JP3936976B2 - Ａｍｐの酵素的分解 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査や食品検査の分野において行われる検査方法に関するものであり、試料中の酵素活性や基質濃度を測定する方法に関する。より詳細には、本発明は、定量性に優れた、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系を利用して試料中の酵素活性や基質濃度を測定するための方法ならびにそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
耐熱性細菌（Thermococcus由来、Pyrococcus由来）よりアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）依存性のヘキソキナーゼ（ＨＫ）（以下、ＡＤＰ依存性のヘキソキナーゼをＡＤＰ−ＨＫともいう）が分離、精製されている。本酵素は、通常のリン酸化酵素とは異なり、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を基質としないで、ＡＤＰと特異的に反応してＡＭＰと６単糖リン酸化物（グルコース−６−リン酸等）を生じる反応を触媒する（反応式(1) ）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
本酵素は安定性が高いため、グルコースや中性脂肪等の基質及びクレアチンリン酸キナーゼ等の酵素類の測定に有効であることが知られている〔オランダ特許9400836 、J. Biol. Chem. (1994), 269, 17537-17541 、J. Biol. Chem. (1995), 270, 30453-30457 、Arch. Microbiol. (1997), 167, 217-232 〕。
【０００５】
本酵素を用いて、物質Ａを定量する原理は一連の反応式(2) 〜(4) で例示される。
【０００６】
【化２】
【０００７】
この場合、最終的に生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を波長３４０ｎｍの吸光度で測定することになるが、生体試料とりわけ血清中の物質を測定する際に、血清中に含まれるアデニレートキナーゼ（ＭＫ）の作用により、反応過程で生じるＡＭＰがＡＤＰに逆戻りするため、正確な定量が不可能である。このＭＫの作用を阻害するために、Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）５リン酸（Ａｐ５Ａ）が使用されている。しかし、本阻害剤単独ではＭＫの活性を完全に阻害することは困難であった（臨床化学・補冊236-255, 1987 ）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＡＤＰ−ＨＫの作用により基質や酵素を定量する方法において、上述のような試料中に共存するＭＫの影響を回避して定量性を向上させる方法を提供することである。さらに本発明の別の目的は、ＡＤＰ−ＨＫを作用させる反応系（以下、ＡＤＰ−ＨＫ反応系ともいう）において生じるＡＭＰの定量的な測定方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＤＰ−ＨＫ反応の直接の生成物であるＡＭＰを酵素的に加水分解することにより、共存するＭＫの影響を回避できることを見出し、さらにＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することにより当該ＡＭＰを定量できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを加水分解する酵素を用いて、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去する方法。
(2) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(1) 記載の方法。
(3) 上記(1) 又は(2) 記載の、ＡＭＰを実質的に除去する方法にてＡＭＰを実質的に除去することにより、少なくともＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼと試料とを反応させる反応系に及ぼす、試料中に共存するアデニレートキナーゼの影響を実質的に排除する方法。
(4) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを定量する方法。
(5) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(4) 記載の方法。
(6) 加水分解して生成した物質がイノシン−１−リン酸、アデニン及びアデノシンからなる群より選択される少なくとも１種である上記(4) 又は(5) 記載の方法。
(7) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
(8) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
(9) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(7) 又は(8) 記載の方法。
(10)試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定するための試薬であって、ＡＭＰを加水分解する酵素を一要素として含む試薬。
(11)ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(10)記載の試薬。
【００１１】
本発明におけるＡＤＰ−ＨＫ反応系を利用する具体的な例としては、試料中のグルコース、中性脂肪、尿素窒素、クレアチニン、１，５アンヒドログルシトール等の基質、クレアチンリン酸キナーゼ、コリンエステラーゼ等の酵素等の測定が挙げられる。
【００１２】
本発明の方法が適用可能な試料としては、予め各成分の濃度が既知の、調製試料の他、各成分の濃度が未知の生体試料が用いられる。生体試料としては、ヒトをはじめとした対象の哺乳動物の血液、血清、尿等の体液等が挙げられる。
臨床検査用に採取された試料も好適に用いられる。
【００１３】
本発明において使用されるＡＭＰを加水分解する酵素（以下、ＡＭＰ加水分解酵素ともいう）は、ＡＭＰを加水分解できるものであれば特に限定されないが、具体的にはEC No. 3.5.4.6 ＡＭＰデアミナーゼ、EC No. 3.2.2.4 ＡＭＰヌクレオシダーゼ及びEC No. 3.1.3.6 ５’−ヌクレオチダーゼ等が挙げられ、これらの酵素は単独又は２種以上を組み合わせて用いることも可能である。
ＡＭＰデアミナーゼとしては動物組織、植物及び酵母由来等のものが使用出来るが、好ましくはウサギ筋肉由来のものが利用される。ＡＭＰヌクレオシダーゼとしてはAzotobacter vinelandii等の微生物由来のものが、５’−ヌクレオチダーゼとしては酵母またはじゃがいも由来のものが利用できる。
【００１４】
