DE69423815T2

DE69423815T2 - Reagens-Zusammensetzung zur quantitativen Analyse von anorganischem Phosphor und trockenes, analytisches Element dazu

Info

Publication number: DE69423815T2
Application number: DE69423815T
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Amano; Kazuya Kawasaki; Osamu Seshimoto; Kiyoshi Yamada
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1993-06-15
Filing date: 1994-06-15
Publication date: 2000-07-27
Anticipated expiration: 2014-06-16
Also published as: EP0629705A2; EP0629705A3; JP3167508B2; DE69423815D1; JPH07197A; EP0629705B1; US5496708A

Description

Hintergrund der Erfindung:

Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens für die quantitative Analyse von in einer Probe enthaltenem, anorganischem Phosphor oder Phosphat und ein Trockenanalyseelement, umfassend eine Reagensschicht, enthaltend ein solches Reagens.

Stand der Technik:

Die quantitative Analyse von in Blutserum oder Urin enthaltenem, anorganischem Phosphor ist ein effektiver, klinisch-chemischer Test zur Erhebung eines Befundes bezüglich des Mineral- oder Elektrolytmetabolismus, ähnlich zurAnalyse von Calcium im Blutserum, und wird daher als einer der wichtigen klinischen Tests zur Untersuchung einer Erkrankung der Nierenfunktion, der Vitamin-D-Defizienz, der Akromegalie, des Hyperparathyreoidismus oder des Hypoparathyreoidismus angesehen.
Die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, die im Fachgebiet am häufigsten angewandt wurde, ist die Phosphomolybdat-Reduktionsmethode, ein Beispiel hierfür ist die Fiske-Subbarow-Methode. Bei der Phosphomolybdat-Reduktionsmethode werden Phosphationen mit einem Molybdat umgesetzt, wodurch Phosphormolybdänsäure entsteht, welche dann mit einem Reduktionsmittel reduziert wird, wodurch sie zu Molybdänblau umgesetzt wird, welches dann kolorimetrisch bestimmt wird, um eine quantitative Analyse des anorganischen Phosphors durchzuführen. Diese bekannte Methode besitzt jedoch Nachteile darin, daß eine Deproteinierung, die durch Zusatz von Trichloressigsäure oder einem ähnlichen Reagens durchgeführt wird, nötig ist. Weiterhin ist die Farbstabilität nach Entwicklung der Farbe relativ gering, so daß eine strikte Kontrolle des Zeitverlaufs von der Farbentwicklung bis zur kolorimetrischen Messung erforderlich ist. Zusätzlich besitzt das Reduktionsmittel, welches bei der Farbreaktion verwendet wird, eine geringe Lagerstabilität. Diese Nachteile bewirken eine umständliche Handhabung, wenn die Methode für einen klinischen Test verwendet wird, bei dem eine Reihe von Proben schnell bearbeitet werden muß. Weitere Probleme dieser bekannten Methode sind, daß metallische Teile der Instrumente, die für die Durchführung der Analyse verwendet werden, aufgrund der Verwendung einer starken Säure korrodiert werden, und daß gebildete Farbstoffpigmente dazu neigen, an die Gefäße oder die Leitungen des Instruments zu adsorbieren. Diese Probleme werfen schwerwiegende Hindernisse bei der Verwirklichung eines automatisierten Analysesystems für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor auf.
Besonders bei klinischen Routmetests, bei denen eine Anzahl von Testproben gehandhabt werden muß, ist es erforderlich, daß die individuellen Proben schnell unter Zuhilfenahme einfacher Verfahrensschritte analysiert werden können, besonders wünschenswert durch Ablauf automatisierter Verfahrensschritte. Dieser Anforderung folgend wurden Trockenanalyseelemente vorgeschlagen (US Patent No. 3,992,158; EP 0097952A; US Patent No. 4,861,552 und US Patent No. 4,459,358). Obwohl es wünschenswert ist, die Phosphomolybdat-Reduktionsmethode auf ein solches Trockenanalyseelement anzuwenden, ist es schwierig, eine solche Anwendung zu verwirklichen.
In den letzten Jahren wurden einige wenige enzymatische Analysemethoden entwickelt, mit deren Hilfe anorganischer Phosphor spezifisch analysiert werden kann ohne die Notwendigkeit der Deproteinierung oder einer ähnlichen Vorbehandlung (Japan J. Clin. Chem., 11, 83, (1982)). Eine dieser Me thoden ist die PNP-XOD-POD-Methode, beispielsweise offenbart in Japan J. Clin. Chem., 11, 83, (1982), bei der anorganisches Phosphat Pi in Gegenwart der Purinnucleosidphosphorylase (im weiteren PNP genannt) mit Inosin umgesetzt wird, wodurch Hypoxanthin produziert wird, welches durch Einwirkung der Xanthinoxidase (im weiteren XOD genannt) oxidiert wird, wodurch Xanthin gebildet wird, welches weiter zu Harnsäure oxidiert wird, wobei Wasserstoffperoxid (H&sub2;O2), welches während des Oxidationsschrittes durch die Einwirkung der XOD produziert wird, für die Farbentwicklung, ausgehend von einem Farbbildner (Farbstoffvorstufe oder chromogenem Substrat) unter Verwendung einer Peroxidase (im weiteren POD genannt) verwendet wird, und bei der dann die Farbintensität der auf diese Weise gebildeten Farbe kolorimetrisch analysiert wird. Das Prinzip dieser Methode ist in Fig. 2 gezeigt. Da diese Methode eine direkte Methode ist, bei der Deproteinierung nicht erforderlich ist, und da sie ein enzymatisches Verfahren darstellt, bei dem keine starke Säure verwendet wird, gibt es hier kein Problem in Bezug auf flüssigen Abfall, welches sonst bei der konventionellen Phosphomolybdat-Reduktionsmethode entsteht. Diese Methode ist besonders gut handhabbar für automatisierte Analysesysteme, da sie frei von Korrosionsmitteln ist und die Adsorption von gebildetem Farbstoffpigment nicht stattfindet.
Die oben beschriebene PNP-XOD-POD-Methode kann für ein Trockenanalyseelement verwendet werden. Das Trockenanalyseelement ist ein Analyseelement, das eine oder eine Mehrzahl von funktionellen Schichten umfaßt, von denen mindestens eine Schicht (oder mehrere Schichten) ein analytisches Reagens enthält, um einen Farbstoff in der Schicht durch die stattfindende Reaktion zu bilden und der auf diese Weise gebildete Farbstoff wird kolorimetrisch analysiert, indem man das Durchlicht oder das reflektierende Licht an der Außenseite des Analyseelements mißt. Da ein solches Trockenanalyseelement in trockenem Zustand vor der Durchführung der Analyse gelagert und vor dem Verderb bewahrt wird, besteht keine Notwendigkeit zur Herstellung des Reagens bei dem Meßschritt. Darüber hinaus wird das Verfahren bei Verwendung eines solchen Trockenanalyseelements vereinfacht und beschleunigt, verglichen mit dem konventionellen Naßprozeß, da das Reagens in trockenem Zustand eine höhere Stabilität aufweist.
Im Verlauf ihrer Untersuchungen zur Verwirklichung des Anwendens der oben erwähnten PNP-XOD-POD-Methode in einem Trockenanalyseelement fanden die Erfinder jedoch, daß Probleme bei der Lagerstabilität und dem Meßbereich auftreten.

Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung:

Nach großen Anstrengungen bei der Lösung der Probleme, wurde die vorliegende Erfindung erreicht, basierend auf dem Ergebnis, daß die Lagerstabilität bemerkenswert verbessert und der Meßbereich signifikant ausgedehnt werden kann, durch die Verwendung von Xanthosin an Stelle des konventionell verwendeten Inosins als Substrat für PNP.
Entsprechend ist es eine erste Aufgabe der Erfindung, ein Reagens bereitzustellen für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, welches gut geeignet ist für die Herstellung eines Trockenanalyseelements, welches eine verbesserte Lagerstabilität und einen weiten Meßbereich aufweist. Die erste Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch die Bereitstellung eines Reagens zur quantitativen Analyse von anorganischem Phosphor, umfassend Xanthosin, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase, Peroxidase und einen Farbbildner.
Eine zweite Aufgabe der Erfindung ist es, ein Trockenanalyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor bereitzustellen, welches in Bezug auf Lagerstabilität verbessert ist und einen breiten Meßbereich aufweist. Die zweite Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch die Bereitstellung eines Trockenanalyseelements für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, umfassend eine Reagensschicht, welche Xanthosin, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase, Peroxidase und einen Farbbildner enthält.

Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen:

Die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung werden an dieser Stelle bezüglich der beigefügten Zeichnung beschrieben, bei denen:
Fig. 1 als Diagramm das Prinzip der Reaktion des in der vorliegenden Erfindung für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor verwendeten Reagens zeigt;
Fig. 2 als Diagramm das Reaktionsprinzip des konventionellen Reagens, welches in einem Verfahren aus dem Stand der Technik unter Zuhilfenahme einer enzymatischen Reaktion verwendet wird, zeigt; und
Fig. 3 in einer graphischen Darstellung Eichkurven, die als Resultate von Bestimmungen in einem Beispiel der Erfindung beziehungsweise einem Vergleichsbeispiel entsprechend der konventionellen Technik erhalten wurden, zeigt.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungen:

