25840/1980. Von diesen sind 4-Aminoantipyrin, 1-(2,4,6- Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on und 1-(3,5-Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on bevorzugt.
- Beispiele für die Kuppler umfassen die in Ann. Clin. Biochem., 6, 24-27 (1969), den japanischen Patentpublikationen Nrn. 25840/1980, 45599/1981 und 18628/1983, den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 164356/1980, 124398/1981 und 155852/1981 beschriebenen Phenole; Phenolsulfonsäuren (einschließlich der Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze davon), wie 2-Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 4-Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 3,5-Dichlor-2-hydroxy-1-benzolsulfonsäure und 2-Hydroxy-3- methoxy-1-benzolsulfonsäure; 1-Naphthol und 2-Naphthol; Dihydroxynaphthaline, wie 1,7-Dihydroxynaphthalin; Naphtholsulfonsäuren (einschließlich der Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze davon), wie 1- Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure und 1-Hydroxy-4-naphthalinsulfonsäure; und andere Phenol- oder Naphtholderivate. Von diesen Verbindungen sind 1,7-Dihydroxynaphthalin, 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure (einschließlich der Na-, K- und Li-Salze davon) und 3,5-Dichlor-2-hydroxy-1-benzolsulfonsäure (einschließlich der Na-, K- und Li-Salze davon) bevorzugt.
- Beispiele für den Leucofarbstoff sind Triarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis-[4-(dimethylamino)- phenyl]-imidazol, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 5519/1982; Diarylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-[4-(dimethylamino)-phenyl]-5-phenethylimidazol, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 193352/1984; Diarylindolylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(2-Phenyl-3-indolyl)-4,5-di-[4-(dimethylamino)-phenyl]-imidazol, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 4960/1986; Triarylmonoacylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(4- Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3-acetyl-4,5-bis-[4-(diethylamino)-phenyl]- imidazol, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 229868/1986; und Triarylmonoalkylimidazolleucofarbstoffe, wie 2-(4- Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-3-methyl-4,5-bis-[4-(diethylamino)-phenyl]- imidazol.
- Eine Ferrocyanidverbindung kann als fakultative Komponente der Farbreagenszusammensetzung zur Cholesterinanalyse zugesetzt werden.
- Eine Verbindung, die ein Ferrocyanidion (ein Hexacyanoferrat(II)- ion, d.h. [Fe(CN)&sub6;]&sup4; ) enthält oder freisetzt, kann als die Ferrocyanidverbindung verwendet werden. Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhexacyanoferrate(II) oder Gemische dieser Metallsalze können als die Ferrocyanidverbindung verwendet werden. Spezifische Beispiele für die Ferrocyanidverbindung sind Natriumferrocyanid Na&sub4;[Fe(CN)&sub6;], Kaliumferrocyanid K&sub4;[Fe(CN)&sub6;], Lithiumhexacyanoferrat(II), Magnesiumhexacyanoferrat(II) und Calciumhexacyanoferrat(II). Von diesen sind Kaliumferrocyanid und Natriumferrocyanid bevorzugt.
- Unter den Komponenten der Farbreagenszusammensetzung zur Cholesterinanalyse sind die Enzyme, die Gallensäureverbindung und der Alkylphenoxypolyethoxyethanol bevorzugt in der porösen Ausbreitungsschicht enthalten. Die Farbreagenszusammensetzung und das Ferrocyanid als fakultative Komponenten können in einer oder mehreren der porösen Ausbreitungsschicht und einer Schicht benachbart oder nicht benachbart zu der porösen Ausbreitungsschicht, wie einer unabhängigen Reagensschicht, einer hydrophilen Schicht und einer wasserabsorbierenden Schicht, enthalten sein.
- Die Mengen der Komponenten der Farbreagenszusammensetzung zur Cholesterinanalyse, die in dem erfindungsgemäßen Element verwendet werden, (die Mengen, die pro m² des Elements beschichtet werden) sind wie folgt:
- Mindestens ein Enzym mit Cholesterinesteraseaktivität: 500 bis 50.000 IU, bevorzugt 1000 bis 30.000 IU (als Cholesterinesteraseaktivitätswert).
- Cholesterinoxidase: 1000 bis 30.000 IU, bevorzugt 1500 bis 20.000 IU.
- Peroxidase: 1000 bis 100.000, bevorzugt 2000 bis 60.000 IU.
- Chromogen oder Leucofarbstoff: 0,5 bis 10 mMol, bevorzugt 1 bis 5 mMol.
- Kuppler: 2,5 bis 50 mMol, bevorzugt 5 bis 25 mMol.