本発明は、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを、ＡＤＰに変換させること無しにＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ又は５’−ヌクレオチダーゼ等のＡＭＰ加水分解酵素で処理することにより加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去する方法であり、また、当該ＡＭＰの除去によって、試料中に共存するＭＫによるＡＤＰ−ＨＫ反応系に及ぼす影響を実質的に回避する方法である。ここで「ＡＭＰを実質的に除去する」とは、ＭＫの基質として働かない程度にまで該ＡＭＰが分解されていることを意味し、また「試料中に共存するＭＫの影響」とは、試料中に共存するＭＫによって、いったんＡＤＰ−ＨＫ反応によって生じたＡＭＰがＡＤＰへと逆戻りし、本来の値よりも高値となることを意味し、「試料中に共存するＭＫの影響を実質的に排除する」とは、当該「ＭＫの影響の排除」が、少なくとも、酵素活性や基質濃度の測定において、その測定値に影響がでない程度にまでなされていることを意味している。
さらに、上述の様にＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去することにより、試料中に共存するＭＫの影響を実質的に受けない、試料にＡＤＰ−ＨＫを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法を得ることができる。
【００１５】
以下にクレアチニンの測定例を挙げて本発明を詳細に説明する。クレアチニンは一連の反応式(5) 〜(8) に示す測定原理により定量することができる。
【００１６】
【化３】
【００１７】
この一連の反応は、緩衝液中で行われるが、クレアチニンデイミナーゼ（ＣＲＩＭＩ）、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＮＭＨase ）、ＡＤＰ−ＨＫ、及びＧ６ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）等の使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ７．５〜８．５の範囲で緩衝能を有する適切な緩衝剤を選択する。一般には、Ｔｒｉｓ緩衝液等が選択される。さらに、当該一連の反応は、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行い、通常１〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる各種の酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。試料として血液等の生体試料を用いる場合は、例えばＣＲＩＭＩは０．３〜１０Ｕ／ｍｌ、ＮＭＨase は０．１〜２Ｕ／ｍｌ、ＡＤＰ−ＨＫは０．５〜１０Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨは０．５〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。当該一連の反応において用いられる二価金属イオン（Ｍ2+）としては通常、マグネシウム又はマンガンが選ばれ、０．１〜２０ｍＭで使用される。試料中にＭＫが共存している場合には、ここで反応過程で生成されるＡＭＰが、試料中に共存するＡＴＰとＭＫの作用でＡＤＰに変換されるのを防ぐために、ＡＭＰデアミナーゼやＡＭＰヌクレオシダーゼ等のＡＭＰ加水分解酵素を添加する。本発明において用いられるこれらの加水分解酵素の量は、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰの量、反応条件等によっても異なるが、通常、酵素の量として０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ程度を反応系に添加する。２種以上を併用する場合は適宜増減できる。
【００１８】
当該ＡＭＰ加水分解酵素は、ＡＭＰ加水分解酵素単独で反応系に添加する以外に、これら試料中の酵素活性や基質濃度の測定において使用する試薬に一要素として必要量を安定な状態で含めておくことができる。ＡＭＰ加水分解酵素を一要素として含む試薬は、当該反応系に必要な他の酵素等の試薬とともに、必要量を併せて梱包しキットとすることが、臨床検査用等の応用に際して好適である。
ＡＭＰ加水分解酵素を一要素として含む試薬に含められる、又は別個に梱包し、キットとして含められる試薬は、測定対象によっても異なるが、ＡＭＰ加水分解酵素（ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ又は５’−ヌクレオチダーゼ等）の他に、本発明はＡＤＰ−ＨＫ反応系を利用するものであるので、少なくとも、ＡＤＰ−ＨＫ、基質としてのヘキソース（グルコース等；測定対象が当該ヘキソースの場合はこの限りではない。）、二価金属イオン（マグネシウム、マンガン等）が含められる。これらの試薬は、安定性を保持している限り適宜緩衝液に溶解した状態で含めることも可能である。さらに、必要に応じて緩衝剤等を含めてもよい。
【００１９】
ＡＤＰ−ＨＫ反応系にＡＭＰ加水分解酵素を添加して、ＡＭＰを加水分解する本発明の方法は、試料中に共存するＭＫの妨害を回避するばかりでなく、以下のような方法にも適用できる。すなわち、当該反応系において生じるＡＭＰを直接定量することが可能となる。さらに、ＡＭＰを酵素的に加水分解することによりＡＭＰを定量する方法を利用することにより、試料にＡＤＰ−ＨＫを作用させて試料中の基質濃度や酵素活性を測定する、就中高感度に測定する方法が提供され得る。
【００２０】
ＡＭＰデアミナーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(9),(10)に示す測定原理によって測定することができる。すなわち反応式(9) の結果生じるイノシン−１−リン酸をイノシン−１−リン酸デヒドロゲナーゼで反応させることによりＮＡＤＨの生成量として測定できる。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ７〜８．５の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えばＡＭＰデアミナーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼは０．３〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。
【００２１】
【化４】
【００２２】
さらにこの時、ＡＤＰ−ＨＫの作用により生じるもう一方の生成物であるグルコース−６−リン酸について、前述の反応式(8) で示されるように、Ｇ−６−ＰＤＨの作用でＮＡＤＨを生成させれば２倍のＮＡＤＨ量として検出できるため、高感度測定が可能になる。
【００２３】
ＡＭＰヌクレオシダーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(11)〜(15)に示す測定原理によって測定することができる。すなわち、反応式(11)の結果生じるアデニンをアデノシンデアミナーゼでイノシンに変換し（反応式(12)）、イノシンをプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼでヒポキサンチンに変換し（反応式(13)）、さらにヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼで酸化して生じる過酸化水素（反応式(14)）を定量すれば、１分子のＡＭＰから２分子の過酸化水素を発生させることができ高感度化定量が可能である。さらにウリカーゼを作用させれば、反応式(15)に示されるように尿酸からもう１分子の過酸化水素が発生させられるので合計３倍の感度の上昇が可能である。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ６〜８．５の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えばＡＭＰヌクレオシダーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、アデノシンデアミナーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、キサンチンオキシダーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、ウリカーゼは０．０５〜５Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。最終生成物である過酸化水素は、ペルオキシダーゼを用いる常法により比色定量することができる。
【００２４】
【化５】
【００２５】
５’ヌクレオチダーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(16),(17) に示す測定原理によって測定することができる。すなわち、反応式(16)の結果生じるアデノシンをアデノシンオキシダーゼで酸化させ過酸化水素を発生させ（反応式(17)）、その過酸化水素をペルオキシダーゼを用いる常法により比色定量する。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ６〜８の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えば５’ヌクレオチダーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、アデノシンオキシダーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。
【００２６】
【化６】
【００２７】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために参考例、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
尚、緩衝剤として用いたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸をそれぞれトリスおよびＨＥＰＥＳと略記する。
参考例：クレアチニン濃度の測定（従来法）
１）測定試薬の調製
参考例として、以下の組成の試薬を調製し、従来法である阻害剤を用いた測定法を行った。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ５ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
Ａｐ５Ａ Ｘ μＭ
【００２８】
２）測定
上記の第２試薬中のＡｐ５Ａ （アデニレートキナーゼ阻害剤）の濃度（ＸμＭ）を０、４２．５、８５、１７０、３４０、６８０、及び１３６０μＭと変化させた。尚、最終反応液中のＡｐ５Ａ濃度はそれぞれ０、１０、２０、４０、８０、１６０、及び３２０μＭとなるように調製した。約２０ｍｇ／Ｌのクレアチニン水溶液にヒト筋肉由来のアデニレートキナーゼ（ＭＫ）を、５，０００Ｕ／ｍｌ含ませたものと含ませていないものをそれぞれ測定試料とした。試料２０μｌに第１試薬２４０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベート後、波長３４０ｎｍの吸光度Ａ１を測定する。第２試薬を８０μｌ加えて反応を開始させる。５分間反応させた後、再度波長３４０ｎｍの吸光度Ａ２を測定する。クレアチニン濃度は次式により求めた。
【００２９】
【化７】
【００３０】
３）結果
表１に示すようにＭＫを含まない試料では、阻害剤Ａｐ５Ａの有無に関係なく調製したクレアチニン濃度とほぼ等しい値が測定されている。一方、ＭＫを含む試料ではＡｐ５Ａの濃度依存的に測定値が減少し、Ａｐ５ＡがＭＫの影響を減少させていることがわかる。しかし、３２０μＭのＡｐ５Ａでも完全にはＭＫの影響を除去することはできなかった。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例１：クレアチニン濃度の測定（ＡＭＰデアミナーゼの使用）
１）測定試薬の調製
以下の組成の試薬を調製し、本発明の方法によるＡＭＰデアミナーゼの効果を調べた。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ｙ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
【００３３】
２）測定・結果
上記の第１試薬中のＡＭＰデアミナーゼの濃度（ｙＵ／ｍｌ）を０、１、２、４、８、及び１６Ｕ／ｍｌと変化させた。また、各種濃度のＡＭＰデアミナーゼに加え、第２試薬にＡｐ５Ａを最終濃度１０μＭとなるように添加した場合についても同様に操作した。試料は参考例と同じものを用い、参考例と同様に操作してそれぞれのクレアチニン濃度を測定した。ＭＫ（５，０００Ｕ／ｍｌ）を含ませた測定試料についての結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
ＡＭＰデアミナーゼを２Ｕ／ｍｌ添加することにより、ほぼ完全にＭＫの影響を除去できることがわかった。また参考例では１０μＭのＡｐ５Ａの添加ではＭＫの影響をほとんど除去できなかったが、１Ｕ／ｍｌのＡＭＰデアミナーゼを添加することにより１０μＭのＡｐ５Ａ濃度でもほぼ完全にＭＫの影響を除去できることがわかり、両者を混合することにより効果的にＭＫの影響を除去できることもわかった。
【００３６】
実施例２：クレアチニン濃度の測定（ＡＭＰヌクレオシダーゼの使用）
実施例１のＡＭＰデアミナーゼの代わりにＡＭＰヌクレオシダーゼを用いて操作し、ＡＭＰヌクレオシダーゼの効果を調べた。その結果を表３に示した。ＡＭＰヌクレオシダーゼもＡＭＰデアミナーゼ同様の効果が認められた。
【００３７】
【表３】
【００３８】
実施例３：ＡＭＰの定量に基づくクレアチニン濃度の測定
１）測定試薬の調製
本発明のＡＭＰの加水分解によるＡＭＰの定量法の効果を確かめるために以下の組成の試薬を調製した。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰヌクレオシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
アデノシンデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
キサンチンオキシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
カタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ
トリヨードフェノール ４ ｍＭ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ ２５ ｍＭ
４−アミノアンチピリン １．６ｍＭ
ペルオキシダーゼ ２０ Ｕ／ｍｌ
アジ化ナトリウム ５０ ｍＭ
【００３９】
２）測定・結果
試料は約２０ｍｇ／Ｌのクレアチニン濃度を含むヒト血清にヒト筋肉由来の精製ＭＫ５，０００Ｕ／ｍｌを添加したものをもとに同じヒト血清で希釈しＭＫ濃度０、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、及び５，０００Ｕ／ｍｌとなるよう調製した。さらに、ヒト血球を生理食塩水で３回洗浄後、精製水中で溶血させ、前述のヒト血清と１：９の比率で混合した溶血試料を調製した（５ｇ／Ｌのヘモグロビン相当）。この試料を生理食塩水と血清を１：９で混和したヘモグロビン０ｇ／ｍｌ濃度の試料で希釈し、ヘモグロビン０、１、２、３、４、及び５ｇ／Ｌ濃度の試料を調製した。
２０μｌの検体に第１試薬２４０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、波長５４６ｎｍの吸光度Ａ1 を測定した。第２試薬を８０μｌ加えて反応を開始させ、５分間反応させた後、再度波長５４６ｎｍの吸光度Ａ2 を測定した。クレアチニン濃度は標準液の吸光度と対比して算出した。結果を表４に示す。この結果、試料中のＭＫ濃度に関係なく測定値が一定であること、及びＭＫが含まれることが知られている溶血試料においても測定値が一定であることから、本発明の方法はこれらの影響を除去できることが明らかである。さらに、得られた吸光度を実施例２で得られた吸光度と比較すると約７倍もの高感度測定が実現されている。この結果は、用いた色原体のみかけの分子吸光係数がＮＡＤＨの約３．５倍であることと、過酸化水素が２倍量生成するためであり、本発明の方法が実施できることが明らかとなった。
【００４０】
【表４】
【００４１】
実施例４：尿素窒素濃度の測定
Ａ法、Ｂ法及びＣ法により、尿素窒素濃度を測定した。ここでＡ法は、ＡＭＰを加水分解することなしに測定する方法であり、Ｂ法はＡＭＰを加水分解した後、残っているグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を、Ｃ法はＡＭＰを加水分解した後、水解して得られた水解物を測定したものである。即ち、本発明の方法はＢ法及びＣ法に相当する。各方法について以下の試薬を調製した。
＜Ａ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ３ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
＜Ｂ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ３ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
＜Ｃ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ ３ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
【００４２】
２）測定・結果
溶血ヒト血清及び非溶血血清各５例について、上記Ａ、Ｂ、及びＣの各方法でそれぞれ尿素窒素の定量を行った。検体３μｌに第１試薬２７０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベート後、波長３４０ｎｍで吸光度を測定する。第２試薬８０μｌを添加して反応を開始させる。５分後に再度吸光度を測定し、第２試薬添加前後の吸光度差から次式により尿素窒素濃度を求めた。
【００４３】
【化８】
【００４４】
測定結果を表５に示した。この結果、非溶血検体の測定値は３法とも大差ないのに対して、溶血検体ではＡＭＰを加水分解しないままで行うＡ法での測定値が他の２法に比べて異常に高く測定されている。これは溶血によりＭＫが高濃度に共存するため、その影響を受けて、ＡＭＰを分解できないＡ法ではＡＭＰからＡＤＰが生成され高値に測定されたものと考えられる。また、ＡＤＰ−ＨＫの作用により生じるＡＭＰとＧ６Ｐのうち、ＡＭＰを加水分解させて残ったＧ６Ｐを測定しているＢ法とＡＭＰを加水分解させてその水解物を測定しているＣ法を比較した場合、両方の測定結果がほぼ一致していることから、本発明の方法が再現性に優れ、有効であることが明らかである。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【発明の効果】
ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系から除去することにより、公知の阻害剤を使用しなくとも、試料中に共存するＭＫのＡＤＰ−ＨＫ反応系に及ぼす影響を排除でき、かつこのＡＭＰ加水分解酵素の利用により、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを定量することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査や食品検査の分野において行われる検査方法に関するものであり、試料中の酵素活性や基質濃度を測定する方法に関する。より詳細には、本発明は、定量性に優れた、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系を利用して試料中の酵素活性や基質濃度を測定するための方法ならびにそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
耐熱性細菌（Thermococcus由来、Pyrococcus由来）よりアデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）依存性のヘキソキナーゼ（ＨＫ）（以下、ＡＤＰ依存性のヘキソキナーゼをＡＤＰ−ＨＫともいう）が分離、精製されている。本酵素は、通常のリン酸化酵素とは異なり、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を基質としないで、ＡＤＰと特異的に反応してＡＭＰと６単糖リン酸化物（グルコース−６−リン酸等）を生じる反応を触媒する（反応式(1) ）。
【０００３】
【化１】
本酵素は安定性が高いため、グルコースや中性脂肪等の基質及びクレアチンリン酸キナーゼ等の酵素類の測定に有効であることが知られている〔オランダ特許9400836 、J. Biol. Chem. (1994), 269, 17537-17541 、J. Biol. Chem. (1995), 270, 30453-30457 、Arch. Microbiol. (1997), 167, 217-232 〕。
【０００５】
