JPH09173097A - １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量方法Info
- Publication number
- JPH09173097A JPH09173097A JP35133995A JP35133995A JPH09173097A JP H09173097 A JPH09173097 A JP H09173097A JP 35133995 A JP35133995 A JP 35133995A JP 35133995 A JP35133995 A JP 35133995A JP H09173097 A JPH09173097 A JP H09173097A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- sample
- glucose
- enzyme
- anhydroglucitol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖尿病の診断マーカーである１，５−アンヒ
ドログルシトール（以下、１，５−ＡＧという）の定量
方法を提供する。 【解決手段】 本発明の定量方法は、１，５−ＡＧをリ
ン酸化する酵素反応を少なくとも含むことからなる試料
中の１，５−ＡＧの定量方法である。本発明によれば、
試料中の１，５−ＡＧを簡便に且つ高精度で測定するこ
とができ、特に自動分析装置に好適に利用できる方法で
ある。
ドログルシトール（以下、１，５−ＡＧという）の定量
方法を提供する。 【解決手段】 本発明の定量方法は、１，５−ＡＧをリ
ン酸化する酵素反応を少なくとも含むことからなる試料
中の１，５−ＡＧの定量方法である。本発明によれば、
試料中の１，５−ＡＧを簡便に且つ高精度で測定するこ
とができ、特に自動分析装置に好適に利用できる方法で
ある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は１，５−アンヒドロ
グルシトール（以下、１，５−ＡＧという）の定量方法
に関し、より詳細には、臨床検査などの分野で利用され
る１，５−ＡＧの定量方法に関する。
グルシトール（以下、１，５−ＡＧという）の定量方法
に関し、より詳細には、臨床検査などの分野で利用され
る１，５−ＡＧの定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧはグルコース類似の構造を
有するポリオールであり、ヒトでは血液、髄液、尿など
に存在し、糖尿病患者では１，５−ＡＧ濃度が低下する
ことが知られている。そのため、糖尿病のマーカーとし
て注目されている。従来、１，５−ＡＧはガスクロマト
グラフィーにより定量されていた。しかし、この方法で
定量するには特別な装置が必要であり、また操作が繁雑
で熟練を要するため、臨床検査の分野で多数の検体を測
定するには支障があった。最近、１，５−ＡＧの定量に
酵素を用いた方法が報告されている。例えば特開昭６３
−１８５３９７号には１，５−ＡＧを酸化する酵素を用
いて過酸化水素を産生させ、生成した過酸化水素を指標
として１，５−ＡＧを定量する方法が開示されている。
また特開昭６２−７９７８０号も、類似の酸化酵素を用
いる方法が開示されている。しかし、このような酸化酵
素を用いる方法は、指標となる分子吸光係数が明らかで
なく、また生体試料では、試料中のビリルビンやアスコ
ルビン酸などの還元性物質の影響を受けるという問題が
ある。また、臨床検査のような生体試料の定量におい
て、酵素を用いる方法の多くは試料中に共存する糖類、
特にグルコースの影響を受けるので、グルコースの影響
を回避する必要がある。グルコースを除去する方法とし
ては、例えば前記特開昭６３−１８５３９７号や特開平
７−２３１７９６号では、強塩基性陰イオン交換樹脂や
ホウ酸処理法が開示されている。また特開平６−３４３
４９２号では試料のｐＨを７未満に、特開平５−３０４
９９６号では同様にｐＨを７．２〜８．５に調整する方
法が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも
操作が繁雑であるという欠点があり、自動分析装置を用
いて多数の検体を迅速に測定するには不向きである。
有するポリオールであり、ヒトでは血液、髄液、尿など
に存在し、糖尿病患者では１，５−ＡＧ濃度が低下する
ことが知られている。そのため、糖尿病のマーカーとし
て注目されている。従来、１，５−ＡＧはガスクロマト
グラフィーにより定量されていた。しかし、この方法で
定量するには特別な装置が必要であり、また操作が繁雑
で熟練を要するため、臨床検査の分野で多数の検体を測
定するには支障があった。最近、１，５−ＡＧの定量に
酵素を用いた方法が報告されている。例えば特開昭６３
−１８５３９７号には１，５−ＡＧを酸化する酵素を用
いて過酸化水素を産生させ、生成した過酸化水素を指標
として１，５−ＡＧを定量する方法が開示されている。
また特開昭６２−７９７８０号も、類似の酸化酵素を用
いる方法が開示されている。しかし、このような酸化酵
素を用いる方法は、指標となる分子吸光係数が明らかで
なく、また生体試料では、試料中のビリルビンやアスコ
ルビン酸などの還元性物質の影響を受けるという問題が
ある。また、臨床検査のような生体試料の定量におい
て、酵素を用いる方法の多くは試料中に共存する糖類、
特にグルコースの影響を受けるので、グルコースの影響
を回避する必要がある。グルコースを除去する方法とし
ては、例えば前記特開昭６３−１８５３９７号や特開平
７−２３１７９６号では、強塩基性陰イオン交換樹脂や
ホウ酸処理法が開示されている。また特開平６−３４３
４９２号では試料のｐＨを７未満に、特開平５−３０４
９９６号では同様にｐＨを７．２〜８．５に調整する方
法が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも
操作が繁雑であるという欠点があり、自動分析装置を用
