JP2000300293A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬Info
- Publication number
- JP2000300293A JP2000300293A JP11350907A JP35090799A JP2000300293A JP 2000300293 A JP2000300293 A JP 2000300293A JP 11350907 A JP11350907 A JP 11350907A JP 35090799 A JP35090799 A JP 35090799A JP 2000300293 A JP2000300293 A JP 2000300293A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleoside
- glucose
- anhydroglucitol
- diphosphate
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 61
- MPCAJMNYNOGXPB-SLPGGIOYSA-N 1,5-anhydro-D-glucitol Chemical compound OC[C@H]1OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O MPCAJMNYNOGXPB-SLPGGIOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 title 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 96
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 96
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 46
- KAJAXXUCVJFKFM-SLPGGIOYSA-N [(2r,3s,4r,5s)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1CO[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O KAJAXXUCVJFKFM-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229940025237 fructose 1,6-diphosphate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- -1 nucleoside diphosphate Chemical class 0.000 claims description 140
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 138
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 76
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 74
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 63
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 63
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 63
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 claims description 61
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 claims description 61
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 40
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 38
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 38
- 102000012435 Phosphofructokinase-1 Human genes 0.000 claims description 33
- 108010022684 Phosphofructokinase-1 Proteins 0.000 claims description 33
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims description 23
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims description 21
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 14
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 11
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 17
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 10
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 10
- 108010001816 pyranose oxidase Proteins 0.000 description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 10
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 8
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 8
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 5
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 5
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 4
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 4
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 4
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006306 4-iodophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1I 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 2
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 2
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical group C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical group 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- QLAJNZSPVITUCQ-UHFFFAOYSA-N 1,3,2-dioxathietane 2,2-dioxide Chemical compound O=S1(=O)OCO1 QLAJNZSPVITUCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001917 2,4-dinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C(=C1*)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- ZOFMBTCGGPDAIC-UHFFFAOYSA-N 2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2h-tetrazol-2-ium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[NH+]=C(C=2C=CC=CC=2)N=N1 ZOFMBTCGGPDAIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 2-amino-9-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purine-6-thione Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=S)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SCVJRXQHFJXZFZ-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ZTQGWROHRVYSPW-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 ZTQGWROHRVYSPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYTYGFDMAMIXOO-UHFFFAOYSA-N 4-(tetrazol-2-yl)benzenesulfonic acid Chemical class C1=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C1N1N=NC=N1 XYTYGFDMAMIXOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTIMXJARBBCNGT-UHFFFAOYSA-N 4-methoxy-10-methyl-5h-phenazine Chemical compound CN1C2=CC=CC=C2NC2=C1C=CC=C2OC MTIMXJARBBCNGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCZQXJKDCHCTAI-UHFFFAOYSA-N 4h-1,3-dioxine Chemical compound C1OCC=CO1 UCZQXJKDCHCTAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IKECFYHQIOKZOE-UHFFFAOYSA-N C(=O)(O)CNC(=O)N1C2=CC=C(C=C2SC=2C=C(C=CC12)NC)NC Chemical compound C(=O)(O)CNC(=O)N1C2=CC=C(C=C2SC=2C=C(C=CC12)NC)NC IKECFYHQIOKZOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710184216 Cardioactive peptide Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N Dioxacarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC=C1C1OCCO1 SDKQRNRRDYRQKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N IDP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000047703 Nonion Species 0.000 description 1
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical class [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- RWHOZGRAXYWRNX-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1O RWHOZGRAXYWRNX-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- DPXDJGUFSPAFJZ-UHFFFAOYSA-L disodium;4-[3-methyl-n-(4-sulfonatobutyl)anilino]butane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC=CC(N(CCCCS([O-])(=O)=O)CCCCS([O-])(=O)=O)=C1 DPXDJGUFSPAFJZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 1
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000040 m-tolyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010077372 mast cell degranulating peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- VADCBWWRVPBNGE-UHFFFAOYSA-N n-methyl-3,7-bis(methylamino)phenothiazine-10-carboxamide Chemical compound CNC1=CC=C2N(C(=O)NC)C3=CC=C(NC)C=C3SC2=C1 VADCBWWRVPBNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000003854 p-chlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3-methylanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC=CC(C)=C1 IRQRBVOQGUPTLG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010069925 sorbitol-6-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 1
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 1
- IWLROWZYZPNOFC-UHFFFAOYSA-O thiamine triphosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N IWLROWZYZPNOFC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 グルコースを含有する試料中の特定物質，例
えば１，５−アンヒドログルシトールを簡便に定量する
方法並びにそれに用いる定量用試薬および定量用試薬キ
ットを提供する。 【解決手段】 グルコースを含有する試料中の１，５−
アンヒドログルシトールを定量する方法において、該試
料に、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に
変換し、かつ１，５−アンヒドログルシトールを１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換すること
ができる酵素系を作用させることにより１，５−アンヒ
ドログルシトール−６−リン酸を生成させ、ついで酸化
型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型
補酵素を定量することを特徴とする、１，５−アンヒド
ログルシトールの定量方法並びにそれに用いる定量用試
薬および定量用試薬キット。
えば１，５−アンヒドログルシトールを簡便に定量する
方法並びにそれに用いる定量用試薬および定量用試薬キ
ットを提供する。 【解決手段】 グルコースを含有する試料中の１，５−
アンヒドログルシトールを定量する方法において、該試
料に、グルコースをフルクトース−１，６−二リン酸に
変換し、かつ１，５−アンヒドログルシトールを１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変換すること
ができる酵素系を作用させることにより１，５−アンヒ
ドログルシトール−６−リン酸を生成させ、ついで酸化