Das Reaktionsprinzip des Reagens zur quantitativen Analyse entsprechend der Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt. Wie gezeigt, wird anorganischer Phosphor oder anorganisches Phosphat (Pi) in Gegenwart von Purinnucleosidphosphorylase (PNP) mit Xanthosin umgesetzt, um Xanthin zu erhalten. Xanthin wird durch die Xanthinoxidase (XOD) oxidiert, wodurch Harnsäure erhalten wird. Während dieser letzteren XOD-Reaktion wird ebenso Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;) produziert. Das so hergestellte Wasserstoffperoxid reagiert mit und oxidiert einen Farbbildner (Farbstoffvorstufe oder chromogenes Substrat) mit Hilfe der Peroxidase (POD), wodurch ein gebildeter Farbstoff erhalten wird. Die gebildete Farbe wird kolorimetrisch bestimmt.
Elementarer Phosphor im eigentlichen Sinne existiert im Körper nicht in erwähnenswertem Umfang, und daher waren frühere Methoden zur Analyse von anorganischem Phosphor auf den Nachweis der zwei Phosphatanionen gerichtet, welche abhängig vom pH-Wert schnell ineinander übergehen. Die monovalenten und divalenten Anionformen liegen im Serum bei Vorliegen einer Acidose in etwa gleicher Konzentration vor, bei Vorliegen einer Alkalose in einem Verhältnis von 1 : 9, bei pH 7,4 in einem Verhältnis von 1 : 4 und in Urin eines pH-Wertes 4,5 in einem Verhältnis von 100 : 1, was es unmöglich macht, mit irgendeiner Gewißheit vorherzusagen, was das Molekulargewicht von anorganischem "Phosphat" ist. Daher waren die üblicherweise gewählten Einheiten Milligramm oder Millimol Phosphor·(in einem Volumen), aber nie Milliäquivalente Phosphat, da diese sich abhängig von der Ladung schnell ändern würden. Entsprechend umfaßt der anorganische Phosphor, welcher mit dem Reagens der vorliegenden Erfindung analysiert werden kann, monovalente Phosphatanionen (H&sub2;PO&sub4;&supmin;), divalente Phosphatanionen (HPO&sub4;²&supmin;) und Salze davon.
Das der vorliegenden Erfindung entsprechende Reagens und das Trockenanalyseelement, umfassend das Reagens, können nicht nur für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor in Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma und Urin verwendet werden, sondern können ebenso für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor eingesetzt werden, der in verschiedenen Abwässern (Haushaltsabwässern, Fabrikabwässern und Abwässern von Krankenhäusern oder Forschungseinrichtungen) enthalten ist. Das der vorliegenden Erfindung entsprechende Reagens und das Trockenanalyseelement, umfassend dieses Reagens, können für die quantitative Analyse von anorga nischem Phosphor in Abwässern und zur Untersuchung des Grades der Verschmutzung derselben, zur quantitativen Analyse von anorganischem Phosphor in natürlichem Wasser, um zu bestimmen, ob dieses als Trinkwasser geeignet ist, oder zur quantitativen Analyse von anorganischem Phosphor als Zeichen für Überdüngung in einer Wasserprobe, die aus einem See oder Fluß entnommen wurde, verwendet werden. Das erfindungsgemäße Reagens und das Trockenanalyseelement, umfassend das Reagens, können ebenso für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, enthalten in einem Tropfen Flüssigkeit aus einem frischen Fisch, um die Frische des Fischs zu untersuchen, verwendet werden.
Für die Erfindung können kommerziell erhältliche Purinnucleosidphosphorylase (PNP, EC 2.4.2.1)1 kommerziell erhältliche Xanthinoxidase (XOD, EC 1.2.3.2) und Peroxidase (POD, EC 1.11.1.7) verwendet werden. Der in der Erfindung verwendete Farbbildner kann entweder ein solcher sein, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase (POD) bildet. Beispiele hierfür sind Zusammensetzungen, die durch die Oxidation eines Leukofarbstoffes, wie beispielsweise Triarylimidazol-Leukofarbstoff, offenbart in US Patent No. 4,089,747 und Diarylimidazol-Leukofarbstoff, offenbart in EP 0 122 641A, oder eine Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die einen Farbstoff bildet unter Kupplung mit einer anderen Verbindung bei gleichzeitiger Oxidation (beispielsweise eine Zusammensetzung umfassend 4-Aminoantipyrine und entweder ein Phenol oder ein Naphtol).
Das Reagens der vorliegenden Erfindung kann, wenn erwünscht, einen anderen Bestandteil wie beispielsweise eine Pufferzusammensetzung enthalten. Der geeignete pH-Bereich des Reagens ist vorzugsweise von 6,0 bis 8,0, besonders bevorzugt von 7,0 bis 7,5. Falls das Reagens für die Herstellung eines Trockenanalyseelements verwendet wird, ist es wünschenswert, einen oberflächenaktiven Stoff zu verwenden.
Das erfindungsgemäße Trockenanalyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor kann eine Schichtenstruktur entsprechend verschiedener bekannter Trockenanalyseelemente besitzen. Eine zusätzliche Schicht kann eingefügt werden, um ein Trockenanalyseelement herzustellen, das eine Schichtenstruktur ähnlich zu der eine Vielzahl von bekannten Trockenanalyseelementen aufweist. Im Detail kann das erfindungsgemäße Analyseelement zusätzlich zu der Schicht, die das erfindungsgemäße Reagens enthält, eine Mehrschichtstruktur, umfassend einen Träger, eine Ausbreitungsschicht, eine Nachweisschicht, eine Lichtschutzschicht, eine Klebeschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine Grundbeschichtungsschicht oder andere erwünschte Schichten haben. Die Herstellung einer Mehrschichtstruktur wurde beispielsweise in US Patent No. 3,992,158; US Patent No. 4,042,335; US Patent No.4,292,272 und EP-0166365A offenbart.
Falls ein lichtdurchlässiger und wasserundurchlässiger Träger verwendet wird, kann ein Trockenanalyseelement mit der folgenden Konstruktion verwendet werden, obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Konstruktionen begrenzt ist.
(1) ein Träger und eine Reagensschicht in dieser Reihenfolge übereinandergelegt;
(2) ein Träger, eine Nachweisschicht und eine Reagensschicht in dieser Reihenfolge übereinandergelegt;
(3) ein Träger, eine Nachweisschicht, eine lichtreflektierende Schicht und eine Reagensschicht in dieser Reihenfolge übereinandergelegt;
(4) ein Träger, eine zweite Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht und eine erste Reagensschicht in dieser Reihenfolge übereinandergelegt;
(5) ein Träger, eine Nachweisschicht, eine zweite Reagensschicht, eine lichtreflektierende Schicht und eine erste Reagensschicht in dieser Reihenfolge übereinandergelegt.
In jeder der Strukturen (1) bis (3), wie oben beschrieben, kann die Reagensschicht aus einer Vielzahl von Schichten zusammengesetzt sein. Beispielsweise kann die Reagensschicht eine erste Reagensschicht umfassen, die die Substanzen Xanthosin und PNP, die für die in Fig. 1 gezeigte PNP-Reaktion benötigt werden, enthält; eine zweite Reagensschicht umfassen, die das Enzym XOD, welches für die in Fig. 1 gezeigte XOD-Reaktion benötigt wird, enthält; und eine dritte Reagensschicht umfassen, die POD und einen Farbbildner (Farbstoffvorstufe), die für die in Fig. 1 gezeigte POD-Reaktion benötigt werden, enthält. In einem anderen Fall kann die Reagensschicht zwei Schichten umfassen, die eine erste Reagensschicht, in der die PNP-Reaktion stattfindet, und eine zweite Reagensschicht, in der die XOD- und POD-Reaktionen stattfinden, beinhalten. In einer weiteren modifizierten Ausführung, umfaßt die Reagensschicht eine erste Reagensschicht, in der die PNP- und XOD-Reaktionen stattfinden, und eine zweite Reagensschicht, in der die POD-Reaktion stattfindet.
Eine wasserabsorbierende Schicht kann zwischen den Träger und die Reagensschicht (oder die Nachweisschicht) eingebracht werden. Zwischen benachbarte Schichten können Filtrationsschichten eingebracht werden. Auf der Reagensschicht kann eine Ausbreitungsschicht aufgetragen werden und zwischen die Ausbreitungsschicht und die Reagensschicht kann eine Klebeschicht eingebracht werden.
Details der entsprechenden Schichten, welche die Vielschichtenstrukturen bilden, werden nun beschrieben.