いて多数の検体を迅速に測定するには不向きである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は従来の方
法を改良し、臨床検査における検体試料の測定に適応で
き、特に自動分析装置に利用できる方法を鋭意研究を行
った。その結果、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応
を用いることにより、その目的が達成されることを見い
出した。即ち、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応を
用い、反応の指標となり得る物質を産生させ又は反応に
関与させ、当該反応の指標となり得る物質を測定するこ
とにより、１，５−ＡＧの量を定量することが可能とな
る。反応の指標となり得る物質として、補酵素、例えば
ＮＡＤＨを使用すると、ＮＡＤＨの分子吸光係数が明ら
かなため濃度算出も可能であり、また試料中の還元性物
質の影響を受けることがない利点がある。また、反応の
指標となり得る物質として、過酸化水素の産生する反応
に導くこともできる。この場合は、公知の色原体を用い
て発色させ、それを吸光度の増加として測定することに
より実施することができる。これらの方法は操作が繁雑
でなく、反応条件が穏和なため自動分析装置での測定が
可能となり、日常の臨床検査で多数の試料測定に有用で
あることが分かり、本発明を完成するに至った。本発明
はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は簡便
にして高精度で１，５−ＡＧを測定できる方法を提供す
ることを目的とする。
法を改良し、臨床検査における検体試料の測定に適応で
き、特に自動分析装置に利用できる方法を鋭意研究を行
った。その結果、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応
を用いることにより、その目的が達成されることを見い
出した。即ち、１，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応を
用い、反応の指標となり得る物質を産生させ又は反応に
関与させ、当該反応の指標となり得る物質を測定するこ
とにより、１，５−ＡＧの量を定量することが可能とな
る。反応の指標となり得る物質として、補酵素、例えば
ＮＡＤＨを使用すると、ＮＡＤＨの分子吸光係数が明ら
かなため濃度算出も可能であり、また試料中の還元性物
質の影響を受けることがない利点がある。また、反応の
指標となり得る物質として、過酸化水素の産生する反応
に導くこともできる。この場合は、公知の色原体を用い
て発色させ、それを吸光度の増加として測定することに
より実施することができる。これらの方法は操作が繁雑
でなく、反応条件が穏和なため自動分析装置での測定が
可能となり、日常の臨床検査で多数の試料測定に有用で
あることが分かり、本発明を完成するに至った。本発明
はかかる知見に基づいてなされたもので、本発明は簡便
にして高精度で１，５−ＡＧを測定できる方法を提供す
ることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、 １，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応を少なくとも含
むことを特徴とする試料中の１，５−ＡＧの定量方法； 酵素として、バチルス属(Bacillus sp.)由来のヘキソ
キナーゼ又はバチルスステアロサーモフィルス(Bacillu
s stearothermophilus)由来のグルコキナーゼを用いる
上記記載の定量方法； グルコースを含有する試料中の１，５−ＡＧの定量法
であって、試料をグルコースをリン酸化する酵素反応に
付してグルコースを消費した試料を用いる上記又は
記載の試料中の１，５−アンヒドログルシトールの定量
方法；である。
めになされた本発明の要旨は、 １，５−ＡＧをリン酸化する酵素反応を少なくとも含
むことを特徴とする試料中の１，５−ＡＧの定量方法； 酵素として、バチルス属(Bacillus sp.)由来のヘキソ
キナーゼ又はバチルスステアロサーモフィルス(Bacillu
s stearothermophilus)由来のグルコキナーゼを用いる
上記記載の定量方法； グルコースを含有する試料中の１，５−ＡＧの定量法
であって、試料をグルコースをリン酸化する酵素反応に
付してグルコースを消費した試料を用いる上記又は
記載の試料中の１，５−アンヒドログルシトールの定量
方法；である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明において、１，５−ＡＧを
リン酸化する酵素反応は、下記の反応１で示されるよう
に、ＡＴＰの存在下、酵素により１，５−ＡＧをリン酸
化１，５−ＡＧに変換し、またＡＤＰを産生するもので
ある。この反応に使用される酵素としては、本発明の目
的を達成できるものであれば全て用いることができ、ヘ
キソキナーゼ(EC 2.7.1.1)に属する酵素、グルコキナー
ゼ(EC 2.7.1.2)に属する酵素などが例示される。特に、
本発明者等は１，５−ＡＧをリン酸化する酵素として種
々の酵素を探索研究した結果、バチルス属(Bacillus s
p.)由来のヘキソキナーゼ又はバチルス ステアロサーモ
フィルス(Bacillus stearothermophilus)由来のグルコ
キナーゼ（以下、両者を合わせ、Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫと
表記する）が好適であることを見い出した。この酵素反
応はマグネシウムイオンにより促進されるので、マグネ
シウムイオンの存在下に行うのが好ましく、適当な緩衝
液（例えば、トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６
程度）中、加温下にて行われる。酵素の使用量は、試料
中の１，５−ＡＧ濃度などに応じて適宜調整することが
できる。この酵素反応に使用される試薬組成物の好まし