型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型
補酵素を定量することを特徴とする、１，５−アンヒド
ログルシトールの定量方法並びにそれに用いる定量用試
薬および定量用試薬キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のグルコー
スを他の物質に変換した後、試料中の特定の物質、例え
ば１，５−アンヒドログルシトール等を酵素反応を利用
して定量する方法並びにそれに用いる定量用試薬および
定量用キットに関する。
スを他の物質に変換した後、試料中の特定の物質、例え
ば１，５−アンヒドログルシトール等を酵素反応を利用
して定量する方法並びにそれに用いる定量用試薬および
定量用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中にはグルコースが存在し、し
かも定量すべき物質に比べ非常に高濃度である場合があ
り、定量すべき物質の定量結果が不正確なものになる場
合がある。このような場合、該物質の定量に先立って、
試料中のグルコースを試料中から除去するか、定量すべ
き物質の定量に影響しない他の物質に変換した後定量す
る方法が行われる。
かも定量すべき物質に比べ非常に高濃度である場合があ
り、定量すべき物質の定量結果が不正確なものになる場
合がある。このような場合、該物質の定量に先立って、
試料中のグルコースを試料中から除去するか、定量すべ
き物質の定量に影響しない他の物質に変換した後定量す
る方法が行われる。
【０００３】試料中からグルコースを除去する方法とし
ては、例えばイオン交換カラムクロマトグラフィーでグ
ルコースを分離する方法（特開昭６３−１８５３９７号
公報、特公昭６４−６７５６号公報）等が知られてい
る。また試料中のグルコースを他の物質に変換する方法
としては、例えば、（１）アデノシン三リン酸存在下
に、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ等のリン酸化
酵素を作用させ、グルコースをグルコース−６−リン酸
に変換する方法、（２）酸素の存在下に、グルコースオ
キシダーゼ、ピラノースオキシダーゼまたはソルボース
オキシダーゼ等の酸化酵素を作用させ、グルコースをグ
ルコノラクトンに変換する方法が知られている。
ては、例えばイオン交換カラムクロマトグラフィーでグ
ルコースを分離する方法（特開昭６３−１８５３９７号
公報、特公昭６４−６７５６号公報）等が知られてい
る。また試料中のグルコースを他の物質に変換する方法
としては、例えば、（１）アデノシン三リン酸存在下
に、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ等のリン酸化
酵素を作用させ、グルコースをグルコース−６−リン酸
に変換する方法、（２）酸素の存在下に、グルコースオ
キシダーゼ、ピラノースオキシダーゼまたはソルボース
オキシダーゼ等の酸化酵素を作用させ、グルコースをグ
ルコノラクトンに変換する方法が知られている。
【０００４】これらの変換方法において種々の改良が知
られている。（１）のリン酸化酵素を用いる方法におい
ては、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホ
フラクトキナーゼを作用させ、グルコースをフルクトー
ス−１，６−二リン酸に変換させることにより、グルコ
ース−６−リン酸が平衡反応によりグルコースに再変換
されるのを防止する方法（特開平５−７６３９７号）、
酸化型補酵素存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼを作用させる方法（特開平１−３２０９９８号
公報、特開平３−２７２９９号公報、特開平６−２３７
７９４号公報）、アデノシン二リン酸存在下にピルビン
酸キナーゼを作用させ、グルコース消去時に減少するア
デノシン三リン酸の濃度変化を防止し、アデノシン三リ
ン酸濃度を一定に保つ方法（特開平２−１０４２９８号
公報）等が知られている。（２）の酸化酵素を用いる方
法においては、グルコースオキシダーゼを作用させた
後、カタラーゼを作用させ生成する過酸化水素を消去す
る方法（特開昭６３−１８５３９７号公報）等が知られ
ている。
られている。（１）のリン酸化酵素を用いる方法におい
ては、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホ
フラクトキナーゼを作用させ、グルコースをフルクトー
ス−１，６−二リン酸に変換させることにより、グルコ
ース−６−リン酸が平衡反応によりグルコースに再変換
されるのを防止する方法（特開平５−７６３９７号）、
酸化型補酵素存在下にグルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼを作用させる方法（特開平１−３２０９９８号
公報、特開平３−２７２９９号公報、特開平６−２３７
７９４号公報）、アデノシン二リン酸存在下にピルビン
酸キナーゼを作用させ、グルコース消去時に減少するア
デノシン三リン酸の濃度変化を防止し、アデノシン三リ
ン酸濃度を一定に保つ方法（特開平２−１０４２９８号
公報）等が知られている。（２）の酸化酵素を用いる方
法においては、グルコースオキシダーゼを作用させた
後、カタラーゼを作用させ生成する過酸化水素を消去す
る方法（特開昭６３−１８５３９７号公報）等が知られ
ている。
【０００５】しかしながら、グルコースを他の物質に変
換する際に使用する物質並びにその変換系で変化する物
質およびその濃度等により、物質を定量するための酵素
反応系が影響を受けてしまうという問題点がある。例え
ば、グルコースをグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ
を用いて消去しようとする場合（特開平５−７６３９７
号公報）には、アデノシン二リン酸が大量に生成してし
まうという問題点がある。特に、完全にグルコースを消
去するためにアデノシン三リン酸を十分量供給した場合
にはグルコース濃度の２倍高濃度のアデノシン二リン酸
が生成してしまうことになり、このアデノシン二リン酸
濃度の影響は無視できないものとなる。
換する際に使用する物質並びにその変換系で変化する物
質およびその濃度等により、物質を定量するための酵素
反応系が影響を受けてしまうという問題点がある。例え
ば、グルコースをグルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ
を用いて消去しようとする場合（特開平５−７６３９７
号公報）には、アデノシン二リン酸が大量に生成してし
まうという問題点がある。特に、完全にグルコースを消
去するためにアデノシン三リン酸を十分量供給した場合
にはグルコース濃度の２倍高濃度のアデノシン二リン酸
が生成してしまうことになり、このアデノシン二リン酸
濃度の影響は無視できないものとなる。
【０００６】髄液、血漿、血清、尿中など生体液中に存
在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が
低下し、糖尿病診断マーカーとして有用である１，５−
アンヒドログルシトールにおいては、１，５−アンヒド
ログルシトールがグルコースに酷似した構造を持ったも
のであり、また量的にもグルコースに比べて微量である
ことから、その定量は困難を極めている。
在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が
低下し、糖尿病診断マーカーとして有用である１，５−
アンヒドログルシトールにおいては、１，５−アンヒド
ログルシトールがグルコースに酷似した構造を持ったも
のであり、また量的にもグルコースに比べて微量である
ことから、その定量は困難を極めている。
【０００７】１，５−アンヒドログルシトールに作用す
る酵素としては、ソルボースオキシダーゼ、ピラノース
オキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アデ
ノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼなどがある。しか
しこれらの酵素は１，５−アンヒドログルシトールの他
に共存するグルコース等の糖類と反応してしまい、何ら
かの方法でグルコース等の糖類を除去あるいは消去する
必要がある。
る酵素としては、ソルボースオキシダーゼ、ピラノース
オキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコキナーゼ、アデ
ノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼなどがある。しか
しこれらの酵素は１，５−アンヒドログルシトールの他
に共存するグルコース等の糖類と反応してしまい、何ら
かの方法でグルコース等の糖類を除去あるいは消去する
必要がある。
【０００８】１，５−アンヒドログルシトールの酸化反
応を触媒するピラノースオキシダーゼまたはソルボース
オキシダーゼを用いて生成する過酸化水素を定量する方
法を用いる場合は下記のグルコース消去方法が知られて
いる。 （１）イオンクロマトカラムで試料中のグルコースを分
離した後、試料にピラノースオキシダーゼを作用させ生
成する過酸化水素を定量し１，５−アンヒドログルシト
ールを定量する方法（特開昭６３−１８５３０７号公
報、特開昭６４−６７５６号公報）、（２）試料中のグ
ルコースに、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ及び
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ
て、グルコースをピラノースオキシダーゼに反応しない
化合物に変換したのち、試料にピラノースオキシダーゼ
を作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５−アン
ヒドログルシトールを定量する方法（特開平１−３２０
９９８号公報、特開平３−２７２９９号公報）、（３）
試料中のグルコースに、グルコキナーゼとピルベートキ
ナーゼを用いてグルコースをピラノースオキシダーゼに
反応しない化合物に変えた後、試料にピラノースオキシ
ダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５
−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平２−
１０４２９８号公報）、（４）試料中のグルコースに、
ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６
−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをピ
ラノースオキシダーゼに反応しない化合物に変えた後、
試料にソルボースオキシダーゼまたはピラノースオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量し、１，
５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平５
−７６３９７号公報）等が知られている。
応を触媒するピラノースオキシダーゼまたはソルボース
オキシダーゼを用いて生成する過酸化水素を定量する方
法を用いる場合は下記のグルコース消去方法が知られて
いる。 （１）イオンクロマトカラムで試料中のグルコースを分
離した後、試料にピラノースオキシダーゼを作用させ生
成する過酸化水素を定量し１，５−アンヒドログルシト
ールを定量する方法（特開昭６３−１８５３０７号公
報、特開昭６４−６７５６号公報）、（２）試料中のグ
ルコースに、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼ及び
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ
て、グルコースをピラノースオキシダーゼに反応しない
化合物に変換したのち、試料にピラノースオキシダーゼ
を作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５−アン
ヒドログルシトールを定量する方法（特開平１−３２０
９９８号公報、特開平３−２７２９９号公報）、（３）
試料中のグルコースに、グルコキナーゼとピルベートキ
ナーゼを用いてグルコースをピラノースオキシダーゼに
反応しない化合物に変えた後、試料にピラノースオキシ
ダーゼを作用させ生成する過酸化水素を定量し、１，５
−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平２−
１０４２９８号公報）、（４）試料中のグルコースに、
ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ及び６
−ホスホフルクトキナーゼを作用させてグルコースをピ
ラノースオキシダーゼに反応しない化合物に変えた後、
試料にソルボースオキシダーゼまたはピラノースオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を定量し、１，
５−アンヒドログルシトールを定量する方法（特開平５
−７６３９７号公報）等が知られている。
【０００９】しかし（１）に記載のカラムを用いる方法
は操作性に問題があり、（２）〜（４）に記載の消去系
では、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼが、１，５
−アンヒドログルシトールにも作用し１，５−アンヒド
ログルシトール−６−リン酸を生成することから、正確
な１，５−アンヒドログルシトールの定量が困難であ
る。
は操作性に問題があり、（２）〜（４）に記載の消去系
では、ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼが、１，５
−アンヒドログルシトールにも作用し１，５−アンヒド
ログルシトール−６−リン酸を生成することから、正確
な１，５−アンヒドログルシトールの定量が困難であ
る。
【００１０】１，５−アンヒドログルシトールのリン酸
化反応を触媒するヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまた
はアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼを用いて生
成する物質を定量する方法を用いる場合は下記の方法が
知られている。（５）イオンクロマトカラムで試料中の
グルコースを分離した後、試料にヘキソキナーゼまたは
グルコキナーゼを作用させ生成するアデノシン二リン酸
を定量し１，５−アンヒドログルシトールを定量する方
法（特開平８−１０７７９６号）、（６）試料中のグル
コースに、（ａ）グルコースオキシダーゼ、またはグル
コースオキシダーゼおよびカタラーゼ、（ｂ）グルコー
スデヒドロゲナーゼ、あるいは、（ｃ）ヘキソキナーゼ
またはグルコキナーゼなどの酵素を作用させてグルコー
スをアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼに反応し
ない化合物に変えたのち、試料にアデノシン二リン酸依
存性ヘキソキナーゼおよび１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生成す
る還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）を定量することにより１，５−アンヒドログルシト
ールを定量する方法（特開平１０−１９１９９８号公
報）がある。
化反応を触媒するヘキソキナーゼ、グルコキナーゼまた
はアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼを用いて生
成する物質を定量する方法を用いる場合は下記の方法が
知られている。（５）イオンクロマトカラムで試料中の
グルコースを分離した後、試料にヘキソキナーゼまたは
グルコキナーゼを作用させ生成するアデノシン二リン酸
を定量し１，５−アンヒドログルシトールを定量する方
法（特開平８−１０７７９６号）、（６）試料中のグル
コースに、（ａ）グルコースオキシダーゼ、またはグル
コースオキシダーゼおよびカタラーゼ、（ｂ）グルコー
スデヒドロゲナーゼ、あるいは、（ｃ）ヘキソキナーゼ
またはグルコキナーゼなどの酵素を作用させてグルコー
スをアデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼに反応し
ない化合物に変えたのち、試料にアデノシン二リン酸依
存性ヘキソキナーゼおよび１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて生成す
る還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン
酸）を定量することにより１，５−アンヒドログルシト
ールを定量する方法（特開平１０−１９１９９８号公
報）がある。
【００１１】しかしながら、（５）の方法では操作が煩