本酵素を用いて、物質Ａを定量する原理は一連の反応式(2) 〜(4) で例示される。
【０００６】
【化２】
この場合、最終的に生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を波長３４０ｎｍの吸光度で測定することになるが、生体試料とりわけ血清中の物質を測定する際に、血清中に含まれるアデニレートキナーゼ（ＭＫ）の作用により、反応過程で生じるＡＭＰがＡＤＰに逆戻りするため、正確な定量が不可能である。このＭＫの作用を阻害するために、Ｐ１，Ｐ５−ジ（アデノシン−５’）５リン酸（Ａｐ５Ａ）が使用されている。しかし、本阻害剤単独ではＭＫの活性を完全に阻害することは困難であった（臨床化学・補冊236-255, 1987 ）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＡＤＰ−ＨＫの作用により基質や酵素を定量する方法において、上述のような試料中に共存するＭＫの影響を回避して定量性を向上させる方法を提供することである。さらに本発明の別の目的は、ＡＤＰ−ＨＫを作用させる反応系（以下、ＡＤＰ−ＨＫ反応系ともいう）において生じるＡＭＰの定量的な測定方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＤＰ−ＨＫ反応の直接の生成物であるＡＭＰを酵素的に加水分解することにより、共存するＭＫの影響を回避できることを見出し、さらにＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することにより当該ＡＭＰを定量できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを加水分解する酵素を用いて、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去する方法。
(2) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(1) 記載の方法。
(3) 上記(1) 又は(2) 記載の、ＡＭＰを実質的に除去する方法にてＡＭＰを実質的に除去することにより、少なくともＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼと試料とを反応させる反応系に及ぼす、試料中に共存するアデニレートキナーゼの影響を実質的に排除する方法。
(4) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを定量する方法。
(5) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(4) 記載の方法。
(6) 加水分解して生成した物質がイノシン−１−リン酸、アデニン及びアデノシンからなる群より選択される少なくとも１種である上記(4) 又は(5) 記載の方法。
(7) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
(8) ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
(9) ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(7) 又は(8) 記載の方法。
(10)試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定するための試薬であって、ＡＭＰを加水分解する酵素を一要素として含む試薬。
(11)ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５'ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である上記(10)記載の試薬。
【００１１】
本発明におけるＡＤＰ−ＨＫ反応系を利用する具体的な例としては、試料中のグルコース、中性脂肪、尿素窒素、クレアチニン、１，５アンヒドログルシトール等の基質、クレアチンリン酸キナーゼ、コリンエステラーゼ等の酵素等の測定が挙げられる。
【００１２】
本発明の方法が適用可能な試料としては、予め各成分の濃度が既知の、調製試料の他、各成分の濃度が未知の生体試料が用いられる。生体試料としては、ヒトをはじめとした対象の哺乳動物の血液、血清、尿等の体液等が挙げられる。
臨床検査用に採取された試料も好適に用いられる。
【００１３】
本発明において使用されるＡＭＰを加水分解する酵素（以下、ＡＭＰ加水分解酵素ともいう）は、ＡＭＰを加水分解できるものであれば特に限定されないが、具体的にはEC No. 3.5.4.6 ＡＭＰデアミナーゼ、EC No. 3.2.2.4 ＡＭＰヌクレオシダーゼ及びEC No. 3.1.3.6 ５’−ヌクレオチダーゼ等が挙げられ、これらの酵素は単独又は２種以上を組み合わせて用いることも可能である。
ＡＭＰデアミナーゼとしては動物組織、植物及び酵母由来等のものが使用出来るが、好ましくはウサギ筋肉由来のものが利用される。ＡＭＰヌクレオシダーゼとしてはAzotobacter vinelandii等の微生物由来のものが、５’−ヌクレオチダーゼとしては酵母またはじゃがいも由来のものが利用できる。
【００１４】
本発明は、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを、ＡＤＰに変換させること無しにＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ又は５’−ヌクレオチダーゼ等のＡＭＰ加水分解酵素で処理することにより加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去する方法であり、また、当該ＡＭＰの除去によって、試料中に共存するＭＫによるＡＤＰ−ＨＫ反応系に及ぼす影響を実質的に回避する方法である。ここで「ＡＭＰを実質的に除去する」とは、ＭＫの基質として働かない程度にまで該ＡＭＰが分解されていることを意味し、また「試料中に共存するＭＫの影響」とは、試料中に共存するＭＫによって、いったんＡＤＰ−ＨＫ反応によって生じたＡＭＰがＡＤＰへと逆戻りし、本来の値よりも高値となることを意味し、「試料中に共存するＭＫの影響を実質的に排除する」とは、当該「ＭＫの影響の排除」が、少なくとも、酵素活性や基質濃度の測定において、その測定値に影響がでない程度にまでなされていることを意味している。
さらに、上述の様にＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去することにより、試料中に共存するＭＫの影響を実質的に受けない、試料にＡＤＰ−ＨＫを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法を得ることができる。
【００１５】
以下にクレアチニンの測定例を挙げて本発明を詳細に説明する。クレアチニンは一連の反応式(5) 〜(8) に示す測定原理により定量することができる。
【００１６】
【化３】