い例としては、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、
５ｍＭ ＡＴＰ、0.25ｍＭ ＮＡＤＨ、１Ｕ／ｍｌピルビ
ン酸キナーゼ（ＰＫ）、１０Ｕ／ｍｌ乳酸脱水素酵素
（ＬＤＨ）、１ｋＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫを含む
０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）な
どが挙げられる。
リン酸化する酵素反応は、下記の反応１で示されるよう
に、ＡＴＰの存在下、酵素により１，５−ＡＧをリン酸
化１，５−ＡＧに変換し、またＡＤＰを産生するもので
ある。この反応に使用される酵素としては、本発明の目
的を達成できるものであれば全て用いることができ、ヘ
キソキナーゼ(EC 2.7.1.1)に属する酵素、グルコキナー
ゼ(EC 2.7.1.2)に属する酵素などが例示される。特に、
本発明者等は１，５−ＡＧをリン酸化する酵素として種
々の酵素を探索研究した結果、バチルス属(Bacillus s
p.)由来のヘキソキナーゼ又はバチルス ステアロサーモ
フィルス(Bacillus stearothermophilus)由来のグルコ
キナーゼ（以下、両者を合わせ、Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫと
表記する）が好適であることを見い出した。この酵素反
応はマグネシウムイオンにより促進されるので、マグネ
シウムイオンの存在下に行うのが好ましく、適当な緩衝
液（例えば、トリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．６
程度）中、加温下にて行われる。酵素の使用量は、試料
中の１，５−ＡＧ濃度などに応じて適宜調整することが
できる。この酵素反応に使用される試薬組成物の好まし
い例としては、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、
５ｍＭ ＡＴＰ、0.25ｍＭ ＮＡＤＨ、１Ｕ／ｍｌピルビ
ン酸キナーゼ（ＰＫ）、１０Ｕ／ｍｌ乳酸脱水素酵素
（ＬＤＨ）、１ｋＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫを含む
０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）な
どが挙げられる。
【０００６】
【化１】
【０００７】本発明においては、上記の反応１と他の酵
素反応系を組合せ、反応の指標となり得る物質を産生さ
せるか又は反応の指標となり得る物質を反応系に関与さ
せ、当該指標となり得る物質を測定することにより、
１，５−ＡＧの定量を行う。より具体的には、上記の指
標となる反応として、例えば、下記反応２に示されるよ
うな、公知の共役反応を組み合わせることができる。こ
の反応２に示される酵素反応系は、臨床検査の測定法で
よく利用される反応系であり、従来法に準じて実施する
ことができ、使用される試薬組成物、反応条件などは従
来法に準じて設定することができる。
素反応系を組合せ、反応の指標となり得る物質を産生さ
せるか又は反応の指標となり得る物質を反応系に関与さ
せ、当該指標となり得る物質を測定することにより、
１，５−ＡＧの定量を行う。より具体的には、上記の指
標となる反応として、例えば、下記反応２に示されるよ
うな、公知の共役反応を組み合わせることができる。こ
の反応２に示される酵素反応系は、臨床検査の測定法で
よく利用される反応系であり、従来法に準じて実施する
ことができ、使用される試薬組成物、反応条件などは従
来法に準じて設定することができる。
【０００８】
【化２】
【０００９】上記の反応１と反応２を組み合わせると、
下記の反応３となる。反応３に示される反応系は、測定
対象である１，５−ＡＧを、ＡＴＰの存在下、前述の酵
素によりリン酸化してリン酸化１，５−ＡＧに変換する
と共にＡＤＰを生成させ；生成したＡＤＰに、ホスホエ
ノールピルビン酸（ＰＥＰ）の存在下、ピルビン酸キナ
ーゼ（ＰＫ）を作用させ、ＡＴＰとピルビン酸を生成さ
せ；生じたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）を作用させて乳酸とＮＡＤを生成する
反応である。この共役酵素反応系において、反応の指標
となり得る物質はＮＡＤＨであり、酵素反応の進行に伴
い、ＮＡＤＨは減少する。従って、ＮＡＤＨの減少量を
３４０ｎｍ（ＮＡＤＨの特性吸収波長）での吸光度の減
少度から求め、予め作成した検量線との比較又はＮＡＤ
Ｈの分子吸光係数から１，５−ＡＧを定量することがで
きる。
下記の反応３となる。反応３に示される反応系は、測定
対象である１，５−ＡＧを、ＡＴＰの存在下、前述の酵
素によりリン酸化してリン酸化１，５−ＡＧに変換する
と共にＡＤＰを生成させ；生成したＡＤＰに、ホスホエ
ノールピルビン酸（ＰＥＰ）の存在下、ピルビン酸キナ
ーゼ（ＰＫ）を作用させ、ＡＴＰとピルビン酸を生成さ
せ；生じたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸脱水
素酵素（ＬＤＨ）を作用させて乳酸とＮＡＤを生成する
反応である。この共役酵素反応系において、反応の指標
となり得る物質はＮＡＤＨであり、酵素反応の進行に伴
い、ＮＡＤＨは減少する。従って、ＮＡＤＨの減少量を
３４０ｎｍ（ＮＡＤＨの特性吸収波長）での吸光度の減
少度から求め、予め作成した検量線との比較又はＮＡＤ
Ｈの分子吸光係数から１，５−ＡＧを定量することがで
きる。
【００１０】臨床検査のように試料が血清や血漿の場
合、試料中に糖類が含まれていることがあり、本発明に
用いる１，５−ＡＧをリン酸化する酵素自体の基質特異
性によっては糖類、特にグルコースも反応することがあ
る。このような場合には、予め試料中に共存しているグ
ルコースなどの影響を除去する必要がある。グルコース
の影響を回避するには種々の手段がある。前述のように
イオン交換樹脂を用いたり、ホウ酸処理法やｐＨを調整
する方法などが知られているが、これらの方法は操作が