雑である、（６）の方法においてはグルコースオキシダ
ーゼを用いる（ａ）の方法では、被検液中に高濃度のグ
ルコースが存在する場合は酸素供給が律速となる、グル
コースデヒドロゲナーゼを用いる（ｂ）の方法では、グ
ルコースから生成される還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（リン酸）の消去系が必要となる、ヘキ
ソキナーゼまたはグルコキナーゼを用いる（ｃ）の方法
では、グルコースから生成するグルコース−６−リン酸
に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼが作用してしまうため分別定量することがで
きず、またグルコースが大量に存在する糖尿病患者等に
由来する試料を測定対象とする場合には、反応系にアデ
ノシン二リン酸が大量に生成し１，５−アンヒドログル
シトールの定量が不正確となる等の問題がある。
雑である、（６）の方法においてはグルコースオキシダ
ーゼを用いる（ａ）の方法では、被検液中に高濃度のグ
ルコースが存在する場合は酸素供給が律速となる、グル
コースデヒドロゲナーゼを用いる（ｂ）の方法では、グ
ルコースから生成される還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（リン酸）の消去系が必要となる、ヘキ
ソキナーゼまたはグルコキナーゼを用いる（ｃ）の方法
では、グルコースから生成するグルコース−６−リン酸
に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼが作用してしまうため分別定量することがで
きず、またグルコースが大量に存在する糖尿病患者等に
由来する試料を測定対象とする場合には、反応系にアデ
ノシン二リン酸が大量に生成し１，５−アンヒドログル
シトールの定量が不正確となる等の問題がある。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、グル
コースを含有する試料中の特定の物質、例えば１，５−
アンヒドログルシトールを簡便に定量する方法、試料中
の特定物質を定量するに際し実質的にグルコースを完全
に消去できる試料中のグルコース消去方法、およびそれ
らのための試薬ならびにキットを提供することである。
コースを含有する試料中の特定の物質、例えば１，５−
アンヒドログルシトールを簡便に定量する方法、試料中
の特定物質を定量するに際し実質的にグルコースを完全
に消去できる試料中のグルコース消去方法、およびそれ
らのための試薬ならびにキットを提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、グルコースを
含有する試料に、グルコースをフルクトース−１，６−
二リン酸に変換し、かつ１，５−アンヒドログルシトー
ルを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変
換することができる酵素系を作用させることにより１，
５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を生成させ、
ついで酸化型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて１，
５−アンヒドログルシトール−6−リン酸の脱水素反応
を行い、生成する還元型補酵素を定量することを特徴と
するグルコース含有試料中の１，５−アンヒドログルシ
トールの定量方法に関する。
含有する試料に、グルコースをフルクトース−１，６−
二リン酸に変換し、かつ１，５−アンヒドログルシトー
ルを１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸に変
換することができる酵素系を作用させることにより１，
５−アンヒドログルシトール−６−リン酸を生成させ、
ついで酸化型補酵素存在下に１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させて１，
５−アンヒドログルシトール−6−リン酸の脱水素反応
を行い、生成する還元型補酵素を定量することを特徴と
するグルコース含有試料中の１，５−アンヒドログルシ
トールの定量方法に関する。
【００１４】また本発明は、（ａ）ヌクレオシド二リン
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６
−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソ
キナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナ
ーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホス
ホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナー
ゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、を含有する１，５−
アンヒドログルシトールの定量用試薬に関する。
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６
−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ，もしくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソ
キナーゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナ
ーゼから選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホス
ホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナー
ゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、を含有する１，５−
アンヒドログルシトールの定量用試薬に関する。
【００１５】また本発明は、（ａ）ヌクレオシド二リン
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよ
び６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬，もしくは
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよ
びヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ば
れる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソース
イソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む
試薬と、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む試薬とから
なる１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬キッ
トに関する。
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよ
び６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬，もしくは
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよ
びヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ば
れる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソース
イソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼを含む
試薬と、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む試薬とから
なる１，５−アンヒドログルシトールの定量用試薬キッ
トに関する。
【００１６】また本発明は、試料中に存在するグルコー
スに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン
酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフ
ルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトー
ス−１，６―二リン酸に変換することを特徴とする試料
中のグルコース消去方法に関する。
スに、ヌクレオシド二リン酸およびヌクレオシド三リン
酸の存在下、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフ
ルクトキナーゼを作用させて、グルコースをフルクトー
ス−１，６―二リン酸に変換することを特徴とする試料
中のグルコース消去方法に関する。
【００１７】また本発明は、ヌクレオシド二リン酸、ヌ
クレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキ
ソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―
ホスホフルクトキナーゼを含むグルコース消去用試薬に
関する。また本発明は、試料中のグルコースに、ヌクレ
オシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘ
キソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナー
ゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６―
二リン酸に変換したのち、試料中の成分を化学的または
酵素的反応を用いて定量することを特徴とするグルコー
ス含有試料中成分の定量方法に関する。
クレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキ
ソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―
ホスホフルクトキナーゼを含むグルコース消去用試薬に
関する。また本発明は、試料中のグルコースに、ヌクレ
オシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘ
キソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナー
ゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６―
二リン酸に変換したのち、試料中の成分を化学的または
酵素的反応を用いて定量することを特徴とするグルコー
ス含有試料中成分の定量方法に関する。
【００１８】また本発明は、ヌクレオシド二リン酸、ヌ
クレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキ
ソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―
ホスホフルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する
酵素または定量すべき物質と反応する物質とを含む、物
質の定量用試薬に関する。また本発明は、ヌクレオシド
二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン
酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラー
ゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、定
量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反
応する物質とを含む試薬とからなる物質の定量用試薬キ
ットに関する。
クレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキ
ソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―
ホスホフルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する
酵素または定量すべき物質と反応する物質とを含む、物
質の定量用試薬に関する。また本発明は、ヌクレオシド
二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン
酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラー
ゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、定
量すべき物質に作用する酵素または定量すべき物質と反
応する物質とを含む試薬とからなる物質の定量用試薬キ
ットに関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明で扱う試料としては、グル
コースが混在する可能性のある試料であればどのような
ものでもよく、例えば血液、血漿、血清、尿等の生体試
料があげられる。試料中のグルコースの消去は、グルコ
ースを下記反応式に従ってフルクトース−１，６−二リ
ン酸に変換することにより行われる。
コースが混在する可能性のある試料であればどのような
ものでもよく、例えば血液、血漿、血清、尿等の生体試
料があげられる。試料中のグルコースの消去は、グルコ
ースを下記反応式に従ってフルクトース−１，６−二リ
ン酸に変換することにより行われる。
【００２０】
【化１】
【００２１】グルコースをグルコース−６−リン酸に変
換しただけでは反応が可逆反応であるため生成したグル
コース−６−リン酸がグルコースに再変換してしまう
が、この反応系においては、グルコースをフルクトース
−１，６−二リン酸にまで変換することにより、グルコ
ースの再変換が進行せず試料中のグルコースが完全に消
去できる。
換しただけでは反応が可逆反応であるため生成したグル
コース−６−リン酸がグルコースに再変換してしまう
が、この反応系においては、グルコースをフルクトース
−１，６−二リン酸にまで変換することにより、グルコ
ースの再変換が進行せず試料中のグルコースが完全に消
去できる。
【００２２】グルコースからフルクトース−１，６−二
リン酸にまで変換する酵素系には、グルコースからグル
コース−６−リン酸を生成する酵素系（酵素系１とい
う）、グルコース−６−リン酸からフルクトース−６−
リン酸を生成する酵素系（酵素系２という）およびフル
クトース−６−リン酸からフルクトース−１，６−二リ
ン酸を生成する酵素系（酵素系３という）が含まれる。
リン酸にまで変換する酵素系には、グルコースからグル
コース−６−リン酸を生成する酵素系（酵素系１とい
う）、グルコース−６−リン酸からフルクトース−６−
リン酸を生成する酵素系（酵素系２という）およびフル
クトース−６−リン酸からフルクトース−１，６−二リ
ン酸を生成する酵素系（酵素系３という）が含まれる。
【００２３】酵素系１においては、（ａ）酵素がヌクレ
オシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌ
クレオシド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換
を伴うものと、（ｂ）酵素がヌクレオシド三リン酸依存
性ヘキソキナーゼまたはヌクレオシド三リン酸依存性グ
ルコキナーゼであり補酵素がヌクレオシド三リン酸から
ヌクレオシド二リン酸への変換を伴うものとがある。酵
素系２においては、酵素はホスホヘキソースイソメラー
ゼである。酵素系３においては、酵素は６−ホスホフル
クトキナーゼであり補酵素はヌクレオシド三リン酸から
ヌクレオシド二リン酸への変換を伴う。
オシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌ
クレオシド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換
を伴うものと、（ｂ）酵素がヌクレオシド三リン酸依存
性ヘキソキナーゼまたはヌクレオシド三リン酸依存性グ
ルコキナーゼであり補酵素がヌクレオシド三リン酸から
ヌクレオシド二リン酸への変換を伴うものとがある。酵
素系２においては、酵素はホスホヘキソースイソメラー
ゼである。酵素系３においては、酵素は６−ホスホフル
クトキナーゼであり補酵素はヌクレオシド三リン酸から
ヌクレオシド二リン酸への変換を伴う。
【００２４】酵素系１において、酵素がヌクレオシド二
リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシ
ド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うも
