JP2001078797A - グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 - Google Patents
グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬Info
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- JP2001078797A JP2001078797A JP25511099A JP25511099A JP2001078797A JP 2001078797 A JP2001078797 A JP 2001078797A JP 25511099 A JP25511099 A JP 25511099A JP 25511099 A JP25511099 A JP 25511099A JP 2001078797 A JP2001078797 A JP 2001078797A
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- glucono
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の内因性のグルコースおよび／または
グルコノ−１，５−ラクトンを完全に消去する消去試薬
が望まれている。 【解決手段】 グルコースオキシダーゼまたはグルコー
スデヒドロゲナーゼと、グルコノラクトナーゼとを含有
する消去試薬を、試料に作用させることにより、試料中
に存在する内因性のグルコースおよび／またはグルコノ
−１，５−ラクトンを完全に消去することができ、試料
中の1,5-アンヒドログルシトール、マルトース等の糖
や、アミラーゼ等の酵素活性を、グルコースの干渉を受
けることなく正確に測定することが出来る。
グルコノ−１，５−ラクトンを完全に消去する消去試薬
が望まれている。 【解決手段】 グルコースオキシダーゼまたはグルコー
スデヒドロゲナーゼと、グルコノラクトナーゼとを含有
する消去試薬を、試料に作用させることにより、試料中
に存在する内因性のグルコースおよび／またはグルコノ
−１，５−ラクトンを完全に消去することができ、試料
中の1,5-アンヒドログルシトール、マルトース等の糖
や、アミラーゼ等の酵素活性を、グルコースの干渉を受
けることなく正確に測定することが出来る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検体中に既に存在
するグルコースが検体成分の測定に干渉を及ぼす測定試
薬において内因性のグルコースおよび／またはグルコノ
−１，５−ラクトンを速やかに消去するのに用いること
ができる前処理試薬に関するものである。
するグルコースが検体成分の測定に干渉を及ぼす測定試
薬において内因性のグルコースおよび／またはグルコノ
−１，５−ラクトンを速やかに消去するのに用いること
ができる前処理試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】内因性のグルコースを消去する方法とし
て、例えば、特開昭６３−１８５３９７号公報には、
（１）イオン交換樹脂で吸着する方法、（２）塩酸で分
解する方法、（３）水素化ホウ素ナトリウムで還元する
方法、（４）ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼでリ
ン酸化する方法、（５）グルコースオキシダーゼで酸化
する方法が開示されている。これらの方法のうち、
（１）の方法を用いた１，５−アンヒドログルシトール
（１，５−ＡＧ）測定キット、また、（４）の方法を用
いた１，５−ＡＧの自動測定試薬が、開発され上市され
ている。
て、例えば、特開昭６３−１８５３９７号公報には、
（１）イオン交換樹脂で吸着する方法、（２）塩酸で分
解する方法、（３）水素化ホウ素ナトリウムで還元する
方法、（４）ヘキソキナーゼまたはグルコキナーゼでリ
ン酸化する方法、（５）グルコースオキシダーゼで酸化
する方法が開示されている。これらの方法のうち、
（１）の方法を用いた１，５−アンヒドログルシトール
（１，５−ＡＧ）測定キット、また、（４）の方法を用
いた１，５−ＡＧの自動測定試薬が、開発され上市され
ている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】グルコースオキシダー
ゼを用いてグルコースを酸化して消去する従来の方法
は、優れた方法ではあるが、試料中に大量に存在するグ
ルコースを完全に処理できないという問題があり、高濃
度のグルコースを完全に消去する試薬が望まれている。
ゼを用いてグルコースを酸化して消去する従来の方法
は、優れた方法ではあるが、試料中に大量に存在するグ
ルコースを完全に処理できないという問題があり、高濃
度のグルコースを完全に消去する試薬が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、汎用自動
分析装置にも応用可能な迅速で効率の良いグルコースお
よびグルコノ−１，５−ラクトン消去方法およびその試
薬を検討した結果、グルコースに作用してグルコノ−
１，５−ラクトンを生成する酵素と、グルコノ−１，５
−ラクトンをグルコン酸に変換する酵素であるグルコノ
ラクトナーゼとの両者の酵素で検体を処理することによ
って、検体中に存在する内因性のグルコースおよびグル
コノ−１，５−ラクトンを完全に消去できることを見出
し、本発明を完成した。
分析装置にも応用可能な迅速で効率の良いグルコースお
よびグルコノ−１，５−ラクトン消去方法およびその試
薬を検討した結果、グルコースに作用してグルコノ−
１，５−ラクトンを生成する酵素と、グルコノ−１，５
−ラクトンをグルコン酸に変換する酵素であるグルコノ
ラクトナーゼとの両者の酵素で検体を処理することによ
って、検体中に存在する内因性のグルコースおよびグル
コノ−１，５−ラクトンを完全に消去できることを見出
し、本発明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は、以下の（１）から（８）
に示す発明に関するものである。 （１）グルコースに作用してグルコノ−１，５−ラクト
ンを生成する酵素およびグルコノラクトナーゼを含むこ
とを特徴とするグルコースおよび／またはグルコノ−
１，５−ラクトン消去試薬。 （２）グルコースに作用してグルコノ−１，５−ラクト
ンを生成する酵素がグルコースオキシダーゼあるいはグ
ルコースデヒドロゲナーゼである上記（１）記載の消去
試薬。 （３）グルコノラクトナーゼが、フザリウム属、ザイモ
モナス属、シュードモナス属、エシェリヒア属、サッカ
ロミセス属、シリンドロカルボン属、ジベレラ属、アス
ペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ボルテラ
属、グリオクラデイウム属、ユーロテイウム属、ネクト
リア属、シゾフイラム属、ミロセシウム属、ノイロスポ
ラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ属、アブシジア
属、スポロスリクス属、バーティシリウム属、あるいは
アルスロダーマ属に属する微生物より得られた酵素であ
る上記（１）または（２）に記載の消去試薬。 （４）グルコノラクトナーゼが、フザリウム オキシス
ポルム由来である上記（１）または（２）に記載の消去
試薬。 （５）更にムタロターゼを含む上記（１）乃至（４）の
いづれかに記載の消去試薬。 （６）１，５−アンヒドログルシトールの測定用である
上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試薬。 （７）上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試
薬を含むことを特徴とする１，５−アンヒドログルシト
ールの測定用試薬。 （８）上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試
薬を用いることを特徴とする試料中のグルコースおよび
／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去方法。 （９）上記（８）に記載の消去方法で試料を処理し、次
いで１，５−アンヒドログルシトールを定量することを
特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの測定方
法。
に示す発明に関するものである。 （１）グルコースに作用してグルコノ−１，５−ラクト
ンを生成する酵素およびグルコノラクトナーゼを含むこ
とを特徴とするグルコースおよび／またはグルコノ−
１，５−ラクトン消去試薬。 （２）グルコースに作用してグルコノ−１，５−ラクト
ンを生成する酵素がグルコースオキシダーゼあるいはグ
ルコースデヒドロゲナーゼである上記（１）記載の消去
試薬。 （３）グルコノラクトナーゼが、フザリウム属、ザイモ
モナス属、シュードモナス属、エシェリヒア属、サッカ
ロミセス属、シリンドロカルボン属、ジベレラ属、アス
ペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属、ボルテラ
属、グリオクラデイウム属、ユーロテイウム属、ネクト
リア属、シゾフイラム属、ミロセシウム属、ノイロスポ
ラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ属、アブシジア
属、スポロスリクス属、バーティシリウム属、あるいは
アルスロダーマ属に属する微生物より得られた酵素であ
る上記（１）または（２）に記載の消去試薬。 （４）グルコノラクトナーゼが、フザリウム オキシス
ポルム由来である上記（１）または（２）に記載の消去
試薬。 （５）更にムタロターゼを含む上記（１）乃至（４）の
いづれかに記載の消去試薬。 （６）１，５−アンヒドログルシトールの測定用である
上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試薬。 （７）上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試
薬を含むことを特徴とする１，５−アンヒドログルシト
ールの測定用試薬。 （８）上記（１）乃至（５）のいづれかに記載の消去試
薬を用いることを特徴とする試料中のグルコースおよび
／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去方法。 （９）上記（８）に記載の消去方法で試料を処理し、次
いで１，５−アンヒドログルシトールを定量することを
特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの測定方
法。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、試料中の被検物質の測定の前に、試
料を、例えばグルコースオキシダーゼあるいはグルコー
スデヒドロゲナーゼ等のグルコースに作用してグルコノ
−１，５−ラクトンを生成する酵素と、グルコノ−１，
５−ラクトンをグルコン酸に変換する酵素であるグルコ
ノラクトナーゼで処理する。被検物質の測定に阻害また
は干渉を与えるグルコースはα−グルコースとβ−グル
コースが平衡関係にあり、前記酵素はβ−グルコースに
のみ作用し、αグルコースには作用しないので、αグル
コースをβグルコースに変換するために、試料を前記酵
素に加えて更にムタロターゼを用いて処理するのが好ま
しい。被検物質の測定の前に、試料を前処理する具体例
としては、１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素を
用いた１，５−ＡＧ測定試薬のように試料中に存在する
グルコースあるいはグルコノ−１，５−ラクトンまた