繁雑なため、臨床検査の分野、特に自動分析装置に適用
するには好ましくない。試料中の糖類、特にグルコース
の影響を回避する方法について、本発明者等は鋭意研究
した結果、グルコースの影響を回避する酵素反応として
は、１，５−ＡＧに反応しないグルコキナーゼ（ＧＫ）
やヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコースオキシダーゼ
などを用いる方法が採れることが判明した。特に、下記
の反応４に示される酵素反応によりグルコースを先に反
応させて消費し、その後で１，５−ＡＧの定量反応を進
める方法が好適であることを見出した。なお、反応４に
示される酵素反応系は、臨床検査の測定法でよく利用さ
れる反応系であり、従来法に準じて実施することがで
き、使用される試薬組成物、反応条件などは従来法に準
じて設定することができる。
合、試料中に糖類が含まれていることがあり、本発明に
用いる１，５−ＡＧをリン酸化する酵素自体の基質特異
性によっては糖類、特にグルコースも反応することがあ
る。このような場合には、予め試料中に共存しているグ
ルコースなどの影響を除去する必要がある。グルコース
の影響を回避するには種々の手段がある。前述のように
イオン交換樹脂を用いたり、ホウ酸処理法やｐＨを調整
する方法などが知られているが、これらの方法は操作が
繁雑なため、臨床検査の分野、特に自動分析装置に適用
するには好ましくない。試料中の糖類、特にグルコース
の影響を回避する方法について、本発明者等は鋭意研究
した結果、グルコースの影響を回避する酵素反応として
は、１，５−ＡＧに反応しないグルコキナーゼ（ＧＫ）
やヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコースオキシダーゼ
などを用いる方法が採れることが判明した。特に、下記
の反応４に示される酵素反応によりグルコースを先に反
応させて消費し、その後で１，５−ＡＧの定量反応を進
める方法が好適であることを見出した。なお、反応４に
示される酵素反応系は、臨床検査の測定法でよく利用さ
れる反応系であり、従来法に準じて実施することがで
き、使用される試薬組成物、反応条件などは従来法に準
じて設定することができる。
【００１１】
【化４】
【００１２】より詳細には、試料中のグルコースの消費
をグルコースのリン酸化により行う場合には、上記の反
応４と前記の反応２とを組み合わせた下記の反応５によ
る。反応５の酵素反応系は、ＡＴＰの存在下、グルコー
スにＧＫ又はＨＫを作用させてグルコース ６−リン酸
に変換すると共にＡＤＰを生成させ；生成したＡＤＰ
に、ＰＥＰの存在下、ＰＫを作用させ、ＡＴＰとピルビ
ン酸を生成させ；生じたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在
下、ＬＤＨを作用させて乳酸とＮＡＤを生成する反応で
ある。
をグルコースのリン酸化により行う場合には、上記の反
応４と前記の反応２とを組み合わせた下記の反応５によ
る。反応５の酵素反応系は、ＡＴＰの存在下、グルコー
スにＧＫ又はＨＫを作用させてグルコース ６−リン酸
に変換すると共にＡＤＰを生成させ；生成したＡＤＰ
に、ＰＥＰの存在下、ＰＫを作用させ、ＡＴＰとピルビ
ン酸を生成させ；生じたピルビン酸に、ＮＡＤＨの存在
下、ＬＤＨを作用させて乳酸とＮＡＤを生成する反応で
ある。
【００１３】
【化５】
【００１４】本発明の方法により、グルコースを含む試
料中の１，５−ＡＧを定量するには、反応５と反応３を
組合せ、まず反応５によりグルコースを消費した後、反
応３により１，５−ＡＧの定量を行う。この場合、反応
５及び反応３においては、反応２が共通に利用されてお
り、また反応５及び反応３は反応系のｐＨを変更するこ
となく、同一のｐＨ条件で進行する。従って、反応５の
酵素反応が終了後、反応３の試薬組成物を添加するだけ
で、反応５及び反応３を連続的に行うことができる。よ
って、試料中のグルコースの影響を回避するために従来
行われていた樹脂処理、ホウ酸処理、ｐＨ処理などを行
う必要がないので、自動分析装置に好適な方法である。
料中の１，５−ＡＧを定量するには、反応５と反応３を
組合せ、まず反応５によりグルコースを消費した後、反
応３により１，５−ＡＧの定量を行う。この場合、反応
５及び反応３においては、反応２が共通に利用されてお
り、また反応５及び反応３は反応系のｐＨを変更するこ
となく、同一のｐＨ条件で進行する。従って、反応５の
酵素反応が終了後、反応３の試薬組成物を添加するだけ
で、反応５及び反応３を連続的に行うことができる。よ
って、試料中のグルコースの影響を回避するために従来
行われていた樹脂処理、ホウ酸処理、ｐＨ処理などを行
う必要がないので、自動分析装置に好適な方法である。
【００１５】より具体的には、まず、グルコースを含む
試料を反応５の酵素反応により処理する。すると試料中
のグルコースはグルコース ６−リン酸に変換され、そ
の量に応じてＮＡＤＨが減少し波長３４０ｎｍでの吸光
度が低下する（このときの吸光度を「Ａ１」とする）。
次に反応３を進めると、１，５−ＡＧ量に応じてＮＡＤ
Ｈが更に減少し、波長３４０ｎｍでの吸光度が更に低下
する（このとき吸光度を「Ａ２」とする）。ここで「Ａ
１」から「Ａ２」を差し引くと１，５−ＡＧ量に応じた
ＮＡＤＨ量が算出でき、１，５−ＡＧを定量することが
できる。前述のように、反応５と反応３は反応２を共通
の共役酵素反応としているので、実際の測定は反応５の
試薬組成物で処理した後、反応３の試薬組成物（Ｂ．Ｈ
Ｋ／Ｂ．ＧＫ含有組成物）を加えるというステップで行
うことができる。そのため、こられの反応は一連に進め
ることが可能となり、自動分析装置で測定することがで
きるようになる。上記の反応５の工程で使用される試薬
組成物としては、例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＰＥＰ、０．６
ｍＭ ＮＡＤＨ、５Ｕ／ｍｌ ＧＫ又はＨＫ、２Ｕ／ｍｌ