のである場合、グルコース濃度に応じてヌクレオシド二
リン酸が消費されるが、６−ホスホフルクトキナーゼに
より、ヌクレオシド三リン酸から、消費したヌクレオシ
ド二リン酸量と等しい量のヌクレオシド二リン酸が生成
されるため、ヌクレオシド二リン酸濃度を一定濃度に保
つことができ、試料中に含まれるグルコース濃度により
反応系に存在するヌクレオシド二リン酸濃度がばらつく
ことがない。
リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシ
ド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うも
のである場合、グルコース濃度に応じてヌクレオシド二
リン酸が消費されるが、６−ホスホフルクトキナーゼに
より、ヌクレオシド三リン酸から、消費したヌクレオシ
ド二リン酸量と等しい量のヌクレオシド二リン酸が生成
されるため、ヌクレオシド二リン酸濃度を一定濃度に保
つことができ、試料中に含まれるグルコース濃度により
反応系に存在するヌクレオシド二リン酸濃度がばらつく
ことがない。
【００２５】本発明においてグルコースの消去方法を実
施するに際しては、グルコースが共存する試料に（ａ）
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレ
オシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソー
スイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼ、も
しくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナー
ゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼか
ら選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキ
ソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ
を加え、必要に応じて水性媒体、酵素活性調節剤、賦活
剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容
体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等
の存在下に、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましく
は、２〜１０分間反応させる。
施するに際しては、グルコースが共存する試料に（ａ）
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレ
オシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソー
スイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼ、も
しくは（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナー
ゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼか
ら選ばれる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキ
ソースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ
を加え、必要に応じて水性媒体、酵素活性調節剤、賦活
剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容
体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等
の存在下に、１０〜５０℃で１〜３０分間、好ましく
は、２〜１０分間反応させる。
【００２６】ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼまたは
ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼの濃度は、
０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、１〜５０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。ホスホヘキソースイソメラーゼの濃度は、０．１〜
１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／ｍｌがよ
り好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
ゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼまたは
ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼの濃度は、
０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、１〜５０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。ホスホヘキソースイソメラーゼの濃度は、０．１〜
１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／ｍｌがよ
り好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。
【００２７】６−ホスホフルクトキナーゼの濃度は、
０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。
０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．５〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、５〜５０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。
【００２８】各酵素とも市販品が容易に入手可能であ
る。例えば、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼは、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus lito
ralis)またはピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus fu
riosus)由来の酵素が旭化成工業社より、ヌクレオシド
三リン酸依存性ヘキソキナーゼは、サッカロマイセス
（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyverom
yces）属、バチルス（Bacillus）属等の微生物由来の酵
素が、例えばオリエンタル酵母工業社、東洋紡社、ベー
リンガー・マンハイム社、旭化成工業社等より容易に入
手できる。ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼ
は、ザイモモナス（Zymomonas）属、バチルス（Bacillu
s）属等の微生物由来の酵素が、例えばユニチカ社等よ
り容易に入手できる。ホスホヘキソースイソメラーゼは
バチルス・ステアロサーモフィリウス（Bacillus stear
othermophilus）由来の酵素がユニチカ社より、６−ホ
スホフルクトキナーゼはバチルス・ステアロサーモフィ
リウス（Bacillus stearothermophilus）由来の酵素が
ユニチカ社より入手できる。
る。例えば、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼは、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus lito
ralis)またはピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus fu
riosus)由来の酵素が旭化成工業社より、ヌクレオシド
三リン酸依存性ヘキソキナーゼは、サッカロマイセス
（Saccharomyces）属、クルイベロマイセス（Kluyverom
yces）属、バチルス（Bacillus）属等の微生物由来の酵
素が、例えばオリエンタル酵母工業社、東洋紡社、ベー
リンガー・マンハイム社、旭化成工業社等より容易に入
手できる。ヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼ
は、ザイモモナス（Zymomonas）属、バチルス（Bacillu
s）属等の微生物由来の酵素が、例えばユニチカ社等よ
り容易に入手できる。ホスホヘキソースイソメラーゼは
バチルス・ステアロサーモフィリウス（Bacillus stear
othermophilus）由来の酵素がユニチカ社より、６−ホ
スホフルクトキナーゼはバチルス・ステアロサーモフィ
リウス（Bacillus stearothermophilus）由来の酵素が
ユニチカ社より入手できる。
【００２９】ヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド
三リン酸の濃度は、０．０１〜１００ｍＭが好ましく、
０．１〜５０ｍＭがより好ましく、１〜１０ｍＭが特に
好ましい。賦活剤としては、各種無機塩類があげられ例
えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等があげら
れる。無機塩類の濃度は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌ
が好ましく、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌがより好ましく、
０．１〜２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。
三リン酸の濃度は、０．０１〜１００ｍＭが好ましく、
０．１〜５０ｍＭがより好ましく、１〜１０ｍＭが特に
好ましい。賦活剤としては、各種無機塩類があげられ例
えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等があげら
れる。無機塩類の濃度は、０．００１〜１０ｍｇ／ｍｌ
が好ましく、０．０１〜５ｍｇ／ｍｌがより好ましく、
０．１〜２ｍｇ／ｍｌが特に好ましい。
【００３０】上記反応によりグルコースを消去した後、
試料中の物質を定量するのに必要な試薬の存在下に反応
をおこない、反応により生成した物質または減少した物
質を定量することによって目的の物質を定量できる。定
量に必要な試薬としては特に限定されないが、定量すべ
き物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する
物質を含む試薬があげられ、酵素を含有する試薬が好ま
しい。
試料中の物質を定量するのに必要な試薬の存在下に反応
をおこない、反応により生成した物質または減少した物
質を定量することによって目的の物質を定量できる。定
量に必要な試薬としては特に限定されないが、定量すべ
き物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する
物質を含む試薬があげられ、酵素を含有する試薬が好ま
しい。
【００３１】定量すべき物質に作用する酵素がグルコー
スにも作用し、しかも該酵素が触媒する反応がヌクレオ
シド二リン酸濃度に影響を受ける場合には、グルコース
消去方法としては、前述の（ａ）酵素がヌクレオシド二
リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシ
ド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うも
のが好ましい。
スにも作用し、しかも該酵素が触媒する反応がヌクレオ
シド二リン酸濃度に影響を受ける場合には、グルコース
消去方法としては、前述の（ａ）酵素がヌクレオシド二
リン酸依存性ヘキソキナーゼであり補酵素がヌクレオシ
ド二リン酸からヌクレオシド一リン酸への変換を伴うも
のが好ましい。
【００３２】該酵素としては、例えば、ヌクレオチダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ヌクレオ
シド二リン酸ピロホスファターゼ、ヌクレオシド二リン
酸グルコースピロホスホリラーゼ、ヌクレオシド二リン
酸依存性ヘキソキナーゼ、１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等があげられる。
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、ヌクレオ
シド二リン酸ピロホスファターゼ、ヌクレオシド二リン
酸グルコースピロホスホリラーゼ、ヌクレオシド二リン
酸依存性ヘキソキナーゼ、１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等があげられる。
【００３３】定量の対象が１，５−アンヒドログルシト
ールの場合、上記グルコース消去のための酵素系による
作用で同時に１，５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸が生成するため、この１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸を定量することにより試料中に存在し
た１，５−アンヒドログルシトールを定量することがで
きる。
ールの場合、上記グルコース消去のための酵素系による
作用で同時に１，５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸が生成するため、この１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸を定量することにより試料中に存在し
た１，５−アンヒドログルシトールを定量することがで
きる。
【００３４】上記反応によりグルコースを消去した後、
酸化型補酵素の存在下で１，５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼを加え、必要に応じて
水性媒体、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化
剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム
塩、他の酵素とその基質や補酵素等の存在下に、１０〜
５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間反応さ
せる。１，５−アンヒドログルシトール濃度は、反応に
より生成する還元型補酵素を直接例えば３４０ｎｍの吸
光度を測定するか、該還元型補酵素を他の物質に導き、
該物質を定量することにより定量できる。
酸化型補酵素の存在下で１，５−アンヒドログルシトー
ル−６−リン酸デヒドロゲナーゼを加え、必要に応じて
水性媒体、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化
剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム
塩、他の酵素とその基質や補酵素等の存在下に、１０〜
５０℃で１〜３０分間、好ましくは２〜１０分間反応さ
せる。１，５−アンヒドログルシトール濃度は、反応に
より生成する還元型補酵素を直接例えば３４０ｎｍの吸
光度を測定するか、該還元型補酵素を他の物質に導き、
該物質を定量することにより定量できる。
【００３５】１，５−アンヒドログルシトールの定量に
使用する酸化型補酵素または１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方
は、グルコース消去反応に影響しない範囲であらかじめ
グルコース消去反応に共存させていてもよい。ヌクレオ
シド二リン酸依存性ヘキソキナーゼとしては、グルコー
スを基質として、ヌクレオシド二リン酸を消費してグル
コース−６−リン酸およびヌクレオシド一リン酸を生成
する酵素であり、かつ１，５−アンヒドログルシトール
を基質としてヌクレオシド二リン酸を消費して１，５−
アンヒドログルシトール−６−リン酸およびヌクレオシ
ド一リン酸を生成する酵素であればいかなる酵素でもよ
い。ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼの例と
しては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳ
Ｍ３６３８株由来の酵素（特開平９−２３４０９８号公
報）、サーモコッカス・リトラリス由来の酵素（ＴＬＨ
Ｋ）が旭化成工業社から入手できる。
