JPS62142272A - アンモニアまたはａｔｐの定量法 - Google Patents
アンモニアまたはａｔｐの定量法Info
- Publication number
- JPS62142272A JPS62142272A JP28516085A JP28516085A JPS62142272A JP S62142272 A JPS62142272 A JP S62142272A JP 28516085 A JP28516085 A JP 28516085A JP 28516085 A JP28516085 A JP 28516085A JP S62142272 A JPS62142272 A JP S62142272A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- atp
- ammonia
- purine
- purine nucleoside
- quantitative determination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は酵素法によるアンモニアまたはＡＴＰの定量法
に関するものである。
に関するものである。
従来、アンモニアの定量法としては、インドフェノール
法という化学的測定法が主に用いられている。また、酵
素的測定法としては、グルタミン酸脱水素酵素を用いる
方法（例えば特公昭５７−２１９９５号参照）が知られ
ている。
法という化学的測定法が主に用いられている。また、酵
素的測定法としては、グルタミン酸脱水素酵素を用いる
方法（例えば特公昭５７−２１９９５号参照）が知られ
ている。
この方法では、用いられるグルタミン酸脱水素酵素のア
ンモニ“ｒに対するＫｍ値が大きいため、測定に多量の
グルタミン酸脱水素酵素を必要とする問題を有している
。さらに池の酵素的測定法としてはカルバメートキナー
ゼを用いる方法（特開昭５９−２１３３９９号参照）、
また（ｊカルバモイルリン酸分成りγ素を用いる方法（
特開昭６０−４７６９８号参照）が知られている。
ンモニ“ｒに対するＫｍ値が大きいため、測定に多量の
グルタミン酸脱水素酵素を必要とする問題を有している
。さらに池の酵素的測定法としてはカルバメートキナー
ゼを用いる方法（特開昭５９−２１３３９９号参照）、
また（ｊカルバモイルリン酸分成りγ素を用いる方法（
特開昭６０−４７６９８号参照）が知られている。
前者の方法では用いられるカルバメートキナーゼが一般
的に不安定で、透析などの処理により失活すると報告さ
れている。それ故、還元型グルタチオン、２−メルカプ
トエタノールなどのＳＨ基保護剤の存在下で酵素を精製
あるいは保存する必要がある。ところが、これらのＳＨ
基保獲剤を含むカルバメートキナーゼ標品を用いて、被
検液中のアンモニアを酸化醇素−ペルオキシダーゼー水
素供与体色源体反応系を含む系で定量する場合、ＳＨ基
保護剤の存在はペルオキシダーゼ水素供与体の発色系を
阻害するので、正確な測定値が得られず負の誤差を与え
ることになる。さらに、カルバメートキナーゼは平衡が
アンモニア生成の方向へ傾いているため、アンモニア濃
度が低い場合アンモニアを消費する反応はほとんど進ま
ず、生体試料中の微１のアンモニアの定量には不適当で
ある。
的に不安定で、透析などの処理により失活すると報告さ
れている。それ故、還元型グルタチオン、２−メルカプ
トエタノールなどのＳＨ基保護剤の存在下で酵素を精製
あるいは保存する必要がある。ところが、これらのＳＨ
基保獲剤を含むカルバメートキナーゼ標品を用いて、被
検液中のアンモニアを酸化醇素−ペルオキシダーゼー水
素供与体色源体反応系を含む系で定量する場合、ＳＨ基
保護剤の存在はペルオキシダーゼ水素供与体の発色系を
阻害するので、正確な測定値が得られず負の誤差を与え
ることになる。さらに、カルバメートキナーゼは平衡が
アンモニア生成の方向へ傾いているため、アンモニア濃
度が低い場合アンモニアを消費する反応はほとんど進ま
ず、生体試料中の微１のアンモニアの定量には不適当で
ある。
後者の方法では用いられるカルバモイルリン酸合成酵素
が動物臓器由来のものしか入手できないため、酵素の大
皿かつ安価な供給という点で問題を有している。
が動物臓器由来のものしか入手できないため、酵素の大
皿かつ安価な供給という点で問題を有している。
また、ＡＴＰの定量法としては、従来グルコースの存在
下で被検液中のＡＴＰにヘキソキナーゼを作用させてグ
ルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグルコース−
６−リン酸にＮＡＤＰ の存在下でグルコース−６−リ
ン酪脱水素酵素を作用させ、生成したＮＡＤＰＨを３４
０ｎｍで測定する方法〔メソツズΦオプ・エンザイマテ
イツクφアナリシス、第７巻、３４６頁（１９８５））
、またはルシフェリンおよびＭｇ２＋の存在下でＡＴＰ
にルシフェラーゼを作用させ、発生する５６２皿の光強
度よりＡＴＰを定量する方法が知られている〔同第７巻
、第３５７頁（１９８５））。
下で被検液中のＡＴＰにヘキソキナーゼを作用させてグ
ルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグルコース−
６−リン酸にＮＡＤＰ の存在下でグルコース−６−リ
ン酪脱水素酵素を作用させ、生成したＮＡＤＰＨを３４
０ｎｍで測定する方法〔メソツズΦオプ・エンザイマテ
イツクφアナリシス、第７巻、３４６頁（１９８５））
、またはルシフェリンおよびＭｇ２＋の存在下でＡＴＰ
にルシフェラーゼを作用させ、発生する５６２皿の光強
度よりＡＴＰを定量する方法が知られている〔同第７巻
、第３５７頁（１９８５））。
しかし前者の方法では、ＡＴＰ １分子よりＮＡＤＰＨ
１分子しか生成しないため感度が低く、また、後者の方
法ではルシフェリンおよびルシフェラーゼが高価である
という問題を有している。
１分子しか生成しないため感度が低く、また、後者の方
法ではルシフェリンおよびルシフェラーゼが高価である
という問題を有している。
上記現状に鑑み先にグルタミン合成酵素を用いたアンモ
ニアまたはＡＴＰの定量法が提案された（特願昭６０−
１４１２４１号ン。この方法は被検液中のアンモニアま
たはＡＴＰを定量する場合、被定量成分ではないもう一
方の物質（即ちアンモニア定量の場合はＡＴＰ 、また
はＡＴＰ定量の場合はアンモニア）およびＬ−グルタミ
ンの存在下で被検液にグルタミン合成酵素を作用させ、
生成したＡＤＰにキナーゼ基質用リン化合物例えばホス
ホエノールピルビン酸の存在下、キナーゼ、例えばピル
ビン酸キナーゼを作用させて、生成したキナーゼ反応生
成物、例えばピルビン酸を定量する方法である。例えば
ピルビン酸を定量する場合は乳酸脱水素酵素を用いてＵ
Ｖ法で、またピルビン酸オキシダーゼを用いた場合には
比色法でそれぞれ定量することが可能である。とくにピ
ルビン酸オキシダーゼを用いた比色法はＵＶ法よりも感
度がよいことから微量のアンモニアまたはＡＴＰの定量
に適している。
ニアまたはＡＴＰの定量法が提案された（特願昭６０−
１４１２４１号ン。この方法は被検液中のアンモニアま
たはＡＴＰを定量する場合、被定量成分ではないもう一
方の物質（即ちアンモニア定量の場合はＡＴＰ 、また
はＡＴＰ定量の場合はアンモニア）およびＬ−グルタミ
ンの存在下で被検液にグルタミン合成酵素を作用させ、
生成したＡＤＰにキナーゼ基質用リン化合物例えばホス
ホエノールピルビン酸の存在下、キナーゼ、例えばピル
ビン酸キナーゼを作用させて、生成したキナーゼ反応生
成物、例えばピルビン酸を定量する方法である。例えば
ピルビン酸を定量する場合は乳酸脱水素酵素を用いてＵ
Ｖ法で、またピルビン酸オキシダーゼを用いた場合には
比色法でそれぞれ定量することが可能である。とくにピ
ルビン酸オキシダーゼを用いた比色法はＵＶ法よりも感
度がよいことから微量のアンモニアまたはＡＴＰの定量
に適している。
最近、血清中の酸素活性が種々の病態の診断の指標にな
っていることからさらに微量のアンモニアまたけＡＴＰ
の定量法が望まれている。しかしながら、上記特願昭６
０−１４１２４１号の方法では、グルタミン合成酵素に
より生成されるＡＤＰをピルビン酸キナーゼおよびピル
ビン酸オキシダーゼ糸で測定する場合、アンモニアまた
はＡＴＰ １分子より過酸化水素１分子が生成されるだ
けであり、このため測定感度が充分に大であるとはいえ
ない。
っていることからさらに微量のアンモニアまたけＡＴＰ
の定量法が望まれている。しかしながら、上記特願昭６
０−１４１２４１号の方法では、グルタミン合成酵素に
より生成されるＡＤＰをピルビン酸キナーゼおよびピル
ビン酸オキシダーゼ糸で測定する場合、アンモニアまた
はＡＴＰ １分子より過酸化水素１分子が生成されるだ
けであり、このため測定感度が充分に大であるとはいえ
ない。
従って、本発明の目的は、アンモニアまたはＡＴＰの高
感度で簡便かつ安価な定量法を提供することにある。
感度で簡便かつ安価な定量法を提供することにある。
本発明者等は、被検液中のアンモニアまたはＡ’ｌ”Ｐ
の定量方法について鋭意検討を重ねた結果、グルタミン
合成酵素を用いてしかも高感度で簡便かつ安価なアンモ
ニアまたはＡＴＰの定量法をここに見出した。
の定量方法について鋭意検討を重ねた結果、グルタミン
合成酵素を用いてしかも高感度で簡便かつ安価なアンモ
ニアまたはＡＴＰの定量法をここに見出した。
本発明はアンモニアまたはＡＴＰの定？・１法に関する
ものであって、その特徴とするところは、被検液中のア
ンモニアまたはＡＴＰを定量するに当り、被定量成分で
はないもう一方の物質およびＬ−グルタミン酸の存在下
で被検液にグルタミン合成酵素を作用させ、生成した無
機リン酸にプリンヌクレオシドの存在下、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼを作用させて、生成したプリン化
合物をキサンチン・オキシダーゼで定量することである
。
ものであって、その特徴とするところは、被検液中のア
ンモニアまたはＡＴＰを定量するに当り、被定量成分で
はないもう一方の物質およびＬ−グルタミン酸の存在下
で被検液にグルタミン合成酵素を作用させ、生成した無
機リン酸にプリンヌクレオシドの存在下、プリンヌクレ
オシドホスホリラーゼを作用させて、生成したプリン化
合物をキサンチン・オキシダーゼで定量することである
。
上記被定量成分ではないもう一方の物質とは、アンモニ
ア定量の場合ＡＴＰを、またＡＴＰ定散の場合アンモニ
アを表わすものとする。
ア定量の場合ＡＴＰを、またＡＴＰ定散の場合アンモニ
アを表わすものとする。
本発明に供される被検液としては、アンモニアまたはＡ
ＴＰのいずれか一方を含むものであればよく、アンモニ
アまたはＡＴＰを予め含む被検液や、酵素反応により生
成されたアンモニアまたはＡＴＰを含む被検液がある。
ＴＰのいずれか一方を含むものであればよく、アンモニ
アまたはＡＴＰを予め含む被検液や、酵素反応により生
成されたアンモニアまたはＡＴＰを含む被検液がある。
酵素反応によりアンモニアを生成する反応には、以下に
例示するものがあるが、それらの酵素活性測定、基質ま
たは生成分の定量を行うことが可能である。
例示するものがあるが、それらの酵素活性測定、基質ま
たは生成分の定量を行うことが可能である。
Ｌ−アスパラギンｂ−ｔフマール酸十ＮＨａ３、アデニ
ンデアミナーゼ（ｘａ ３ 、５ 、４ 、２ ）アデ
ニン＋Ｈ！Ｏ→ヒ叡キサンチン十ＮＨｓ４、アデノシン
デアミナーゼ（ｒ；ｏ３．５．４．４）アデノシン＋Ｈ
！０→イノシン十Ｎ Ｈｓ５、アデノシンモノリン酸デ
アミナーゼ（ＩＣａ ３ 、５ 、４ 、６ ）ＡＭＰ
＋ Ｈｘ Ｏ→ 工ＭＰ＋ＮＨｓＬ−アルギニン→
Ｌ−シトルリン十ＮＨ。
ンデアミナーゼ（ｘａ ３ 、５ 、４ 、２ ）アデ
ニン＋Ｈ！Ｏ→ヒ叡キサンチン十ＮＨｓ４、アデノシン
デアミナーゼ（ｒ；ｏ３．５．４．４）アデノシン＋Ｈ
！０→イノシン十Ｎ Ｈｓ５、アデノシンモノリン酸デ
アミナーゼ（ＩＣａ ３ 、５ 、４ 、６ ）ＡＭＰ
＋ Ｈｘ Ｏ→ 工ＭＰ＋ＮＨｓＬ−アルギニン→
Ｌ−シトルリン十ＮＨ。
グアニン＋Ｈ２０→キサンチン＋ＮＨ３１４、り７ ／
シンデＴミナ−−ｔ／（Ｅｃ３．５．４．１５）グア
ノシン十ＨｚＯ→キサントシン＋ＮＨｓクレアチニン十
Ｈ２Ｏ−４ＰＮ−メチルヒダントイン十ＮＨ３１７、シ
チジンデアミナーゼ（Σ０３．５．４．５）シチジン十
ＨｚＯ→ウリジン十ＮＨｓ １８、シトシンデアミナーゼ（Ｅａ３．５．４．１）シ
トモレ十ＨｔＯ→つラシ′・＋Ｎ’！ 。
シンデＴミナ−−ｔ／（Ｅｃ３．５．４．１５）グア
ノシン十ＨｚＯ→キサントシン＋ＮＨｓクレアチニン十
Ｈ２Ｏ−４ＰＮ−メチルヒダントイン十ＮＨ３１７、シ
チジンデアミナーゼ（Σ０３．５．４．５）シチジン十
ＨｚＯ→ウリジン十ＮＨｓ １８、シトシンデアミナーゼ（Ｅａ３．５．４．１）シ
トモレ十ＨｔＯ→つラシ′・＋Ｎ’！ 。
また、酵素反応によりＡＴＰを生成する反応としては以
下に例示するものがあるが、それらの酵素活性測定、基
質または生成物の定ｈ１を行うことが可能である。
下に例示するものがあるが、それらの酵素活性測定、基
質または生成物の定ｈ１を行うことが可能である。
Ｌ−アスパラギン酸＋１１ Ｈｚ ＋ＡＩ？ＡＴＰ＋Ｄ
−リボースー５−リン酸 以上これらは例示であり、何ら本発明の対象を限定する
ものではない。
−リボースー５−リン酸 以上これらは例示であり、何ら本発明の対象を限定する
ものではない。
次に、本発明に用いられるグルタミン合成酵素は各種高
等動物の脳や肝臓、マメの種子、大腸菌その他の微生物
に存在するが、大量かつ安価に供給できるという点でマ
イクロコツカス属およびブレビバクテリウム属より選ば
れたグルタミン合成酵素生産菌より取得される酵素（こ
のグルタミン合成酵素については特開昭５７−３３５９
４号参照）を使用するのが有利である。
等動物の脳や肝臓、マメの種子、大腸菌その他の微生物
に存在するが、大量かつ安価に供給できるという点でマ
イクロコツカス属およびブレビバクテリウム属より選ば
れたグルタミン合成酵素生産菌より取得される酵素（こ
のグルタミン合成酵素については特開昭５７−３３５９
４号参照）を使用するのが有利である。
まず、本発明に使用されるグルタミン合成酵素の各性質
を示す。
を示す。
グルタミン合成酵素の酵素化学的および理化学的性質
（１）作 用：
本酵素は下式のようにＬ−グルタミン酸とアンモニアよ
り、ＡＴＰの化学エネルギーを利用してグルタミンを合
成する反応を触媒する。
り、ＡＴＰの化学エネルギーを利用してグルタミンを合
成する反応を触媒する。
Ｌ−グルタミン酸＋アンモニア＋ＡＴＰ→Ｌ−グルタミ
ン＋ＡＤＰ＋無機リン酸 （２）基質特異性： アミ７基受容体としては、本酵素はＬ−グルタミン酸に
極めて高い特異性を示す。塩化アンモニウムの代りにヒ
ドロキシルアミンを用いた場合にも、約３０％の活性が
認められた。
ン＋ＡＤＰ＋無機リン酸 （２）基質特異性： アミ７基受容体としては、本酵素はＬ−グルタミン酸に
極めて高い特異性を示す。塩化アンモニウムの代りにヒ
ドロキシルアミンを用いた場合にも、約３０％の活性が
認められた。
（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性：
本酵素の至適ｐＨは７、Ｏ〜８．０である。また、本酵
素を５０℃において、それぞれのｐＨで１０分間処理し
たとき、ｐＨ６，０〜９．０の範囲で安定である。
素を５０℃において、それぞれのｐＨで１０分間処理し
たとき、ｐＨ６，０〜９．０の範囲で安定である。
（４）至適温度および熱安定性：
本酵素の至適温度は５０℃付近にあり、ｐＨ７，０にお
いて、それぞれの温度で１０分間処理したとき５０℃ま
で安定である。
いて、それぞれの温度で１０分間処理したとき５０℃ま
で安定である。
（５）分子量：
本酵素の分子量は沈降平衡法により、’）：、ｌ比容を
０，７５と仮定したときに約５０万である。また、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル軍、気泳動劫は約６万〜６
．５万であることから、本酵素は同一のサブユニット８
個からなる８量体である。
０，７５と仮定したときに約５０万である。また、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル軍、気泳動劫は約６万〜６
．５万であることから、本酵素は同一のサブユニット８
個からなる８量体である。
（６）阻 害：
各種代謝産物による阻害を検討したところ、アミノ酸類
ではグリシン、Ｌ−）リプトファン、Ｄ−スレオニン等
で若干の阻害が見られる程度であるが、ヌクレオチド、
ヌクレオシド類による阻害は大きく、アデノシン、ＡＭ
Ｐ ５ＡＤＰなどによって活性は強く阻害される。
ではグリシン、Ｌ−）リプトファン、Ｄ−スレオニン等
で若干の阻害が見られる程度であるが、ヌクレオチド、
ヌクレオシド類による阻害は大きく、アデノシン、ＡＭ
Ｐ ５ＡＤＰなどによって活性は強く阻害される。
（７）金属イオンの影響：
酵素反応には金属イオンとしてＭｇ ２＋を要求し、Ｍ
ｎ２＋でも３４％の活性がある。
ｎ２＋でも３４％の活性がある。
（８） Ｋｍ 値：
各基質に対するｈ値を求めたところ、Ｌ−グルタミン酸
に対して７．９ Ｘ １０−” Ｍ、塩化アンモニウム
に対して５． ＯＸ １０−ＪＭ、 ＡＴＰに対して１
．２Ｘ１０−’Ｍであった。
に対して７．９ Ｘ １０−” Ｍ、塩化アンモニウム
に対して５． ＯＸ １０−ＪＭ、 ＡＴＰに対して１
．２Ｘ１０−’Ｍであった。
（９）酵素活性測定法：
酵素活性の測定は次のようにして求めた。
５００ ｍＭグルタミン酸ナナトリウム溶液０１ｍｌ。
２５０ｍＭ塩化アンモニウム溶液０．１ ｆｎｌ、 ７
５ｍＭＡＴＰ溶液Ｃ１１ｍｅ Ｎ ３００ ｍＭ Ｍ
ｇＯ／ ２溶液０．１ ＋ｒｄ！、１Ｍイミダゾール−
塩酸緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ） ０．１ｍｅ１水０．４
ｍｇおよび適当に希釈した酵素液０．１ｎ１ｅ１反応液
鼠１．０−で３７℃、１０分間反応させ、生成する無機
リン酸をフイスケーサバロウの方法で測定する方法、お
よび生成するグルタミンをペーパークロマトグラフィー
で分離し、ニンヒドリン発色法で測定する方法により求
めた。グルタミン合成活性の１単位は上記反応系で１分
間に１．ｉｌＭの無機リン酸あるいはグルタミンを生成
する酵素量として表示した。
５ｍＭＡＴＰ溶液Ｃ１１ｍｅ Ｎ ３００ ｍＭ Ｍ
ｇＯ／ ２溶液０．１ ＋ｒｄ！、１Ｍイミダゾール−
塩酸緩衝液（１）Ｈ７，Ｏ） ０．１ｍｅ１水０．４
ｍｇおよび適当に希釈した酵素液０．１ｎ１ｅ１反応液
鼠１．０−で３７℃、１０分間反応させ、生成する無機
リン酸をフイスケーサバロウの方法で測定する方法、お
よび生成するグルタミンをペーパークロマトグラフィー
で分離し、ニンヒドリン発色法で測定する方法により求
めた。グルタミン合成活性の１単位は上記反応系で１分
間に１．ｉｌＭの無機リン酸あるいはグルタミンを生成
する酵素量として表示した。
なお、グルタミン合成酵素の製造方法については特開昭
５７−３３５９４号に記載されている。
５７−３３５９４号に記載されている。
復述する如く被検液１のアンモニアまたはＡＴＰはＬ−
グルタミン酸とＡＴＰまたはアンモニアの存在下、グル
タミン合成酵素の作用により、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰ
および無機リン酸を生成し、また被検液中のＡＴＥはＬ
−グルタミン酸とアンモニアの存在下、本酵素作用によ
り、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成す
る。酵素反応により生成した無機リン酸にプリンヌクレ
オシド、例えばイノシンの存在下、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼを作用させるとプリン化合物、例えはヒ
ボキサンチンが生成する。
グルタミン酸とＡＴＰまたはアンモニアの存在下、グル
タミン合成酵素の作用により、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰ
および無機リン酸を生成し、また被検液中のＡＴＥはＬ
−グルタミン酸とアンモニアの存在下、本酵素作用によ
り、Ｌ−グルタミン、ＡＤＰおよび無機リン酸を生成す
る。酵素反応により生成した無機リン酸にプリンヌクレ
オシド、例えばイノシンの存在下、プリンヌクレオシド
ホスホリラーゼを作用させるとプリン化合物、例えはヒ
ボキサンチンが生成する。
生成したヒボキサンチンの定量には公知の方法を用いる
ことができる。例えばヒボキサンチンにキサンチン・オ
キシダーゼを作用させ消費される酸素を酸素電極で測定
するか、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼ系によ
る呈色反応、例えば４−アミノアンチピリン−フェノー
ル−ペルオキシダーゼ法を用いた場合５００ｎｍ、で定
量することができる。
ことができる。例えばヒボキサンチンにキサンチン・オ
キシダーゼを作用させ消費される酸素を酸素電極で測定
するか、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼ系によ
る呈色反応、例えば４−アミノアンチピリン−フェノー
ル−ペルオキシダーゼ法を用いた場合５００ｎｍ、で定
量することができる。
反応に用いられる緩衝液はリン酸塩を含まない緩衝液な
ら特に限定されず、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝液
、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液などが好適であり、
ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７の緩衝液が用いられる。
ら特に限定されず、イミダゾール緩衝液、トリス緩衝液
、グリシン緩衝液、グッドの緩衝液などが好適であり、
ｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７の緩衝液が用いられる。
グルタミン合成酵素は通常０．２〜２０単位、好ましく
は１〜５単位、プリンヌクレオシドホスホリラーゼは０
．０５〜５単位、好ましくは０．２〜１単位、キサンチ
ン壷オキダーゼは０．０１〜１０単位、好ましくは０．
１〜１単位用いられる。Ｌ−グルタミン酸濃度は１〜５
０ｍＭ％好ましくは５〜ｌＱｍＭが望ましい。
は１〜５単位、プリンヌクレオシドホスホリラーゼは０
．０５〜５単位、好ましくは０．２〜１単位、キサンチ
ン壷オキダーゼは０．０１〜１０単位、好ましくは０．
１〜１単位用いられる。Ｌ−グルタミン酸濃度は１〜５
０ｍＭ％好ましくは５〜ｌＱｍＭが望ましい。
本発明方法によりアンモニアを定量する場合は、イノシ
ンやＡＴＰは少なくとも被検液中のアンモニアのモルＵ
以上加えればよく、またＡＴＰを定量する場合はイノシ
ンやアンモニアは少なくとも被検液中のＡＴＰのモル瓜
以上用いればよい。反応温度は２０〜４０℃、反応時間
は２〜２０分間が望ましい。またグルタミン合成酵素、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン・オキ
シダーゼおよびプリンヌクレオシドは検液中に同時に存
在させてもよい。
ンやＡＴＰは少なくとも被検液中のアンモニアのモルＵ
以上加えればよく、またＡＴＰを定量する場合はイノシ
ンやアンモニアは少なくとも被検液中のＡＴＰのモル瓜
以上用いればよい。反応温度は２０〜４０℃、反応時間
は２〜２０分間が望ましい。またグルタミン合成酵素、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチン・オキ
シダーゼおよびプリンヌクレオシドは検液中に同時に存
在させてもよい。
本発明においてキサンチン・オキシダーゼを用いると特
願昭６０−１４１２４１号記載の定量法と異なり、アン
モニアまたはＡＴＰにグルタミン合成酵素を作用させ生
成した無機リン酸をプリンヌクレオシド、例えばイノシ
ンの存在下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサ
ンチン争オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ系で測定
する場合は下記の如くアンモニアまたはＡＴＰ１分子か
ら過酸化水素２分子が生成するので感度が２倍増大する
。
願昭６０−１４１２４１号記載の定量法と異なり、アン
モニアまたはＡＴＰにグルタミン合成酵素を作用させ生
成した無機リン酸をプリンヌクレオシド、例えばイノシ
ンの存在下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサ
ンチン争オキシダーゼおよびペルオキシダーゼ系で測定
する場合は下記の如くアンモニアまたはＡＴＰ１分子か
ら過酸化水素２分子が生成するので感度が２倍増大する
。
〜→Ｌ−グルタミン＋ＡＤＰ＋無機リン酸−ラヒボキサ
ンチン＋リボース７１−リン酸ＯＤ ヒボキサンチン＋Ｏｔ ＋ Ｈｔ Ｏ−一一÷キサンチ
ン＋ＨｇＯｘＯＤ キサンチン＋ Ｏｔ ＋ Ｈｘ Ｏ−）尿酸＋ Ｈ！
０２２ＨｚＯｚ十色源体−−最赤色キ／ン色素＋４Ｍ、
０以上のことより、本発明は非常に高感度であること、
比色定量が可能であること、グルタミン合成酵素が微生
物より安価かつ大故に調整可能であること、とくにマイ
クロコツカス属およびブレビバクテリウム属のグルタミ
ン合成酵素は菌体内タンパク質の２〜３％にまで達し、
また非常に安定である、などの特徴を有しており、臨床
検査分野に新規なアンモニアまたはＡＴＰの定量法を提
供する。
ンチン＋リボース７１−リン酸ＯＤ ヒボキサンチン＋Ｏｔ ＋ Ｈｔ Ｏ−一一÷キサンチ
ン＋ＨｇＯｘＯＤ キサンチン＋ Ｏｔ ＋ Ｈｘ Ｏ−）尿酸＋ Ｈ！
０２２ＨｚＯｚ十色源体−−最赤色キ／ン色素＋４Ｍ、
０以上のことより、本発明は非常に高感度であること、
比色定量が可能であること、グルタミン合成酵素が微生
物より安価かつ大故に調整可能であること、とくにマイ
クロコツカス属およびブレビバクテリウム属のグルタミ
ン合成酵素は菌体内タンパク質の２〜３％にまで達し、
また非常に安定である、などの特徴を有しており、臨床
検査分野に新規なアンモニアまたはＡＴＰの定量法を提
供する。
以下に本発明を、実施例をもって説明するが本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例 １ アンモニアの定量
３００ ｍＭ イミダゾール−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０） １，０．ｎｅ１５０ｍＭ Ｉ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ｏ、１ｒｎｆ
！３０ ｍＭ 、ＡＴＰ
Ｏ１ｒｎｅ３ＱｍＭ イ
ノシン ０，１ｍｅ２４
．６ｍＭ ４−アミ／アンチピリン ０．
１−４２０ｍＭ フエ／−ル
０．１ｍ１３０単位／ ｍｅ グルタミン合
成酵素（合成活性） ０．１ｍｅ３００ｍＭ
ＭｇＯ１ｚ Ｏ，１ｍ
ｆ’水 ＬＯｒｎｅ
上記混合溶液３． Ｏｍｅに０．１ 、０．２ 、０．
３．０．４およびＱ、５ｍＭの塩化アンモニウム溶液０
．１ ｍｅをそれぞれ添加し、３７℃で５分間反応した
。第１図に示すように添加した塩化アンモニウム辰と５
００ ｎｍの吸光度の増加量には良好な直線関係が得ら
れた。
Ｈ７，０） １，０．ｎｅ１５０ｍＭ Ｉ
Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ｏ、１ｒｎｆ
！３０ ｍＭ 、ＡＴＰ
Ｏ１ｒｎｅ３ＱｍＭ イ
ノシン ０，１ｍｅ２４
．６ｍＭ ４−アミ／アンチピリン ０．
１−４２０ｍＭ フエ／−ル
０．１ｍ１３０単位／ ｍｅ グルタミン合
成酵素（合成活性） ０．１ｍｅ３００ｍＭ
ＭｇＯ１ｚ Ｏ，１ｍ
ｆ’水 ＬＯｒｎｅ