ＰＫ、２Ｕ／ｍｌ ＬＤＨを含有する１００ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）などが例示でき
る。また、反応３の工程で使用される試薬組成物として
は、例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ＫＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫを含有する
１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）
などが例示できる。
試料を反応５の酵素反応により処理する。すると試料中
のグルコースはグルコース ６−リン酸に変換され、そ
の量に応じてＮＡＤＨが減少し波長３４０ｎｍでの吸光
度が低下する（このときの吸光度を「Ａ１」とする）。
次に反応３を進めると、１，５−ＡＧ量に応じてＮＡＤ
Ｈが更に減少し、波長３４０ｎｍでの吸光度が更に低下
する（このとき吸光度を「Ａ２」とする）。ここで「Ａ
１」から「Ａ２」を差し引くと１，５−ＡＧ量に応じた
ＮＡＤＨ量が算出でき、１，５−ＡＧを定量することが
できる。前述のように、反応５と反応３は反応２を共通
の共役酵素反応としているので、実際の測定は反応５の
試薬組成物で処理した後、反応３の試薬組成物（Ｂ．Ｈ
Ｋ／Ｂ．ＧＫ含有組成物）を加えるというステップで行
うことができる。そのため、こられの反応は一連に進め
ることが可能となり、自動分析装置で測定することがで
きるようになる。上記の反応５の工程で使用される試薬
組成物としては、例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０
ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＰＥＰ、０．６
ｍＭ ＮＡＤＨ、５Ｕ／ｍｌ ＧＫ又はＨＫ、２Ｕ／ｍｌ
ＰＫ、２Ｕ／ｍｌ ＬＤＨを含有する１００ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）などが例示でき
る。また、反応３の工程で使用される試薬組成物として
は、例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ＫＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ／Ｂ．ＧＫを含有する
１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．６）
などが例示できる。
【００１６】なお、本発明の測定方法は上記で示された
方法に限定されるものではない。例えば、本発明は、反
応の指標として過酸化水素を産生する酵素反応を共役す
ることにより行うこともできる。例えば、下記のような
反応６を反応１に組合せて反応７とし、この反応で生成
した過酸化水素を測定することにより１，５−ＡＧを定
量することができる。なお、反応６に示される酵素反応
は公知の反応系で、この分野でよく知られた反応系であ
り、従来法に準じて実施することができ、使用される試
薬組成物、反応条件などは従来法に準じて設定すること
ができる。生成した過酸化水素の定量は常法に準じて行
うことができ、例えば、過酸化水素電極による測定方
法；ペルオキシダーゼの存在下でフェノールと４−アミ
ノアンチピリンと反応させると赤（紫）色に発色するの
でその吸光度を測る方法などにより定量できる。また、
ペルオキダーゼの存在下、ペルオキシダーゼ基質を過酸
化水素で酸化し、生成した蛍光物質や化学発光を測定す
る方法で行うこともできる。
方法に限定されるものではない。例えば、本発明は、反
応の指標として過酸化水素を産生する酵素反応を共役す
ることにより行うこともできる。例えば、下記のような
反応６を反応１に組合せて反応７とし、この反応で生成
した過酸化水素を測定することにより１，５−ＡＧを定
量することができる。なお、反応６に示される酵素反応
は公知の反応系で、この分野でよく知られた反応系であ
り、従来法に準じて実施することができ、使用される試
薬組成物、反応条件などは従来法に準じて設定すること
ができる。生成した過酸化水素の定量は常法に準じて行
うことができ、例えば、過酸化水素電極による測定方
法；ペルオキシダーゼの存在下でフェノールと４−アミ
ノアンチピリンと反応させると赤（紫）色に発色するの
でその吸光度を測る方法などにより定量できる。また、
ペルオキダーゼの存在下、ペルオキシダーゼ基質を過酸
化水素で酸化し、生成した蛍光物質や化学発光を測定す
る方法で行うこともできる。
【００１７】
【化６】
【００１８】
【化７】
【００１９】また、他の方法として、本発明の方法は、
ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を用いた下記の反応８
により実施することもできる。この方法は、工程式に示
されるように、前述と同様にして生成したピルビン酸
を、ＰＤＨ及びコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の存在下、Ｎ
ＡＤと反応させ、ＮＡＤＨ、アセチル-ＣｏＡ及びＣｏ2
を生成させるもので、生成したＮＡＤＨ量を波長３４０
ｎｍでの吸光度で測定することにより、１，５−ＡＧの
量を求めることができる。
ピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を用いた下記の反応８
により実施することもできる。この方法は、工程式に示
されるように、前述と同様にして生成したピルビン酸
を、ＰＤＨ及びコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の存在下、Ｎ
ＡＤと反応させ、ＮＡＤＨ、アセチル-ＣｏＡ及びＣｏ2
を生成させるもので、生成したＮＡＤＨ量を波長３４０
ｎｍでの吸光度で測定することにより、１，５−ＡＧの
量を求めることができる。
【００２０】
【化８】
【００２１】更に、その他の方法として、本発明の方法
は、ＰＨＤ及び電子受容体を関与させた下記の反応９に