使用する酸化型補酵素または１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼのいずれか一方
は、グルコース消去反応に影響しない範囲であらかじめ
グルコース消去反応に共存させていてもよい。ヌクレオ
シド二リン酸依存性ヘキソキナーゼとしては、グルコー
スを基質として、ヌクレオシド二リン酸を消費してグル
コース−６−リン酸およびヌクレオシド一リン酸を生成
する酵素であり、かつ１，５−アンヒドログルシトール
を基質としてヌクレオシド二リン酸を消費して１，５−
アンヒドログルシトール−６−リン酸およびヌクレオシ
ド一リン酸を生成する酵素であればいかなる酵素でもよ
い。ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼの例と
しては、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳ
Ｍ３６３８株由来の酵素（特開平９−２３４０９８号公
報）、サーモコッカス・リトラリス由来の酵素（ＴＬＨ
Ｋ）が旭化成工業社から入手できる。
【００３６】ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナー
ゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼと
しては、グルコースを基質として、ヌクレオシド三リン
酸を消費してグルコース−６−リン酸およびヌクレオシ
ド二リン酸を生成する酵素であり、かつ、１，５−アン
ヒドログルシトールを基質としてヌクレオシド三リン酸
を消費して１，５−アンヒドログルシトール−６−リン
酸およびヌクレオシド二リン酸を生成する酵素であれば
いかなる酵素でもよい。具体的には、前記の酵素類があ
げられる。
ゼおよびヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼと
しては、グルコースを基質として、ヌクレオシド三リン
酸を消費してグルコース−６−リン酸およびヌクレオシ
ド二リン酸を生成する酵素であり、かつ、１，５−アン
ヒドログルシトールを基質としてヌクレオシド三リン酸
を消費して１，５−アンヒドログルシトール−６−リン
酸およびヌクレオシド二リン酸を生成する酵素であれば
いかなる酵素でもよい。具体的には、前記の酵素類があ
げられる。
【００３７】１，５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼとしては、１，５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸と酸化型補酵素からＣ6Ｈ11Ｏ8
Ｐ1で表される化合物と還元型補酵素を生成する酵素で
あればいかなる酵素でもよい。
ン酸デヒドロゲナーゼとしては、１，５−アンヒドログ
ルシトール−６−リン酸と酸化型補酵素からＣ6Ｈ11Ｏ8
Ｐ1で表される化合物と還元型補酵素を生成する酵素で
あればいかなる酵素でもよい。
【００３８】
【化２】
【００３９】この反応を触媒する酵素、１，５−アンヒ
ドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとして
は、例えばエッシェリヒア・コリ（E. coli）・ＤＨ１
（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来の酵素をあげることがで
きる。該酵素は、例えば特開平１０−８４９５３号公報
の記載に従って調製できる。１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応液中の濃度
は、０．５〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、１〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、２〜４０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。酸化型補酵素の反応液中の濃度は、０．１〜１００
ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましく、２〜２
０ｍＭが特に好ましい。
ドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼとして
は、例えばエッシェリヒア・コリ（E. coli）・ＤＨ１
（ＡＴＣＣ３３８４９）株由来の酵素をあげることがで
きる。該酵素は、例えば特開平１０−８４９５３号公報
の記載に従って調製できる。１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼの反応液中の濃度
は、０．５〜１００Ｕ／ｍｌが好ましく、１〜５０Ｕ／
ｍｌがより好ましく、２〜４０Ｕ／ｍｌが特に好まし
い。酸化型補酵素の反応液中の濃度は、０．１〜１００
ｍＭが好ましく、１〜５０ｍＭがより好ましく、２〜２
０ｍＭが特に好ましい。
【００４０】ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ヌク
レオシド三リン酸依存性グルコキナーゼ、ホスホヘキソ
ースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ、
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸の反応液
中の濃度は、前述のグルコースの消去反応に用いる濃度
と同一である。
ゼ、ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ヌク
レオシド三リン酸依存性グルコキナーゼ、ホスホヘキソ
ースイソメラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼ、
ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸の反応液
中の濃度は、前述のグルコースの消去反応に用いる濃度
と同一である。
【００４１】酸化型補酵素としては、酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、
チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等があげられる。ヌクレオシ
ド三リン酸としては、例えばアデノシン三リン酸、グア
ノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チアミン三リン
酸、ウリジン三リン酸、イノシン三リン酸等があげら
れ、アデノシン三リン酸が好ましい。
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、
チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等があげられる。ヌクレオシ
ド三リン酸としては、例えばアデノシン三リン酸、グア
ノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チアミン三リン
酸、ウリジン三リン酸、イノシン三リン酸等があげら
れ、アデノシン三リン酸が好ましい。
【００４２】ヌクレオシド二リン酸としては、例えばア
デノシン二リン酸、グアノシン二リン酸、シチジン二リ
ン酸、チアミン二リン酸、ウリジン二リン酸、イノシン
二リン酸等があげられ、アデノシン二リン酸が好まし
い。生成する還元型補酵素を他の物質に導き高感度に定
量する方法としては、例えば次式で示すようにテトラゾ
リウム塩存在下に電子受容体を作用させ生成するホルマ
ザン色素を比色定量する方法があげられる。
デノシン二リン酸、グアノシン二リン酸、シチジン二リ
ン酸、チアミン二リン酸、ウリジン二リン酸、イノシン
二リン酸等があげられ、アデノシン二リン酸が好まし
い。生成する還元型補酵素を他の物質に導き高感度に定
量する方法としては、例えば次式で示すようにテトラゾ
リウム塩存在下に電子受容体を作用させ生成するホルマ
ザン色素を比色定量する方法があげられる。
【００４３】
【化３】
【００４４】テトラゾリウム塩としては、例えばインド
ニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラ
ゾリウム（ＮＢＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３
−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォ
ニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（以
下、ＷＳＴ−１と略記する）、２−（４−ヨードフェニ
ル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，
４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム 一ナト
リウム塩（以下、ＷＳＴ−３と略記する）、３，３'−
［３，３'−ジメトキシ−（１，１'−ビフェニル）４，
４'−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−
５−フェニル−２Ｈ テトラゾリウム クロライド］
（ＮＴＢ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−
フェニル）−５−（３−カーボキシメトキシフェニル）
−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウ
ム塩（ＭＴＳ）等があげられる。
ニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラ
ゾリウム（ＮＢＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３
−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォ
ニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩（以
下、ＷＳＴ−１と略記する）、２−（４−ヨードフェニ
ル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，
４−ジスルフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム 一ナト
リウム塩（以下、ＷＳＴ−３と略記する）、３，３'−
［３，３'−ジメトキシ−（１，１'−ビフェニル）４，
４'−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−
５−フェニル−２Ｈ テトラゾリウム クロライド］
（ＮＴＢ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−
フェニル）−５−（３−カーボキシメトキシフェニル）
−２−（４−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウ
ム塩（ＭＴＳ）等があげられる。
【００４５】色源体として使用されているテトラゾリウ
ム塩も使用することができる。テトラゾリウム塩として
は、感度の増幅を目的とするため分子吸光係数が大きい
ものが良く、通常臨床の場で使用されることを考慮する
と、還元後水溶性ホルマザン色素に変換されるものが望
ましい。従ってＷＳＴ−１やＷＳＴ−３などが好適であ
る。使用量としては臨床で使用する場合、０．０１〜５
０ｍＭの範囲が好ましい。本発明に用いるテトラゾリウ
ム塩の反応液中の初期濃度としては、０．０１〜５０ｍ
Ｍ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭである。
ム塩も使用することができる。テトラゾリウム塩として
は、感度の増幅を目的とするため分子吸光係数が大きい
ものが良く、通常臨床の場で使用されることを考慮する
と、還元後水溶性ホルマザン色素に変換されるものが望
ましい。従ってＷＳＴ−１やＷＳＴ−３などが好適であ
る。使用量としては臨床で使用する場合、０．０１〜５
０ｍＭの範囲が好ましい。本発明に用いるテトラゾリウ
ム塩の反応液中の初期濃度としては、０．０１〜５０ｍ
Ｍ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭである。
【００４６】電子受容体としては、例えばフェナジンメ
トサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジン
メトサルフェート、メルドラズブルーおよびジアホラー
ゼがあげられる。ジアホラーゼとしては、例えばバチル
ス・メガテリウム（Bacillusmegaterium）由来の酵素が
旭化成工業社および東洋紡社から入手できる。本発明に
用いる電子受容体の反応液中の初期濃度としては、０．
０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭであ
る。
トサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジン
メトサルフェート、メルドラズブルーおよびジアホラー
ゼがあげられる。ジアホラーゼとしては、例えばバチル
ス・メガテリウム（Bacillusmegaterium）由来の酵素が
旭化成工業社および東洋紡社から入手できる。本発明に
用いる電子受容体の反応液中の初期濃度としては、０．
０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭであ
る。
【００４７】反応は、１０〜５０℃で１〜３０分間、好
ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補
酵素を生成する反応が終了した後行ってもよいが、同時
に行うのが好ましい。また生成する還元型補酵素を他の
物質に導き定量する他の方法としては次式に示されるよ
うに色源体の存在下に還元型補酵素オキシダーゼおよび
パーオキシダーゼを作用させ生成する色素を比色定量す
る方法があげられる。色源体は、例えば４−アミノアン
チピリンとの組合わせで用いられる色源体でもよいが、
単独で色素に変換する色源体が好ましい。
ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補
酵素を生成する反応が終了した後行ってもよいが、同時
に行うのが好ましい。また生成する還元型補酵素を他の
物質に導き定量する他の方法としては次式に示されるよ
うに色源体の存在下に還元型補酵素オキシダーゼおよび
パーオキシダーゼを作用させ生成する色素を比色定量す
る方法があげられる。色源体は、例えば４−アミノアン
チピリンとの組合わせで用いられる色源体でもよいが、
単独で色素に変換する色源体が好ましい。
【００４８】
【化４】
【００４９】単独で用いられる色源体としては、例えば
ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−
ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス
［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−カル
ボキシエチルアミノフェニル］アミン、１０−Ｎ−メチ
ルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フ
ェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−カルボキシメチ
ルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フ
ェノチアジン（ＣＣＡＰ）等があげられる。
ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−
ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス
［３−ビス（４−クロロフェニル）−メチル−４−カル
ボキシエチルアミノフェニル］アミン、１０−Ｎ−メチ
ルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フ
ェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０−Ｎ−カルボキシメチ
ルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フ
ェノチアジン（ＣＣＡＰ）等があげられる。
【００５０】また、４−アミノアンチピリンと組合わせ
て用いる色源体としては例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミ
ン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、
Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−ｍ−トルイジン二