この一連の反応は、緩衝液中で行われるが、クレアチニンデイミナーゼ（ＣＲＩＭＩ）、Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＮＭＨase ）、ＡＤＰ−ＨＫ、及びＧ６ＰＤＨ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）等の使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ７．５〜８．５の範囲で緩衝能を有する適切な緩衝剤を選択する。一般には、Ｔｒｉｓ緩衝液等が選択される。さらに、当該一連の反応は、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行い、通常１〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる各種の酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。試料として血液等の生体試料を用いる場合は、例えばＣＲＩＭＩは０．３〜１０Ｕ／ｍｌ、ＮＭＨase は０．１〜２Ｕ／ｍｌ、ＡＤＰ−ＨＫは０．５〜１０Ｕ／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨは０．５〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。当該一連の反応において用いられる二価金属イオン（Ｍ2+）としては通常、マグネシウム又はマンガンが選ばれ、０．１〜２０ｍＭで使用される。試料中にＭＫが共存している場合には、ここで反応過程で生成されるＡＭＰが、試料中に共存するＡＴＰとＭＫの作用でＡＤＰに変換されるのを防ぐために、ＡＭＰデアミナーゼやＡＭＰヌクレオシダーゼ等のＡＭＰ加水分解酵素を添加する。本発明において用いられるこれらの加水分解酵素の量は、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰの量、反応条件等によっても異なるが、通常、酵素の量として０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ程度を反応系に添加する。２種以上を併用する場合は適宜増減できる。
【００１８】
当該ＡＭＰ加水分解酵素は、ＡＭＰ加水分解酵素単独で反応系に添加する以外に、これら試料中の酵素活性や基質濃度の測定において使用する試薬に一要素として必要量を安定な状態で含めておくことができる。ＡＭＰ加水分解酵素を一要素として含む試薬は、当該反応系に必要な他の酵素等の試薬とともに、必要量を併せて梱包しキットとすることが、臨床検査用等の応用に際して好適である。
ＡＭＰ加水分解酵素を一要素として含む試薬に含められる、又は別個に梱包し、キットとして含められる試薬は、測定対象によっても異なるが、ＡＭＰ加水分解酵素（ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ又は５’−ヌクレオチダーゼ等）の他に、本発明はＡＤＰ−ＨＫ反応系を利用するものであるので、少なくとも、ＡＤＰ−ＨＫ、基質としてのヘキソース（グルコース等；測定対象が当該ヘキソースの場合はこの限りではない。）、二価金属イオン（マグネシウム、マンガン等）が含められる。これらの試薬は、安定性を保持している限り適宜緩衝液に溶解した状態で含めることも可能である。さらに、必要に応じて緩衝剤等を含めてもよい。
【００１９】
ＡＤＰ−ＨＫ反応系にＡＭＰ加水分解酵素を添加して、ＡＭＰを加水分解する本発明の方法は、試料中に共存するＭＫの妨害を回避するばかりでなく、以下のような方法にも適用できる。すなわち、当該反応系において生じるＡＭＰを直接定量することが可能となる。さらに、ＡＭＰを酵素的に加水分解することによりＡＭＰを定量する方法を利用することにより、試料にＡＤＰ−ＨＫを作用させて試料中の基質濃度や酵素活性を測定する、就中高感度に測定する方法が提供され得る。
【００２０】
ＡＭＰデアミナーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(9),(10)に示す測定原理によって測定することができる。すなわち反応式(9) の結果生じるイノシン−１−リン酸をイノシン−１−リン酸デヒドロゲナーゼで反応させることによりＮＡＤＨの生成量として測定できる。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ７〜８．５の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えばＡＭＰデアミナーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼは０．３〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。
【００２１】
【化４】
さらにこの時、ＡＤＰ−ＨＫの作用により生じるもう一方の生成物であるグルコース−６−リン酸について、前述の反応式(8) で示されるように、Ｇ−６−ＰＤＨの作用でＮＡＤＨを生成させれば２倍のＮＡＤＨ量として検出できるため、高感度測定が可能になる。
【００２３】
ＡＭＰヌクレオシダーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(11)〜(15)に示す測定原理によって測定することができる。すなわち、反応式(11)の結果生じるアデニンをアデノシンデアミナーゼでイノシンに変換し（反応式(12)）、イノシンをプリンヌクレオシドフォスフォリラーゼでヒポキサンチンに変換し（反応式(13)）、さらにヒポキサンチンをキサンチンオキシダーゼで酸化して生じる過酸化水素（反応式(14)）を定量すれば、１分子のＡＭＰから２分子の過酸化水素を発生させることができ高感度化定量が可能である。さらにウリカーゼを作用させれば、反応式(15)に示されるように尿酸からもう１分子の過酸化水素が発生させられるので合計３倍の感度の上昇が可能である。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ６〜８．５の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えばＡＭＰヌクレオシダーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、アデノシンデアミナーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、キサンチンオキシダーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ、ウリカーゼは０．０５〜５Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。最終生成物である過酸化水素は、ペルオキシダーゼを用いる常法により比色定量することができる。
【００２４】
【化５】