よっても実施することができる。この方法は、工程式に
示されるように、前述と同様にして生成したピルビン酸
を、ＰＤＨ、無機リン(Ｐｉ)、ＦＡＤ、ＴＰＰ及びＭｇ
2+の存在下、電子受容体と反応させ、還元型電子受容
体、アセチルリン酸及びＣＯ2を生成させるもので、生
成した還元型電子受容体を直接又は他の反応系を関与さ
せて測定することにより、１，５−ＡＧの量を求めるこ
とができる。上記の電子受容体としては、例えば、フェ
ナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、ジクロロフェノー
ルインドフェノール、フェリシアン化化合物、フェロセ
ン、フェロセン誘導体、ニトロブルーテトラゾリウムク
ロライド（ＮＴＢ）、チトクロームＣ、フラビンモノヌ
クレオチド（ＦＭＮ）などが例示される。より具体的に
は、電子受容体としてＰＭＳを用いた例をもって説明す
る。この反応は下記の反応１０で示される。即ち、ピル
ビン酸を、ＰＤＨ、Ｐｉ、ＦＡＤ、ＴＰＰ及びＭｇ2+の
存在下、ＰＭＳと反応させ、還元型ＰＭＳ、アセチルリ
ン酸及びＣＯ2を生成させ、次いで生成した還元型ＰＭ
ＳでＮＴＢを還元してジフォルマザンを生成させ、生成
したジフォルマザン量を波長５７０ｎｍでの吸光度で測
定することにより行うことができる。
は、ＰＨＤ及び電子受容体を関与させた下記の反応９に
よっても実施することができる。この方法は、工程式に
示されるように、前述と同様にして生成したピルビン酸
を、ＰＤＨ、無機リン(Ｐｉ)、ＦＡＤ、ＴＰＰ及びＭｇ
2+の存在下、電子受容体と反応させ、還元型電子受容
体、アセチルリン酸及びＣＯ2を生成させるもので、生
成した還元型電子受容体を直接又は他の反応系を関与さ
せて測定することにより、１，５−ＡＧの量を求めるこ
とができる。上記の電子受容体としては、例えば、フェ
ナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、ジクロロフェノー
ルインドフェノール、フェリシアン化化合物、フェロセ
ン、フェロセン誘導体、ニトロブルーテトラゾリウムク
ロライド（ＮＴＢ）、チトクロームＣ、フラビンモノヌ
クレオチド（ＦＭＮ）などが例示される。より具体的に
は、電子受容体としてＰＭＳを用いた例をもって説明す
る。この反応は下記の反応１０で示される。即ち、ピル
ビン酸を、ＰＤＨ、Ｐｉ、ＦＡＤ、ＴＰＰ及びＭｇ2+の
存在下、ＰＭＳと反応させ、還元型ＰＭＳ、アセチルリ
ン酸及びＣＯ2を生成させ、次いで生成した還元型ＰＭ
ＳでＮＴＢを還元してジフォルマザンを生成させ、生成
したジフォルマザン量を波長５７０ｎｍでの吸光度で測
定することにより行うことができる。
【００２２】
【化９】
【００２３】
【化１０】
【００２４】本発明の方法は、糖尿病のマーカーである
１，５−ＡＧの測定法であり、臨床検査などの分野で好
適に利用される。測定試料（検体）としては、例えば、
血液、血漿、血清、髄液、尿等の体液、動物組織の抽出
液などが挙げられる。
１，５−ＡＧの測定法であり、臨床検査などの分野で好
適に利用される。測定試料（検体）としては、例えば、
血液、血漿、血清、髄液、尿等の体液、動物組織の抽出
液などが挙げられる。
【００２５】
【発明の効果】本発明の方法によれば、１，５−ＡＧを
簡便にして且つ高精度で定量することができ、試料中の
還元物質の影響を受けないという利点がある。特に、グ
ルコースを含む試料に対して、グルコースを消費する酵
素反応と組み合わせることにより、試料を前処理するこ
となく、１，５−ＡＧを定量することができるので、自
動分析装置による測定が可能であり、多数の試料を迅速
に処理することができるという効果を奏する。
簡便にして且つ高精度で定量することができ、試料中の
還元物質の影響を受けないという利点がある。特に、グ
ルコースを含む試料に対して、グルコースを消費する酵
素反応と組み合わせることにより、試料を前処理するこ
となく、１，５−ＡＧを定量することができるので、自
動分析装置による測定が可能であり、多数の試料を迅速
に処理することができるという効果を奏する。
【００２６】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１検量線の作成 １０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ
ＰＥＰ、５ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ、１Ｕ
／ｍｌ ＰＫ、１０Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ、１ｋＵ／ｍｌ
Ｂ．ＨＫを含む０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．６）１ｍｌを３７℃に恒温し、ここに各濃度
の１，５−ＡＧ溶液（１０μｌ）を添加し、反応を開始
した。反応開始１０分後の３４０ｎｍにおける減少吸光
度を測定した。その結果を図１に示した。図１に示され
るように、本発明の方法による測定は良好な直線性を示
した。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１検量線の作成 １０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ
ＰＥＰ、５ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＮＡＤＨ、１Ｕ
／ｍｌ ＰＫ、１０Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ、１ｋＵ／ｍｌ
Ｂ．ＨＫを含む０．１Ｍトリエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ７．６）１ｍｌを３７℃に恒温し、ここに各濃度
の１，５−ＡＧ溶液（１０μｌ）を添加し、反応を開始
した。反応開始１０分後の３４０ｎｍにおける減少吸光
度を測定した。その結果を図１に示した。図１に示され
るように、本発明の方法による測定は良好な直線性を示