ナトリウム塩等があげられる。
て用いる色源体としては例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（３
−メチルフェニル）−Ｎ'−サクシニルエチレンジアミ
ン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、
Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−ｍ−トルイジン二
ナトリウム塩等があげられる。
【００５１】反応は、１０〜５０℃で１〜３０分間、好
ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補
酵素を生成する反応が終了した後に行ってもよいが、同
時に行うのが好ましい。水性媒体としては、緩衝剤、食
塩等を含有する水等の液体を例示できるが緩衝液が好ま
しい。
ましくは２〜１０分間行う。本反応は、前述の還元型補
酵素を生成する反応が終了した後に行ってもよいが、同
時に行うのが好ましい。水性媒体としては、緩衝剤、食
塩等を含有する水等の液体を例示できるが緩衝液が好ま
しい。
【００５２】緩衝剤としては、例えば乳酸緩衝剤、クエ
ン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩
衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジ
エタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール
緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩
衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グ
ッド緩衝剤等があげられる。
ン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩
衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジ
エタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール
緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩
衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グ
ッド緩衝剤等があげられる。
【００５３】酵素活性調節剤としては、１，１０−フェ
ナントロリン等の金属キレート剤、マンニトール、グリ
セロール等の糖アルコール、マグネシウム、マンガン、
亜鉛、銅等の金属イオン、ヨード酢酸、ヨードアセトア
ミド等のＳＨ阻害剤があげられる。酵素の安定化剤とし
ては、例えばエチレンジアミン四酢酸等の金属キレート
剤、可溶性デンプン等の多糖類またはその誘導体、アル
ブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレングリコー
ル等の水溶性高分子化合物、ホスフィン、システイン等
のＳＨ基含有化合物等があげられる。
ナントロリン等の金属キレート剤、マンニトール、グリ
セロール等の糖アルコール、マグネシウム、マンガン、
亜鉛、銅等の金属イオン、ヨード酢酸、ヨードアセトア
ミド等のＳＨ阻害剤があげられる。酵素の安定化剤とし
ては、例えばエチレンジアミン四酢酸等の金属キレート
剤、可溶性デンプン等の多糖類またはその誘導体、アル
ブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレングリコー
ル等の水溶性高分子化合物、ホスフィン、システイン等
のＳＨ基含有化合物等があげられる。
【００５４】界面活性剤としては、ポリオキシエチレン
オクチルフェニルエーテル（ノニオンＨＳ−２１０、花
王社製）、３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチル
アミノ］プロパンスルホン酸、トリトンＸ−１００、ド
デシル硫酸ナトリウム等をあげることができる。防腐剤
としては、例えばアジ化ナトリウム等があげられる。
オクチルフェニルエーテル（ノニオンＨＳ−２１０、花
王社製）、３−［（３−クロラミドプロピル）ジメチル
アミノ］プロパンスルホン酸、トリトンＸ−１００、ド
デシル硫酸ナトリウム等をあげることができる。防腐剤
としては、例えばアジ化ナトリウム等があげられる。
【００５５】他の酵素としては、例えば酸化型補酵素オ
キシダーゼ、パーオキシダーゼ等をあげることができ
る。本発明の１，５−アンヒドログルシトールの定量用
試薬は、（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三
リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、
ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキ
ナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ，もしくは（ｂ）
ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌク
レオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一
つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素お
よび１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを含有し、必要に応じて前述の緩衝剤、酵
素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性
剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素
とその基質や補酵素等を含む。
キシダーゼ、パーオキシダーゼ等をあげることができ
る。本発明の１，５−アンヒドログルシトールの定量用
試薬は、（ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三
リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、
ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフルクトキ
ナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドログルシ
トール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ，もしくは（ｂ）
ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌク
レオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一
つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補酵素お
よび１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを含有し、必要に応じて前述の緩衝剤、酵
素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性
剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素
とその基質や補酵素等を含む。
【００５６】これら試薬は、１）（ａ）ヌクレオシド二
リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸
依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ
および６−ホスホフルクトキナーゼ，もしくは（ｂ）ヌ
クレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレ
オシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つ
と、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラ
ーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じ
て前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安
定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリ
ウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有する第一
試薬および、２）１，５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型補酵素と、必要
に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐
剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テト
ラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有す
る第二試薬からなる１，５−アンヒドログルシトール定
量用キットとすることができる。第二試薬中には１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼと酸化型補酵素のいずれか一方を含有させ、残りを第
一試薬に含有させることもできる。
リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸
依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ
および６−ホスホフルクトキナーゼ，もしくは（ｂ）ヌ
クレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレ
オシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つ
と、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラ
ーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じ
て前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安
定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリ
ウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有する第一
試薬および、２）１，５−アンヒドログルシトール−６
−リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型補酵素と、必要
に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐
剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、テト
ラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含有す
る第二試薬からなる１，５−アンヒドログルシトール定
量用キットとすることができる。第二試薬中には１，５
−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼと酸化型補酵素のいずれか一方を含有させ、残りを第
一試薬に含有させることもできる。
【００５７】本発明のグルコース消去用試薬は、ヌクレ
オシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド
二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソ
メラーゼ、および６−ホスホフルクトキナーゼを含み、
必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、
防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、
テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含
む。
オシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド
二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソ
メラーゼ、および６−ホスホフルクトキナーゼを含み、
必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、
防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源体、電子受容体、
テトラゾリウム塩、他の酵素とその基質や補酵素等を含
む。
【００５８】本発明の、物質の定量用試薬は、ヌクレオ
シド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二
リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、定量すべ
き物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する
物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調
節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源
体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基
質や補酵素等を含む。
シド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二
リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメ
ラーゼおよび６−ホスホフルクトキナーゼと、定量すべ
き物質に作用する酵素または定量すべき物質と反応する
物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵素活性調
節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、色源
体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素とその基
質や補酵素等を含む。
【００５９】該定量試薬は、１）ヌクレオシド二リン
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよ
び６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じて前述の
緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、
界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、
他の酵素とその基質や補酵素等を含む第一試薬、および
２）定量すべき物質に作用する酵素、定量すべき物質と
反応する物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵
素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性
剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素
とその基質や補酵素等を含む第二試薬を含有するキット
として構成することができる。
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよ
び６−ホスホフルクトキナーゼと、必要に応じて前述の
緩衝剤、酵素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、
界面活性剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、
他の酵素とその基質や補酵素等を含む第一試薬、および
２）定量すべき物質に作用する酵素、定量すべき物質と
反応する物質からなり、必要に応じて前述の緩衝剤、酵
素活性調節剤、賦活剤、防腐剤、安定化剤、界面活性
剤、色源体、電子受容体、テトラゾリウム塩、他の酵素
とその基質や補酵素等を含む第二試薬を含有するキット
として構成することができる。