- Ferrocyanid: 0,1 bis 10 mMol, bevorzugt 0,5 bis 5 mMol.
- Gallensäureverbindung: 0,2 g bis 10,0 g, bevorzugt 0,5 bis 5,0 g.
- Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend eine Polyoxyethylenkette mit mindestens 16 (und im allgemeinen mindestens durchschnittlich 20) Oxyethyleneinheiten: 0,5 g bis 12,0 g, bevorzugt 0,8 g bis 8,0 g.
- Ein bekannter Puffer, der die pH-Werte zur Zeit der Durchführung der Analyse einer flüssigen Probe auf einen gewünschten Wert im Bereich von 5,5 bis 9,0, bevorzugt 7,7 bis 8,5 puffern kann, kann in dem erfindungsgemäßen, mehrschichtigen, analytischen Element enthalten sein.
- Puffer, die verwendet werden können, sind beispielsweise die pH- Puffersysteme, die im "Manual of Chemistry, Fundamentals", herausgegeben von Japanese Chemical Society (veröffentlicht 1966 von Maruzen Co., Ltd., Tokyo), S. 1312-1320; "Data for Biochemical Research", herausgegeben von R.M.C. Dawson et al., 2. Auflage (veröffentlicht von Oxford bei Clarendon Press, 1969), S. 476-508, Biochemistry 5, S. 467 und folgende, (1966) und Analytical Biochemistry 104, S. 300-310 (1980) beschrieben sind.
- Spezifische Beispiele für die pH-Puffer innerhalb eines pH-Bereichs von 5,5 bis 9,0 umfassen Puffer, die Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) enthalten; phosphathaltige Puffer, borathaltige Puffer; citronensäure- oder citrathaltige Puffer; glycinhaltige Puffer; Puffer, die N,N- Bis-(2-hydroxyethyl)-glycin (Bicin); ein Na- oder K-Salz von N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropan-3-sulfonsäure (HEPPS); ein Na- oder K- Salz von N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-sulfonsäure (EPPS); ein Na- oder K-Salz von N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-3-aminopropansulfonsäure (TAPS); ein Na- oder K-Salz von N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES); und Säuren, Basen und Salzen, die mit irgendeiner dieser vorstehenden Verbindungen kombinieren können, sofern erforderlich, enthalten. Spezifische Beispiele für bevorzugte Puffer sind Kaliumdihydrogenphosphatdinatriumhydrogenphosphat; Trisnatriumborat; Trisnatriumborat-EDTA 2Na-Salz; Tris-Citronensäure; Citronensäurenatriumdihydrogenphosphat; Bicin; HEPPS; HEPPS-Natriumsalz; EPPS; EPPS-Natriumsalz; TAPS; TAPS-Natriumsalz.
- Bevorzugt ist der pH-Puffer in der ein Enzym enthaltenden Schicht enthalten. Der pH-Puffer ist bevorzugt in der porösen Ausbreitungsschicht oder der Reagensschicht, welche das Enzym enthalten, enthalten. Andererseits kann sich ein pH-Puffer mit niedrigem Molekulargewicht durch die Schichten mit der Durchdringung von Wasser, das ein Medium für die aufgebrachte, wäßrige, flüssige Probe ist, durchbewegen und muß daher nicht in allen Schichten, die das Enzym und die Farbreagenszusammensetzung enthalten, enthalten sein. Ein solcher pH-Puffer mit niedrigem Molekulargewicht kann nur in der hydrophilen Schicht oder der wasserabsorbierenden Schicht beispielsweise enthalten sein.
- Angesichts der Produktion, der Verpackung, des Transports, der Lagerung und des Analysenarbeitsganges ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße, mehrschichtige, analytische Element in kleine Stücke in der Form eines Vierecks, bei dem eine Seite die Maße von 15 mm bis 20 mm besitzt, oder in die Form eines Kreises mit so ziemlich der gleichen Größe geschnitten wird und zu Analysenträgern geformt wird, indem man sie in Rahmen von Objektträgern einführt, wie beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 63452/1982 und 156079/1979, den japanischen Gebrauchsmusteranmeldungen (OPI) Nrn. 142454/1981 und 32350/1983 und der japanischen Patentpublikation Nr. 501144/1983 (basierend auf der PCT-Anmeldung) beschrieben ist.
- Die Analysenprobe kann irgendeine wäßrige, cholesterinhaltige Probe sein und kann beispielsweise Blutproben, wie Vollblut, Plasma oder Serumproben, andere verschiedene Körperflüssigkeiten, Lebensmittel und Proben zur Verfahrenskontrolle von Anlagen, die Cholesterin erzeugen oder verwerten, sein.