５’ヌクレオチダーゼを使用する場合には、例えば、一連の反応式(16),(17) に示す測定原理によって測定することができる。すなわち、反応式(16)の結果生じるアデノシンをアデノシンオキシダーゼで酸化させ過酸化水素を発生させ（反応式(17)）、その過酸化水素をペルオキシダーゼを用いる常法により比色定量する。当該反応は、使用する酵素の活性至適ｐＨ条件下、通常ｐＨ６〜８の範囲で、酵素の活性至適温度下、通常２５〜４０℃で行う。通常２〜３０分で最終生成物を得ることができる。当該一連の反応において用いられる酵素の量は、適宜、基質の量に応じ、十分量を添加する。当該一連の反応において、例えば試料として血液等の生体試料を用いた場合は、例えば５’ヌクレオチダーゼは０．１〜２０Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍｌ）、アデノシンオキシダーゼは０．１〜１０Ｕ／ｍｌ程度が通常添加される。
【００２６】
【化６】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために参考例、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
尚、緩衝剤として用いたトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸をそれぞれトリスおよびＨＥＰＥＳと略記する。
参考例：クレアチニン濃度の測定（従来法）
１）測定試薬の調製
参考例として、以下の組成の試薬を調製し、従来法である阻害剤を用いた測定法を行った。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ５ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
Ａｐ５Ａ Ｘ μＭ
【００２８】
２）測定
上記の第２試薬中のＡｐ５Ａ （アデニレートキナーゼ阻害剤）の濃度（ＸμＭ）を０、４２．５、８５、１７０、３４０、６８０、及び１３６０μＭと変化させた。尚、最終反応液中のＡｐ５Ａ濃度はそれぞれ０、１０、２０、４０、８０、１６０、及び３２０μＭとなるように調製した。約２０ｍｇ／Ｌのクレアチニン水溶液にヒト筋肉由来のアデニレートキナーゼ（ＭＫ）を、５，０００Ｕ／ｍｌ含ませたものと含ませていないものをそれぞれ測定試料とした。試料２０μｌに第１試薬２４０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベート後、波長３４０ｎｍの吸光度Ａ１を測定する。第２試薬を８０μｌ加えて反応を開始させる。５分間反応させた後、再度波長３４０ｎｍの吸光度Ａ２を測定する。クレアチニン濃度は次式により求めた。
【００２９】
【化７】
３）結果
表１に示すようにＭＫを含まない試料では、阻害剤Ａｐ５Ａの有無に関係なく調製したクレアチニン濃度とほぼ等しい値が測定されている。一方、ＭＫを含む試料ではＡｐ５Ａの濃度依存的に測定値が減少し、Ａｐ５ＡがＭＫの影響を減少させていることがわかる。しかし、３２０μＭのＡｐ５Ａでも完全にはＭＫの影響を除去することはできなかった。
【００３１】
【表１】
実施例１：クレアチニン濃度の測定（ＡＭＰデアミナーゼの使用）
１）測定試薬の調製
以下の組成の試薬を調製し、本発明の方法によるＡＭＰデアミナーゼの効果を調べた。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ｙ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
【００３３】
２）測定・結果
上記の第１試薬中のＡＭＰデアミナーゼの濃度（ｙＵ／ｍｌ）を０、１、２、４、８、及び１６Ｕ／ｍｌと変化させた。また、各種濃度のＡＭＰデアミナーゼに加え、第２試薬にＡｐ５Ａを最終濃度１０μＭとなるように添加した場合についても同様に操作した。試料は参考例と同じものを用い、参考例と同様に操作してそれぞれのクレアチニン濃度を測定した。ＭＫ（５，０００Ｕ／ｍｌ）を含ませた測定試料についての結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
ＡＭＰデアミナーゼを２Ｕ／ｍｌ添加することにより、ほぼ完全にＭＫの影響を除去できることがわかった。また参考例では１０μＭのＡｐ５Ａの添加ではＭＫの影響をほとんど除去できなかったが、１Ｕ／ｍｌのＡＭＰデアミナーゼを添加することにより１０μＭのＡｐ５Ａ濃度でもほぼ完全にＭＫの影響を除去できることがわかり、両者を混合することにより効果的にＭＫの影響を除去できることもわかった。
【００３６】
実施例２：クレアチニン濃度の測定（ＡＭＰヌクレオシダーゼの使用）
実施例１のＡＭＰデアミナーゼの代わりにＡＭＰヌクレオシダーゼを用いて操作し、ＡＭＰヌクレオシダーゼの効果を調べた。その結果を表３に示した。ＡＭＰヌクレオシダーゼもＡＭＰデアミナーゼ同様の効果が認められた。
【００３７】
【表３】
実施例３：ＡＭＰの定量に基づくクレアチニン濃度の測定
１）測定試薬の調製
本発明のＡＭＰの加水分解によるＡＭＰの定量法の効果を確かめるために以下の組成の試薬を調製した。
（第１試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ７ ｍＭ
ＣＲＩＭＩ ８ Ｕ／ｍｌ
ＮＭＨase ０．５Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰヌクレオシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
アデノシンデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
プリンヌクレオシドフォスフォリラーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
キサンチンオキシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
アスコルビン酸オキシダーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
カタラーゼ ５００ Ｕ／ｍｌ
トリヨードフェノール ４ ｍＭ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） １００ ｍＭ（ｐＨ８．０）
グルコース ５０ ｍＭ
ＡＴＰ ２５ ｍＭ
４−アミノアンチピリン １．６ｍＭ
ペルオキシダーゼ ２０ Ｕ／ｍｌ
アジ化ナトリウム ５０ ｍＭ
【００３９】
２）測定・結果
試料は約２０ｍｇ／Ｌのクレアチニン濃度を含むヒト血清にヒト筋肉由来の精製ＭＫ５，０００Ｕ／ｍｌを添加したものをもとに同じヒト血清で希釈しＭＫ濃度０、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、及び５，０００Ｕ／ｍｌとなるよう調製した。さらに、ヒト血球を生理食塩水で３回洗浄後、精製水中で溶血させ、前述のヒト血清と１：９の比率で混合した溶血試料を調製した（５ｇ／Ｌのヘモグロビン相当）。この試料を生理食塩水と血清を１：９で混和したヘモグロビン０ｇ／ｍｌ濃度の試料で希釈し、ヘモグロビン０、１、２、３、４、及び５ｇ／Ｌ濃度の試料を調製した。