Träger:

Der Träger kann lichtundurchlässig (opak), lichthalbdurchlässig (translucent) oder lichtdurchlässig (transparent) sein, und es ist im allgemeinen bevorzugt, daß der Träger lichtdurchlässig und wasserundurchlässig ist. Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen und wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat und Polystyrol. Im allgemeinen wird eine Grundbeschichtung angewandt oder der Träger wird einer Hydrophilisierungsbehandlung unterzogen, um die hydrophile Schicht fest anzuheften.

Reagensschicht:

Die Reagensschicht enthält das erfindungsgemäße Reagens für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor. Um sicherzustellen, daß die Reagensschicht wasserdurchlässig ist, ist es bevorzugt, daß diese Schicht eine poröse Schicht ist, die aus einem porösen Medium oder aus einem hydrophilen Polymerbinder zusammengesetzt ist. Es wird bevorzugt, daß eine solche wasserdurchlässige Schicht eine kontinuierliche Schicht aus hydrophilem Polymerbinder ist. Der spezifische hydrophile Polymerbinder, der verwendet wird, um die wasserdurchlässige Schicht zu bilden, kann unter Berücksichtigung des Produkts (Farbstoff oder Pigment), welches in der Reagensschicht hergestellt wird, und des Reagens, welches in der Reagensschicht enthalten ist, ausgewählt werden.
Falls eine poröse Schicht als Reagensschicht verwendet wird, kann die poröse Schicht faserig oder nicht-faserig sein. Als faseriges Material, kann Filterpapier, nicht gewebter Stoff, gewebter Stoff (z. B. einfach gewobener Stoff), gewirkter Stoff (z. B. Tricotagen) oder aus Glasfasern hergestelltes Filterpapier verwendet werden. Beispiele für nichtfaseriges Material können entweder Membranfilter, die aus Celluloseacetat zusammengesetzt sind, wie in US Patent No. 3,992,158 beschrieben ist, oder eine Schicht einer besonderen Struktur, die miteinander verbundene Poren enthält und aus anorganischen oder organischen feinen Teilchen zusammengesetzt ist, wie in US Patent No. 3,992,158, US Patent No. 4,258,001 und US Patent No. 4,486,537 offenbart ist, sein. Eine Laminatstruktur, hergestellt aus zum Teil verbundenen mehreren porösen Schichten kann auch bevorzugt verwendet werden, wobei Beispiele für solche Strukturen in US Patent No. 5,019,347, EP 0166365A und EP 0226465A offenbart sind.
Die poröse Schicht kann eine Ausbreitungsschicht sein, die eine sogenannte Ausbringungsfunktion besitzt, um die Flüssigkeit über eine Fläche zu verteilen, die im wesentlichen proportional zu dem Volumen der aufgebrachten Flüssigkeit ist. Bevorzugte Materialien für die Ausbreitungsschicht sind gewebte und gewirkte Stoffe. Gewebte Stoffe oder ähnliches können einer Glimmentladungsbehandlung, wie in US Patent No. 4,783,315 und GB 2,087,974A beschrieben, unterzogen werden. Um die Fläche oder die Geschwindigkeit der Ausbreitung einzustellen, kann die Ausbreitungsschicht ein hydrophiles Polymer oder eine grenzflächenaktive Substanz, wie in EP 0162301A, US Patent No. 4,889,797, US Patent No. 4,916,059 und EP 0207406A beschrieben, enthalten.
Es ist mittlerweile ein gut geeignetes Verfahren, ein erfindungsgemäßes Trockenanalyseelement herzustellen, indem man zuerst das erfindungsgemäße Reagens in oder auf eine poröse Membranschicht oder dergleichen aus Papier, Stoff oder hochpolymerem Material imprägniert oder beschichtet, um eine Reagensschicht herzustellen, die man dann an eine andere wasserdurchlässige Schicht, beispielsweise eine Nachweisschicht, anhaften läßt, welche auf einem Träger bereitgestellt wird, vermittels eines Schrittes wie er in dem US Patent No. 4,292,272 offenbart ist.
Obwohl die Stärke der Reagensschicht, hergestellt durch irgendeine der vorstehend erwähnten Methoden, nicht begrenzt ist, kann die Stärke zwischen 1 um bis 50 um betragen und vorzugsweise von 2 um bis 30 um, wenn die Schicht als Beschichtungsschicht bereitgestellt wird. Falls sie durch eine andere Methode bereitgestelt wird, beispielsweise durch Auf = bauen eines Laminats, kann dessen Stärke in einem weiten Bereich von einigen zehn um bis einigen hundert um variiert werden.
Falls die Reagensschicht aus einer wasserdurchlässigen Schicht, aus einem hydrophilen Polymerbinder, aufgebaut ist, kann der verwendbare hydrophile Binder Gelatine und deren Derivate (z. B. phthalatierte Gelatine), Derivate von Cellulose (z. B. Hydroxyethyl-Cellulose), Agarose, Natriumalginat, Acrylamidcopolymere, Methacrylamidcopolymere, Copolymere von Acrylamiden oder Methacrylamiden mit verschiedenen Vinylmonomeren, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Natriumpolyacrylat und Copolymere von Acrylsäure mit verschiedenen Vinylmonomeren sein.