は、前処理により生成したグルコノ−１，５−ラクトン
が、被検物質の測定の障害となるような場合がある。ま
た、被検物質の測定にグルコース測定を測定原理とした
アミラーゼ測定、マルトース測定、α−グルコシダーゼ
測定のような場合にも、試料中に存在するグルコースを
完全に除去しなければならない。
本発明においては、試料中の被検物質の測定の前に、試
料を、例えばグルコースオキシダーゼあるいはグルコー
スデヒドロゲナーゼ等のグルコースに作用してグルコノ
−１，５−ラクトンを生成する酵素と、グルコノ−１，
５−ラクトンをグルコン酸に変換する酵素であるグルコ
ノラクトナーゼで処理する。被検物質の測定に阻害また
は干渉を与えるグルコースはα−グルコースとβ−グル
コースが平衡関係にあり、前記酵素はβ−グルコースに
のみ作用し、αグルコースには作用しないので、αグル
コースをβグルコースに変換するために、試料を前記酵
素に加えて更にムタロターゼを用いて処理するのが好ま
しい。被検物質の測定の前に、試料を前処理する具体例
としては、１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素を
用いた１，５−ＡＧ測定試薬のように試料中に存在する
グルコースあるいはグルコノ−１，５−ラクトンまた
は、前処理により生成したグルコノ−１，５−ラクトン
が、被検物質の測定の障害となるような場合がある。ま
た、被検物質の測定にグルコース測定を測定原理とした
アミラーゼ測定、マルトース測定、α−グルコシダーゼ
測定のような場合にも、試料中に存在するグルコースを
完全に除去しなければならない。
【０００７】本発明の消去試薬を用いる対象となる試料
としては、種々のものが挙げられ、例えば、ヒトを含む
各種動物の髄液、血漿、血清、尿等の体液や組織抽出
物、植物の抽出液、漢方薬、食品等が挙げられる。本発
明に使用するグルコースに作用してグルコノ−１，５−
ラクトンを生成する具体的な酵素としては、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢの命名法で、グルコースオキシダーゼ：ＥＣ
１．１．３．４、ヘキソースオキシダーゼ：ＥＣ１．
１．３．５、グルコースデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．
１．１．４７、ＥＣ１．１．１．１１８、ＥＣ１．１．
１．１１９、ＥＣ１．１．９９．１０に分類し得るもの
等が挙げられ、特に制限はなく、市販のものを使用し得
る。また、本発明で使用するグルコノラクトナーゼは、
グルコノ−１，５−ラクトンに作用してグルコン酸を生
成する酵素であれば特に制限はなく、好ましくは、ＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でＥＣ３．１．１．１７に分類
し得るものである。また、種々の微生物例えば、フザリ
ウム属、ザイモモナス属、シュードモナス属、エシェリ
ヒア属、サッカロミセス属、シリンドロカルボン属、ジ
ベレラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプ
ス属、ボルテラ属、グリオクラデイウム属、ユーロテイ
ウム属、ネクトリア属、シゾフイラム属、ミロセシウム
属、ノイロスポラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ
属、アブシジア属、スポロスリクス属、バーティシリウ
ム属、あるいはアルスロダーマ属に属する微生物等が生
産したグルコノラクトナーゼを使用することができる。
好ましくはフザリウムオキシスポルム由来のグルコノラ
クトナーゼであり、特に好ましくはフザリウムオキシス
ポルム ＩＦＯ５９４２由来のグルコノラクトナーゼで
ある。上記の種々の微生物由来のグルコノラクトナーゼ
の抽出・精製は、通常の方法が適用でき特に限定されな
い。また、フザリウム オキシスポルムのグルコノラク
トナーゼについては、公知である（Eur. J. Biochem.,
209, 383 (1992)）が、当然ながらこの方法に限定され
るものではない。本発明においてムタロターゼを使用す
る場合、使用するムタロターゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの
命名法でＥＣ５．１．３．３に分類されるものであれば
特に制限はない。
としては、種々のものが挙げられ、例えば、ヒトを含む
各種動物の髄液、血漿、血清、尿等の体液や組織抽出
物、植物の抽出液、漢方薬、食品等が挙げられる。本発
明に使用するグルコースに作用してグルコノ−１，５−
ラクトンを生成する具体的な酵素としては、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢの命名法で、グルコースオキシダーゼ：ＥＣ
１．１．３．４、ヘキソースオキシダーゼ：ＥＣ１．
１．３．５、グルコースデヒドロゲナーゼ：ＥＣ１．
１．１．４７、ＥＣ１．１．１．１１８、ＥＣ１．１．
１．１１９、ＥＣ１．１．９９．１０に分類し得るもの
等が挙げられ、特に制限はなく、市販のものを使用し得
る。また、本発明で使用するグルコノラクトナーゼは、
グルコノ−１，５−ラクトンに作用してグルコン酸を生
成する酵素であれば特に制限はなく、好ましくは、ＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でＥＣ３．１．１．１７に分類
し得るものである。また、種々の微生物例えば、フザリ
ウム属、ザイモモナス属、シュードモナス属、エシェリ
ヒア属、サッカロミセス属、シリンドロカルボン属、ジ
ベレラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプ
ス属、ボルテラ属、グリオクラデイウム属、ユーロテイ
ウム属、ネクトリア属、シゾフイラム属、ミロセシウム
属、ノイロスポラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ
属、アブシジア属、スポロスリクス属、バーティシリウ
ム属、あるいはアルスロダーマ属に属する微生物等が生
産したグルコノラクトナーゼを使用することができる。
好ましくはフザリウムオキシスポルム由来のグルコノラ
クトナーゼであり、特に好ましくはフザリウムオキシス
ポルム ＩＦＯ５９４２由来のグルコノラクトナーゼで
ある。上記の種々の微生物由来のグルコノラクトナーゼ
の抽出・精製は、通常の方法が適用でき特に限定されな
い。また、フザリウム オキシスポルムのグルコノラク
トナーゼについては、公知である（Eur. J. Biochem.,
209, 383 (1992)）が、当然ながらこの方法に限定され
るものではない。本発明においてムタロターゼを使用す
る場合、使用するムタロターゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの
命名法でＥＣ５．１．３．３に分類されるものであれば
特に制限はない。
【０００８】試料中のグルコースおよび／またはグルコ
ノ−１，５−ラクトンを消去する際、各酵素の使用量
は、試料中に含まれるグルコース量等により異なるが、
通常は、例えば次のとおりである。グルコースに作用し
てグルコノ−１，５−ラクトンを生成する酵素は、５Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが使用され、例えばグルコース
オキシダーゼでは１０Ｕ／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが、グ
ルコースデヒドロゲナーゼでは５Ｕ／ｍＬ〜４００Ｕ／
ｍＬが使用される。また、グルコノラクトナーゼは５Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが使用される。グルコースオキ
シダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコノラク
トナーゼ等は、必要に応じてムタロターゼと組み合わせ
て使用される。ムタロターゼの使用量は通常例えば１Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬである。また、これらの酵素
は、試料に同時に添加してもよく、また、任意の順序で
添加してもよい。
ノ−１，５−ラクトンを消去する際、各酵素の使用量
は、試料中に含まれるグルコース量等により異なるが、
通常は、例えば次のとおりである。グルコースに作用し
てグルコノ−１，５−ラクトンを生成する酵素は、５Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが使用され、例えばグルコース
オキシダーゼでは１０Ｕ／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが、グ
ルコースデヒドロゲナーゼでは５Ｕ／ｍＬ〜４００Ｕ／
ｍＬが使用される。また、グルコノラクトナーゼは５Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬが使用される。グルコースオキ
シダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコノラク
トナーゼ等は、必要に応じてムタロターゼと組み合わせ
て使用される。ムタロターゼの使用量は通常例えば１Ｕ
／ｍＬ〜４００Ｕ／ｍＬである。また、これらの酵素
は、試料に同時に添加してもよく、また、任意の順序で
添加してもよい。
【０００９】グルコースオキシダーゼを用いる場合、グ
ルコノラクトナーゼおよびムタロターゼを併せて試料に
添加することにより、これら酵素が試料に作用し、試料
中のα−グルコースは、ムタロターゼによりβ−グルコ
ースに変換され、β−グルコースは、グルコースオキシ
ダーゼにより、グルコノ−１，５−ラクトンに変換さ
れ、それと同時に過酸化水素が生成される。また、グル
コノ−１，５−ラクトンは、グルコノラクトナーゼによ
りグルコン酸に変換され、グルコノ−１，５−ラクトン
とグルコースの平衡が変化することによって、グルコー
スオキシダーゼによるグルコースの酸化が完全に行われ
るようになる。グルコースオキシダーゼによるグルコー
スの酸化で生成する過酸化水素が、被検物質の測定の障
害となるような場合は、過酸化水素を処理でき、上記反
応を阻害しない酵素や試薬を添加し、過酸化水素を消去
させることができる。例えば、カタラーゼや、ペルオキ
シダーゼとフェノールなどで、過酸化水素を処理するこ
とが公知である。
ルコノラクトナーゼおよびムタロターゼを併せて試料に
添加することにより、これら酵素が試料に作用し、試料
中のα−グルコースは、ムタロターゼによりβ−グルコ
ースに変換され、β−グルコースは、グルコースオキシ
ダーゼにより、グルコノ−１，５−ラクトンに変換さ
れ、それと同時に過酸化水素が生成される。また、グル
コノ−１，５−ラクトンは、グルコノラクトナーゼによ
りグルコン酸に変換され、グルコノ−１，５−ラクトン
とグルコースの平衡が変化することによって、グルコー
スオキシダーゼによるグルコースの酸化が完全に行われ
るようになる。グルコースオキシダーゼによるグルコー
スの酸化で生成する過酸化水素が、被検物質の測定の障
害となるような場合は、過酸化水素を処理でき、上記反
応を阻害しない酵素や試薬を添加し、過酸化水素を消去
させることができる。例えば、カタラーゼや、ペルオキ
シダーゼとフェノールなどで、過酸化水素を処理するこ
とが公知である。
【００１０】また、グルコースデヒドロゲナーゼを用い
る場合、試料中のβ−グルコースは、グルコースデヒド
ロゲナーゼと、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（リン酸）（β−ＮＡＤ（Ｐ）+）あるいは