- Gemäß den in den vorstehend zitierten Patentdokumenten beschriebenen Verfahren werden 5 ul bis 30 ul, bevorzugt 8 ul bis 15 ul der wäßrigen, flüssigen Probe auf die Ausbreitungsschicht des mehrschichtigen, analytischen Elements getropft und, sofern erforderlich, bei im wesentlichen konstanter Temperatur im Bereich von 20ºC bis 45ºC, bevorzugt 35ºC bis 40ºC, inkubiert. Danach wird die in dem analytischen Element gebildete Farbe reflektiert und gemessen, beispielsweise von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers aus, und auf dem Prinzip der Kolorimetrie kann der Gesamtcholesteringehalt der flüssigen Probe bestimmt werden.
- Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
- Auf einen Polyethylenterephthalatfilm (PET)-Film mit einer Dicke von 180 um und einer Gelatineunterschicht wurden Gelatine (26 g/m²), Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend eine durchschnittliche Anzahl an Oxyethyleneinheiten im Bereich von 9 bis 10; die Anzahl der Oxyethyleneinheiten wird nachstehend als n abgekürzt) (0,03 g/m²) und Bis- (vinylsulfonylmethyl)-ether (30 mg/m²) beschichtet und unter Bildung einer Gelatineschicht (wasserabsorbierende Schicht) getrocknet.
- Wasser wurde als Befeuchtungswasser in die wasserabsorbierende Schicht in einer Menge von 30 g/m² gegeben, und eine Tricotwirkware (durchschnittliche Dicke 250 um) aus gesponnenem Garn (50 Denier) aus Polyethylenterephthalat (PET), welche durch Koronaentladung hydrophil gemacht worden war, wurde laminiert und verbunden, wodurch eine Ausbreitungsschicht gebildet wurde.
- Dann wurde eine wäßrige Lösung aus einer Farbreagenszusammensetzung zur Cholesterinanalyse auf die Ausbreitungsschicht aus Wirkware beschichtet und getrocknet, so daß die beschichtenden Mengen ihrer Komponenten in der Ausbreitungsschicht, wie nachstehend gezeigt, waren. So wurde ein mehrschichtiges, analytisches Element zur Bestimmung von Gesamtcholesterin erzeugt.
- Methylcellulose (Methoxygruppengehalt 29 %, Viskosität 112 cps als eine 2 gew.-%ige wäßrige Lösung bei 20ºC) 3,0 g Feine Titandioxidteilchen (Rutiltyp; Teilchengröße 0,25 bis 0,40 um) 24 g Octylphenoxypolyethoxyethanol (n = durchschnittlich 40) 1,1 g Natriumdesoxycholat 1,5 g Cholesterinoxidase (EC 1.1.3.6) 3500 IU Cholesterinesterase (EC 3.1.1.13) 2000 IU Peroxidase (EC 1.11.1.7) 2900 IU Natrium-2-hydroxy-3,5-bichlorbenzolsulfonat 1,8 g 4-Aminoantipyrin 0,3 g Natriumdihydrogenphosphat 7,3 g NaOH zur Einstellung des pH-Werts auf 8,0
- Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Octylphenoxypolyethoxyethanol (n = durchschnittlich 40), Nonylphenoxypolyethoxyethanol (n = im Bereich von 9 bis 10 im Durchschnitt) und Natriumdesoxycholat in ihren Mengen verändert oder neu zugesetzt wurden, wie in der nachstehenden Tabelle in 9 verschiedenen Fällen angegeben ist. Somit wurden mehrschichtige, analytische Elemente zum Vergleich zur Bestimmung von Gesamtcholesterin hergestellt.
- Jedes der mehrschichtigen, analytischen Elemente, die in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurden, wurde in einen viereckigen Chip mit einer Größe von 15 mm x 15 mm geschnitten und in eine Plastikvorrichtung des Typs, wie in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 63452/1982 beschrieben ist, eingesetzt, wodurch ein chemischer analytischer Objektträger bzw. Stäbchen zur Bestimmung von Gesamtcholesterin gebildet wurde.
- Diese Stäbchen wurden dann wie folgt bewertet.
- Der vorstehend beschriebene Objektträger zur chemischen Analyse wurde 3 Tage bei 4 ºC bei einer relativen Feuchtigkeit von nicht mehr als 5 % und bei 45ºC und einer relativen Feuchtigkeit von etwa 45 % gelagert. Die optischen Dichten der gebildeten Farben wurden verglichen. 10 ul einer menschlichen Plasmaprobe mit einer Cholesterinkonzentration von etwa 450 mg/dl, welche unter Verwendung von Heparin abgenommen worden waren, wurden auf jedes Stäbchen bzw. jeden Objektträger aufgetropft und bei 37ºC 6 min lang inkubiert. Die reflektierenden optischen Dichten wurden von der Seite des PET-Trägers mit einem Licht mit einer Wellenlänge von 540 nm gemessen.