Die aus einem hydrophilen Polymerbinder zusammengesetzte Reagensschicht kann durch Beschichten einer anderen Schicht, wie beispielsweise eine Träger- oder Nachweisschicht, mit einer wäßrigen Lösung oder Dispersion des Reagens der vorliegenden Erfindung und einem hydrophilen Polymerbinder bereitgestellt werden, wonach die aufgetragene Lösung oder Dispersion getrocknet wird, wie in den Beschreibungen von US Patent No. 3,992,158, US Patent No. 4,292,272, US Patent No. 4,132,528 und Chemical Abstracts, 106, 210567y beschrieben ist. Die Stärke der getrockneten Substratschicht, die ein hydrophiles Polymer als einen Binder enthält, kann von ungefähr 2 um bis ungefähr 50 um reichen, und vorzugsweise von ungefähr 4 um bis ungefähr 30 um und der deckende Be lag derselben kann von ungefähr 2 g/m² bis ungefähr 50 g/m², und vorzugsweise von ungefähr 4 g/m² bis ungefähr 30 g/m² reichen.
Zur Verbesserung der Eigenschaften wie Beschichtungseigenschaften, Diffusionsfähigkeit von diffundierbarem Material. der Reaktivität und der Lagerstabilität kann die Reagensschicht zusätzlich zu dem Reagens der vorliegenden Erfindung verschiedene organische oder anorganische Zusatzstoffe enthalten, beispielsweise Enzymaktivatoren, Coenzyme, grenzflächenaktive Substanzen, pH-Puffer-Reagenzien, feine Teilchen, Antioxidanzien usw. Beispiele für Puffersysteme, die in der Reagensschicht enthalten sein können, beinhalten solche pH- Puffer-Reagenzien wie in "KAGAKU BINRAN, KISOHEN", herausgegeben von der Japanese Chemical Society (MARUZEN, Tokyo, 1966), S. 1312-1320; R. M. C. Dawson et al., "Data for Biochemical Research", zweite Ausgabe (Oxford at the Clarendon Press, 1969), S. 476-508; "Biochemistry", 5, S. 467-477 (1966); und "Analytical Biochemistry", 104, S. 300-310 (1980) beschtieben. Spezifische Beispiele für verwendbare Puffer sind Pufferreagenzien, die Borate enthalten, Pufferreagenzien, die Zitronensäure oder Citrate enthalten, Pufferreagenzien, die Glycin enthalten, Pufferlösungen, die Bicin enthalten, Pufferreagenzien, die HEPES enthalten (2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure), und Pufferreagenzien, die Good-Puffermittel enthalten wie MES (2-Morpholinoethansulfonsäure). Puffer, die Phosphat enthalten, können bei dem der vorliegenden Erfindung entsprechenden Reagens für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor nicht verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Trockenanalyseelement kann durch jedes der bekannten Verfahren, wie sie in den Beschreibungen der vorher zitierten Patente beschrieben sind, hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Analyseelement kann in ein quadratförmiges Stück geschnitten sein, welches jeweils Seiten in einem Bereich zwischen 10 bis 30 mm aufweist, oder in eine Scheibe, die im wesentlichen die gleiche Fläche besitzt. Es wird hinsichtlich der Herstellung, dem Verpacken, dem Versenden, der Lagerung und der Meßprozedur bevorzugt, daß das Element in einem Gleitrahmen, wie beispielsweise in JP No. 28331/1982 (entsprechend US Patent No. 4,169,751), US Patent No. 4,387,990 und WO 83/00391 zur Verwendung als ein Gleitelement für die chemische Analyse enthalten ist. Für eine bequeme Handhabung bei einigen Anwendungen kann es in Form eines langen Bandes vorliegen, welches in einer Kassette oder einem Magazin enthalten ist, oder es kann ein kleines Stück davon auf einer Karte appliziert sein oder in einer Karte mit einer Öffnung enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Analyseelement kann für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, der in einer Probeflüssigkeit enthalten ist, indem man es entsprechend der Handhabungen, die in den Beschreibungen der vorher zitierten Patente beschrieben sind, verwendet werden. Beispielsweise werden etwa 2 ul bis etwa 30 ul, vorzugsweise 4 ul bis 15 ul einer wäßrigen Probeflüssigkeit wie Serum, Plasma oder Urin auf die Reagensschicht aufgetropft oder in anderer Weise aufgetragen. Das Analyseelement mit der aufgetropften Probeflüssigkeit wird dann bei einer konstanten Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 45ºC, bevorzugt bei einer konstanten Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 40ºC, 1 bis 10 Minuten inkubiert. Die optische Dichte der Reflektion der Farbe oder der Farbwechsel in dem Element kann ausgehend von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers gemessen werden, und die Menge des in der Probe enthaltenen anorganischen Phosphors kann unter Verwendung einer vorher hergestellten Eichkurve, die auf dem Prinzip der Kolorimetrie basiert, bestimmt werden. Das Volumen der aufgetragenen Probeflüssigkeit und die Zeit und Temperatur für die Inkubation werden konstant gehalten, um die Genauigkeit der quantitativen Analyse zu verbessern.
Die Messung kann ausgeführt werden unter Verwendung eines chemischen Analyseapparates wie in US Patent No. 4,424,191 beschrieben ist, um eine quantitative Analyse mit. hoher Genauigkeit bei extrem einfacher Handhabung zu verwirklichen. Mittlerweile kann eine halb-quantitative Analyse durchgeführt werden, indem man den Grad der Farbbildung mit dem Auge abschätzt, falls eine solche visuelle Abschätzung für die erforderliche Genauigkeit adäquat ist.

Beispiele:

Im Nachfolgenden werden spezifische Beispiele beschrieben, um die Erfindung klarer verständlich zu machen.

Beispiel 1:

Auf einer glatten Folie aus farblosem und transparentem Polyethylenterephthalat (PET) mit einer Gelatine-Unterbeschichtung und einer Stärke von 180 um, wurde mit einer wäßrigen Lösung der Zusammensetzung (a), gezeigt in der folgenden Tabelle 1, beschichtet, worauf diese getrocknet wurde, um eine Reagensschicht zu bilden, bei der die entsprechenden Komponenten die Belagstärke, wie in Tabelle 1 gezeigt, aufwiesen.

Tabelle 1: Zusammensetzung (a) der wäßrigen Reagenslösung

Gelatine 18,8 g/m
p-Nonylphenoxypolyxydol (enthaltend 10 (durchschnittlich) Glycidoleinheiten; C&sub9;H&sub1;&sub9;-C&sub6;H&sub4;-O-(CH&sub2;CH(OH)-CH&sub2;-O)&sub1;&sub0;H) 1,5 g/m²
Xanthosin 1,96 g/m²
Peroxidase 15000 IU/m²
Xanthinoxidase 13600 IU/m²
Purinnucleosidphosphorylase 3400 IU/m²
Leukofarbstoff (2-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4- phenethyl-5-(4-dimethylaminophenyl) imidazol) 0,28 g/m²
Wasser (eingestellt auf einen pH-Wert von 6,8 durch Zusatz verdünnter NaOH&supmin; Lösung) 136 g/m²
Eine Klebeschicht wurde durch Beschichten einer wäßrigen Lösung mit der Zusammensetzung (b), wie in der folgenden Tabelle 2 gezeigt, gebildet, mit nachfolgendem Trocknen, so daß die entsprechenden Komponenten die Belagstärke, wie in Tabelle 2 gezeigt, aufwiesen.

Tabelle 2: Zusammensetzung (b) der wäßrigen Klebelösung

Gelatine 3,1 g/m²
p-Nonylphenoxypolyxydol (enthaltend 10 (durchschnittlich) Glycidoleinheiten; C&sub9;H&sub1;&sub9;-C&sub6;H&sub4;-O-(CH&sub2;CH (OH)-CH&sub2;-O)&sub1;&sub0;H) 0,25 g/m²
Wasser 59 g/m²
Danach wurde eine poröse Ausbreitungsschicht hergestellt, indem Wasser über die gesamte Oberfläche der Klebeschicht mit einer Ausbreitungsrate von 30 g/m² aufgetragen wurde, um die Gelatineschicht zu quellen, gefolgt von dem Aufkleben eines breiten Stoffes aus reinem Polyester durch gleichmäßiges, leichtes Andrücken des Stoffes auf die Klebeschicht.
Schlußendlich wurde eine wäßrige Lösung der Zusammensetzung (c), wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt, über die Auftragsschicht geschichtet, so daß die entsprechenden Komponenten die Belagstärken, wie in Tabelle 3 gezeigt, besaßen, gefolgt von Trocknen, um ein integrales Mehrschicht-Analyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, entsprechend der Ausführung der Erfindung, herzustellen.