電子受容体の存在下、グルコノ−１，５−ラクトンに変
換され、それと同時に還元型β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（リン酸）（β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）あ
るいは電子受容体の還元体が生成する。さらに、グルコ
ノ−１，５−ラクトンは、グルコノラクトナーゼにより
前記と同様にグルコン酸となり、グルコース酸化の平衡
を変化させてグルコースの変換が完全に行われるように
なる。グルコースデヒドロゲナーゼとβ−ＮＡＤ（Ｐ）
+の反応ではβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成し、検出系の発
色反応を妨害する場合があるが、乳酸脱水素酵素、グル
タミン酸脱水素酵素等のβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消去反応系
を併用すれば、β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈがβ−ＮＡＤ（Ｐ）
+に戻り、測定系の効率が高まり、発色反応への影響を
回避できる。
る場合、試料中のβ−グルコースは、グルコースデヒド
ロゲナーゼと、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（リン酸）（β−ＮＡＤ（Ｐ）+）あるいは
電子受容体の存在下、グルコノ−１，５−ラクトンに変
換され、それと同時に還元型β−ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（リン酸）（β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）あ
るいは電子受容体の還元体が生成する。さらに、グルコ
ノ−１，５−ラクトンは、グルコノラクトナーゼにより
前記と同様にグルコン酸となり、グルコース酸化の平衡
を変化させてグルコースの変換が完全に行われるように
なる。グルコースデヒドロゲナーゼとβ−ＮＡＤ（Ｐ）
+の反応ではβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成し、検出系の発
色反応を妨害する場合があるが、乳酸脱水素酵素、グル
タミン酸脱水素酵素等のβ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ消去反応系
を併用すれば、β−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈがβ−ＮＡＤ（Ｐ）
+に戻り、測定系の効率が高まり、発色反応への影響を
回避できる。
【００１１】一般にグルコースからグルコースオキシダ
ーゼあるいはグルコースデヒドロゲナーゼの作用により
生成したグルコノ−１，５−ラクトンはグルコン酸と平
衡にあり、ｐＨが高いほど開環したグルコン酸の方に平
衡がずれると言われている。しかしながら短時間で完全
にグルコン酸にするためには少なくともｐＨ９．５以
上、好ましくはｐＨ１０．５付近が必要であり、酵素活
性の点からｐＨを高くするのは有利ではない。本発明で
はグルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクト
ンの消去は通常、ｐＨ５．５〜９．５、好ましくはｐＨ
７．０〜８．５、１０〜２００ｍＭのバッファー中で、
１０〜５５℃で１〜５０分程度行われる。バッファーと
しては、トリス塩酸バッファー、グッドのバッファー等
が好ましい。バッファー中に加える塩類としては、塩化
カリウム１〜２００ｍＭ、塩化カルシウム０．５〜１ｍ
Ｍ程度が好ましいが、特に限定はされない。
ーゼあるいはグルコースデヒドロゲナーゼの作用により
生成したグルコノ−１，５−ラクトンはグルコン酸と平
衡にあり、ｐＨが高いほど開環したグルコン酸の方に平
衡がずれると言われている。しかしながら短時間で完全
にグルコン酸にするためには少なくともｐＨ９．５以
上、好ましくはｐＨ１０．５付近が必要であり、酵素活
性の点からｐＨを高くするのは有利ではない。本発明で
はグルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクト
ンの消去は通常、ｐＨ５．５〜９．５、好ましくはｐＨ
７．０〜８．５、１０〜２００ｍＭのバッファー中で、
１０〜５５℃で１〜５０分程度行われる。バッファーと
しては、トリス塩酸バッファー、グッドのバッファー等
が好ましい。バッファー中に加える塩類としては、塩化
カリウム１〜２００ｍＭ、塩化カルシウム０．５〜１ｍ
Ｍ程度が好ましいが、特に限定はされない。
【００１２】以上に説明した方法により試料中のグルコ
ースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトンを消去
した後、例えば１，５−ＡＧを測定する場合について以
下に説明する。１，５−ＡＧを測定する方法としては、
（１）ピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオ
キシダーゼを用いる方法（特開昭６３−１８５３９７号
公報）、（２）グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを
用いる方法（特開平８−１０７７９６号公報）、（３）
１，５−ＡＧを酵素的に１，５−ＡＧ６リン酸に変換
し、１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素を用いる方法（特
開平１０−１９１９９８号公報）等に従って行うことが
できる。以下、順次１，５−ＡＧを測定する方法を説明
する。
ースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトンを消去
した後、例えば１，５−ＡＧを測定する場合について以
下に説明する。１，５−ＡＧを測定する方法としては、
（１）ピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオ
キシダーゼを用いる方法（特開昭６３−１８５３９７号
公報）、（２）グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを
用いる方法（特開平８−１０７７９６号公報）、（３）
１，５−ＡＧを酵素的に１，５−ＡＧ６リン酸に変換
し、１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素を用いる方法（特
開平１０−１９１９９８号公報）等に従って行うことが
できる。以下、順次１，５−ＡＧを測定する方法を説明
する。
【００１３】（１）ピラノースオキシダーゼまたはＬ−
ソルボースオキシダーゼを用いて、例えば次のようにし
て１，５−ＡＧを測定することができる。即ち、試料に
予めムタロターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコノ
ラクトナーゼおよびカタラーゼを添加し、試料中のグル
コースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトンを消
去し、同時に生成された過酸化水素も消去した後、これ
にピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを添加し、酸素等の電子受容体の存在下、４〜５
０℃、好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、
好ましくは２分〜１時間インキュベートし、次いで生成
する過酸化水素等の電子受容体の還元体等を測定し、別
に作成した検量線から１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
ソルボースオキシダーゼを用いて、例えば次のようにし
て１，５−ＡＧを測定することができる。即ち、試料に
予めムタロターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコノ
ラクトナーゼおよびカタラーゼを添加し、試料中のグル
コースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトンを消
去し、同時に生成された過酸化水素も消去した後、これ
にピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを添加し、酸素等の電子受容体の存在下、４〜５
０℃、好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、
好ましくは２分〜１時間インキュベートし、次いで生成
する過酸化水素等の電子受容体の還元体等を測定し、別
に作成した検量線から１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
【００１４】ピラノースオキシダーゼおよびＬ−ソルボ
ースオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれ
ぞれＥＣ．１．１．３．１０およびＥＣ１．１．３．１
１に分類し得るものであれば、特に制限はなく、市販の
ものを使用し得る。これらの酵素は、通常０．５〜５０
０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５〜１００Ｕ／ｍＬで使用され
る。
ースオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれ
ぞれＥＣ．１．１．３．１０およびＥＣ１．１．３．１
１に分類し得るものであれば、特に制限はなく、市販の
ものを使用し得る。これらの酵素は、通常０．５〜５０
０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５〜１００Ｕ／ｍＬで使用され
る。
【００１５】電子受容体の還元体を測定する具体例を示
すとつぎのとおりである。例えば、電子受容体が酸素の
場合、その還元体である過酸化水素を検出する方法とし
ては、高感度に検出できる方法であればいずれであって
も良く、数多くの方法が利用できる。これらのうちで最
も一般的に用いられている方法は、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を触媒酵素として、各種の
ＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであり、酸化反
応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発光をそれぞ
れ吸光度測定、ケイ光測定および発光測定すれば良い。
すとつぎのとおりである。例えば、電子受容体が酸素の
場合、その還元体である過酸化水素を検出する方法とし
ては、高感度に検出できる方法であればいずれであって
も良く、数多くの方法が利用できる。これらのうちで最
も一般的に用いられている方法は、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を触媒酵素として、各種の
ＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであり、酸化反
応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発光をそれぞ
れ吸光度測定、ケイ光測定および発光測定すれば良い。
【００１６】色素を生成するＨＲＰの基質としては２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウ
ム塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノ
ール類、ヒドロキシトリヨード安息香酸、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジンあるいはＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組み合わせによるいわゆ
るトリンダー系発色剤などがある。ケイ光物質を生成す
るＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢
酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Ｈ
ＰＰＡ）などがある。また、化学発光するＨＲＰの基質
としては、ルミノール、イソルミノールなどが知られて
いる。
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウ
ム塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノ
ール類、ヒドロキシトリヨード安息香酸、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジンあるいはＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組み合わせによるいわゆ
るトリンダー系発色剤などがある。ケイ光物質を生成す
るＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル酢
酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Ｈ
ＰＰＡ）などがある。また、化学発光するＨＲＰの基質
としては、ルミノール、イソルミノールなどが知られて
いる。
【００１７】ＨＲＰなしに化学発光で検出する方法もい
くつか知られている。例えば、フェリシアンイオン存在
下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属イ
オン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリールシュウ酸エステル類の化合物をケイ
光物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステ
ルの分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる
方法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出
する方法として、過酸化水素電極を用いても良い。
くつか知られている。例えば、フェリシアンイオン存在
下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属イ
オン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリールシュウ酸エステル類の化合物をケイ
光物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステ
ルの分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる
方法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出
する方法として、過酸化水素電極を用いても良い。
【００１８】（２）グルコキナーゼまたはヘキソキナー
ゼを用いて、例えば次のようにして１，５−ＡＧを測定
することができる。即ち、試料に予めムタロターゼ、グ
ルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼを添
加し、試料中のグルコースおよび／またはグルコノ−
１，５−ラクトンを消去後、これにグルコキナーゼまた
はヘキソキナーゼ、およびアデノシン−５’−三リン酸
（ＡＴＰ）等のリン酸基供与体を添加し、４〜５０℃、
好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、好まし
くは２分〜１時間インキュベートし、ＡＴＰ等のリン酸
基供与体の減少量または反応により生成するＡＤＰ等の
リン酸基受容体量を測定し、別に作成した検量線から
１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
ゼを用いて、例えば次のようにして１，５−ＡＧを測定
することができる。即ち、試料に予めムタロターゼ、グ
ルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼを添
加し、試料中のグルコースおよび／またはグルコノ−
１，５−ラクトンを消去後、これにグルコキナーゼまた
はヘキソキナーゼ、およびアデノシン−５’−三リン酸
（ＡＴＰ）等のリン酸基供与体を添加し、４〜５０℃、
好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、好まし
くは２分〜１時間インキュベートし、ＡＴＰ等のリン酸
基供与体の減少量または反応により生成するＡＤＰ等の
リン酸基受容体量を測定し、別に作成した検量線から
１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
【００１９】グルコキナーゼおよびヘキソキナーゼはＩ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれぞれＥＣ．２．７．
１．２およびＥＣ２．７．１．１に分類し得るものであ
れば、特に制限はなく、市販のものを使用し得る。これ
らの酵素は、通常０．５〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは
５〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。
ＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれぞれＥＣ．２．７．
１．２およびＥＣ２．７．１．１に分類し得るものであ
れば、特に制限はなく、市販のものを使用し得る。これ
らの酵素は、通常０．５〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは
５〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。
【００２０】測定の具体例を示すとつぎのとおりであ
る。例えば、リン酸基供与体がＡＴＰで、反応によりア
デノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）を生成する場合で
は、ＡＴＰまたは、ＡＤＰを検出できる方法であればい
ずれであっても良く、数多くの方法が利用できる。例え
ば、ＡＤＰをホスホエノールピルビン酸とマグネシウム
の存在下ピルビン酸キナーゼを用いて反応させ、生じた
ピルビン酸を定量する。
る。例えば、リン酸基供与体がＡＴＰで、反応によりア
デノシン−５’−二リン酸（ＡＤＰ）を生成する場合で
は、ＡＴＰまたは、ＡＤＰを検出できる方法であればい
ずれであっても良く、数多くの方法が利用できる。例え
ば、ＡＤＰをホスホエノールピルビン酸とマグネシウム
の存在下ピルビン酸キナーゼを用いて反応させ、生じた
ピルビン酸を定量する。
【００２１】ピルビン酸を検出する方法としては、数多
くの方法が利用できる。例えば、β−ＮＡＤＨの存在
下、乳酸脱水素酵素を作用させて、乳酸とβ−ＮＡＤ+
を生成し、減少したβ−ＮＡＤＨ量を波長３４０ｎｍの
吸光度変化量で測定することにより、１，５−ＡＧ量を
求めることができる。
くの方法が利用できる。例えば、β−ＮＡＤＨの存在
下、乳酸脱水素酵素を作用させて、乳酸とβ−ＮＡＤ+
を生成し、減少したβ−ＮＡＤＨ量を波長３４０ｎｍの
吸光度変化量で測定することにより、１，５−ＡＧ量を
求めることができる。
【００２２】ピルビン酸を高感度に検出する方法として
は、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸脱水素酵素を
作用させる方法などが知られている。例えば、ピルビン
酸、酸素およびリン酸を基質とするピルビン酸オキシダ
ーゼの作用により過酸化水素を発生させ、生じた過酸化
水素を前述の方法で定量することもできる。
は、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸脱水素酵素を
作用させる方法などが知られている。例えば、ピルビン
酸、酸素およびリン酸を基質とするピルビン酸オキシダ
ーゼの作用により過酸化水素を発生させ、生じた過酸化
水素を前述の方法で定量することもできる。
【００２３】また、ピルビン酸を、ピルビン酸脱水素酵
素およびコエンザイムＡの存在下、β−ＮＡＤ+と反応
させ、β−ＮＡＤＨ、アセチル−コエンザイムＡおよび
ＣＯ2を生成させ、生成したβ−ＮＡＤＨ量を波長３４
０ｎｍの吸光度で測定することにより、１，５−ＡＧの
量を求めることができる。
素およびコエンザイムＡの存在下、β−ＮＡＤ+と反応
させ、β−ＮＡＤＨ、アセチル−コエンザイムＡおよび
ＣＯ2を生成させ、生成したβ−ＮＡＤＨ量を波長３４
０ｎｍの吸光度で測定することにより、１，５−ＡＧの
量を求めることができる。
【００２４】（３）１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素を
用いて、例えば次のように１，５−ＡＧを測定すること
ができる。即ち、試料に予めムタロターゼ、グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼを添加し、試
料中のグルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラ
クトンを消去後、これにグルコキナーゼまたはヘキソキ
ナーゼおよびＡＴＰまたはＡＤＰ等のリン酸基供与体、
１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素および酸化型（チオ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）+）類の酸化型補酵素を添加
し、４〜５０℃、好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒
〜３時間、好ましくは２分〜１時間インキュベートし、
生成した還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（リン酸）（還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）
類の還元型補酵素を測定し、別に作成した検量線から
１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
用いて、例えば次のように１，５−ＡＧを測定すること
ができる。即ち、試料に予めムタロターゼ、グルコース
オキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼを添加し、試
料中のグルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラ
クトンを消去後、これにグルコキナーゼまたはヘキソキ
ナーゼおよびＡＴＰまたはＡＤＰ等のリン酸基供与体、
１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素および酸化型（チオ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）（酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）+）類の酸化型補酵素を添加
し、４〜５０℃、好ましくは、２５〜４０℃で、３０秒
〜３時間、好ましくは２分〜１時間インキュベートし、
生成した還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（リン酸）（還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）
類の還元型補酵素を測定し、別に作成した検量線から
１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
【００２５】グルコキナーゼおよびヘキソキナーゼはＩ
ＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれぞれＥＣ．２．７．
１．２およびＥＣ２．７．１．１に分類し得るもの、ま
たは、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼであってもよく、特
に制限はない。これらの酵素は、通常０．５〜５００Ｕ
／ｍＬ、好ましくは５〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。
１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素は、１，５−ＡＧ６リ
ン酸を基質とし、補酵素として酸化型（チオ）ＮＡＤ
（Ｐ）+類を消費して還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
を生成するものであれば何ら限定されるものでない。本
酵素は、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログ記載のエシェリ
ヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）をグルコー
ス、グリセロール、ソルビトール、ラクトース、酵母エ
キス、肉エキス、トリペプトン、ペプトン、塩化ナトリ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む培地
で通気培養し、酵素が最高力価となる培養時間で酵素を
採取することにより得られる。１，５−ＡＧ６リン酸脱
水素酵素は、通常１〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。Ａ
ＴＰまたはＡＤＰの濃度は、例えば０．１〜１００ｍＭ
程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は、例えば、０．
１〜５０ｍＭ程度である。
ＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれぞれＥＣ．２．７．
１．２およびＥＣ２．７．１．１に分類し得るもの、ま
たは、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼであってもよく、特
に制限はない。これらの酵素は、通常０．５〜５００Ｕ
／ｍＬ、好ましくは５〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。
１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素は、１，５−ＡＧ６リ
ン酸を基質とし、補酵素として酸化型（チオ）ＮＡＤ
（Ｐ）+類を消費して還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類
を生成するものであれば何ら限定されるものでない。本
酵素は、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログ記載のエシェリ
ヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）をグルコー
ス、グリセロール、ソルビトール、ラクトース、酵母エ
キス、肉エキス、トリペプトン、ペプトン、塩化ナトリ
ウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含む培地
で通気培養し、酵素が最高力価となる培養時間で酵素を
採取することにより得られる。１，５−ＡＧ６リン酸脱
水素酵素は、通常１〜１００Ｕ／ｍＬで使用される。Ａ
ＴＰまたはＡＤＰの濃度は、例えば０．１〜１００ｍＭ
程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸
化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）+類の濃度は、例えば、０．
１〜５０ｍＭ程度である。
【００２６】測定の具体例を示すと次の通りである。例
えば、酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ） +類から形成された
還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定は、公
知の数多くの方法が利用できる。これらのうちで、最も
一般的には、吸光度測定法が用いられる。測定波長は、
還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、還元型３−アセチルＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ、還元型デアミノＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの場合に
は３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合
は、４０５ｎｍ付近の波長が選択される。また、還元型
（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定法として、イ
ンドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテ
トラゾリウム（ＮＴＢ）等のテトラゾリウム塩を用い
て、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）またはジアホラーゼ（ＥＣ１．６．４．３）の作
用により、ホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザ
ン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還
元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の蛍光を測定してもよ
い。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、例えば０．０１〜
０．１ｍＭ、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）+、例えば０．５
〜５ｍＭを共に添加し、１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵
素の可逆性を利用した、酵素サイクリング法を用いて還
元型チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成を増幅して３４０ｎｍ付
近で検出することもできる。又、試料中のグルコースを
消去した後、マルトースやアミラーゼを測定する場合に
ついて以下に説明する。マルトースは麦芽モルトや植物
の葉や花、種子に含まれアミラーゼ分解で澱粉より生成
される。また、通常ヒト血清中には、ほとんどないが、
マルトース輸液により血中の濃度が上昇する。マルトー
スを測定する方法としては、例えば、マルトースをα−
グルコシダーゼで加水分解し、精製するグルコースを公
知の方法等で定量してマルトース濃度を求める。公知の
グルコース測定法としては、例えば、グルコースオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する前述
の方法等が利用できる。この時内因性のグルコースをあ
らかじめ完全に消去する必要があるが、本発明で示した
方法では、グルコースを短時間で、容易に完全消去する
ことができる。さらには、同様の原理で、本消去法はα
−グルコシダーゼ活性の測定の際にも有用な方法であ
る。血中、尿中、体液中のアミラーゼ活性の測定は、
膵、唾液腺疾患のみならず各種疾患におけるアミラーゼ
異常の解析に臨床的に利用される。アミラーゼ活性の測
定には、澱粉にアミラーゼを作用させて残存する澱粉量
をヨードデンプン反応で測定する方法や、色素を澱粉に
結合させたものを基質としてアミラーゼ作用によって遊
離した色素を定量する方法などがある。また、マルトペ
ンタオース等のオリゴサッカライド、澱粉などを基質と
し、検体中のアミラーゼと添加酵素の作用により生成す
るグルコースを公知の方法等で定量し、アミラーゼ活性
を求める方法がある。本方法では、検体中の内因性のグ
ルコースをあらかじめ消去する必要があるが、本発明で
示した方法により、グルコースを短時間で容易に消去す
ることができる。
えば、酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ） +類から形成された
還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定は、公
知の数多くの方法が利用できる。これらのうちで、最も
一般的には、吸光度測定法が用いられる。測定波長は、
還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、還元型３−アセチルＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ、還元型デアミノＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの場合に
は３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合
は、４０５ｎｍ付近の波長が選択される。また、還元型
（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定法として、イ
ンドニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテ
トラゾリウム（ＮＴＢ）等のテトラゾリウム塩を用い
て、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）またはジアホラーゼ（ＥＣ１．６．４．３）の作
用により、ホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザ
ン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還
元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の蛍光を測定してもよ
い。また、還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、例えば０．０１〜
０．１ｍＭ、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）+、例えば０．５
〜５ｍＭを共に添加し、１，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵
素の可逆性を利用した、酵素サイクリング法を用いて還
元型チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成を増幅して３４０ｎｍ付
近で検出することもできる。又、試料中のグルコースを
消去した後、マルトースやアミラーゼを測定する場合に
ついて以下に説明する。マルトースは麦芽モルトや植物
の葉や花、種子に含まれアミラーゼ分解で澱粉より生成
される。また、通常ヒト血清中には、ほとんどないが、
マルトース輸液により血中の濃度が上昇する。マルトー
スを測定する方法としては、例えば、マルトースをα−
グルコシダーゼで加水分解し、精製するグルコースを公
知の方法等で定量してマルトース濃度を求める。公知の
グルコース測定法としては、例えば、グルコースオキシ
ダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する前述
の方法等が利用できる。この時内因性のグルコースをあ
らかじめ完全に消去する必要があるが、本発明で示した
方法では、グルコースを短時間で、容易に完全消去する
ことができる。さらには、同様の原理で、本消去法はα
−グルコシダーゼ活性の測定の際にも有用な方法であ
る。血中、尿中、体液中のアミラーゼ活性の測定は、
膵、唾液腺疾患のみならず各種疾患におけるアミラーゼ
異常の解析に臨床的に利用される。アミラーゼ活性の測
定には、澱粉にアミラーゼを作用させて残存する澱粉量
をヨードデンプン反応で測定する方法や、色素を澱粉に
結合させたものを基質としてアミラーゼ作用によって遊
離した色素を定量する方法などがある。また、マルトペ
ンタオース等のオリゴサッカライド、澱粉などを基質と
し、検体中のアミラーゼと添加酵素の作用により生成す
るグルコースを公知の方法等で定量し、アミラーゼ活性
を求める方法がある。本方法では、検体中の内因性のグ
ルコースをあらかじめ消去する必要があるが、本発明で
示した方法により、グルコースを短時間で容易に消去す
ることができる。
【００２７】
【実施例】以下、比較例および実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【００２８】比較例１グルコースオキシダーゼ単独によるグルコースの消去方
法 下記組成からなるグルコースオキシダーゼを含むがグル
コノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消去試
薬として調製し、０、５０、１００および２００ｍｇ／
ｄＬのグルコース溶液を試料として用いて、グルコース
の消去を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５０Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＮ3 ０．０４％ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ ＰＲＯＤ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
法 下記組成からなるグルコースオキシダーゼを含むがグル
コノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消去試
薬として調製し、０、５０、１００および２００ｍｇ／
ｄＬのグルコース溶液を試料として用いて、グルコース
の消去を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５０Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＮ3 ０．０４％ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ ＰＲＯＤ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００２９】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ
【００３０】グルコースの消去割合を測定した結果を、
以後に示す実施例１の結果と共に表１に示す。
以後に示す実施例１の結果と共に表１に示す。
【００３１】実施例１グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼとを用
いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースオキシダーゼとグルコノラ
クトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬として
調製し、比較例１と同様の方法で、０、５０、１００お
よび２００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用
いてグルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５０Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ １１０Ｕ／ｍＬ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＮ3 ０．０４％ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ ＰＲＯＤ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースオキシダーゼとグルコノラ
クトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬として
調製し、比較例１と同様の方法で、０、５０、１００お
よび２００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用
いてグルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５０Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ １１０Ｕ／ｍＬ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＮａＮ3 ０．０４％ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ ＰＲＯＤ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００３２】測定した結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】 グルコースの吸光度変化量（Ｘ１０００） グルコース濃度 比較例１ 実施例１ ０（ｍｇ／ｄＬ） ９．５ ９．９ ５０ ２８．６ １０．０ １００ ５５．９ １０．２ ２００ １０９．３ １０．３ 表１の結果から明らかなように、本発明の消去試薬を用
いることによって、グルコースを効果的に消去できる。
いることによって、グルコースを効果的に消去できる。
【００３４】比較例２グルコースデヒドロゲナーゼ単独によるグルコースの消
去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼを含むが
グルコノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消
去試薬として調製し、０、１２５、２５０、５００およ
び１０００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用
いて、グルコースの消去を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １．０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ２−オキソグルタール酸 ８ｍＭ 塩化アンモニウム ２０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼを含むが
グルコノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消
去試薬として調製し、０、１２５、２５０、５００およ
び１０００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用
いて、グルコースの消去を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １．０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ２−オキソグルタール酸 ８ｍＭ 塩化アンモニウム ２０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００３５】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。
なお、残存グルコースの定量は、グルコースデヒドロゲ
ナーゼを除いた第一試薬を用い同様に測定して作成した
検量線から行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２４−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。
なお、残存グルコースの定量は、グルコースデヒドロゲ
ナーゼを除いた第一試薬を用い同様に測定して作成した
検量線から行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２４−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ
【００３６】グルコースの消去割合を測定した結果を、
以後に示す実施例２の結果と共に表２に示す。
以後に示す実施例２の結果と共に表２に示す。
【００３７】実施例２グルコースデヒドロゲナーゼとグルコノラクトナーゼと
を用いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼとグルコ
ノラクトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬と
して調製し、比較例２と同様の方法で、０、１２５、２
５０、５００、および１０００ｍｇ／ｄＬのグルコース
溶液を試料として用いてグルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ３４０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １．０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ２−オキソグルタール酸 ８ｍＭ 塩化アンモニウム ２０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
を用いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼとグルコ
ノラクトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬と
して調製し、比較例２と同様の方法で、０、１２５、２
５０、５００、および１０００ｍｇ／ｄＬのグルコース
溶液を試料として用いてグルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ３４０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １．０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ２−オキソグルタール酸 ８ｍＭ 塩化アンモニウム ２０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ ４０Ｕ／ｍｌ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００３８】測定した結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】 グルコースの残存量（ｍｇ／ｄＬ） グルコース濃度 比較例２ 実施例２ ０（ｍｇ／ｄＬ） ０．０ ０．０ １２５ １９．５ ０．２ ２５０ ３８．１ −０．１ ５００ ７１．７ −０．２ １０００ １４４．７ −０．２ 表２の結果から明らかなように、本発明の消去試薬を用
いることにより、グルコースをほぼ完全に消去できる。
いることにより、グルコースをほぼ完全に消去できる。
【００４０】比較例３グルコースデヒドロゲナーゼ単独によるグルコースの消
去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼを含むが
グルコノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消
去試薬として調製し、０、１００、２００ｍｇ／ｄＬの
グルコース溶液を試料として用いて、グルコースの消去
を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ ０．６ｍＭ
去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼを含むが
グルコノラクトナーゼは含まない試薬を、グルコース消
去試薬として調製し、０、１００、２００ｍｇ／ｄＬの
グルコース溶液を試料として用いて、グルコースの消去
を試みた。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ ０．６ｍＭ
【００４１】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２４−５０ 検体量 １０μＬ 第１試薬 ３００μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（一波長） ３４０ｎｍ
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２４−５０ 検体量 １０μＬ 第１試薬 ３００μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（一波長） ３４０ｎｍ
【００４２】グルコースの消去割合を測定した結果を図
１に示す。図１の反応曲線の結果から明らかなように、
グルコースデヒドロゲナーゼ単独の場合には、グルコー
スを有効に消去することが出来ない。
１に示す。図１の反応曲線の結果から明らかなように、
グルコースデヒドロゲナーゼ単独の場合には、グルコー
スを有効に消去することが出来ない。
【００４３】実施例３グルコースデヒドロゲナーゼとグルコノラクトナーゼと
を用いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼとグルコ
ノラクトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬と
して調製し、比較例３と同様の方法で、０、１００、２
００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用いてグ
ルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ ０．６ｍＭ グルコノラクトナーゼ ３００Ｕ／ｍＬ
を用いた本発明によるグルコース消去方法 下記組成からなるグルコースデヒドロゲナーゼとグルコ
ノラクトナーゼとを含む試薬を、グルコース消去試薬と
して調製し、比較例３と同様の方法で、０、１００、２
００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液を試料として用いてグ
ルコースの消去を行った。試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ ５Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ ０．６ｍＭ グルコノラクトナーゼ ３００Ｕ／ｍＬ
【００４４】測定した結果を図２に示す。図２の反応曲
線から明らかなように、本発明の消去試薬により、５分
以内でグルコースを完全に消去できる。
線から明らかなように、本発明の消去試薬により、５分
以内でグルコースを完全に消去できる。
【００４５】実施例４グルコースデヒドロゲナーゼとグルコノラクトナーゼか
らなる消去試薬を用い、ピラノースオキシダーゼによる
血清中の１，５−ＡＧ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用
いて、ヒト血清サンプル中のグルコースおよびグルコノ
−１，５−ラクトンを消去し、次いで、ピラノースオキ
シダーゼ（PORD）を用いてヒト血清サンプル中の１，５
−ＡＧ濃度を測定した。
らなる消去試薬を用い、ピラノースオキシダーゼによる
血清中の１，５−ＡＧ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用
いて、ヒト血清サンプル中のグルコースおよびグルコノ
−１，５−ラクトンを消去し、次いで、ピラノースオキ
シダーゼ（PORD）を用いてヒト血清サンプル中の１，５
−ＡＧ濃度を測定した。
【００４６】試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ ２５Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ３４０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １．０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ２．５Ｕ／ｍＬ ２−オキソグルタール酸 ８ｍＭ 塩化アンモニウム ２０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍＬ ＰＲＯＤ ４０Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００４７】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：１，５−ＡＧ標準液（５０μｇ／ｍＬ）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／正） ７００／５４６ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：１，５−ＡＧ標準液（５０μｇ／ｍＬ）
【００４８】測定した結果を、実施例５の結果と共に表
３に示す。なお、表３には、ガスクロマトグラフ法（Ｇ
Ｃ法）により測定した１，５−ＡＧ濃度を参考のため示
した。
３に示す。なお、表３には、ガスクロマトグラフ法（Ｇ
Ｃ法）により測定した１，５−ＡＧ濃度を参考のため示
した。
【００４９】実施例５グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼからな
る消去試薬を用い、ヘキソキナーゼによる血清中の１，
５−ＡＧ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースオキシダーゼ
とグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用い
て、実施例４と同様の方法、ただし、測定波長（副／
主）を４５０／３４０ｎｍに変えヘキソキナーゼを含む
下記組成の第２試薬を用いてヒト血清サンプル中の１，
５−ＡＧ濃度を測定した。
る消去試薬を用い、ヘキソキナーゼによる血清中の１，
５−ＡＧ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースオキシダーゼ
とグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用い
て、実施例４と同様の方法、ただし、測定波長（副／
主）を４５０／３４０ｎｍに変えヘキソキナーゼを含む
下記組成の第２試薬を用いてヒト血清サンプル中の１，
５−ＡＧ濃度を測定した。
【００５０】試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ３４０Ｕ／ｍＬ β−ＮＡＤＰ+ １０．０ｍＭ第２試薬 ：ＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ９．８） ２００ｍＭ ＮａＮ3 ０．０２％ 塩化マグネシウム ０．５ｍＭ ヘキソキナーゼ ５０Ｕ／ｍＬ ＡＴＰ １０ｍＭ １，５−ＡＧ６リン酸脱水素酵素 ４０Ｕ／ｍＬ
【００５１】測定した結果を表３に示した。
【００５２】
【表３】 血清中の１，５−ＡＧの濃度（μｇ／ｍＬ） 実施例４ 実施例５ ＧＣ法 サンプル１ １５．０ １６．９ １５．７ サンプル２ ２５．９ ２６．５ ２５．９ サンプル３ ３０．９ ３３．２ ３１．１ 表３に示した結果から明らかなように、本発明の消去試
薬を用いることによって、グルコースを有効に消去する
ことができ、その結果、１，５−ＡＧを従来法のＧＣ法
と同様の精度で正確に測定することができる。
薬を用いることによって、グルコースを有効に消去する
ことができ、その結果、１，５−ＡＧを従来法のＧＣ法
と同様の精度で正確に測定することができる。
【００５３】実施例６グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼからな
る消去試薬を用いた血清中のマルトース測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースオキシダーゼ
とグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用いて
マルトース測定を行った。即ち、マルトースを１０％含
む輸液２５０ｍＬ投与治療中の糖尿病患者のマルトース
輸液投与後、経時的に採取した血清サンプルを上記消去
試薬で処理後、α−グルコシダーゼを含む下記組成から
なる第２試薬を用いてマルトースを測定した。
る消去試薬を用いた血清中のマルトース測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースオキシダーゼ
とグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用いて
マルトース測定を行った。即ち、マルトースを１０％含
む輸液２５０ｍＬ投与治療中の糖尿病患者のマルトース
輸液投与後、経時的に採取した血清サンプルを上記消去
試薬で処理後、α−グルコシダーゼを含む下記組成から
なる第２試薬を用いてマルトースを測定した。
【００５４】試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースオキシダーゼ ４００Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ３４０Ｕ／ｍＬ カタラーゼ １０００Ｕ／ｍＬ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ酸緩衝液（ｐＨ７．５） １００ｍＭ α−グルコシダーゼ ２００Ｕ／ｍＬ ＮａＮ3 ０．０２％ ＨＲＰ ５Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．２ｍｇ／ｍＬ ＴＯＯＳ ２．０ｍｇ／ｍＬ
【００５５】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ５μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／主） ７００／５４６ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：マルトース標準液（５００μｇ／ｍＬ）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ２７−５０ 検体量 ５μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（副／主） ７００／５４６ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：マルトース標準液（５００μｇ／ｍＬ）
【００５６】得られた結果を表４に示す。なお、表４に
は、ＧＣ法により測定したマルトース濃度を参考のため
示した。
は、ＧＣ法により測定したマルトース濃度を参考のため
示した。
【００５７】
【表４】 マルトース輸液患者血清中のマルトースの濃度（μｇ／ｍＬ） 本発明法 ＧＣ法 投与後 １時間 ９９５．９ ９９８．０ 投与後 ４時間 ６２５．２ ６２３．５ 投与後 ７時間 １４４．４ １４３．１ 投与後１０時間 １００．０ １０１．２ 投与後２４時間 ０．２ ０．８ 表４に示す結果から明らかなように、本発明の消去試薬
を用いることにより、マルトースをGC法と同様の精度で
正確に測定することができる。
を用いることにより、マルトースをGC法と同様の精度で
正確に測定することができる。
【００５８】実施例７グルコースデヒドロゲナーゼとグルコノラクトナーゼか
らなる消去試薬を用いた血清中のアミラーゼ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用
いて血清サンプル中のグルコースおよびグルコノ-1,5-
ラクトンを消去し、次いで、マルトペンタオースを含む
下記組成の第２試薬を用いて血清サンプル中のアミラー
ゼを測定した。
らなる消去試薬を用いた血清中のアミラーゼ測定 下記組成からなる第１試薬を、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコノラクトナーゼとを含む消去試薬として用
いて血清サンプル中のグルコースおよびグルコノ-1,5-
ラクトンを消去し、次いで、マルトペンタオースを含む
下記組成の第２試薬を用いて血清サンプル中のアミラー
ゼを測定した。
【００５９】試薬組成 第１試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５） １００ｍＭ 塩化カルシウム ０．５ｍＭ グルコースデヒドロゲナーゼ １０Ｕ／ｍＬ ムタロターゼ １０Ｕ／ｍＬ グルコノラクトナーゼ ２００Ｕ／ｍＬ α−グルコシダーゼ ２０Ｕ／ｍＬ ＮＡＤＰ １０ｍＭ第２試薬 ：ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ２００ｍＭ マルトペンタオース ２０ｍＭ
【００６０】測定は、自動分析装置７１５０型（（株）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ３５−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（一波長） ３４０ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：アミラーゼ標準液（２００ＩＵ／Ｌ）
日立製作所製）を用い、以下のパラメーターで行った。 分析法 ２ポイントエンド 測定ポイント ３５−５０ 検体量 ６μＬ 第１試薬 １８０μＬ 第２試薬 ９０μＬ 温度 ３７℃ 測定波長（一波長） ３４０ｎｍ キャリブレーション法 直線法 ＳＴＤ（１）：生理食塩液 ＳＴＤ（２）：アミラーゼ標準液（２００ＩＵ／Ｌ）
【００６１】得られた結果は表５に示す。なお、表５に
は、市販のアミラーゼ測定キット（イヤトロファイン
ＡＭＹレート（Ａ））により測定したアミラーゼ濃度を
参考のため示した。
は、市販のアミラーゼ測定キット（イヤトロファイン
ＡＭＹレート（Ａ））により測定したアミラーゼ濃度を
参考のため示した。
【００６２】
【表５】 血清中のα−アミラーゼの濃度（ＩＵ／Ｌ） 本発明法 アミラーゼ測定キット サンプルＤ １１６ １２０ サンプルＥ ８５ ８１ サンプルＦ ６３ ６５ 表５に示した結果から明らかなように、本発明の消去試
薬を用いることによって、市販のアミラーゼ測定キット
と同様の精度でα-アミラーゼを測定をできる。
薬を用いることによって、市販のアミラーゼ測定キット
と同様の精度でα-アミラーゼを測定をできる。
【００６３】
【発明の効果】本発明による、グルコースに作用してグ
ルコノ-1,5-ラクトンを生成する酵素とグルコノラクト
ナーゼとを含む消去試薬を用いることにより、試料中に
大量・高濃度に含まれる内因性のグルコースおよび/ま
たはグルコノ−１，５−ラクトンを完全に消去すること
が可能となり、試料中の１，５−ＡＧ、マルトース等の
糖や、アミラーゼ等の酵素活性の測定が、グルコースの
干渉を受けることなく正確に行えるようになった。
ルコノ-1,5-ラクトンを生成する酵素とグルコノラクト
ナーゼとを含む消去試薬を用いることにより、試料中に
大量・高濃度に含まれる内因性のグルコースおよび/ま
たはグルコノ−１，５−ラクトンを完全に消去すること
が可能となり、試料中の１，５−ＡＧ、マルトース等の
糖や、アミラーゼ等の酵素活性の測定が、グルコースの
干渉を受けることなく正確に行えるようになった。
【図１】図１は、比較例３に示した消去試薬とグルコー
スを反応させた場合の反応曲線を示す。
スを反応させた場合の反応曲線を示す。
【図２】図２は、実施例３に示したグルコースデヒドロ
ゲナーゼとグルコノラクトナーゼとを含む本発明の消去
試薬とグルコースを、反応させた場合の反応曲線を示し
た。図２のグラフから、５分以内にグルコースがすべて
変換され、グルコース当量のＮＡＤＰＨの生成が終了し
たことがわかる。
ゲナーゼとグルコノラクトナーゼとを含む本発明の消去
試薬とグルコースを、反応させた場合の反応曲線を示し
た。図２のグラフから、５分以内にグルコースがすべて
変換され、グルコース当量のＮＡＤＰＨの生成が終了し
たことがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片岡 道彦 京都府京都市左京区一乗寺西水干町32−１ コスモ227 (72)発明者 町田 礼子 埼玉県本庄市小島６−６−15 (72)発明者 藪内 正彦 東京都練馬区小竹町１−40−５ (72)発明者 池本 昌弘 広島県福山市川口町３−23−19 ジュネス モリタ101 (72)発明者 小村 啓悟 広島県福山市南松永町２−15−12−４ Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA16 BA01 CA25 CA26 CB03 CB21 DA30 FB01 4B063 QA01 QQ03 QQ16 QQ68 QR03 QR04 QR07 QR15 QR19 QS20 QS28
Claims (9)
- 【請求項１】 グルコースに作用してグルコノ−１，５
−ラクトンを生成する酵素およびグルコノラクトナーゼ
を含むことを特徴とするグルコースおよび／またはグル
コノ−１，５−ラクトン消去試薬。 - 【請求項２】 グルコースに作用してグルコノ−１，５
−ラクトンを生成する酵素がグルコースオキシダーゼあ
るいはグルコースデヒドロゲナーゼである請求項１記載
の消去試薬。 - 【請求項３】 グルコノラクトナーゼが、フザリウム
属、ザイモモナス属、シュードモナス属、エシェリヒア
属、サッカロミセス属、シリンドロカルボン属、ジベレ
ラ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス
属、ボルテラ属、グリオクラデイウム属、ユーロテイウ
ム属、ネクトリア属、シゾフイラム属、ミロセシウム
属、ノイロスポラ属、アクリモニウム属、ツベルクリナ
属、アブシジア属、スポロスリクス属、バーティシリウ
ム属、あるいはアルスロダーマ属に属する微生物より得
られた酵素である請求項１または２に記載の消去試薬。 - 【請求項４】 グルコノラクトナーゼが、フザリウム
オキシスポルム由来である請求項１または２に記載の消
去試薬。 - 【請求項５】 更にムタロターゼを含む請求項１乃至４
のいづれかに記載の消去試薬。 - 【請求項６】 １，５−アンヒドログルシトールの測定
用である請求項１乃至５のいづれかに記載の消去試薬。 - 【請求項７】 請求項１乃至５のいづれかに記載の消去
試薬を含むことを特徴とする１，５−アンヒドログルシ
トールの測定用試薬。 - 【請求項８】 請求項１乃至５のいづれかに記載の消去
試薬を用いることを特徴とする試料中のグルコースおよ
び／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去方法。 - 【請求項９】 請求項８に記載の消去方法で試料を処理
し、次いで１，５−アンヒドログルシトールを定量する
ことを特徴とする１，５−アンヒドログルシトールの測
定方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP25511099A JP2001078797A (ja) | 1999-09-09 | 1999-09-09 | グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 |
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|---|---|---|---|
| JP25511099A JP2001078797A (ja) | 1999-09-09 | 1999-09-09 | グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 |
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|---|---|
| JP2001078797A true JP2001078797A (ja) | 2001-03-27 |
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ID=17274251
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP25511099A Pending JP2001078797A (ja) | 1999-09-09 | 1999-09-09 | グルコースおよび／またはグルコノ−１，５−ラクトン消去試薬 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2001078797A (ja) |
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| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| WO2010010881A1 (ja) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | 日本化薬株式会社 | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット |
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-
1999
- 1999-09-09 JP JP25511099A patent/JP2001078797A/ja active Pending
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