した。
【００２７】実施例２血清試料中の１，５−ＡＧの測定 本発明の方法を用いて、ヒト血清中の１，５−ＡＧの定
量を行った。ヒト血清はグルコースを含有するので、前
述のように、検体を反応５の酵素反応で処理してグルコ
ースを消費した後、反応３により１，５−ＡＧを定量し
た。使用した試薬組成、操作方法及び結果は以下のとお
りである。試薬組成 第一試薬 １００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
６） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １４０ｍＭ ＫＣｌ ２ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ ＰＥＰ ０．６ｍＭ ＮＡＤＨ ５Ｕ／ｍｌ ＧＫ ２Ｕ／ｍｌ ＰＫ ２Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ 第二試薬 １００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
６） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １４０ｍＭ ＫＣｌ １．５ｋＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ
量を行った。ヒト血清はグルコースを含有するので、前
述のように、検体を反応５の酵素反応で処理してグルコ
ースを消費した後、反応３により１，５−ＡＧを定量し
た。使用した試薬組成、操作方法及び結果は以下のとお
りである。試薬組成 第一試薬 １００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
６） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １４０ｍＭ ＫＣｌ ２ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ ＰＥＰ ０．６ｍＭ ＮＡＤＨ ５Ｕ／ｍｌ ＧＫ ２Ｕ／ｍｌ ＰＫ ２Ｕ／ｍｌ ＬＤＨ 第二試薬 １００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．
６） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １４０ｍＭ ＫＣｌ １．５ｋＵ／ｍｌ Ｂ．ＨＫ
【００２８】操作方法 ０．１ｍｌの検体に０．９ｍｌの第一試薬を添加し、３
７℃で５分間加温後、波長３４０ｎｍの吸光度を測定す
る（Ａ１とする）。次いで、第二試薬０．５ｍｌを添加
し、３７℃で５分間加温後、波長３４０ｎｍの吸光度を
測定する（Ａ２とする）。吸光度Ａ１とＡ２の差を算出
し、予め作成した検量線から１，５−ＡＧ濃度を求め
た。なお、従来法として、上記の検体について、市販の
１，５−ＡＧ定量試薬キット［ラナ１，５−ＡＧオート
（カイノス、日本化薬社製）］を用いて、同キットに添
付の使用説明書の用法・用量に従い１，５−ＡＧの定量
を行った。結果 血清検体５例（Ａ〜Ｅ）中の１，５−ＡＧの測定結果を
下記の表１に示す（単位：μｇ／ｍｌ）。表１に示され
るように、本発明の測定結果は従来法の測定結果とよく
相関しており、本発明の方法により１，５−ＡＧの定量
を行えることが判明した。また、操作性も従来法に比べ
て良好であった。
７℃で５分間加温後、波長３４０ｎｍの吸光度を測定す
る（Ａ１とする）。次いで、第二試薬０．５ｍｌを添加
し、３７℃で５分間加温後、波長３４０ｎｍの吸光度を
測定する（Ａ２とする）。吸光度Ａ１とＡ２の差を算出
し、予め作成した検量線から１，５−ＡＧ濃度を求め
た。なお、従来法として、上記の検体について、市販の
１，５−ＡＧ定量試薬キット［ラナ１，５−ＡＧオート
（カイノス、日本化薬社製）］を用いて、同キットに添
付の使用説明書の用法・用量に従い１，５−ＡＧの定量
を行った。結果 血清検体５例（Ａ〜Ｅ）中の１，５−ＡＧの測定結果を
下記の表１に示す（単位：μｇ／ｍｌ）。表１に示され
るように、本発明の測定結果は従来法の測定結果とよく
相関しており、本発明の方法により１，５−ＡＧの定量
を行えることが判明した。また、操作性も従来法に比べ
て良好であった。
【００２９】
【表１】
【図１】本発明の方法による１，５−ＡＧの定量におけ
る検量線を示す図である。
る検量線を示す図である。
【化３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡津 吉史 神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際試薬株 式会社研究開発センター内
Claims (3)
- 【請求項１】 １，５−アンヒドログルシトールを
リン酸化する酵素反応を少なくとも含むことを特徴とす
る試料中の１，５−アンヒドログルシトールの定量方
法。 - 【請求項２】 酵素として、バチルス属(Bacillus
sp.)由来のヘキソキナーゼ又はバチルス ステアロサー
モフィルス(Bacillus stearothermophilus)由来のグル
コキナーゼを用いる請求項１記載の試料中の１，５−ア
ンヒドログルシトールの定量方法。 - 【請求項３】 グルコースを含有する試料中の１，
５−アンヒドログルシトールの定量法であって、試料を
グルコースをリン酸化する酵素反応に付してグルコース
を消費した試料を用いる請求項１又は２記載の試料中の
１，５−アンヒドログルシトールの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35133995A JPH09173097A (ja) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35133995A JPH09173097A (ja) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09173097A true JPH09173097A (ja) | 1997-07-08 |