- Die Gesamtcholesteringehalte von menschlichen Plasmaproben mit unterschiedlichen Gesamtcholesteringehalten wurden nach dem Lösungsverfahren von C.C. Allain et al. als Standardverfahren [Clinical Chemistry, 20, 470-475, (1974)] gemessen. Auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse wurde eine Kalibrationskurve für menschliches Plasma für die erfindungsgemäßen mehrschichtigen, analytischen Elemente und die Vergleichselemente hergestellt.
- Unter Verwendung eines menschlichen Plasmas mit einer Neutralfettkonzentration von etwa 620 mg/dl wurde der gleiche Arbeitsschritt wie in Versuch 1 durchgeführt, um das gefärbte Produkt zu bilden. Der Gesamtcholesteringehalt wurde aus der Kalibrationskurve bestimmt.
- Unter Verwendung von menschlichem Plasma mit einem Gesamtproteingehalt von etwa 11 g/dl wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Versuch 1 durchgeführt, und das gefärbte Produkt wurde gebildet. Der Gesamtcholesteringehalt wurde aus der obigen Kalibrationskurve bestimmt.
- Die nachstehende Tabelle faßt die Verhältnisse des Gesamtcholesteringehalts, die mit dem Stäbchen zur chemischen Analyse erhalten wurden, im Verhältnis zu denen, die nach dem Verfahren von Allain et al. in den menschlichen Plasmaproben in Versuch 2 und Versuch 3 erhalten wurden, zusammen.
- Die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen klar, daß (1) die erfindungsgemäßen mehrschichtigen, analytischen Elemente zur Bestimmung von Gesamtcholesterin eine sehr geringe Abnahme (weniger als 1,3 %) in der optischen Dichte des gefärbten Produkts selbst nach dem beschleunigten Verschlechterungstest bei 45ºC und 45 % RH für 3 Tage besitzt; (2) wie bei dem Lösungsverfahren nach C.C. Allain et al. als Standardmeßverfahren die Interferenz der Analyse infolge der Neutralfette im Blut (etwa -1 %) und der Gesamtproteine in dem Blut (etwa -3 %) bei den erfindungsgemäßen Elementen vernachlässigbar ist und als Gesamteigenschaften das erfindungsgemäße Element eine sehr gute Korrelation mit dem Standardverfahren zeigt. Tabelle Mehrschichtiges analytisches Element Beispiel 1 erfindungsgemäß Vergleichsbeispiel n : durchschnittl. Natriumdesoxycholat Versuch 1 4ºC, nicht mehr als 5 % RH Unterschied zwischen 4ºC und 45ºC Versuch 2 Verhältnis zu dem Allain-Verfahren Versuch 3 Verhältnis zu dem Allain-Verfahren (Reflektierte Werte für die optische Dichte) Anmerkung: OPhPEE: Octylphenoxypolyethoxyethanol NPhPEE: Nonylphenoxypolyethoxyethanol
- Nachstehend sind die in englischer Sprache geschriebenen Patentdokumente, die den japanischen Patentdokumenten entsprechen und auf die hier Bezug genommen wurde, aufgeführt.
- JPA: Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr.
- JPP: Japanische Patentpublikation Nr.
- UMP: Gebrauchsmusteranmeldung (OPI) Nr.
- JPAP: Japanische veröffentlichte Patentanmeldung Nr.
- JPA Nr. 96378/78 US-Patent 4 275 151
- US-Patent 4 275 152
- JPA Nr. 85200/86 US-Patent 4 680 259
- JPA Nr. 125796/75 GB 1 479 994
- JPA Nr. 171864/84 EP 0 119 861A
- JPA Nr. 108753/85 EP 0 142 849A
- JPP Nr. 21677/78 US-Patent 3 992 158
- JPA Nr. 90859/80 US-Patent 4 258 001
- JPA Nr. 164356/80 US-Patent 4 292 272
- JPA Nr. 66359/82 GB 2 087 074A
- JPA Nr. 222769/85 EP 0 162 302A
- JPA Nr. 145965/84 EP 0 115 873A
- JPP Nr. 45599/81 US-Patent 3 983 005
- JPP Nr. 25840/80 US-Patent 3 886 045
- JPA Nr. 54962/84 EP 0 103 901A
- JPP Nr. 18628/83 US-Patent 4 042 335
- JPA Nr. 124398/81 US-Patent 4 350 762
- JPA Nr. 155852/81 US-Patent 4 291 121
- JPP Nr. 5519/82 US-Patent 4 089 747
- JPA Nr. 193352/84 EP 0 122 641A
- JPA Nr. 4960/86 EP 0 165 588A
- JPA Nr. 156079/79 US-Patent 4 169 751
- JUMP Nr. 142454/81 US 4 387 990
- JPAP Nr. 501144/83 WO 83/00391
Claims (18)
1. Mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung
von Gesamtcholesterin, dadurch
gekennzeichnet, daß es einen lichtdurchlässigen,
wasserundurchlässigen Träger, mindestens eine hydrophile Polymerschicht auf
dem Träger und eine Ausbreitungsschicht auf der hydrophilen
Polymerschicht bzw. den hydrophilen Polymerschichten
enthält, und daß es eine Farbreagenz-Zusammensetzung zur
Analyse von Cholesterin enthält, welche
(a) mindestens ein Enzym mit Cholesterinesterase-
Aktivität,
(b) Cholesterinoxidase,
(c) Peroxidase, und
(d) eine Farbreagenz-Zusammensetzung enthält, wobei
das Element weiterhin
(e) mindestens eine Gallensäureverbindung,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gallensäuren,
Gallensäurederivaten und Salzen von Gallensäuren und -derivaten, und
(f) ein Alkylphenoxypolyethoxyethanol, enthaltend
eine Polyoxyethylenkette mit mindestens 16
Oxyethyleneinheiten, enthält.
2. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit
Cholesterinesterase-Aktivität Cholesterinesterase ist.
3. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Gallensäureverbindung aus der Gruppe bestehend aus Cholsäure,
Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Chenodesoxycholsäure,
Taurocholsäure, Glykolsäure, Taurodesoxycholsäure,
Glykodesoxycholsäure
und Natrium-, Kalium- und Lithiumsalzen von diesen
Gallensäuren ausgewählt ist.
4. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Alkylphenoxypolyethoxyethanol ein Alkylphenoxypolyethoxyethanol
ist, worin die Alkylgruppe eine lineare oder verzweigte
Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
5. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl
der Oxyethylengruppen in der Polyoxyethylenkette in dem
Alkylphenoxypolyethoxyethanol 16 bis 60 beträgt.
6. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl
der Oxyethyleneinheiten in dem Alkylphenoxypolyethoxyethanol
durchschnittlich 20 bis 50 beträgt.
7. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Farbreagenz-Zusammensetzung ein Chromogen und einen Kuppler
enthält.
8. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Farbreagenz-Zusammensetzung einen Leukofarbstoff umfaßt.
9. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Element
weiterhin ein Puffermittel enthält.
10. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Farbreagenz-Zusammensetzung
zur Analyse auf Cholesterin weiterhin
eine Ferrocyanidverbindung enthält.
11. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der
Gallensäureverbindung 0,2 g bis 10,0 g pro m² des Elements
beträgt.
12. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des
Alkylphenoxypolyethoxyethanols 0,5 g bis 12,0 g pro m² des
Elements beträgt.
13. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des
Enzyms mit Cholesterinesterase-Aktivität 500 bis 50.000 IU
(als Wert für die Cholesterinesterase-Aktivität) pro m² des
Elements (nachstehend dasselbe) beträgt, die Menge der
Cholesterinoxidase 1.000 bis 30.000 TU beträgt, die Menge der
Peroxidase 1.000 bis 100.000 IU beträgt, die Menge eines
Chromogens oder Leukofarbstoffs, welche in der Farbreagenz-
Zusammensetzung verwendet werden, 0,5 bis 10 mMol beträgt,
die Menge eines Kupplers, der in der
Farbreagenz-Zusammensetzung verwendet wird, 2,5 bis 50 mMol beträgt.
14. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
10, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge
des Ferrocyanids 0,1 bis 10 mMol pro m² des Elements
beträgt.
15. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Element
eine wasserabsorbierende Schicht auf dem Träger und eine
Schicht, die die Schicht mit der Farbreagenzzusammensetzung
auf der wasserabsorbierenden Schicht enthält, enthält.
16. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit
Cholesterinesterase-Aktivität in der Ausbreitungsschicht
enthalten ist.
17. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Gallensäureverbindung in einer Schicht, die mit der Schicht, die
das Alkylphenoxypolyethoxyethanol enthält, identisch ist
oder dieser Schicht benachbart ist, enthalten ist.
18. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl
der Oxyethyleneinheiten in dem Alkylphenoxypolyethoxyethanol
durchschnittlich 30 bis 50 beträgt.
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