JPS5816699A - 体液クレアチンホスホキナ−ゼの改良測定法 - Google Patents
体液クレアチンホスホキナ−ゼの改良測定法Info
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- JPS5816699A JPS5816699A JP12224382A JP12224382A JPS5816699A JP S5816699 A JPS5816699 A JP S5816699A JP 12224382 A JP12224382 A JP 12224382A JP 12224382 A JP12224382 A JP 12224382A JP S5816699 A JPS5816699 A JP S5816699A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、タレアチンホスホキナーゼ測定の改良法及び
組成物に関する。
組成物に関する。
酵素クレアチンホスホキナーゼ（以下に０ＦＩＣと略称
する）は、正常なヒト血清中に見い出され、クレアチン
燐酸からアデノシンニ燐！！（ム１）？）へ燐酸転移し
てアデノシン三燐！ （ＡＴＰ） トクＬ、アチンを生
成するのを触媒する。心筋梗塞症や肺臓梗塞症、脳梗塞
症、甲状腺機能減退症、肝臓障害、外傷又は障害による
骨格筋損傷、及び筋ジストロフィーのような人間の病気
や障害の診断には、血清のＯＰＫ濃度の分析が通常用い
られる。
する）は、正常なヒト血清中に見い出され、クレアチン
燐酸からアデノシンニ燐！！（ム１）？）へ燐酸転移し
てアデノシン三燐！ （ＡＴＰ） トクＬ、アチンを生
成するのを触媒する。心筋梗塞症や肺臓梗塞症、脳梗塞
症、甲状腺機能減退症、肝臓障害、外傷又は障害による
骨格筋損傷、及び筋ジストロフィーのような人間の病気
や障害の診断には、血清のＯＰＫ濃度の分析が通常用い
られる。
クレアチンホスホキナーゼとアデニレートキナーゼ（Ａ
Ｋ ）の逆作用を用いるＯＰＫ検定法はオリバ：−（０
１ｉｖｅｒ ） ＸＢｉｏｏｈ＠＋ｍ、 ：ｆ、 ６１
巻１１６頁（１９５５年）によって開発された。のちに
この方法は、ロサルキ−（Ｒｏｓａｌｌｃｉ ） １．
Ｔ、 Ｉ、ａｍ、 ０１１ｎ、 Ｍｏ２．５１巻６９６
頁（１９６７年）及びヘス（Ｈ＠ｖｒｔｒ ）等、Ａｍ
。
Ｋ ）の逆作用を用いるＯＰＫ検定法はオリバ：−（０
１ｉｖｅｒ ） ＸＢｉｏｏｈ＠＋ｍ、 ：ｆ、 ６１
巻１１６頁（１９５５年）によって開発された。のちに
この方法は、ロサルキ−（Ｒｏｓａｌｌｃｉ ） １．
Ｔ、 Ｉ、ａｍ、 ０１１ｎ、 Ｍｏ２．５１巻６９６
頁（１９６７年）及びヘス（Ｈ＠ｖｒｔｒ ）等、Ａｍ
。
Ｊ、 ０１ｉｎ、 Ｐａｔｈ ５０巻８９頁（１９６８
年）によって改良された。更にこの手順の変法により、
最終紫外線検出段階でニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド燐酸（ＮＡＤＰ ）の代りにニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ ）が使えるようになった
。オキナカ（０ｋｉｎａｋａ ）等１．ｒ、 Ｌａｌ
＆！１（１０１１ｎｉａａｌ Ｍ＠１（ｌｈ ６４巻２
９９頁（１９６４年）を参照。
年）によって改良された。更にこの手順の変法により、
最終紫外線検出段階でニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド燐酸（ＮＡＤＰ ）の代りにニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ ）が使えるようになった
。オキナカ（０ｋｉｎａｋａ ）等１．ｒ、 Ｌａｌ
＆！１（１０１１ｎｉａａｌ Ｍ＠１（ｌｈ ６４巻２
９９頁（１９６４年）を参照。
主反応は次のように要約できる。
■、 酸化された不活性ＯＰＫ＋還元されたチオール活
性化剤→還元された活性ＯＰＫ＋酸化されたチオール活
性化剤Ｉ１． ＡＤＰ＋クレアチン燐酸μ２ ＡＴ
、＋クレアチン１、 ＡＴＰ＋グヤ７−８ ＋二セ＝
ム茸４゜１釉−８−６−澗嘩特開昭５８− １６６９９
（２） 紫外線検出装置を使わずに済ませるため、上の反応■で
形成されるＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋に変換しそれに続いて
テトラゾリウム化合物の２−Ｃ’ｌ’−インドフェニル
）−３−（Ｐ−こト、、、マ７エエル）−５−フェニル
テトラゾリウムクロライド（以下工ＮＴ）が還元してジ
アホラーゼによる酵素触媒を経て赤色ホルマザン染料工
ＮＴＨが形成される。アビガド（Ａｖｉｇａｄ ）及び
レビン（Ｌ＠ｖｉｎ ） 、Ｎ、 ｇｕｒｏｐ。
性化剤→還元された活性ＯＰＫ＋酸化されたチオール活
性化剤Ｉ１． ＡＤＰ＋クレアチン燐酸μ２ ＡＴ
、＋クレアチン１、 ＡＴＰ＋グヤ７−８ ＋二セ＝
ム茸４゜１釉−８−６−澗嘩特開昭５８− １６６９９
（２） 紫外線検出装置を使わずに済ませるため、上の反応■で
形成されるＮＡＤＨを、ＮＡＤ＋に変換しそれに続いて
テトラゾリウム化合物の２−Ｃ’ｌ’−インドフェニル
）−３−（Ｐ−こト、、、マ７エエル）−５−フェニル
テトラゾリウムクロライド（以下工ＮＴ）が還元してジ
アホラーゼによる酵素触媒を経て赤色ホルマザン染料工
ＮＴＨが形成される。アビガド（Ａｖｉｇａｄ ）及び
レビン（Ｌ＠ｖｉｎ ） 、Ｎ、 ｇｕｒｏｐ。
Ｊ、 ！ｌｉｏｃｈｅｍ、 １ ＠ １０２頁（１９６
９年）を参照。この反応を次のように表わすことができ
る。
９年）を参照。この反応を次のように表わすことができ
る。
ｖ、 ｗＡＴＪａ ＋ 工ｉｒｙ −！！−Ｚ−！−
２二’） ＩＮＴＨ＋ Ｎムー反応Ｉ Ａ／Ｖの連続を
オリバ・ロサルキ・ホルマザン法と以下で呼ぶことにす
る。血清、血漿、リンパ液等のような体液はこの方法を
使用し、活性化剤、−次基質、中間体基質、最終基質、
結合酵素、アデニレートキナーゼ抑制剤ＡＭＰ 、緩衝
化合物及び安定剤を含有する予め暖めもどした凍結乾燥
基質に試験液を加□えることによって、ＯＰＫ活性につ
いて検定される。試験液を一定期間（通常約１０分）約
３７℃で培養し、次に酸添加によって反応を止める。同
じく水を別の基質に加え、試薬の空試験を行なう０未知
試験血清の活性を測定するため、既知ＯＰＫ活性をもつ
対照群血清を使用する。１現在使われているオリバー・
田すルキ・ホルマザン法には、四つの大きな欠点がある
０第一に、上記の反応Ｉでチオール活性化剤によるａｐ
Ｋの活性化で、遅延時間がいろいろに変わる。この遅れ
は試薬ブランクバイアルをもち二重ビームを使用する複
雑な連続モニタリング比色測定設備を使用して追跡でき
るが、パッチ（回分）式分析で使われるような終点法を
使用する時は、この遅れが不利である。このため、もつ
と複雑でない比色設備を終点法分析に使う場合は、結果
のバラツキが現行使用の方法ではさけられない。第二に
、血清以外のＯＰＫ色原体産生に必要な全成分の存在の
ため、基質をもどした後、試薬ブランク吸光度が連続的
に増加する。第三に、血清の存在下で最終色原体重ＮＴ
Ｉ（の溶解度が変わるため、試薬ブランクバイアルの吸
光度と試験バイアルの吸光度間に差がある。この結果、
試薬ブランクは不適当になってし寸う。第四に、対照の
血清は不安定であり、多様な活性化時間を示すため、広
範囲の活性をもつＯＰＫ含有の市販血清に標識をつける
必要がある。
２二’） ＩＮＴＨ＋ Ｎムー反応Ｉ Ａ／Ｖの連続を
オリバ・ロサルキ・ホルマザン法と以下で呼ぶことにす
る。血清、血漿、リンパ液等のような体液はこの方法を
使用し、活性化剤、−次基質、中間体基質、最終基質、
結合酵素、アデニレートキナーゼ抑制剤ＡＭＰ 、緩衝
化合物及び安定剤を含有する予め暖めもどした凍結乾燥
基質に試験液を加□えることによって、ＯＰＫ活性につ
いて検定される。試験液を一定期間（通常約１０分）約
３７℃で培養し、次に酸添加によって反応を止める。同
じく水を別の基質に加え、試薬の空試験を行なう０未知
試験血清の活性を測定するため、既知ＯＰＫ活性をもつ
対照群血清を使用する。１現在使われているオリバー・
田すルキ・ホルマザン法には、四つの大きな欠点がある
０第一に、上記の反応Ｉでチオール活性化剤によるａｐ
Ｋの活性化で、遅延時間がいろいろに変わる。この遅れ
は試薬ブランクバイアルをもち二重ビームを使用する複
雑な連続モニタリング比色測定設備を使用して追跡でき
るが、パッチ（回分）式分析で使われるような終点法を
使用する時は、この遅れが不利である。このため、もつ
と複雑でない比色設備を終点法分析に使う場合は、結果
のバラツキが現行使用の方法ではさけられない。第二に
、血清以外のＯＰＫ色原体産生に必要な全成分の存在の
ため、基質をもどした後、試薬ブランク吸光度が連続的
に増加する。第三に、血清の存在下で最終色原体重ＮＴ
Ｉ（の溶解度が変わるため、試薬ブランクバイアルの吸
光度と試験バイアルの吸光度間に差がある。この結果、
試薬ブランクは不適当になってし寸う。第四に、対照の
血清は不安定であり、多様な活性化時間を示すため、広
範囲の活性をもつＯＰＫ含有の市販血清に標識をつける
必要がある。
合幸国特許！ ４，０１２，２８６号はオリバー・ロサ
ルキ・ホルマザン法の変法を記載しているが、これは次
の三つの重要な点で異なっている。（１）酵素触媒と色
原体産生の開始に先立って、血清０ＦＩＣを予備活性化
する。（２） ＫＩＴＨへの血清Ｏ１積極的な溶解を排
除しつつ、色原体の溶解を助けるために、表面活性剤を
酵素基質へ添加した。（８）血清の不在下に展し７て色
原体の溶解が良い結果、対照の血清は中間反応生成物、
すなわち純粋な化学標準に置き代えられ、これはその後
に最終色原体へ転化される。
ルキ・ホルマザン法の変法を記載しているが、これは次
の三つの重要な点で異なっている。（１）酵素触媒と色
原体産生の開始に先立って、血清０ＦＩＣを予備活性化
する。（２） ＫＩＴＨへの血清Ｏ１積極的な溶解を排
除しつつ、色原体の溶解を助けるために、表面活性剤を
酵素基質へ添加した。（８）血清の不在下に展し７て色
原体の溶解が良い結果、対照の血清は中間反応生成物、
すなわち純粋な化学標準に置き代えられ、これはその後
に最終色原体へ転化される。
エフ・メイアチーエ（７，Ｍｓｉａｔｔｌｎｉ ） 、
ジー・シアニー ニ（Ｇ、 Ｇｉａｎｎｉｎｉ ）及び
ビー・ターリ（ｐ。
ジー・シアニー ニ（Ｇ、 Ｇｉａｎｎｉｎｉ ）及び
ビー・ターリ（ｐ。
Ｔａｒｌｉ ） （０１ｉｎ、 Ｏｈ＠ｍ、 ２４巻４
９８頁（１９７８年）、合衆国特許第４，２２０，７１
４号〕で推せんされている一般的なＯＰＫ検定では、ム
ＭＰ ２ ｔ Ｑモル／ ｚ 、 ＡＤＰ２ミリモル／
／、及び弗化ナトリウム６ミリモル／ｌを最適効果のた
め使用する。しかし、残留人！（アデニレートキナーゼ
）活性が著しい。メイアチ一二等は１ないし約１０のＡ
Ｔ？／ＡＤＰ比を明らかにしているが、ｌの比は干渉す
るＡＩ酵素を最大限に抑制することがわかった。
９８頁（１９７８年）、合衆国特許第４，２２０，７１
４号〕で推せんされている一般的なＯＰＫ検定では、ム
ＭＰ ２ ｔ Ｑモル／ ｚ 、 ＡＤＰ２ミリモル／
／、及び弗化ナトリウム６ミリモル／ｌを最適効果のた
め使用する。しかし、残留人！（アデニレートキナーゼ
）活性が著しい。メイアチ一二等は１ないし約１０のＡ
Ｔ？／ＡＤＰ比を明らかにしているが、ｌの比は干渉す
るＡＩ酵素を最大限に抑制することがわかった。
メイアチーことは反対に、弗化物イオンの存在下に１０
を絨え、好ましくは１１〜６０ （最も好ましくは１５
〜２５）のＡＴＰ／ＡＤＰ比は、ノイ！イア−（Ｎ＊ｕ
ｍ＊ｉｒ ）等、０１ｉｎ、 Ｏｈ＠ｍ、 Ａｏｔａ
７３巻４４５頁（１９７６年）及びゲルハｌ／Ｌ／ ）
（Ｇ＠ｒｈａｒ４ｔ ）等、０１１ｍ、 （Ｔｈｅｍ
、 Ａａｔａ ７ｆ３巻２９頁（１９７７年）に記載の
抑制抗体方法と、伝統的なオリバー・ロサルキ・ホルマ
ザン検定反応順序又は合衆国特許第４，０１２゜２８６
号のテトラゾリウムと結合させた改良法とを利用して、
ＯＰＫ −ＭＢイソ酵素に対する診断検定系に使用する
と、ＡＩ抑制用のすぐれた組成物をもたらすことがわか
った。この改良された抑制では、先行技術の方法で必要
とされる血清ブランクが要らなくなり、０ＰＫ−１回転
率のわずかな妥協的減少で済む。
を絨え、好ましくは１１〜６０ （最も好ましくは１５
〜２５）のＡＴＰ／ＡＤＰ比は、ノイ！イア−（Ｎ＊ｕ
ｍ＊ｉｒ ）等、０１ｉｎ、 Ｏｈ＠ｍ、 Ａｏｔａ
７３巻４４５頁（１９７６年）及びゲルハｌ／Ｌ／ ）
（Ｇ＠ｒｈａｒ４ｔ ）等、０１１ｍ、 （Ｔｈｅｍ
、 Ａａｔａ ７ｆ３巻２９頁（１９７７年）に記載の
抑制抗体方法と、伝統的なオリバー・ロサルキ・ホルマ
ザン検定反応順序又は合衆国特許第４，０１２゜２８６
号のテトラゾリウムと結合させた改良法とを利用して、
ＯＰＫ −ＭＢイソ酵素に対する診断検定系に使用する
と、ＡＩ抑制用のすぐれた組成物をもたらすことがわか
った。この改良された抑制では、先行技術の方法で必要
とされる血清ブランクが要らなくなり、０ＰＫ−１回転
率のわずかな妥協的減少で済む。
ノイマイアー及びゲルハルトの方法では、血清（＋）’
ＭＢ ＩＱＰＫイソ酵素活性の洩留％ Ｂ Ｉサブユ
ニット活性は、主要な血清ＱＰＫイソ酵素二量体韮及び
助のＭサブユニットに対する抑制抗体で血清試料を処置
後、変更オリバー・ロサルキ法と組合わせた紫外線分光
光度分析によって測定される。
ＭＢ ＩＱＰＫイソ酵素活性の洩留％ Ｂ Ｉサブユ
ニット活性は、主要な血清ＱＰＫイソ酵素二量体韮及び
助のＭサブユニットに対する抑制抗体で血清試料を処置
後、変更オリバー・ロサルキ法と組合わせた紫外線分光
光度分析によって測定される。
−次基質クレアチン燐酸（ｏｐ）を除く全部のＯＰＫ活
性検定成分を含有する反応混合物中で免疫抑制が行なわ
れる。この培養期にＭ−ＯＫサブユニットとのＭ抗体の
複合化が起るばかりでなく、０１”Ｋ検定混合物中のス
ルフヒドリル還元物で活性化された血清アデニレートキ
ナーゼが、混合物中ニ存在すル他方の一次。ＰＫ基質で
あるアデノシン二ｊＩＩ酸（ＡＤＰ ）と不均化してア
デノシン−＃＃（謄）とアデノシン三燐酸（ムＴＰ）を
形成する干渉反応奢触媒してもいる。ｏｐに触媒の同一
生成物であるＡＴＰ Ｇｆ 、ｅｌｌいて還元形ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＩＡＩ）Ｈ）の最終
生成物産生と共役する。
性検定成分を含有する反応混合物中で免疫抑制が行なわ
れる。この培養期にＭ−ＯＫサブユニットとのＭ抗体の
複合化が起るばかりでなく、０１”Ｋ検定混合物中のス
ルフヒドリル還元物で活性化された血清アデニレートキ
ナーゼが、混合物中ニ存在すル他方の一次。ＰＫ基質で
あるアデノシン二ｊＩＩ酸（ＡＤＰ ）と不均化してア
デノシン−＃＃（謄）とアデノシン三燐酸（ムＴＰ）を
形成する干渉反応奢触媒してもいる。ｏｐに触媒の同一
生成物であるＡＴＰ Ｇｆ 、ｅｌｌいて還元形ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＩＡＩ）Ｈ）の最終
生成物産生と共役する。
ム！（アデニル酸キナーゼ）の干渉は、遷移状態の錯体
状化合物ジアデノシン五燐酸（ＤＡＰＰ ）を使用して
最小限に抑えられる。しかし、赤血球中に高濃度で見い
出され、従って普通に見られる溶血血清試料中に見い出
されるＡＫの抑制が不十分だと免疫抑制が起きたあとで
、血清ブランク（すなわちＯＦを除いた検定）をモニタ
ーしなければならない。続いてＯＦ添加後、ＯＰＫ −
Ｂによる触媒をモニターする。
状化合物ジアデノシン五燐酸（ＤＡＰＰ ）を使用して
最小限に抑えられる。しかし、赤血球中に高濃度で見い
出され、従って普通に見られる溶血血清試料中に見い出
されるＡＫの抑制が不十分だと免疫抑制が起きたあとで
、血清ブランク（すなわちＯＦを除いた検定）をモニタ
ーしなければならない。続いてＯＦ添加後、ＯＰＫ −
Ｂによる触媒をモニターする。
かつては、検定に先立ち血清成分の分離を行なう古典的
な電気泳動法やイオン交換法でのＯＰＫイソ酵素の測定
においては、ＡＭの干渉は問題ではなかった。活性度染
色又は溶出液分析に先立って、ＡＫを当該イソ酵素から
物理的に分離した。抑制抗体の使用に伴い、時間のかか
るＯＰＫイソ酵素の分離は回避されるが、特に血清ブラ
ンク分析用に設計されていない多くの自動臨床機器へ応
用するためには、Ａｉｒ干渉についての改良の必要は極
めて重要なことである。
な電気泳動法やイオン交換法でのＯＰＫイソ酵素の測定
においては、ＡＭの干渉は問題ではなかった。活性度染
色又は溶出液分析に先立って、ＡＫを当該イソ酵素から
物理的に分離した。抑制抗体の使用に伴い、時間のかか
るＯＰＫイソ酵素の分離は回避されるが、特に血清ブラ
ンク分析用に設計されていない多くの自動臨床機器へ応
用するためには、Ａｉｒ干渉についての改良の必要は極
めて重要なことである。
本明細書に記載された改良は、ＡＭＰ／ＡＤＰ比を利用
するものであり、慣用のＯＰＫ検定に使われるものとは
根本的に違い、全体として次の点を付与するため弗化物
を追加包含させている。
するものであり、慣用のＯＰＫ検定に使われるものとは
根本的に違い、全体として次の点を付与するため弗化物
を追加包含させている。
（１）アデニレートキナーゼ干渉の抑制が劇的に改曽さ
れたこと。
れたこと。
（２）低水早入ＤＰに於けるＡＭＰによる強化された競
争的抑制のため、測定された０ＰＫ−Ｂ活性にわずかな
妥協的な減少があること。
争的抑制のため、測定された０ＰＫ−Ｂ活性にわずかな
妥協的な減少があること。
第１表は、精製されたヒト赤血球アデニレートキナーゼ
の抑制における高いＡ％Ｐ／ＡＤＰ此の利用を示シテイ
ル。ａｌａＫ活性はオリバー・ｏ サＡ／ キＣＰＫ検
定の全必要成分を含有する試薬系で測定される。系は次
の３成分すなわちＡＭＰ 、 ＡＤＰ及び弗化ナトリウ
ムの関数として変化する。データの数値は、ＡＤＰ １
．４３〜５．７２ミリモル／ｅの範囲とＡＭＰ２．９〜
２９．２ミリモｈ／ｚの範囲士Ｎａ１Ｆ ６ Ｚす％Ａ
ｌ／１を包含している。第１表に見てとれるように、パ
の抑制程度又は逆に残留ＡＫ活性を支配する優勢なパラ
メータはＡＭＰ／ＡＤＰ比である。
の抑制における高いＡ％Ｐ／ＡＤＰ此の利用を示シテイ
ル。ａｌａＫ活性はオリバー・ｏ サＡ／ キＣＰＫ検
定の全必要成分を含有する試薬系で測定される。系は次
の３成分すなわちＡＭＰ 、 ＡＤＰ及び弗化ナトリウ
ムの関数として変化する。データの数値は、ＡＤＰ １
．４３〜５．７２ミリモル／ｅの範囲とＡＭＰ２．９〜
２９．２ミリモｈ／ｚの範囲士Ｎａ１Ｆ ６ Ｚす％Ａ
ｌ／１を包含している。第１表に見てとれるように、パ
の抑制程度又は逆に残留ＡＫ活性を支配する優勢なパラ
メータはＡＭＰ／ＡＤＰ比である。
不活性ＯＰＫの予備活性化は、酵素触媒作用と色原体産
生り開始に先立って、グルタチオン、ジチオスレイトー
ル、Ｎ−アセチルシスティン又はシスティンなどの還元
されたチオール活性化剤によって達成される←Ｆの反応
Ｉ）。体液中に存在するＯＰＫ、Ｍ部を活性化するには
十分な千オｊ、−ル活性化剤がなければならない。従っ
て、存在する全オの全体の活性化を確実に行なうために
は、チオール活性化剤の過剰量が一般に使われる。チオ
ール活性化剤のｏｐｘ活性化量は、ＯＰＫの既知濃度を
もつ試料を使用する時に種々量の添加活性化剤でつくら
れる色の強度を測定する簡単な便法によって決定できる
。予備活性化は血清ＯＰＫの多様な活性化時間から生ず
る不正確さを排除する。なぜならばＯＰＫは一次基質Ａ
ＤＰと接触する前に十分に活性化しているためである。
生り開始に先立って、グルタチオン、ジチオスレイトー
ル、Ｎ−アセチルシスティン又はシスティンなどの還元
されたチオール活性化剤によって達成される←Ｆの反応
Ｉ）。体液中に存在するＯＰＫ、Ｍ部を活性化するには
十分な千オｊ、−ル活性化剤がなければならない。従っ
て、存在する全オの全体の活性化を確実に行なうために
は、チオール活性化剤の過剰量が一般に使われる。チオ
ール活性化剤のｏｐｘ活性化量は、ＯＰＫの既知濃度を
もつ試料を使用する時に種々量の添加活性化剤でつくら
れる色の強度を測定する簡単な便法によって決定できる
。予備活性化は血清ＯＰＫの多様な活性化時間から生ず
る不正確さを排除する。なぜならばＯＰＫは一次基質Ａ
ＤＰと接触する前に十分に活性化しているためである。
これが、いったん酵素反応が始まると、色原体生産を線
形化することがわかった。
形化することがわかった。
非血清ＯＰＫクロモゲン産生をもたらす副反応は、最終
中間基質重ＩＴ及びＡＤＰの不存在下における区の予備
活性化によっても最少限に抑えられる。色原体に影１し
不正確な結果を生じうる三つの副反応は次のものである
。（ａ） ＮＡＤＨによってではなくてチオール活性化
剤による工ＮＴの還元、（ｂ）結合酵素グルツース−６
−燐酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼ中の汚染物
質として存在するＯＰＫによる“ＡＤｐの触媒作用、及
び（Ｑ）アデニレートキナーゼの抑制剤ＡＭＰが上の伽
）の結合酵素中に見い出されるアデニレートキナーゼの
干渉を完全には除去しないという事実。予備活性イヒ混
合物がらＡＤＰ及び工ＩＴを排除することによって、ｃ
ＰＫ酵素反応の開始に先立ってこれらの副反応が起きな
くなる。
中間基質重ＩＴ及びＡＤＰの不存在下における区の予備
活性化によっても最少限に抑えられる。色原体に影１し
不正確な結果を生じうる三つの副反応は次のものである
。（ａ） ＮＡＤＨによってではなくてチオール活性化
剤による工ＮＴの還元、（ｂ）結合酵素グルツース−６
−燐酸デヒドロゲナーゼ及びヘキソキナーゼ中の汚染物
質として存在するＯＰＫによる“ＡＤｐの触媒作用、及
び（Ｑ）アデニレートキナーゼの抑制剤ＡＭＰが上の伽
）の結合酵素中に見い出されるアデニレートキナーゼの
干渉を完全には除去しないという事実。予備活性イヒ混
合物がらＡＤＰ及び工ＩＴを排除することによって、ｃ
ＰＫ酵素反応の開始に先立ってこれらの副反応が起きな
くなる。
従って改良されたオリバー・ロサルキ・ホルＹザン法は
、この方法を実権するに当たって独特の順序の段階を取
り入れている。要約すると、これらの段階は次のとおり
である。
、この方法を実権するに当たって独特の順序の段階を取
り入れている。要約すると、これらの段階は次のとおり
である。
１、予備活性化段階−チオール活性化剤、好ましくはグ
ルタチオン、−次基質、中間体基質、結合酵素、緩衝化
合物麦び安定化剤を含有する部分的基質に試料を混合す
る。しかし、この部分的基質からは、−次基質ＡＤＰと
最終基質ＩＮ’ｒが欠けている。抑制剤ＡＭＰとアルカ
リ金属弗化物、例えば弗化カリウム又は好ましくは弗化
ナトリウムのような弗化物を後から添加してもよいが、
好ましくは予備活性化段階でこれを加える。５ミリモル
／ｊないし８ミリモル／／゛、好ましくは約６ミリモル
力の弗化物イオンを利用すると、オリバー・ロサルキ結
果検定に必要な共因子であるマグネシウムイオンを沈殿
させずに、非競合的なＡＫ抑制が達成される。予備活性
化混合物を培養するが、典型的には水浴又は加熱ブロッ
ク中で約２５＠ないし約４０℃、好ましくは３０″ない
し３７℃の温度で、ＣＩＰＫを最適活性化するのに十分
な時間ガ、一般的には約３〜５分間培養する。予備活性
化段階用材料の調製においては、二つの別個の組成物を
使用するのが好ましい。すなわち活性剤、クレアチン燐
酸、ＮＡＤ、クルコース、ヘキソキナーゼ、グルコース
−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、及びジアホラーゼを含有
する第一の凍結乾燥した部分的基質組成物と、弗化物、
６と７の間のｐＨをもつ緩衝液及び表面活性剤を含有す
る第二の戻すための試薬とである。そのほか、ＯＰＫイ
ソ酵素二量体ＭＭ及びＭＢのＭサブユニットの寄与を検
定から排除したい時は、凍結乾燥した部分的基質が抗−
ＯＰＫ −Ｍ抑制抗体を含有しうる。ＯＰＫ検定におい
てＭサブユニットの寄与を排除することは、心筋梗塞の
診断に特に価値がある。このように部分的基質用の成分
が二つの別個の組成物としてつくられる時は、このよう
な両綱成物は使用に先立って長期間安定である。別個の
組成物を混合すると、予備活性化段階ニ使われる戻され
た部分的基質が得られる。
ルタチオン、−次基質、中間体基質、結合酵素、緩衝化
合物麦び安定化剤を含有する部分的基質に試料を混合す
る。しかし、この部分的基質からは、−次基質ＡＤＰと
最終基質ＩＮ’ｒが欠けている。抑制剤ＡＭＰとアルカ
リ金属弗化物、例えば弗化カリウム又は好ましくは弗化
ナトリウムのような弗化物を後から添加してもよいが、
好ましくは予備活性化段階でこれを加える。５ミリモル
／ｊないし８ミリモル／／゛、好ましくは約６ミリモル
力の弗化物イオンを利用すると、オリバー・ロサルキ結
果検定に必要な共因子であるマグネシウムイオンを沈殿
させずに、非競合的なＡＫ抑制が達成される。予備活性
化混合物を培養するが、典型的には水浴又は加熱ブロッ
ク中で約２５＠ないし約４０℃、好ましくは３０″ない
し３７℃の温度で、ＣＩＰＫを最適活性化するのに十分
な時間ガ、一般的には約３〜５分間培養する。予備活性
化段階用材料の調製においては、二つの別個の組成物を
使用するのが好ましい。すなわち活性剤、クレアチン燐
酸、ＮＡＤ、クルコース、ヘキソキナーゼ、グルコース
−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、及びジアホラーゼを含有
する第一の凍結乾燥した部分的基質組成物と、弗化物、
６と７の間のｐＨをもつ緩衝液及び表面活性剤を含有す
る第二の戻すための試薬とである。そのほか、ＯＰＫイ
ソ酵素二量体ＭＭ及びＭＢのＭサブユニットの寄与を検
定から排除したい時は、凍結乾燥した部分的基質が抗−
ＯＰＫ −Ｍ抑制抗体を含有しうる。ＯＰＫ検定におい
てＭサブユニットの寄与を排除することは、心筋梗塞の
診断に特に価値がある。このように部分的基質用の成分
が二つの別個の組成物としてつくられる時は、このよう
な両綱成物は使用に先立って長期間安定である。別個の
組成物を混合すると、予備活性化段階ニ使われる戻され
た部分的基質が得られる。
２、酵素鉄媒作用段階−−次基質ＡＤＰ 、工ＮＴのよ
うなテトラゾリウム塩染料、及び抑制剤ＡＭＰを含有す
る出発試薬を培養した予備活性化混合物と混合する。
うなテトラゾリウム塩染料、及び抑制剤ＡＭＰを含有す
る出発試薬を培養した予備活性化混合物と混合する。
３、停止試薬の添加−改良法の−っの大きな利点は、臨
床等級の比色計でａｐｘ活性を正確に測定できることで
ある。通常このためには、妥当な色原体の発現を可能と
するのに十分な時間の後、酸、例えば＃１酸（Ｈ（：ｊ
！ ’）の添加によって色原体産生反応を停止させる必
要がある。満足な色原体発現を生じさせるのに２５分か
かることがわかった◇上の反応は一般に６と７の間のｐ
Ｈが行なわれ、６．３ないし７．５のｐＨが好ましい。
床等級の比色計でａｐｘ活性を正確に測定できることで
ある。通常このためには、妥当な色原体の発現を可能と
するのに十分な時間の後、酸、例えば＃１酸（Ｈ（：ｊ
！ ’）の添加によって色原体産生反応を停止させる必
要がある。満足な色原体発現を生じさせるのに２５分か
かることがわかった◇上の反応は一般に６と７の間のｐ
Ｈが行なわれ、６．３ないし７．５のｐＨが好ましい。
本発明の改良されたＯＰＫ検定手順によって検定できる
体液は血清、血漿、脳を髄液（９ｉ９Ｆ） 、ＩＪンパ
液、及び組織ホモゲネートを包含する。本発明方法で検
定すべき種々の体液は、人間の給源からのものであるが
、動物の体液を検定する時も一般的ＯＰＫ検定は有用で
ある。好ましし１体液番ま人の血清である。
体液は血清、血漿、脳を髄液（９ｉ９Ｆ） 、ＩＪンパ
液、及び組織ホモゲネートを包含する。本発明方法で検
定すべき種々の体液は、人間の給源からのものであるが
、動物の体液を検定する時も一般的ＯＰＫ検定は有用で
ある。好ましし１体液番ま人の血清である。
上の好ましい組成物は以下のとおりである。
実施例１ 予備活性化試薬（戻したもの＊）グルタチオ
ン活性化剤 ５ミリモル／ｅクレア
チン燐ｌ！（酵母から） ３４．５ ミ
１】モル／ｊグルフース １２ミ
ＩＪモル／１ヘキソキナーゼ（酵母から）５．５単位／
試験ジアホラーゼ（クロストリジューム・クルイベリか
ら’） ３ Ｊａ位／試験酢酸マグネシウム
１４．４ ミ１Ｊモル／１３−（
Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホンｗａＭ！８２．１８
ミリモル／１表面活性剤（エマルフォアＩＩＬ ６
２０） ０．０２５％ル〜エコチンア之ドアデニ
ンジヌクレオチド ２７７ ミリモル／ｌ（酵
母から） 。
ン活性化剤 ５ミリモル／ｅクレア
チン燐ｌ！（酵母から） ３４．５ ミ
１】モル／ｊグルフース １２ミ
ＩＪモル／１ヘキソキナーゼ（酵母から）５．５単位／
試験ジアホラーゼ（クロストリジューム・クルイベリか
ら’） ３ Ｊａ位／試験酢酸マグネシウム
１４．４ ミ１Ｊモル／１３−（
Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホンｗａＭ！８２．１８
ミリモル／１表面活性剤（エマルフォアＩＩＬ ６
２０） ０．０２５％ル〜エコチンア之ドアデニ
ンジヌクレオチド ２７７ ミリモル／ｌ（酵
母から） 。
抗ＯＰＫ−Ｍ抑制抗体（ヤギ血清から）＜２ｏｏＯ単位
／／Ｍ＆１
６ ミ１）モル／ｌ＊）上の調製剤は戻した状態の
組成物を表わす・凍結乾燥組成物の好ましい態様におい
ては、スルホン酸緩衝液、表面活性剤及び弗化ナトリウ
ムが欠けており、戻す間に後から加えられる。
／／Ｍ＆１
６ ミ１）モル／ｌ＊）上の調製剤は戻した状態の
組成物を表わす・凍結乾燥組成物の好ましい態様におい
ては、スルホン酸緩衝液、表面活性剤及び弗化ナトリウ
ムが欠けており、戻す間に後から加えられる。
＊怖例２ 出発試薬
アデノシン−５Ｌ−二燐酸（ｗ＃母から）
８．６ ミリモル／ｌアデノシン−５′−−燐酸（酵
母から）１７５４リモル／を実施例３ 改良オリバー・ロサルキ・ホルマザン法の好ましい態様
は、次のように実施される。
８．６ ミリモル／ｌアデノシン−５′−−燐酸（酵
母から）１７５４リモル／を実施例３ 改良オリバー・ロサルキ・ホルマザン法の好ましい態様
は、次のように実施される。
ａ）実施例１の予備活性化試薬各１．０４を患者用、ブ
ランク及び標準用と適切にマークを付した空のバイアル
３本に移す。
ランク及び標準用と適切にマークを付した空のバイアル
３本に移す。
ｂ）バイアルを３７℃で約１０分培養する。
Ｃ）患者バイアルに患者自涜０．１０ｍ、ブランクバイ
アルに蒸留水０．ｌＯ−を混合する。
アルに蒸留水０．ｌＯ−を混合する。
ｄ）バイアル３本命部を出発試薬（上の実施例２）約０
．６６−と−緒に、別個の容ご中で３７℃の熱源で約３
〜５分培養する。
．６６−と−緒に、別個の容ご中で３７℃の熱源で約３
〜５分培養する。
ｅ）予め暖めた出発試薬α２ｍを３本のバイアル全部に
混合し、培養を続ける。
混合し、培養を続ける。
ｆ）化学標準（グルコース−６−燐酸２ミリモル／ ｔ
） ｏ、ｔｏ ｗｔを標準バイアルに加える。
） ｏ、ｔｏ ｗｔを標準バイアルに加える。
ｇ）出発試薬の添加後２５分に、停止試薬（α６襲ＷΔ
エマルフオアＩＩＬ ６２０を含有する塩酸４０ミリモ
ル／／）４．０−を各バイアルに加える。
エマルフオアＩＩＬ ６２０を含有する塩酸４０ミリモ
ル／／）４．０−を各バイアルに加える。
ｈ）比色計又は５００１１！１１に設定した分光光度計
を使用して、材料を分析する。比色計の指示装置は予め
蒸留、水用に対しゼロ吸光度を読取るよう設定しておく
。バイアル３本のそれぞれの吸光度を比色計で読取って
記録する。
を使用して、材料を分析する。比色計の指示装置は予め
蒸留、水用に対しゼロ吸光度を読取るよう設定しておく
。バイアル３本のそれぞれの吸光度を比色計で読取って
記録する。
酵素濃度の好ましい表わし方は！当りの国際単位である
（ Ｕ／／ ）。１国際車位は、標準条件下に１分間に
１マイクロモルの基質を転イヒする酵素量である。従っ
て、患者サンプル中のＯＰＫ濃度Ｇ１次式を用いて計算
できる。
（ Ｕ／／ ）。１国際車位は、標準条件下に１分間に
１マイクロモルの基質を転イヒする酵素量である。従っ
て、患者サンプル中のＯＰＫ濃度Ｇ１次式を用いて計算
できる。
グルコース−６燐酸を使用する化学標準液＆マ、上の手
順の標準として満足できること力（わかった。
順の標準として満足できること力（わかった。
従って、上式でＶｌの値はＵ／／の標準液濃度として使
われる。
われる。
実施例４
響を例示している。実施例１及び２の試薬Ｇよ、表にあ
げたＡＭＰ及びＡＤ？濃度で、６Ｉ！１モル／ｌの弗化
ナトリウムを加えて、又は加えずに使用された。
げたＡＭＰ及びＡＤ？濃度で、６Ｉ！１モル／ｌの弗化
ナトリウムを加えて、又は加えずに使用された。
第 １ 表
ＯＰＫ −ＵＶ検定におけるＡＭＰ ５ＡＤＰ及びＮａ
１Ｆの関数としての精製ヒト赤血球アデニレートキナー
ゼの抑制 ＝ｙ、ｔｚ ２９．２ ５．１ ６２
１３実施例５ 第２表は、改良ＣＰＫ−Ｂ紫外線検定組成物による血清
ブランクの最少化を例示している。ヒト血清試料（心臓
手術を受ける患者から採血するため多くは溶血性）は地
方のコロナリー・ケア・ユニットから得られた。採血１
．後冷蔵した試料を３日以内に検定した。これに用いた
ＵＶ試験はノイマイアー等及びゲルハルト等の方法（先
行技術）にならったもので、ＡＭＰ／ＡＤＰ比が２５で
弗化物イオンが欠けている点で、本検定組成物とは本質
的に異なっている。この両方の「先行技術」の組成物と
、すぐれたＡＫ抑制組成物（実施例１と２）を含有する
本発明の検定組成物をクレアチン叔燐酸なしに調製した
。
１Ｆの関数としての精製ヒト赤血球アデニレートキナー
ゼの抑制 ＝ｙ、ｔｚ ２９．２ ５．１ ６２
１３実施例５ 第２表は、改良ＣＰＫ−Ｂ紫外線検定組成物による血清
ブランクの最少化を例示している。ヒト血清試料（心臓
手術を受ける患者から採血するため多くは溶血性）は地
方のコロナリー・ケア・ユニットから得られた。採血１
．後冷蔵した試料を３日以内に検定した。これに用いた
ＵＶ試験はノイマイアー等及びゲルハルト等の方法（先
行技術）にならったもので、ＡＭＰ／ＡＤＰ比が２５で
弗化物イオンが欠けている点で、本検定組成物とは本質
的に異なっている。この両方の「先行技術」の組成物と
、すぐれたＡＫ抑制組成物（実施例１と２）を含有する
本発明の検定組成物をクレアチン叔燐酸なしに調製した
。
予想のごとく先行技術の検定システムでは、溶血性血清
は、赤血球ＡＫによる非溶血性血清より大きな血清ブラ
ンクを示した。しかし、本システムのすぐれたＡＫ抑制
組成物の場合、あるとしてもごくわずかの血清ブランク
しか示さなかった。
は、赤血球ＡＫによる非溶血性血清より大きな血清ブラ
ンクを示した。しかし、本システムのすぐれたＡＫ抑制
組成物の場合、あるとしてもごくわずかの血清ブランク
しか示さなかった。
心筋の損傷を示す３７℃で８ Ｕ／／より大きいＢ活性
値では、先行技術の血清ブランクは定常的な測定を必要
とするほど、かなり大きい。これに対し本システムでは
、そうした測定は不要である。
値では、先行技術の血清ブランクは定常的な測定を必要
とするほど、かなり大きい。これに対し本システムでは
、そうした測定は不要である。
第 ２ 表
ＵＴ／ ０ＰＫ−Ｂ試薬の関数としての血清てランク測
定１’ ７．０ ０．６２
＆４ ０．１３
＆８ α６４
５．５ α４
５ ４、６ ０
．４６ １９
α４７ ａ２
０．３８ ２．８
０．４９ ６．５
０．７１０ ３．６
ＬＯｌｌ
６．５ ０．５１２
＆９ ０．６１３ ＆６
０．１１４ ３．４
０．１１５ ７．２
０．３１６ １７
０ １７ ４０ ０．２１８
４．６ −０．７１９
３．６ −０
゜１２０ ６、２
０．３２１ ａｏ
０．３２２ ４１．６
１．２２３
５．２ ０．４２４
１．９ ０．６３１’
１８．２ ０．７３２
＆４ ０．５３３
５．４ ０．６３４
４、５ ０．８
３５ ５．４ ０３
６ ３．４ ０．
２３７ ３．０
０．２３８ ４．７
０．５３９ ４．１
０．５４０ ４．１
α５４１ ４８
α３４２ ４．１
０．４４３ ３．７
０．６４４ ５．０
０．４４５ ４．０
０．４４６ ３．５
０．８４７ ４
．１ ０．７４８
４２ α９４９
７．７ α４５０
＆７ ０．２５１
３．９ ０．４５２
４．９ ０．
５５３ ２に８
０．３１）コ田ナリー・ケア・ユニットからの血清試
料。
定１’ ７．０ ０．６２
＆４ ０．１３
＆８ α６４
５．５ α４
５ ４、６ ０
．４６ １９
α４７ ａ２
０．３８ ２．８
０．４９ ６．５
０．７１０ ３．６
ＬＯｌｌ
６．５ ０．５１２
＆９ ０．６１３ ＆６
０．１１４ ３．４
０．１１５ ７．２
０．３１６ １７
０ １７ ４０ ０．２１８
４．６ −０．７１９
３．６ −０
゜１２０ ６、２
０．３２１ ａｏ
０．３２２ ４１．６
１．２２３
５．２ ０．４２４
１．９ ０．６３１’
１８．２ ０．７３２
＆４ ０．５３３
５．４ ０．６３４
４、５ ０．８
３５ ５．４ ０３
６ ３．４ ０．
２３７ ３．０
０．２３８ ４．７
０．５３９ ４．１
０．５４０ ４．１
α５４１ ４８
α３４２ ４．１
０．４４３ ３．７
０．６４４ ５．０
０．４４５ ４．０
０．４４６ ３．５
０．８４７ ４
．１ ０．７４８
４２ α９４９
７．７ α４５０
＆７ ０．２５１
３．９ ０．４５２
４．９ ０．
５５３ ２に８
０．３１）コ田ナリー・ケア・ユニットからの血清試
料。
２）クレアチン燐酸を含まない先行技術の検定システム
。
。
３）クレアチン燐酸を含まない本検定システム（実施例
３）。
３）。
４）溶血試料。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 アデノシン−５′−二燐酸を媒介とするクレアチ
ン燐酸のクレアチンへの転化を利用して行なう体液中の
クレアチンキナーゼ活性を測定する方法において、１５
ないし２５のアデノシン−ぎ−−ｊｌ！／アデノシンー
ダ一二ｍｍの比を利用することからなる改、良法。 ２ アデノシン−５′−一燐酸／アデノシンー５′−二
燐瞭の比が約２０である、特許請求の範１ｔ！！＊１項
の方法。 １ 体液が人間の血清である、特許請求の範囲第１項の
方法。 未 弗化物イオンが存在している、特許請求の範囲第１
項の方法。 ５、 ’Ｐｔ−１に活性化剤、クレアチン燐酸、ヘキ
ソキナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、
グルコース、ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド
、ジアホラーゼ、及び弗化物イオンを有する第二の予備
活性化組成物と、予トラゾリウム塩染料及び１５ないし
２５の比の７デノシンー５′−一燐１１／アデノシンー
５′−二燐酸を有する第二の組成物とからなるクレアチ
ンホスホキナーゼ測定用キット。 ６・ アデノシン−ぎ−一燐酸／アデノシンー５′−二
燐巌の比が約２０である、特許請求の範囲第５項のキッ
ト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28426981A | 1981-07-17 | 1981-07-17 | |
| US284269 | 1988-12-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5816699A true JPS5816699A (ja) | 1983-01-31 |
Family
ID=23089537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12224382A Pending JPS5816699A (ja) | 1981-07-17 | 1982-07-15 | 体液クレアチンホスホキナ−ゼの改良測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0071087B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5816699A (ja) |
| CA (1) | CA1175737A (ja) |
| DE (1) | DE3263261D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1251395A (en) * | 1985-05-01 | 1989-03-21 | John B. Findlay | Immunochemical method and analytical compositions and element for determination of creatine kinase-mb |
| US5274095A (en) * | 1989-05-31 | 1993-12-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diarylimidazoles |
| JP4199119B2 (ja) * | 2001-11-21 | 2008-12-17 | ユニチカ株式会社 | 目視判定可能なａｔｐ測定方法およびその試薬 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1930059C3 (de) * | 1969-06-13 | 1975-11-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabilisiertes Nicotinamid-adenindinucleotid oder bzw. und Nicotinamld-adenin-dinucleotidphosphat |
| US4042462A (en) * | 1975-12-24 | 1977-08-16 | Monsanto Company | Creatine phosphokinase determination method |
| US4012286A (en) * | 1976-04-09 | 1977-03-15 | The Dow Chemical Company | Determination of creatine phosphokinase in body fluids |
| IT1114658B (it) * | 1977-09-30 | 1986-01-27 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Composizione adatta all inibizione dell'adenilato chinasi e suoi impieghi |
| DE2908054A1 (de) * | 1979-03-02 | 1980-09-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung der creatinkinase |
| SE7905852L (sv) * | 1979-07-04 | 1981-01-05 | Lkb Produkter Ab | Forfarande for bestemning av kreatinkinas |
| EP0049606A1 (en) * | 1980-10-02 | 1982-04-14 | Colin Henry Self | Detection method, use and diagnostic aid |
-
1982
- 1982-07-12 CA CA000407069A patent/CA1175737A/en not_active Expired
- 1982-07-14 EP EP19820106303 patent/EP0071087B1/en not_active Expired
- 1982-07-14 DE DE8282106303T patent/DE3263261D1/de not_active Expired
- 1982-07-15 JP JP12224382A patent/JPS5816699A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3263261D1 (en) | 1985-05-30 |
| EP0071087B1 (en) | 1985-04-24 |
| EP0071087A1 (en) | 1983-02-09 |
| CA1175737A (en) | 1984-10-09 |
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