上記混合溶液３． Ｏｍｅに０．１ 、０．２ 、０．
３．０．４およびＱ、５ｍＭの塩化アンモニウム溶液０
．１ ｍｅをそれぞれ添加し、３７℃で５分間反応した
。第１図に示すように添加した塩化アンモニウム辰と５
００ ｎｍの吸光度の増加量には良好な直線関係が得ら
れた。
実施例 ２ ＡＴＰの定量
３００ｍＭ イミダゾール−ｋＡＭ緩衝液Ｃｐ
Ｈ７，０） １．０ｍｌ！１５０ ｍＭ Ｌ
−グルタミン酸ナト°ノウ二 〇ニセ１５０ ｍＭ
塩化アンモニウム ０．１ｎｇ
３ＱｍＭ イノシン ０．
１ ｍｇ２４．８ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．ｌｙｄ！４２０ｍＭ フェノー
ル ０，１１ｎ１３０単位／Ｔ
ｎｌ グルタミン合成酵素（合成活性） ０．１
ｄ３ Ｑ Ｑ ｍＭ ＭｇＯ１ｚ
０．１ｍｔ’水
１．〇−上記混合液３．３ ｍｅに０．１
、０．２ 、０．３ 、０．４およびＱ、 ５ ｍＭ
のＡＴＰ溶液０．１ ｒｎｅをそれぞれ添加し、３７℃
で５分間反応した。第２図に示すように添加したＡＴＰ
ｍと５００ｎｍの吸光度の増加量には良好な直線謁係
が得られた。
Ｈ７，０） １．０ｍｌ！１５０ ｍＭ Ｌ
−グルタミン酸ナト°ノウ二 〇ニセ１５０ ｍＭ
塩化アンモニウム ０．１ｎｇ
３ＱｍＭ イノシン ０．
１ ｍｇ２４．８ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．ｌｙｄ！４２０ｍＭ フェノー
ル ０，１１ｎ１３０単位／Ｔ
ｎｌ グルタミン合成酵素（合成活性） ０．１
ｄ３ Ｑ Ｑ ｍＭ ＭｇＯ１ｚ
０．１ｍｔ’水
１．〇−上記混合液３．３ ｍｅに０．１
、０．２ 、０．３ 、０．４およびＱ、 ５ ｍＭ
のＡＴＰ溶液０．１ ｒｎｅをそれぞれ添加し、３７℃
で５分間反応した。第２図に示すように添加したＡＴＰ
ｍと５００ｎｍの吸光度の増加量には良好な直線謁係
が得られた。
以上詳細に説明したように、本発明の定量法によればア
ンモニアまたはＡＴＥを高感度かつ特異的に定量するこ
とが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を有す
る。
ンモニアまたはＡＴＥを高感度かつ特異的に定量するこ
とが可能であり、臨床検査試薬として優れた効果を有す
る。
第１図は実施例１における検量線をアンモニアｔと５０
０ｎｍの吸光度差との関係で示したグラフである。第２
図は実施例２における検量線をＡＴＰ ｉとｓｏｏｎｍ
の吸光度差との関係で示したグラフである。 ・−一口 第１図 Ｏｔｏ ２０ ３０ ｄｏ ’；Ｏ（１ｍｏｌｅ
）すＬｌヒアノ七二ラう量 ｏ １０ ｖｏ ３ｏ ４
ｏ ５ｏｃｆＬｔｎｏ／ｅ）、へ ＴＰ −
ψ 手続補正書（１１浴） ＋１ｉ４ Ｉ’１１６１年１月３０：Ｉ特許片長 官学
賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２８５１６０号２
、発明の名称 アンモニアまたはＡＴＰの定量法 ３、補正をする者 【１川−との関係 特許出願人 へへへへ ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第１３頁下より第２行「またはＡＴＰ Ｊ
ｋ削除する。 （２）同第１３頁末行「またはアンモニア」ご削除する
。 （３）同第１６頁末行「色原体」？「色原体」と訂正す
る。 （４）同第１７頁第７行「調整」を「調製」と訂正する
。 以 上
０ｎｍの吸光度差との関係で示したグラフである。第２
図は実施例２における検量線をＡＴＰ ｉとｓｏｏｎｍ
の吸光度差との関係で示したグラフである。 ・−一口 第１図 Ｏｔｏ ２０ ３０ ｄｏ ’；Ｏ（１ｍｏｌｅ
）すＬｌヒアノ七二ラう量 ｏ １０ ｖｏ ３ｏ ４
ｏ ５ｏｃｆＬｔｎｏ／ｅ）、へ ＴＰ −
ψ 手続補正書（１１浴） ＋１ｉ４ Ｉ’１１６１年１月３０：Ｉ特許片長 官学
賀 道 部 殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第２８５１６０号２
、発明の名称 アンモニアまたはＡＴＰの定量法 ３、補正をする者 【１川−との関係 特許出願人 へへへへ ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第１３頁下より第２行「またはＡＴＰ Ｊ
ｋ削除する。 （２）同第１３頁末行「またはアンモニア」ご削除する
。 （３）同第１６頁末行「色原体」？「色原体」と訂正す
る。 （４）同第１７頁第７行「調整」を「調製」と訂正する
。 以 上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、被検液中のアンモニアまたはＡＴＰを定量するに当
り、被定量成分ではないもう一方の物質およびＬ−グル
タミン酸の存在下で被検液にグルタミン合成酵素を作用
させ、生成した無機リン酸にプリンヌクレオシドの存在
下、プリンヌクレオシドホスホリラーゼを作用させて、
生成したプリン化合物をキサンチン・オキシダーゼで定
量することを特徴とするアンモニアまたはＡＴＰの定量
法。 ２、被検液中に、グルタミン合成酵素、プリンヌクレオ
シドホスホリラーゼ、キサンチン・オキシダーゼおよび
プリンヌクレオシドを同時に存在させる特許請求の範囲
第１項記載のアンモニアまたはＡＴＰの定量法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28516085A JPS62142272A (ja) | 1985-12-17 | 1985-12-17 | アンモニアまたはａｔｐの定量法 |