Tabelle 3: Zusammensetzung (c) der wäßrigen Lösung für das Beschichten über der Ausbreitungsschicht

HEPES 2,1 g/m
Hydroxypropylmethylcellulose (enthaltend 19% bis 24% Methoxy- Gruppen und 4% bis 12% Hydroxypropoxy- Gruppen, wobei die Viskosität einer 2%igen wäßrigen Lösung davon etwa 80 bis 120 cps bei 20ºC beträgt) 0,9 g/m²
Oberflächenaktives Mittel (Polyoxyethylenoctylphenylether; (C&sub8;H&sub1;&sub7;-C&sub6;H&sub4;-(O-CH&sub2;-CH&sub2;-)&sub4;&sub0;OH) 2,7 g/m²
Titandioxid (Rutil-Typ) 4,2 g/m²
Wasser (eingestellt auf pH-Wert 7,5 durch Verwendung einer verdünnten NaOH&supmin; Lösung) 90,0 g/m²

Vergleichsbeispiel:

Als ein Vergleichsbeispiel zum Vergleich mit einem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ein Vergleichs- oder Kontrollanalyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor ähnlich der vorstehenden Ausführung hergestellt, außer daß eine Zusammensetzung (a'), wie sie in der folgenden Tabelle 4 dargestellt ist, an Stelle der wäßrigen Lösung mit der Zusammensetzung (a) für die Ausbildung der Reagensschicht der Erfindung verwendet wurde.

Tabelle 4: Zusammensetzung (a') der wäßrigen Lösung zur Herstellung einer Reagensschicht für das Vergleichsbeispiel

Gelatine 18,8 g/m
p-Nonylphenoxypolyxydol (enthaltend 10 (durchschnittlich) Einheiten Glycidol; C&sub9;H&sub1;&sub9;-C&sub6;H&sub4;-O-(CH&sub2;CH(OH)-CH&sub2;-O)&sub1;&sub0;H) 1,5 g/ml
Inosin 1,85 g/m²
Peroxidase 15000 IU/m²
Xanthinoxidase 13600 IU/m²
Purinnucleosidphosphorylase 3400 IU/m²
Leukofarbstoff (2-(3, 5-Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4- phenethyl-5-(4-dimethylaminophenyl) imidazol) 0,28 g/m²
Wasser (eingestellt auf pH-Wert 6,8 durch Verwendung einer verdünnten NaOH&supmin; Lösung) 136 g/m²

Meßbeispiel 1:

Die entsprechenden Analyseelemente wurden einem beschleunigten Lagerstabilitätstest unterzogen, um die Lagerstabilitäten der Analyseelemente, die übereinstimmend mit dem erfindungsgemäßen Beispiel und dem Vergleichsbeispiel hergestellt wurden, in Erfahrung zu bringen. Genauer gesagt wurde jedes Analyseelement direkt nach seiner Herstellung für 0, 1, 4 und 7 Tage in einem Inkubator bei einer Temperatur von 45ºC aufbewahrt.
Ausgehend von einer humanen Blutserumprobe, deren Titer mit dem "Phosphor B-Test Wako" (hergestellt von der Wako Pure Chemicals Co., Ltd.), welcher ein kommerziell erhältlicher Kit für die Bestimmung von anorganischem Phosphor entsprechend der Phosphomolybdat-Reduktionsmethode ist, bestimmt, wurden Serumtestproben mit einer Konzentration von jeweils 2,5; 5,0; 10,0 und 20,0 mg/dl hergestellt. Die Konzentration an anorganischem Phosphor bedeutet hier die Konzentration an Phosphor, gleichbedeutend mit der Konzentration von P (elementarem Phosphor). 10 ul einer jeden Testprobe wurden auf jedes der Analyseelemente aufgetropft. Jedes der Analyseelemente mit so aufgetropften Serumproben wurde bei 37ºC für 6 Minuten inkubiert und es wurde dann die optische Dichte des reflektierten Lichts einer Wellenlänge von 650 nm von der Trägerseite her gemessen. Die Testresultate wurden dann mit einer Eichkurve verglichen, die hergestellt wurde, indem die reflektierten optischen Dichten, welche durch Vermessen der inkubierten Kontrollserumproben erhalten wurden, aufgetragen wurden, um die scheinbaren Konzentrationen an anorganischem Phosphor, wie sie durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Analyseelements und des Analyseelements des Vergleichsbeispiels bestimmt wurden, zu erhalten. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5:
Wie aus Tabelle 5 entnommen werden kann, waren die Ergebnisse, die mit dem Analyseelement des Vergleichsbeispiels erzielt wurden, mit großen Fehlern behaftet, wobei diese Fehler mit der Konzentration der Proben zunahmen. Im Gegensatz dazu waren die Fehler der Resultate, die durch Verwendung des erfindungsgemäßen Analyseelements erhalten wurden, wesentlich kleiner, selbst wenn das Analyseelement, nachdem es bei 45ºC 7 Tage gelagert wurde, verwendet wurde. Das Ergebnis zeigt, daß das erfindungsgemäße Analyseelement in Bezug auf seine Lagerstabilität, verglichen zu dem Analyseelement des Vergleichsbeispiels, verbessert ist.