Family
ID=18416638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35133995A Pending JPH09173097A (ja) | 1995-12-25 | 1995-12-25 | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09173097A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001299386A (ja) * | 2000-04-21 | 2001-10-30 | Mitsubishi Chemicals Corp | 酵素濃度の測定方法および酵素濃度の測定装置 |
-
1995
- 1995-12-25 JP JP35133995A patent/JPH09173097A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001299386A (ja) * | 2000-04-21 | 2001-10-30 | Mitsubishi Chemicals Corp | 酵素濃度の測定方法および酵素濃度の測定装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6309852B1 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| Basak | Development of a rapid and inexpensive plasma glucose estimation by two-point kinetic method based on glucose oxidase-peroxidase enzymes | |
| CN112255219A (zh) | 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| EP0639646B1 (en) | High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| JPH06253895A (ja) | 総ケトン体の測定方法および測定試薬 | |
| JP3170377B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| JPH0771514B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| US6268166B1 (en) | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol | |
| JPH09173097A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量方法 | |
| JP4022799B2 (ja) | 電解質測定用試薬組成物 | |
| EP1099765B1 (en) | Quantitative determination method of mannose and reagent therefor | |
| JP4412780B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法および定量試薬 | |
| EP1213357A2 (en) | Method and reagent for quantitative determination of 1, 5-Anhydroglucitol | |
| JPH0115280B2 (ja) | ||
| US7407774B2 (en) | Method for reducing influence of hemoglobin with albumin in an assay | |
| JP3760250B2 (ja) | 硫酸抱合型胆汁酸の定量法及びそのキット | |
| JP2001078797A (ja) | グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 | |
| JPH06253894A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP3402487B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JP3566976B2 (ja) | 生体成分中の測定対象の測定方法 | |
| JP4104393B2 (ja) | 生体試料中の特定成分の定量方法及び定量用試薬 | |
| JP3287879B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPH06237794A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20050930 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20051101 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051122 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20060119 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20060121 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060314 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060426 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20071010 |