| DE19863642804 DE3642804A1 (de) | 1985-12-17 | 1986-12-15 | Verfahren zur bestimmung von ammoniak oder atp in einer probeloesung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28516085A JPS62142272A (ja) | 1985-12-17 | 1985-12-17 | アンモニアまたはａｔｐの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62142272A true JPS62142272A (ja) | 1987-06-25 |
Family
ID=17687860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28516085A Pending JPS62142272A (ja) | 1985-12-17 | 1985-12-17 | アンモニアまたはａｔｐの定量法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62142272A (ja) |
| DE (1) | DE3642804A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3315611A1 (en) | 2016-10-25 | 2018-05-02 | ARKRAY, Inc. | Quantification method for ammonia, quantification reagent kit, test piece, and ammonia quantification device |
| EP3441478A1 (en) | 2017-08-10 | 2019-02-13 | ARKRAY, Inc. | Improved glutamine synthetase reaction and method for quantifying ammonia utilizing the same |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6347649A (ja) * | 1986-08-14 | 1988-02-29 | Unitika Ltd | グルタミン酸測定用酵素センサ |
| JP3167508B2 (ja) * | 1993-06-15 | 2001-05-21 | 富士写真フイルム株式会社 | 無機燐定量用試薬及び乾式分析要素 |
| JPH07203991A (ja) * | 1994-01-24 | 1995-08-08 | Kyowa Medex Co Ltd | カリウムイオンの定量方法 |
| WO2002025262A1 (fr) * | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Electrode a enzyme |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2834704A1 (de) * | 1978-08-08 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen enzymatischen bestimmung von adp |
| DE3347636A1 (de) * | 1983-12-30 | 1985-07-18 | Herbert de Dr. 4230 Wesel Groot | Verfahren zur enzymatischen bestimmung von anorganischem phosphat und anwendungsverfahren |
-
1985
- 1985-12-17 JP JP28516085A patent/JPS62142272A/ja active Pending
-
1986
- 1986-12-15 DE DE19863642804 patent/DE3642804A1/de not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3315611A1 (en) | 2016-10-25 | 2018-05-02 | ARKRAY, Inc. | Quantification method for ammonia, quantification reagent kit, test piece, and ammonia quantification device |
| US10731200B2 (en) | 2016-10-25 | 2020-08-04 | Arkray, Inc. | Quantification method for ammonia, quantification reagent kit, test piece, and ammonia quantification device |
| EP3441478A1 (en) | 2017-08-10 | 2019-02-13 | ARKRAY, Inc. | Improved glutamine synthetase reaction and method for quantifying ammonia utilizing the same |
| US11162123B2 (en) | 2017-08-10 | 2021-11-02 | Arkray, Inc. | Glutamine synthetase reaction and method for quantifying ammonia utilizing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3642804A1 (de) | 1987-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hohorst | D-Glucose-6-phosphate and D-fructose-6-phosphate: determination with glucose-6-phosphate dehydrogenase and phosphoglucose isomerase | |
| Shapiro et al. | [130] Glutamine synthetase (Escherichia coli) | |
| Larsson et al. | Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleotides: X. REDUCTION OF PURINE RIBONUCLEOTIDES; ALLOSTERIC BEHAVIOR AND SUBSTRATE SPECIFICITY OF THE ENZYME SYSTEM FROM ESCHERICHIA COLI B | |
| Giusti | Adenosine deaminase | |
| Lowery et al. | Characterization of the nucleoside triphosphate phosphohydrolase (ATPase) activity of RNA synthesi termination factor p. I. Enzymatic properties and effects of inhibitors. | |
| US4923796A (en) | Method for the quantitative enzymatic determination of ADP | |
| Von der Saal et al. | Mechanistic investigations of Escherichia coli cytidine-5'-triphosphate synthetase. Detection of an intermediate by positional isotope exchange experiments. | |
| Lundin et al. | Sensitive assay of creatine kinase isoenzymes in human serum using M subunit inhibiting antibody and firefly luciferase | |
| JPS62142272A (ja) | アンモニアまたはａｔｐの定量法 | |
| US5780256A (en) | Method and composition for quantitative determination of ammonia, α-amino acid, or α-keto acid | |
| Spector | Studies with GMP synthetase from Ehrlich ascites cells. Purification, properties, and interactions with nucleotide analogs. | |
| JPS623800A (ja) | アンモニアまたはａｔｐの定量法 | |
| AU2000258358B2 (en) | Method and reagent kit for determining activity of 5'-nucleotidase | |
| JPS6188899A (ja) | クレアチンキナ−ゼ定量用試薬 | |
| EP3315611B1 (en) | Quantification test piece for ammonia, and ammonia quantification device | |
| CN109385409A (zh) | 谷氨酰胺合成酶反应方法、氨定量方法、谷氨酰胺合成酶反应用试剂和氨定量用试剂盒 | |
| Kaletha et al. | The influence of phosphate, fluoride and potassium ions on the activity of AMP-deaminase from human skeletal muscle | |
| JPS63164900A (ja) | クレアチンキナ−ゼの定量方法 | |
| JPS5931700A (ja) | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 | |
| JPS6236199A (ja) | カルシウムイオンの定量法 | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JP3936976B2 (ja) | Ａｍｐの酵素的分解 | |
| Keppler | Determination of 5′-nucleotides as nucleoside-5′-monophosphates | |
| JPS5816699A (ja) | 体液クレアチンホスホキナ−ゼの改良測定法 | |
| Grassl | Guanosine-5′-triphosphate and inosine-5′-triphosphate |