Meßbeispiel 2:

Die folgenden Tests wurden durchgeführt, um Nachweisbereiche der Analyseelemente, die in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Beispiel beziehungsweise dem Vergleichsbeispiel hergestellt wurden, zu bestimmen.
Ausgehend von humanem Blutserum, dessen Titer unter Verwendung des "Phosphor B-Test Wako" (hergestellt von der Wako Pure Chemicals Co., Ltd.), welcher ein kommerziell erhältlicher Kit zur Bestimmung von anorganischem Phosphor nach der Phosphomolybdänsäure-Reduktionsmethode war, wurden Serumtestproben, die jeweils eine Konzentration von 2,5; 5; 0; 10,0 und 20,0 mg/dl (umgerechnet in Konzentration an elementarem Phosphor) hergestellt. 10 ul einer jeden dieser Testproben wurden auf jedes der Analyseelemente aufgetropft. Jedes der Analyseelemente mit so aufgetropften Serumproben wurde bei 37ºC 6 Minuten inkubiert, und dann wurde die optische Dichte des reflektierten Lichts (ODR) einer Wellenlänge von 650 nm von der Rückseite des Trägers her gemessen. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6:
Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse wurden aufgetragen, wodurch eine Eichkurve erhalten wurde, die in der graphischen Darstellung in Fig. 3 gezeigt ist. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, ist die Genauigkeit der quantitativen Analyse von anorganischem Phosphor bei hohen Konzentrationen bei dem Vergleichsbeispiel schlechter, da die optische Dichte des reflektierten Lichts pro Konzentrationseinheit anorganischen Phosphors in dem Bereich oberhalb von 10 mg/dl kleiner wird.
Im Gegensatz dazu ist die optische Dichte des reflektierten Lichts pro Konzentrationseinheit anorganischen Phosphors bei dem erfindungsgemäßen Beispiel weiterhin auf hohem Niveau auch im Bereich oberhalb von 10 mg/dl, wodurch ein genaues Resultat auch innerhalb eines höheren Konzentrationsbereiches erhalten wird. Es kann daher davon ausgegangen werden, daß das erfindungsgemäße Trockenanalyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor in einem breiteren Bestimmungsbereich eingesetzt werden kann, verglichen mit einem Trockenanalyseelement, bei dem ein konventionelles Reagens für eine quantitative Analyse im Naßverfahren herangezogen wird, um dieses herzustellen.
Wie vorstehend beschrieben wurde, wird bei dem Reagens, welches durch die Erfindung bereitgestellt wird, Xanthosin als Substrat für die Purinnucleosidphosphorylase verwendet. Es ist ein vorteilhaftes Ergebnis dieser Tatsache, daß wenn das erfindungsgemäße Reagens für die Herstellung eines Trockenanalyseelements verwendet wird, die Lagerstabilität verbessert wird und der Bestimmungsbereich in bemerkenswerter Weise verbreitert wird.

Claims

1. Reagens für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, umfassend Xanthosin, Purinnucleosidphosphorylase (PNP), Xanthinoxidase (XOD), Peroxidase (POD) und einen Farbbildner.

2. Reagens nach Anspruch 1, wobei der Farbbildner ein Farbstoffvorläufer ist, welcher in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase einen Farbstoff bildet.

3. Reagens nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen Puffer, um die wäßrige Lösung des Reagens in einem pH-Bereich von 6,0 bis 8,0 zu halten.

4. Trockenanalyseelement für die quantitative Analyse von anorganischem Phosphor, umfassend eine Reagensschicht, welche Xanthosin, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase, Peroxidase und einen Farbbildner enthält.

5. Trockenanalyseelement nach Anspruch 4, wobei das Element eine Multischichtstruktur besitzt, umfassend zusätzlich zu der Reagensschicht eine oder mehrere Schichten, ausgewählt aus einem Träger, einer Auftragsschicht, einer Nachweisschicht, einer Lichtschutzschicht, einer Klebeschicht, einer Wasser-absorbierenden Schicht und einer Grundbeschichtüngsschicht.

6. Trockenanalyseelement nach Anspruch 4, wobei die Reagensschicht in eine Vielzahl von Schichten geteilt ist, einschließlich einer ersten Reagensschicht enthaltend das Xanthosin und die Purinnucleosidphosphorylase, einer zweiten Reagensschicht enthaltend die Xanthinoxidase und einer dritten Reagensschicht enthaltend die Peroxidase und den Farbbildner.

7. Trockenanalyselement nach Anspruch 4, wobei die Reagensschicht in zwei Schichten geteilt ist, einschließlich einer ersten Reagensschicht, in der die PNP-Reaktion stattfindet, und einer zweiten Reagensschicht, in der die XOD- und POD-Reaktionen stattfinden.

8. Trockenanalyseelemente nach Anspruch 4, wobei die Reagensschicht in zwei Schichten geteilt ist, einschließlich einer ersten Reagensschicht, in der die PNP- und XOD-Reaktionen stattfinden, und einer zweiten Reagensschicht, in der die POD-Reaktion stattfindet.

9. Trockenanalyseelement nach Anspruch 4, wobei diese Reagensschicht eine wasserlösliche Schicht umfaßt, die das Reagens enthält, und wobei das Material für diese wasserlösliche Schicht ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus porösen Materialien und hydrophilen Polymer-Bindern.