【００６０】本発明の試薬の各々は、凍結乾燥品を調製
した後供給されてもよいが、水等の液体に溶解して供給
されてもよい。以下に具体的な実施例をあげる。
した後供給されてもよいが、水等の液体に溶解して供給
されてもよい。以下に具体的な実施例をあげる。
【００６１】
【実施例】実施例１ 下記の組成のグルコース消去用試薬を調製した。 トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ５０ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍｇ／ｍｌ アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼ （Thermococcus litoralis由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ ホスホヘキソースイソメラーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ４０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ３０Ｕ／ｍｌ アデノシン二リン酸（オリエンタル酵母工業社製） ３ｍＭ アデノシン三リン酸（シグマ社製） １０ｍＭ
【００６２】実施例２ 下記の組成の１，５−アンヒドログルシトール定量用試
薬を調製した。 試薬 １ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．５） ５０ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍｇ／ｍｌ ＮＡＤＰ（シグマ社製） ４ｍＭ アデノシン二リン酸（オリエンタル酵母工業社製） ３ｍＭ アデノシン三リン酸（シグマ社製） １０ｍＭ ホスホヘキソースイソメラーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ４０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ３０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ （Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼ （Thermococcus litoralis由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ
薬を調製した。 試薬 １ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．５） ５０ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍｇ／ｍｌ ＮＡＤＰ（シグマ社製） ４ｍＭ アデノシン二リン酸（オリエンタル酵母工業社製） ３ｍＭ アデノシン三リン酸（シグマ社製） １０ｍＭ ホスホヘキソースイソメラーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ４０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ３０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ （Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ アデノシン二リン酸依存性ヘキソキナーゼ （Thermococcus litoralis由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ
【００６３】 試薬 ２ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０．０） ２００ｍＭ ＷＳＴ−１（同仁化学社製） ０．５ｍＭ １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ （E. coli・DH1(ATCC33849)株由来、旭化成工業社製） ２０Ｕ／ｍｌ
【００６４】実施例３ １，５−アンヒドログルシトールの２５μｇ／ｍｌの標
準液を５段階に希釈して作成した試料及び精製水０．０
７５ｍｌに実施例２で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加
え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例２で調製し
た試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応さ
せ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。このとき得られた
検量線を第１図に示す。
準液を５段階に希釈して作成した試料及び精製水０．０
７５ｍｌに実施例２で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加
え、３７℃で５分間加温し、その後、実施例２で調製し
た試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応さ
せ、４３８ｎｍで吸光度を測定した。このとき得られた
検量線を第１図に示す。
【００６５】実施例４ 本法の有用性を確かめるためにグルコースの消去実験を
行った。試験管に実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ分注
し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシト
ールを２５μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを２
０００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドロ
グルシトールを２５μｇ／ｍｌとグルコース２０００ｍ
ｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３
７℃で５分間加温後、実施例２の試薬２を０．７５ｍｌ
添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を
測定し第１表の結果を得た。
行った。試験管に実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ分注
し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシト
ールを２５μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを２
０００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドロ
グルシトールを２５μｇ／ｍｌとグルコース２０００ｍ
ｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３
７℃で５分間加温後、実施例２の試薬２を０．７５ｍｌ
添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度を
測定し第１表の結果を得た。
【００６６】
【表１】
【００６７】第１表の結果が示すように、（ｃ）と
（ａ）との値は完全に一致しており、本法では（ｃ）検
液中のグルコース２０００ｍｇ／ｄｌが完全に消去され
た。また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法
の有用性が示された。
（ａ）との値は完全に一致しており、本法では（ｃ）検
液中のグルコース２０００ｍｇ／ｄｌが完全に消去され
た。また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法
の有用性が示された。
【００６８】実施例５ 本法と公知の方法との相関性を確かめるために、５０例
の血清を用いて１，５−アンヒドログルシトール濃度の
測定を行った。（ａ）実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ
分注し、血清０．０７５ｍｌを加えて３７℃で５分間加
温後、試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応
させ、４３８ｎｍで測定した吸光度を、実施例１の図１
の検量線より得られた計算式にて血清中の１，５−アン
ヒドログルシトール濃度を算出した。（ｂ）体外診断用
医薬品として承認されている「ラナ１，５−ＡＧオート
II」（日本化薬社製 承認番号（０８ＡＭ）第０１１２
号）を用いて、「測定操作方法」に従い５０例の血清の
測定を行い、同じく「１，５−アンヒドログルシトール
濃度の求め方」に従い１，５−アンヒドログルシトール
濃度を算出した。（ａ）で得られた値を縦軸に、（ｂ）
で得られた値を横軸にそれぞれプロットし図２の結果を
得た。
の血清を用いて１，５−アンヒドログルシトール濃度の
測定を行った。（ａ）実施例２の試薬１を２．２５ｍｌ
分注し、血清０．０７５ｍｌを加えて３７℃で５分間加
温後、試薬２を０．７５ｍｌ添加してさらに５分間反応
させ、４３８ｎｍで測定した吸光度を、実施例１の図１
の検量線より得られた計算式にて血清中の１，５−アン
ヒドログルシトール濃度を算出した。（ｂ）体外診断用
医薬品として承認されている「ラナ１，５−ＡＧオート
II」（日本化薬社製 承認番号（０８ＡＭ）第０１１２
号）を用いて、「測定操作方法」に従い５０例の血清の
測定を行い、同じく「１，５−アンヒドログルシトール
濃度の求め方」に従い１，５−アンヒドログルシトール
濃度を算出した。（ａ）で得られた値を縦軸に、（ｂ）
で得られた値を横軸にそれぞれプロットし図２の結果を
得た。
【００６９】図２の結果が示すように、相関係数ｒ＝
０．９９６６、回帰式ｙ＝０．９８３９ｘ＋０．０５７
６と良好な相関性が得られた。
０．９９６６、回帰式ｙ＝０．９８３９ｘ＋０．０５７
６と良好な相関性が得られた。
【００７０】実施例６ 第一試薬のアデノシン二リン酸濃度を第２表に示す通り
とし、また第二試薬にトリトンＸ−１００を０．４％と
なるように添加する以外は、実施例２と同様な試薬を調
製した。
とし、また第二試薬にトリトンＸ−１００を０．４％と
なるように添加する以外は、実施例２と同様な試薬を調
製した。
【００７１】１，５−アンヒドログルシトール２５μｇ
／ｍｌおよび第２表に示す濃度のグルコースを添加した
試料を作成した。実施例３と同様に操作し１，５−アン
ヒドログルシトールを定量した。結果を第２表に示す。
／ｍｌおよび第２表に示す濃度のグルコースを添加した
試料を作成した。実施例３と同様に操作し１，５−アン
ヒドログルシトールを定量した。結果を第２表に示す。
【００７２】
【表２】
【００７３】本実施例で使用したアデノシン二リン酸依
存性ヘキソキナーゼを用いるグルコースの消去方法を用
いれば、試薬のアデノシン二リン酸濃度を変えても、ま
た試料に種々の濃度のグルコースが含有されていても、
これら条件に関わりなく、試料中の１，５−アンヒドロ
グルシトールが正確に定量された。
存性ヘキソキナーゼを用いるグルコースの消去方法を用
いれば、試薬のアデノシン二リン酸濃度を変えても、ま
た試料に種々の濃度のグルコースが含有されていても、
これら条件に関わりなく、試料中の１，５−アンヒドロ
グルシトールが正確に定量された。
【００７４】実施例７ 下記の組成の１，５−アンヒドログルシトール定量用試
薬を調製した。 試薬１ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０） ５０ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍｇ／ｍｌ ＮＡＤＰ（シグマ社製） ４ｍＭ アデノシン三リン酸（シグマ社製） １０ｍＭ ホスホヘキソースイソメラーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ４０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ３０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ （Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ アデノシン三リン酸依存性ヘキソキナーゼ （酵母由来、オリエンタル酵母工業社製） １００Ｕ／ｍｌ
薬を調製した。 試薬１ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０） ５０ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍｇ／ｍｌ ＮＡＤＰ（シグマ社製） ４ｍＭ アデノシン三リン酸（シグマ社製） １０ｍＭ ホスホヘキソースイソメラーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ４０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナーゼ （Bacillus stearothermophilus由来、ユニチカ社製） ３０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ （Bacillus megaterium由来、旭化成工業社製） １０Ｕ／ｍｌ アデノシン三リン酸依存性ヘキソキナーゼ （酵母由来、オリエンタル酵母工業社製） １００Ｕ／ｍｌ
【００７５】 試薬２ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ １０．０） ２００ｍＭ ＷＳＴ−１（同仁化学社製） ０．５ｍＭ １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ （E. coli・DH1(ATCC33849)株由来、旭化成工業社製） ２０Ｕ／ｍｌ
【００７６】実施例８ １，５−アンヒドログルシトール濃度、５０、１００、
１５０、２００および２５０μｇ／ｍｌの標準液を作成
した。該標準液または精製水０．０７５ｍｌに実施例７
で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で５分間
加温し、その後、実施例７で調製した試薬２を０．７５
ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光
度を測定した。このとき得られた検量線を第３図に示
す。
１５０、２００および２５０μｇ／ｍｌの標準液を作成
した。該標準液または精製水０．０７５ｍｌに実施例７
で調製した試薬１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で５分間
加温し、その後、実施例７で調製した試薬２を０．７５
ｍｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光
度を測定した。このとき得られた検量線を第３図に示
す。
【００７７】実施例９ 本法の有用性を確かめるためにグルコースの消去実験を
行った。試験管に実施例７の試薬１を２．２５ｍｌ分注
し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシト
ールを２５０μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを
１００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドロ
グルシトールを２５０μｇ／ｍｌとグルコース１００ｍ
ｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３
７゜Ｃで５分間加温後、実施例７の試薬２を０．７５ｍ
ｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度
を測定し第３表の結果を得た。
行った。試験管に実施例７の試薬１を２．２５ｍｌ分注
し、（ａ）精製水、（ｂ）１，５−アンヒドログルシト
ールを２５０μｇ／ｍｌ含む検液、（ｃ）グルコースを
１００ｍｇ／ｄｌ含む検液、（ｄ）１，５−アンヒドロ
グルシトールを２５０μｇ／ｍｌとグルコース１００ｍ
ｇ／ｄｌを含む検液をそれぞれ０．０７５ｍｌ加えて３
７゜Ｃで５分間加温後、実施例７の試薬２を０．７５ｍ
ｌ添加してさらに５分間反応させ、４３８ｎｍで吸光度
を測定し第３表の結果を得た。
【００７８】
【表３】
【００７９】第３表の結果が示すように、（ｃ）と
（ａ）との値はほぼ一致しており、本法では（ｃ）検液
中のグルコース１００ｍｇ／ｄｌが完全に消去された。
また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法の有
用性が示された。
（ａ）との値はほぼ一致しており、本法では（ｃ）検液
中のグルコース１００ｍｇ／ｄｌが完全に消去された。