２０μｌの検体に第１試薬２４０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、波長５４６ｎｍの吸光度Ａ1 を測定した。第２試薬を８０μｌ加えて反応を開始させ、５分間反応させた後、再度波長５４６ｎｍの吸光度Ａ2 を測定した。クレアチニン濃度は標準液の吸光度と対比して算出した。結果を表４に示す。この結果、試料中のＭＫ濃度に関係なく測定値が一定であること、及びＭＫが含まれることが知られている溶血試料においても測定値が一定であることから、本発明の方法はこれらの影響を除去できることが明らかである。さらに、得られた吸光度を実施例２で得られた吸光度と比較すると約７倍もの高感度測定が実現されている。この結果は、用いた色原体のみかけの分子吸光係数がＮＡＤＨの約３．５倍であることと、過酸化水素が２倍量生成するためであり、本発明の方法が実施できることが明らかとなった。
【００４０】
【表４】
実施例４：尿素窒素濃度の測定
Ａ法、Ｂ法及びＣ法により、尿素窒素濃度を測定した。ここでＡ法は、ＡＭＰを加水分解することなしに測定する方法であり、Ｂ法はＡＭＰを加水分解した後、残っているグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を、Ｃ法はＡＭＰを加水分解した後、水解して得られた水解物を測定したものである。即ち、本発明の方法はＢ法及びＣ法に相当する。各方法について以下の試薬を調製した。
＜Ａ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ３ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
＜Ｂ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
Ｇ６ＰＤＨ ３ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
＜Ｃ法＞
（第１試薬）
ＨＥＰＥＳ（緩衝剤） ２０ ｍＭ（ｐＨ７．０）
β−ＮＡＤＰ ２ ｍＭ
ウレアアミドリアーゼ １ Ｕ／ｍｌ
ＡＤＰ−ＨＫ ５ Ｕ／ｍｌ
ＡＭＰデアミナーゼ ５ Ｕ／ｍｌ
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ ３ Ｕ／ｍｌ
（第２試薬）
トリス（緩衝剤） ５０ ｍＭ（ｐＨ８．０）
塩化マグネシウム ３ ｍＭ
グルコース ５０ ｍＭ
炭酸水素カリウム １００ ｍＭ
ＡＴＰ １０ ｍＭ
【００４２】
２）測定・結果
溶血ヒト血清及び非溶血血清各５例について、上記Ａ、Ｂ、及びＣの各方法でそれぞれ尿素窒素の定量を行った。検体３μｌに第１試薬２７０μｌを加え、３７℃で５分間インキュベート後、波長３４０ｎｍで吸光度を測定する。第２試薬８０μｌを添加して反応を開始させる。５分後に再度吸光度を測定し、第２試薬添加前後の吸光度差から次式により尿素窒素濃度を求めた。
【００４３】
【化８】
測定結果を表５に示した。この結果、非溶血検体の測定値は３法とも大差ないのに対して、溶血検体ではＡＭＰを加水分解しないままで行うＡ法での測定値が他の２法に比べて異常に高く測定されている。これは溶血によりＭＫが高濃度に共存するため、その影響を受けて、ＡＭＰを分解できないＡ法ではＡＭＰからＡＤＰが生成され高値に測定されたものと考えられる。また、ＡＤＰ−ＨＫの作用により生じるＡＭＰとＧ６Ｐのうち、ＡＭＰを加水分解させて残ったＧ６Ｐを測定しているＢ法とＡＭＰを加水分解させてその水解物を測定しているＣ法を比較した場合、両方の測定結果がほぼ一致していることから、本発明の方法が再現性に優れ、有効であることが明らかである。
【００４５】
【表５】
【発明の効果】
ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系から除去することにより、公知の阻害剤を使用しなくとも、試料中に共存するＭＫのＡＤＰ−ＨＫ反応系に及ぼす影響を排除でき、かつこのＡＭＰ加水分解酵素の利用により、ＡＤＰ−ＨＫ反応系において生じるＡＭＰを定量することができる。
Claims (12)
- アデノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるアデノシン−５’−リン酸（ＡMＰ）を加水分解する酵素を用いて、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去する方法。
- ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５’ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１記載の方法。
- 請求項１又は２記載の、ＡＭＰを実質的に除去する方法にてＡＭＰを実質的に除去することにより、少なくともＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼと試料とを反応させる反応系に及ぼす、試料中に共存するアデニレートキナーゼの影響を実質的に排除する方法。
- ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを定量する方法。
- ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５’ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である請求項４記載の方法。
- 加水分解して生成した物質がイノシン−１−リン酸、アデニン及びアデノシンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項４又は５記載の方法。
- ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解し、当該反応系よりＡＭＰを実質的に除去することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
- ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させる反応系において生じるＡＭＰを酵素的に加水分解して生成した物質を定量することを特徴とする、試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定する方法。
- ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５’ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である請求項７又は８記載の方法。
- 試料にＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させて試料中の酵素活性及び／又は基質濃度を測定するための試薬であって、ＡＭＰを加水分解する酵素を一要素として含む試薬。
- アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）及びグルコースを含有する請求項１０に記載の試薬。
- ＡＭＰを加水分解する酵素が、ＡＭＰデアミナーゼ、ＡＭＰヌクレオシダーゼ及び５’ヌクレオチダーゼからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１０又は１１に記載の試薬。
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