また、（ｂ）と（ｄ）の値もほぼ同じとなり、本法の有
用性が示された。
【００８０】
【発明の効果】本発明によれば、簡便な１，５−アンヒ
ドログルシトールの定量方法並びにそれに用いる定量用
試薬および定量用キットが供給される。しかも共存する
グルコースが高濃度であっても、それが酵素的に完全に
消去され、正確な測定値を得ることができる。また本発
明によれば、反応液中に存在するヌクレオシド二リン酸
濃度を一定に保ちながら反応液中のグルコースをグルコ
ース−１，６−二リン酸に変換することにより消去する
方法およびそれに用いる消去用試薬が提供される。
ドログルシトールの定量方法並びにそれに用いる定量用
試薬および定量用キットが供給される。しかも共存する
グルコースが高濃度であっても、それが酵素的に完全に
消去され、正確な測定値を得ることができる。また本発
明によれば、反応液中に存在するヌクレオシド二リン酸
濃度を一定に保ちながら反応液中のグルコースをグルコ
ース−１，６−二リン酸に変換することにより消去する
方法およびそれに用いる消去用試薬が提供される。
【図１】 １，５−アンヒドログルシトールの検量線を
示す。横軸の１，５−ＡＧは１，５−アンヒドログルシ
トールを示し、縦軸のｍＡｂｓはミリ吸光度を示す。
示す。横軸の１，５−ＡＧは１，５−アンヒドログルシ
トールを示し、縦軸のｍＡｂｓはミリ吸光度を示す。
【図２】 本法で得られる１，５−アンヒドログルシト
ール濃度（ａ：縦軸）と対照方法（ラナ１，５−ＡＧオ
ート）で得られる１，５−アンヒドログルシトール濃度
（ｂ：横軸）の相関図を示す。
ール濃度（ａ：縦軸）と対照方法（ラナ１，５−ＡＧオ
ート）で得られる１，５−アンヒドログルシトール濃度
（ｂ：横軸）の相関図を示す。
【図３】 １，５−アンヒドログルシトールの検量線を
示す。
示す。
Claims (11)
- 【請求項１】 グルコースを含有する試料に、グルコー
スをフルクトース−１，６−二リン酸に変換し、かつ
１，５−アンヒドログルシトールを１，５−アンヒドロ
グルシトール−６−リン酸に変換することができる酵素
系を作用させることにより１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸を生成させ、ついで酸化型補酵素存在
下に１，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを作用させて１，５−アンヒドログルシト
ール−６−リン酸の脱水素反応を行い、生成する還元型
補酵素を定量することを特徴とするグルコース含有試料
中の１，５−アンヒドログルシトールの定量方法。 - 【請求項２】 酵素系が、（ａ）ヌクレオシド二リン
酸、ヌクレオシド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存
性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよ
び６−ホスホフルクトキナーゼ、もしくは（ｂ）ヌクレ
オシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシ
ド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、
ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼ
および６−ホスホフルクトキナーゼ、を含むものである
請求項１記載の定量方法。 - 【請求項３】 還元型補酵素の定量が、テトラゾリウム
塩から生成する色素を比色定量して行うものである請求
項１記載の定量方法。 - 【請求項４】 （ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオ
シド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナ
ーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼ、６−ホスホフル
クトキナーゼ、酸化型補酵素および１，５−アンヒドロ
グルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、もしくは
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよ
びヌクレオシド三リン酸依存性グルコキナーゼから選ば
れる一つと、ヌクレオシド三リン酸、ホスホヘキソース
イソメラーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、酸化型補
酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ、を含有する１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量用試薬。 - 【請求項５】 テトラゾリウム塩および電子受容体をさ
らに含有する請求項４記載の定量用試薬。 - 【請求項６】 （ａ）ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオ
シド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナ
ーゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホ
フルクトキナーゼを含む試薬、もしくは（ｂ）ヌクレオ
シド三リン酸依存性ヘキソキナーゼおよびヌクレオシド
三リン酸依存性グルコキナーゼから選ばれる一つと、ヌ
クレオシド三リン酸、ホスホヘキソースイソメラーゼお
よび６−ホスホフルクトキナーゼを含む試薬と、酸化型
補酵素および１，５−アンヒドログルシトール−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼを含む試薬とからなる１，５−ア
ンヒドログルシトールの定量用試薬キット。 - 【請求項７】 試料中に存在するグルコースに、ヌクレ
オシド二リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、
ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘ
キソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナー
ゼを作用させて、グルコースをフルクトース−１，６―
二リン酸に変換することを特徴とする試料中のグルコー
ス消去方法。 - 【請求項８】 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三
リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、
ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフルク
トキナーゼを含むグルコース消去用試薬。 - 【請求項９】 試料中のグルコースに、ヌクレオシド二
リン酸およびヌクレオシド三リン酸の存在下、ヌクレオ
シド二リン酸依存性ヘキソキナーゼ、ホスホヘキソース
イソメラーゼおよび６―ホスホフルクトキナーゼを作用
させて、グルコースをフルクトース−１，６―二リン酸
に変換したのち、試料中の成分を化学的または酵素的反
応を用いて定量することを特徴とするグルコース含有試
料中成分の定量方法。 - 【請求項１０】 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド
三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフ
ルクトキナーゼと、定量すべき物質に作用する酵素また
は定量すべき物質と反応する物質を含む、物質の定量用
試薬。 - 【請求項１１】 ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド
三リン酸、ヌクレオシド二リン酸依存性ヘキソキナー
ゼ、ホスホヘキソースイソメラーゼおよび６―ホスホフ
ルクトキナーゼを含む試薬と、定量すべき物質に作用す
る酵素または定量すべき物質と反応する物質を含む試薬
とからなる物質の定量用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35090799A JP4412780B2 (ja) | 1998-12-11 | 1999-12-10 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35358698 | 1998-12-11 | ||
| JP11-39433 | 1999-02-18 | ||
| JP10-353586 | 1999-02-18 | ||
| JP3943399 | 1999-02-18 | ||
| JP35090799A JP4412780B2 (ja) | 1998-12-11 | 1999-12-10 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300293A true JP2000300293A (ja) | 2000-10-31 |
| JP4412780B2 JP4412780B2 (ja) | 2010-02-10 |
Family
ID=27290138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35090799A Expired - Lifetime JP4412780B2 (ja) | 1998-12-11 | 1999-12-10 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4412780B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006292521A (ja) * | 2005-04-08 | 2006-10-26 | Nippon Kayaku Co Ltd | 採取された血液に対する耐糖能異常の判定方法 |
| JP2007300818A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Ikeda Shokken Kk | ピラノースオキシダーゼ |
| JP2010094135A (ja) * | 2002-03-29 | 2010-04-30 | Asahi Kasei Pharma Kk | 軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全の検出方法 |
-
1999
- 1999-12-10 JP JP35090799A patent/JP4412780B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010094135A (ja) * | 2002-03-29 | 2010-04-30 | Asahi Kasei Pharma Kk | 軽症耐糖能異常またはインスリン分泌不全の検出方法 |
| JP2006292521A (ja) * | 2005-04-08 | 2006-10-26 | Nippon Kayaku Co Ltd | 採取された血液に対する耐糖能異常の判定方法 |
| JP2007300818A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Ikeda Shokken Kk | ピラノースオキシダーゼ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4412780B2 (ja) | 2010-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bondar et al. | Evaluation of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides in the hexokinase method for determining glucose in serum | |
| US6448029B1 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| US5962248A (en) | Quantitative determination method for chloride ions | |
| EP0533183B1 (en) | Composition for the measurement of potassium ion concentration | |
| RU2184778C2 (ru) | Система восстановления конфермента, набор для ферментативного определения концентрации анализируемого вещества и ферментативный способ определения концентрации анализируемого вещества | |
| EP0639646B1 (en) | High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| US4042462A (en) | Creatine phosphokinase determination method | |
| JP4412780B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 | |
| JP3170377B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| EP1213357A2 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1, 5-Anhydroglucitol | |
| CN112255219A (zh) | 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| EP0089210B1 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| CN114354524B (zh) | 一种稳定的液体检测试剂盒 | |
| CN111575339A (zh) | 1，5-脱水葡萄糖醇酶学定量方法及其试剂 | |
| JP3170320B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| KR100715924B1 (ko) | 1,5-안하이드로글루시톨의 정량 분석법 및 시약 | |
| US5834227A (en) | Kit for assaying creatine kinase | |
| WO1995006136A1 (en) | Reagent for assaying glucose | |
| EP0496412B1 (en) | Method for highly sensitive determination of NADH using NADH kinase | |
| JP2002186497A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 | |
| JP3217180B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| JPH11195A (ja) | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 | |
| JPH06303996A (ja) | アルカリホスフォターゼ測定法と測定試薬 | |
| EP1008853A2 (en) | Reagent compositions for measuring electrolyte using alpha-amylase | |
| JPH09173097A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060901 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090610 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090806 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091021 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121127 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4412780 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131127 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |