JPH06253894A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの定量法Info
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- JPH06253894A JPH06253894A JP6597993A JP6597993A JPH06253894A JP H06253894 A JPH06253894 A JP H06253894A JP 6597993 A JP6597993 A JP 6597993A JP 6597993 A JP6597993 A JP 6597993A JP H06253894 A JPH06253894 A JP H06253894A
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- phosphate
- nad
- atp
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Abstract
(57)【要約】
【目的】血清等の試料中の１，５−アンヒドログルシト
ールを迅速に精度よく定量する方法を提供すること。 【構成】試料中の１，５−アンヒドログルシトールをピ
ラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダー
ゼを用いて測定する際に、試料に対して予め、グルコキ
ナーゼ及び／またはヘキソキナーゼによる酵素反応と、
ＡＴＰリサイクル供給反応と、グルコースのリン酸化に
よって生じたグルコース−６−リン酸をさらに別物質に
変換する酵素反応の処理を同時に行うことを特徴とする
１，５−アンヒドログルシトールの定量法。
ールを迅速に精度よく定量する方法を提供すること。 【構成】試料中の１，５−アンヒドログルシトールをピ
ラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダー
ゼを用いて測定する際に、試料に対して予め、グルコキ
ナーゼ及び／またはヘキソキナーゼによる酵素反応と、
ＡＴＰリサイクル供給反応と、グルコースのリン酸化に
よって生じたグルコース−６−リン酸をさらに別物質に
変換する酵素反応の処理を同時に行うことを特徴とする
１，５−アンヒドログルシトールの定量法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は糖尿病の診断マーカーと
して用いられている１，５−アンヒドログルシトール
（以下１，５−ＡＧと略す）の正確、迅速でかつ自動分
析装置にも適用可能な測定方法に関するものである。
して用いられている１，５−アンヒドログルシトール
（以下１，５−ＡＧと略す）の正確、迅速でかつ自動分
析装置にも適用可能な測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧは、グルコースと類似構造
を持つ環状ポリオールである。この１，５−ＡＧは、健
常人の血液中に、グルコースに次ぎ高濃度（個人毎に一
定値を持つ）で存在するが、糖尿病患者では、１，５−
ＡＧの濃度は特異的に低下し、かつその低下率が顕著で
あることから、糖尿病の診断に用いられる様になった。
を持つ環状ポリオールである。この１，５−ＡＧは、健
常人の血液中に、グルコースに次ぎ高濃度（個人毎に一
定値を持つ）で存在するが、糖尿病患者では、１，５−
ＡＧの濃度は特異的に低下し、かつその低下率が顕著で
あることから、糖尿病の診断に用いられる様になった。
【０００３】従来、１，５−ＡＧを測定するには、ガス
クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの分
離分析法が用いられていたが、煩雑なため、実用化され
なかった。一方、最近になって、１，５−ＡＧを酸化す
る酵素（以下１，５−ＡＧ酸化酵素という）が見いださ
れ、これを応用した測定法（特公平３−２４２００号公
報）が開発された。また、１，５−ＡＧ酸化酵素ではあ
るが、基質特異性が厳密でないピラノースオキシダーゼ
叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、これら酵素と
反応性を有する１，５−ＡＧ以外の糖類（以下、夾雑糖
類という）を選択的に除去するいくつかの方法のうちの
１つと組み合わせた測定法（特開昭６３−１８５３９７
号公報）が開発された。
クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの分
離分析法が用いられていたが、煩雑なため、実用化され
なかった。一方、最近になって、１，５−ＡＧを酸化す
る酵素（以下１，５−ＡＧ酸化酵素という）が見いださ
れ、これを応用した測定法（特公平３−２４２００号公
報）が開発された。また、１，５−ＡＧ酸化酵素ではあ
るが、基質特異性が厳密でないピラノースオキシダーゼ
叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、これら酵素と
反応性を有する１，５−ＡＧ以外の糖類（以下、夾雑糖
類という）を選択的に除去するいくつかの方法のうちの
１つと組み合わせた測定法（特開昭６３−１８５３９７
号公報）が開発された。
【０００４】この特開昭６３−１８５３９７号公報に
は、夾雑糖類（ヒト血中では主としてグルコース）の除
去法として、（１）イオン交換樹脂（ミニカラム）で吸
着する方法、（２）塩酸で分解する方法、（３）水素化
ホウ素ナトリウムで還元する方法、（４）グルコースオ
キシダーゼで酸化する方法、（５）ヘキソキナーゼでリ
ン酸化する方法が開示されている。これらの方法のう
ち、（１）の方法が最も厳密かつ簡便であり、現在、こ
の方法を用いた用手法の１，５−ＡＧ測定キットが診断
薬として開発され、上市されている。しかしながら、多
忙な臨床現場を考えると、カラム操作を必要とする用手
法のキットでは、必ずしも簡便とは言えず、自動化法の
開発に強い期待がかけられている。
は、夾雑糖類（ヒト血中では主としてグルコース）の除
去法として、（１）イオン交換樹脂（ミニカラム）で吸
着する方法、（２）塩酸で分解する方法、（３）水素化
ホウ素ナトリウムで還元する方法、（４）グルコースオ
キシダーゼで酸化する方法、（５）ヘキソキナーゼでリ
ン酸化する方法が開示されている。これらの方法のう
ち、（１）の方法が最も厳密かつ簡便であり、現在、こ
の方法を用いた用手法の１，５−ＡＧ測定キットが診断
薬として開発され、上市されている。しかしながら、多
忙な臨床現場を考えると、カラム操作を必要とする用手
法のキットでは、必ずしも簡便とは言えず、自動化法の
開発に強い期待がかけられている。
【０００５】そこで、カラム操作が不要であり、生化学
検査用に市販されている汎用の自動分析装置へも応用可
能な（５）の夾雑糖類（主としてグルコース）の酵素に
よるリン酸化法が注目され、特開平１−３２０９９８号
公報、特開平２−１０４２９８号公報、特開平３−２７
２９９号公報にその改良法が提案されている。
検査用に市販されている汎用の自動分析装置へも応用可
能な（５）の夾雑糖類（主としてグルコース）の酵素に
よるリン酸化法が注目され、特開平１−３２０９９８号
公報、特開平２−１０４２９８号公報、特開平３−２７
２９９号公報にその改良法が提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、血液中では
グルコースは空腹時で８００〜１，２００mg/L、食後で
も１，４００mg/L程度の量にコントロールされている。
ところが糖尿病になるとこれ以上に上昇し、３，０００
から４，０００mg/Lに上がることもまれではなく、１
０，０００mg/Lに上昇することも有り得る。一方、１，
５−ＡＧの量は０〜５０mg/Lの範囲に分布しており、健
常者で平均２３〜２５mg/L（グルコースのおよそ１／４
０）、糖尿病患者ではずっと少なくなって平均４〜７mg
/Lであり、１mg/L以下（グルコースの数千分の１）とな
ることも有る。従って、１０，０００mg/Lのグルコース
を完全に除去できる方法でないと、１，５−ＡＧを充分
精度良く測定できる方法とは言えない。すなわち、グル
コース濃度が１０，０００mg/Lの糖尿病患者の血液で
は、グルコースの９９．９９％が除去できても１mg/Lの
グルコースが残存し、１，５−ＡＧの測定値は上昇し、
正確に測定できない。
グルコースは空腹時で８００〜１，２００mg/L、食後で
も１，４００mg/L程度の量にコントロールされている。
ところが糖尿病になるとこれ以上に上昇し、３，０００
から４，０００mg/Lに上がることもまれではなく、１
０，０００mg/Lに上昇することも有り得る。一方、１，
５−ＡＧの量は０〜５０mg/Lの範囲に分布しており、健
常者で平均２３〜２５mg/L（グルコースのおよそ１／４
０）、糖尿病患者ではずっと少なくなって平均４〜７mg
/Lであり、１mg/L以下（グルコースの数千分の１）とな
ることも有る。従って、１０，０００mg/Lのグルコース
を完全に除去できる方法でないと、１，５−ＡＧを充分
精度良く測定できる方法とは言えない。すなわち、グル
コース濃度が１０，０００mg/Lの糖尿病患者の血液で
は、グルコースの９９．９９％が除去できても１mg/Lの
グルコースが残存し、１，５−ＡＧの測定値は上昇し、
正確に測定できない。
【０００７】従って、１，５−ＡＧに対する特異性が悪
く、むしろグルコースと強く反応する様なピラノースオ
キシダーゼ叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、汎
用の生化学分析装置で測定可能な１，５−ＡＧ自動測定
法を開発するためには、カラム処理を用いることなくグ
ルコースを主とする夾雑糖類を完全に除去する方法が必
要となる。
く、むしろグルコースと強く反応する様なピラノースオ
キシダーゼ叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、汎
用の生化学分析装置で測定可能な１，５−ＡＧ自動測定
法を開発するためには、カラム処理を用いることなくグ
ルコースを主とする夾雑糖類を完全に除去する方法が必
要となる。
【０００８】しかし、特開昭６３−１８５３９７号公報
の前記（５）の方法、即ち、グルコースの除去の為にヘ
キソキナーゼを用い、残存する１，５−ＡＧをピラノー
スオキシダーゼで測定する方法では、ヘキソキナーゼで
完全にグルコースを除去できなかったり、ピラノースオ
キシダーゼの反応時間が長く、正確な定量を迅速に行う
ことが出来ないなどの問題点がある。
の前記（５）の方法、即ち、グルコースの除去の為にヘ
キソキナーゼを用い、残存する１，５−ＡＧをピラノー
スオキシダーゼで測定する方法では、ヘキソキナーゼで
完全にグルコースを除去できなかったり、ピラノースオ
キシダーゼの反応時間が長く、正確な定量を迅速に行う
ことが出来ないなどの問題点がある。
【０００９】また、特開平１−３２０９９８号公報及び
特開平３−２７２９９号公報では、グルコースの処理
に、グルコース６位リン酸化酵素（グルコキナーゼ叉は
ヘキソキナーゼ）を用い、さらにこの反応を完結させる
ため、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を組み合わ
せ、グルコースのリン酸化反応の平衡を完全にグルコー
ス−６−リン酸に向かわせる工夫がなされている。しか
しながら、これらの方法でヒト血清叉は血漿中の１，５
−ＡＧの測定を行なった場合、共存する血清タンパク質
によって干渉が起こるため、あらかじめ煩雑な除タンパ
ク操作が必要となり、自動化法に向かないなどの問題点
がある。
特開平３−２７２９９号公報では、グルコースの処理
に、グルコース６位リン酸化酵素（グルコキナーゼ叉は
ヘキソキナーゼ）を用い、さらにこの反応を完結させる
ため、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を組み合わ
せ、グルコースのリン酸化反応の平衡を完全にグルコー
ス−６−リン酸に向かわせる工夫がなされている。しか
しながら、これらの方法でヒト血清叉は血漿中の１，５
−ＡＧの測定を行なった場合、共存する血清タンパク質
によって干渉が起こるため、あらかじめ煩雑な除タンパ
ク操作が必要となり、自動化法に向かないなどの問題点
がある。
【００１０】また、特開平２−１０４２９８号公報にお
いては、グルコースを主とする夾雑糖類の処理にグルコ
キナーゼ叉はヘキソキナーゼを用い、さらにＡＴＰ供給
系としてピルビン酸キナーゼとその基質であるホスフォ
エノールピルビン酸を作用させる方法が提案されてお
り、これにより、グルコースの６位リン酸化に必要なＡ
ＴＰ（アデノシン三リン酸）の濃度をさげ、１，５−Ａ
Ｇのピラノースオキシダーゼによる酸化反応への過剰Ａ
ＴＰによる阻害を回避でき、かつ、汎用の自動分析装置
にフィット可能な短時間処理が可能になったとしてい
る。しかし、ガスクロマトグラフィーと対比した検体で
の測定精度を見ると、臨床応用にはいまだ不十分である
という問題点がある。
いては、グルコースを主とする夾雑糖類の処理にグルコ
キナーゼ叉はヘキソキナーゼを用い、さらにＡＴＰ供給
系としてピルビン酸キナーゼとその基質であるホスフォ
エノールピルビン酸を作用させる方法が提案されてお
り、これにより、グルコースの６位リン酸化に必要なＡ
ＴＰ（アデノシン三リン酸）の濃度をさげ、１，５−Ａ
Ｇのピラノースオキシダーゼによる酸化反応への過剰Ａ
ＴＰによる阻害を回避でき、かつ、汎用の自動分析装置
にフィット可能な短時間処理が可能になったとしてい
る。しかし、ガスクロマトグラフィーと対比した検体で
の測定精度を見ると、臨床応用にはいまだ不十分である
という問題点がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決する簡便で実用的な１，５−ＡＧの測定方法、
即ち、汎用の自動分析装置にも応用可能な方法を検討し
た結果、試料中の１，５−ＡＧをピラノースオキシダー
ゼまたはＬ−ソルボースオキシダーゼを用いて測定する
際に、試料中のグルコースを酵素を用いてリン酸化する
反応に、ＡＴＰリサイクリル系を併用し、リン酸化によ
って生じたグルコース−６−リン酸をさらに酵素的に別
物質に変換する反応を同時に行う事により、グルコース
を実質的に完全に変換させ、１，５−ＡＧを精度よく定
量することができることを見出し、本発明を完成した。
点を解決する簡便で実用的な１，５−ＡＧの測定方法、
即ち、汎用の自動分析装置にも応用可能な方法を検討し
た結果、試料中の１，５−ＡＧをピラノースオキシダー
ゼまたはＬ−ソルボースオキシダーゼを用いて測定する
際に、試料中のグルコースを酵素を用いてリン酸化する
反応に、ＡＴＰリサイクリル系を併用し、リン酸化によ
って生じたグルコース−６−リン酸をさらに酵素的に別
物質に変換する反応を同時に行う事により、グルコース
を実質的に完全に変換させ、１，５−ＡＧを精度よく定
量することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】即ち、本発明は、（１）試料中の１，５−
ＡＧをピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオ
キシダーゼを用いて測定する際に、試料に対して予め、
グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼによる酵素
反応と、ＡＴＰリサイクル供給反応と、グルコースのリ
ン酸化によって生じたグルコース−６−リン酸をさらに
別物質に変換する酵素反応の処理を同時に行うことを特
徴とする１，５−ＡＧの定量法、（２）ＡＴＰリサイク
ル供給反応が、 １．ピルビン酸キナーゼとホスフォエノールピルビン
酸、 ２．アセテートキナーゼとアセチルリン酸、 ３．ピルビン酸キナーゼ、ホスフォグリセリン酸ムター
ゼ、エノラーゼと３−ホスフォグリセリン酸、又は、 ４．クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェート を使用する酵素反応である上記（１）記載の定量法、
ＡＧをピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオ
キシダーゼを用いて測定する際に、試料に対して予め、
グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼによる酵素
反応と、ＡＴＰリサイクル供給反応と、グルコースのリ
ン酸化によって生じたグルコース−６−リン酸をさらに
別物質に変換する酵素反応の処理を同時に行うことを特
徴とする１，５−ＡＧの定量法、（２）ＡＴＰリサイク
ル供給反応が、 １．ピルビン酸キナーゼとホスフォエノールピルビン
酸、 ２．アセテートキナーゼとアセチルリン酸、 ３．ピルビン酸キナーゼ、ホスフォグリセリン酸ムター
ゼ、エノラーゼと３−ホスフォグリセリン酸、又は、 ４．クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェート を使用する酵素反応である上記（１）記載の定量法、
【００１３】（３）グルコース−６−リン酸を別物質に
変換する酵素反応が、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化
還元酵素、該酸化還元酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）お
よび／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いる酵素反応である上
記（１）または（２）の定量法、（４）グルコース−６
−リン酸を別物質に変換する酵素反応が、グルコースリ
ン酸イソメラーゼを用いる方法である上記（１）叉は
（２）の定量法、
変換する酵素反応が、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化
還元酵素、該酸化還元酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）お
よび／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いる酵素反応である上
記（１）または（２）の定量法、（４）グルコース−６
−リン酸を別物質に変換する酵素反応が、グルコースリ
ン酸イソメラーゼを用いる方法である上記（１）叉は
（２）の定量法、
【００１４】（５）ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補
酵素とする酸化還元酵素及び該酸化還元酵素の基質が １．グルタミン酸脱水素酵素と２−ケトグルタル酸とア
ンモニウム塩、 ２．乳酸脱水素酵素とピルビン酸、又は、 ３．リンゴ酸脱水素酵素とオキザロ酢酸 である上記（３）の定量法、に関するものである。
酵素とする酸化還元酵素及び該酸化還元酵素の基質が １．グルタミン酸脱水素酵素と２−ケトグルタル酸とア
ンモニウム塩、 ２．乳酸脱水素酵素とピルビン酸、又は、 ３．リンゴ酸脱水素酵素とオキザロ酢酸 である上記（３）の定量法、に関するものである。
【００１５】ここで、ＮＡＤ（Ｐ）とはニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド及び／またはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）のことを示し、
ＮＡＤ（Ｐ）ＨとはＮＡＤ（Ｐ）の還元体のことを示
し、ＡＴＰとはアデノシン三リン酸を示し、ＡＴＰリサ
イクル供給反応とはＡＤＰ（アデノシン二リン酸）をＡ
ＴＰに変換する反応を言う。
アデニンジヌクレオチド及び／またはニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸（酸化型）のことを示し、
ＮＡＤ（Ｐ）ＨとはＮＡＤ（Ｐ）の還元体のことを示
し、ＡＴＰとはアデノシン三リン酸を示し、ＡＴＰリサ
イクル供給反応とはＡＤＰ（アデノシン二リン酸）をＡ
ＴＰに変換する反応を言う。
【００１６】以下、本発明の１，５−ＡＧ定量法につい
て詳細に説明する。本発明は、２段階の反応からなり第
１段の反応（処理）で試料中に大量に存在するグルコー
スを１，５−ＡＧを酸化する酵素とは反応しない物質に
完全に変換し、第２段の反応によって１，５−ＡＧを定
量することからなっている。
て詳細に説明する。本発明は、２段階の反応からなり第
１段の反応（処理）で試料中に大量に存在するグルコー
スを１，５−ＡＧを酸化する酵素とは反応しない物質に
完全に変換し、第２段の反応によって１，５−ＡＧを定
量することからなっている。
【００１７】第１段の反応はグルコキナーゼ及び／また
はヘキソキナーゼをもちいてグルコースをグルコース−
６−リン酸に変換する系とグルコース−６−リン酸をさ
らに変換する系を併用しグルコースを完全に消去してい
る。グルコースをリン酸化する系では、ＡＴＰリサイク
ル供給系を用い、酵素と基質の組み合わせとしては、
（ａ）ピルビン酸キナーゼとホスフォエノールピルビン
酸、（ｂ）ピルビン酸キナーゼ、ホスフォグリセリン酸
ムターゼ、エノラーゼと３−ホスフォグリセリン酸、
（ｃ）アセテートキナーゼとアセチルリン酸（ｄ）クレ
アチンキナーゼとクレアチンホスフェート等が挙げられ
る。
はヘキソキナーゼをもちいてグルコースをグルコース−
６−リン酸に変換する系とグルコース−６−リン酸をさ
らに変換する系を併用しグルコースを完全に消去してい
る。グルコースをリン酸化する系では、ＡＴＰリサイク
ル供給系を用い、酵素と基質の組み合わせとしては、
（ａ）ピルビン酸キナーゼとホスフォエノールピルビン
酸、（ｂ）ピルビン酸キナーゼ、ホスフォグリセリン酸
ムターゼ、エノラーゼと３−ホスフォグリセリン酸、
（ｃ）アセテートキナーゼとアセチルリン酸（ｄ）クレ
アチンキナーゼとクレアチンホスフェート等が挙げられ
る。
【００１８】グルコース−６−リン酸を別物質に変換す
る系の酵素としてはグルコース−６−リン酸脱水素酵
素、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。グ
ルコースリン酸イソメラーゼを用いる場合は６−ホスフ
ォフルクトキナーゼを併用してさらに平衡をずらすこと
も可能であり、併用したほうがグルコース−６−リン酸
を無くす効果は大きい。グルコース−６−リン酸脱水素
酵素を用いる場合、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）が必要で
あり、反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成するので、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）に変換する酵素系を組み合わ
せる事によって更に効率よく反応が進行する。ＮＡＤ
（Ｐ）リサイクル供給系の酵素と基質の組み合わせとし
ては（ｅ）乳酸脱水素酵素とピルビン酸、（ｆ）グルタ
ミン酸脱水素酵素と２−ケトグルタル酸とアンモニウム
塩、（ｇ）リンゴ酸脱水素酵素とオキザロ酢酸等が挙げ
られる。また、ＡＴＰリサイクル供給系にピルビン酸キ
ナーゼを用い、ＮＡＤ（Ｐ）リサイクル供給系に乳酸脱
水素酵素を用いた場合は、ピルビン酸キナーゼによる反
応でピルビン酸が生成するため乳酸脱水素酵素の基質の
ピルビン酸は添加する必要は無い。
る系の酵素としてはグルコース−６−リン酸脱水素酵
素、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。グ
ルコースリン酸イソメラーゼを用いる場合は６−ホスフ
ォフルクトキナーゼを併用してさらに平衡をずらすこと
も可能であり、併用したほうがグルコース−６−リン酸
を無くす効果は大きい。グルコース−６−リン酸脱水素
酵素を用いる場合、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）が必要で
あり、反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成するので、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＨをＮＡＤ（Ｐ）に変換する酵素系を組み合わ
せる事によって更に効率よく反応が進行する。ＮＡＤ
（Ｐ）リサイクル供給系の酵素と基質の組み合わせとし
ては（ｅ）乳酸脱水素酵素とピルビン酸、（ｆ）グルタ
ミン酸脱水素酵素と２−ケトグルタル酸とアンモニウム
塩、（ｇ）リンゴ酸脱水素酵素とオキザロ酢酸等が挙げ
られる。また、ＡＴＰリサイクル供給系にピルビン酸キ
ナーゼを用い、ＮＡＤ（Ｐ）リサイクル供給系に乳酸脱
水素酵素を用いた場合は、ピルビン酸キナーゼによる反
応でピルビン酸が生成するため乳酸脱水素酵素の基質の
ピルビン酸は添加する必要は無い。
【００１９】第２段の反応はピラノースオキシダーゼ及
び／またはＬ−ソルボースオキシダーゼを用いた酸化反
応であり、これによって１，５−ＡＧが定量される。具
体的に、第１段の反応に用いる酵素、試薬の組み合わせ
を例示すると以下のようになる。
び／またはＬ−ソルボースオキシダーゼを用いた酸化反
応であり、これによって１，５−ＡＧが定量される。具
体的に、第１段の反応に用いる酵素、試薬の組み合わせ
を例示すると以下のようになる。
【００２０】Ａ．（ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘ
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｅ）グルコース−６−リン酸脱水
素酵素及び、（ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ及び、（ｇ）ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
補酵素とする酸化還元酵素及び、（ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）と
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の基質
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｅ）グルコース−６−リン酸脱水
素酵素及び、（ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ及び、（ｇ）ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
補酵素とする酸化還元酵素及び、（ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）と
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の基質
【００２１】Ａ' ．（ａ）グルコキナーゼ及び／または
ヘキソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ
及び、（ｃ）ピルビン酸キナーゼ及び、（ｄ）ホスフォ
グリセリン酸ムターゼ及び、（ｅ）エノラーゼ及び、
（ｆ）３−ホスフォグリセリン酸（ｇ）グルコース−６
−リン酸脱水素酵素及び、（ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／ま
たはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素及び（ｊ）ＮＡＤ
（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の
基質
ヘキソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ
及び、（ｃ）ピルビン酸キナーゼ及び、（ｄ）ホスフォ
グリセリン酸ムターゼ及び、（ｅ）エノラーゼ及び、
（ｆ）３−ホスフォグリセリン酸（ｇ）グルコース−６
−リン酸脱水素酵素及び、（ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／ま
たはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及び、（ｉ）ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素及び（ｊ）ＮＡＤ
（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵素の
基質
【００２２】Ｂ．（ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘ
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｅ）グルコースリン酸イソメラー
ゼ及び、（ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｅ）グルコースリン酸イソメラー
ゼ及び、（ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ
【００２３】Ｃ．（ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘ
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｄ）グルコースリン酸イソメラー
ゼ
キソキナーゼ及び、（ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ及
び、（ｃ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転移酵
素及び、（ｄ）ＡＴＰとＡＤＰを補酵素とするリン酸転
移酵素の基質及び、（ｄ）グルコースリン酸イソメラー
ゼ
【００２４】さらに具体的に酵素及び試薬の組み合わせ
とその使用量を例示すると、通常は次のとおりである。 Ａ−１． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜５０ｍＭ （ｇ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｉ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
とその使用量を例示すると、通常は次のとおりである。 Ａ−１． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜５０ｍＭ （ｇ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｉ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
【００２５】Ａ−２． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ
【００２６】Ａ−３． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
【００２７】Ａ−４． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｉ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｉ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
【００２８】Ａ−５． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）ピルビン酸：０．２〜５０ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）ピルビン酸：０．２〜５０ｍＭ
【００２９】Ａ−６． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｆ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｇ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｈ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
【００３０】Ａ−７． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｊ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｋ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）グルタミン酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｊ）２ーケトグルタル酸：０．２〜５０ｍＭ （ｋ）アンモニウム塩：１〜１００ｍＭ
【００３１】Ａ−８． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）乳酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ
【００３２】Ａ−９． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｊ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコース−６−リン酸脱水素酵素：１〜１００
Ｕ／ｍｌ （ｈ）ＮＡＤ（Ｐ）及び／またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：０．
４〜１００ｍＭ （ｉ）リンゴ酸脱水素酵素：０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｊ）オキザロ酢酸：０．２〜５０ｍＭ
【００３３】Ｂ−１． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
【００３４】Ｂ−２． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜１０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
０．２〜２０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜１０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｆ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
【００３５】Ｂ−３． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｈ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｈ）６−ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
【００３６】Ｃ−１． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォエノールピルビン酸：０．４〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
【００３７】Ｃ−２． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）アセテートキナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）アセチルリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｅ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ
【００３８】Ｃ−３． （ａ）グルコキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼ：
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ これら酵素及び試薬は同時に添加してもよく、叉、任意
の順序で添加してもよい。
０．２〜５０Ｕ／ｍｌ （ｂ）ＡＴＰ及び／またはＡＤＰ：０．１〜５０ｍＭ （ｃ）ピルビン酸キナーゼ：０．３〜５０Ｕ／ｍｌ （ｄ）ホスフォグリセリン酸ムターゼ：０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ （ｅ）エノラーゼ：０．５〜５０Ｕ／ｍｌ （ｆ）３−ホスフォグリセリン酸：０．５〜５０ｍＭ （ｇ）グルコースリン酸イソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ
／ｍｌ これら酵素及び試薬は同時に添加してもよく、叉、任意
の順序で添加してもよい。
【００３９】試料に上記酵素及び試薬を添加することに
より、これらが試料に作用し、グルコキナーゼ及び／ま
たはヘキソキナーゼにより、グルコースはグルコース−
６−リン酸に変換され、同時にＡＴＰはＡＤＰに変換さ
れる。叉、ホスフォエノールピルビン酸の存在下ピルビ
ン酸キナーゼにより及び／またはアセチルリン酸の存在
下アセテートキナーゼにより、及び／または、３−ホス
フォグリセリン酸の存在下ホスフォグリセリン酸ムター
ゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼにより、及び／又
は、クレアチンホスフェートの存在下クレアチンキナー
ゼによりＡＤＰはＡＴＰに変換される。さらに、Ａでは
グルコース−６−リン酸脱水素酵素により、グルコース
−６−リン酸は６−ホスフォグルコノラクトンに変換さ
れ、同時に、ＮＡＤ（Ｐ）はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換さ
れ、叉、２−ケトグルタル酸とアンモニウム塩の存在
下、グルタミン酸脱水素酵素により、あるいはピルビン
酸の存在下、乳酸脱水素酵素により、あるいはオキザロ
酢酸の存在下、リンゴ酸脱水素酵素により、ＮＡＤ
（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）に変換されるという反応系が確
立され、試料中のグルコースが完全に消去される。ま
た、Ｃではグルコースリン酸イソメラーゼにより、グル
コース−６−リン酸はフルクトース−６−リン酸に変換
されるという反応系が確立され、さらに、Ｂでは６−ホ
スフォフルクトキナーゼにより、フルクトース−６−リ
ン酸はフルクトース−１，６−二リン酸に変換され、試
料中のグルコースの完全な消去が行われる。
より、これらが試料に作用し、グルコキナーゼ及び／ま
たはヘキソキナーゼにより、グルコースはグルコース−
６−リン酸に変換され、同時にＡＴＰはＡＤＰに変換さ
れる。叉、ホスフォエノールピルビン酸の存在下ピルビ
ン酸キナーゼにより及び／またはアセチルリン酸の存在
下アセテートキナーゼにより、及び／または、３−ホス
フォグリセリン酸の存在下ホスフォグリセリン酸ムター
ゼ、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼにより、及び／又
は、クレアチンホスフェートの存在下クレアチンキナー
ゼによりＡＤＰはＡＴＰに変換される。さらに、Ａでは
グルコース−６−リン酸脱水素酵素により、グルコース
−６−リン酸は６−ホスフォグルコノラクトンに変換さ
れ、同時に、ＮＡＤ（Ｐ）はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換さ
れ、叉、２−ケトグルタル酸とアンモニウム塩の存在
下、グルタミン酸脱水素酵素により、あるいはピルビン
酸の存在下、乳酸脱水素酵素により、あるいはオキザロ
酢酸の存在下、リンゴ酸脱水素酵素により、ＮＡＤ
（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）に変換されるという反応系が確
立され、試料中のグルコースが完全に消去される。ま
た、Ｃではグルコースリン酸イソメラーゼにより、グル
コース−６−リン酸はフルクトース−６−リン酸に変換
されるという反応系が確立され、さらに、Ｂでは６−ホ
スフォフルクトキナーゼにより、フルクトース−６−リ
ン酸はフルクトース−１，６−二リン酸に変換され、試
料中のグルコースの完全な消去が行われる。
【００４０】本発明で用いられる試料としては種々のも
のが使用でき、１，５−ＡＧを定量したいものならとく
に制限はなく、例えば髄液、血漿、血清、尿等の体液や
植物、動物組織などの抽出物および、それらの除蛋白物
等、グルコース及び１，５−ＡＧを含む試料が挙げられ
る。ここで用いられる酵素の分類は次の通りであり、グ
ルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、アセテートキナー
ゼ、ホスフォグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、グル
コースリン酸イソメラーゼ、６−ホスフォフルクトキナ
ーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リン
ゴ酸脱水素酵素、クレアチンキナーゼはＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢの命名法で、それぞれＥＣ２．７．１．２、ＥＣ
２．７．１．１、ＥＣ１．１．１．４９、ＥＣ２．７．
１．４０、ＥＣ２．７．２．１、ＥＣ５．４．２．１、
ＥＣ４．２．１．１１、ＥＣ５．３．１．９、ＥＣ２．
７．１．１１、（ＥＣ１．４．１．２、ＥＣ１．４．
１．３、ＥＣ１．４．１．４）、（ＥＣ１．１．１．２
７、ＥＣ１．１．１．２８）、（ＥＣ１．１．１．３
７、ＥＣ１．１．１．８２）、ＥＣ２．７．３．２に分
類しうるものであれば、特に制限はなく、市販のものを
使用しうる。
のが使用でき、１，５−ＡＧを定量したいものならとく
に制限はなく、例えば髄液、血漿、血清、尿等の体液や
植物、動物組織などの抽出物および、それらの除蛋白物
等、グルコース及び１，５−ＡＧを含む試料が挙げられ
る。ここで用いられる酵素の分類は次の通りであり、グ
ルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン
酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、アセテートキナー
ゼ、ホスフォグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼ、グル
コースリン酸イソメラーゼ、６−ホスフォフルクトキナ
ーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リン
ゴ酸脱水素酵素、クレアチンキナーゼはＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢの命名法で、それぞれＥＣ２．７．１．２、ＥＣ
２．７．１．１、ＥＣ１．１．１．４９、ＥＣ２．７．
１．４０、ＥＣ２．７．２．１、ＥＣ５．４．２．１、
ＥＣ４．２．１．１１、ＥＣ５．３．１．９、ＥＣ２．
７．１．１１、（ＥＣ１．４．１．２、ＥＣ１．４．
１．３、ＥＣ１．４．１．４）、（ＥＣ１．１．１．２
７、ＥＣ１．１．１．２８）、（ＥＣ１．１．１．３
７、ＥＣ１．１．１．８２）、ＥＣ２．７．３．２に分
類しうるものであれば、特に制限はなく、市販のものを
使用しうる。
【００４１】この反応（処理）は通常、１〜４００mM、
ｐＨ５〜１０のバッファー中で、１０〜６０℃で１〜６
０分程度行なわれる。バッファーとしてはリン酸バッフ
ァー、クエン酸バッファー、クエン酸リン酸バッファ
ー、酢酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、グッド
のバッファー、イミダゾールバッファー、トリエタノー
ルアミンバッファー等が挙げられる。反応の際、塩類を
共存させるのが好ましく、塩類としては塩化マグネシウ
ム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カリウ
ム、硫酸カリウム等のカリウム塩、塩化アンモニウム等
のアンモニウム塩等が挙げられる。これらの塩は、１〜
１００mM程度用いるのが好ましいが、特に限定はされな
い。
ｐＨ５〜１０のバッファー中で、１０〜６０℃で１〜６
０分程度行なわれる。バッファーとしてはリン酸バッフ
ァー、クエン酸バッファー、クエン酸リン酸バッファ
ー、酢酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、グッド
のバッファー、イミダゾールバッファー、トリエタノー
ルアミンバッファー等が挙げられる。反応の際、塩類を
共存させるのが好ましく、塩類としては塩化マグネシウ
ム、酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化カリウ
ム、硫酸カリウム等のカリウム塩、塩化アンモニウム等
のアンモニウム塩等が挙げられる。これらの塩は、１〜
１００mM程度用いるのが好ましいが、特に限定はされな
い。
【００４２】上記第１段の反応により試料中のグルコー
スを消去した後、第２段の反応で１，５−ＡＧをピラノ
ースオキシダーゼ叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用
いて定量する。この１，５−ＡＧの定量法は公知であ
り、特開平３−２４２００号、特開昭６３−１８５３９
７号、特開平１−３２０９９８号公報等に記載された方
法に従って行うことができる。
スを消去した後、第２段の反応で１，５−ＡＧをピラノ
ースオキシダーゼ叉はＬ−ソルボースオキシダーゼを用
いて定量する。この１，５−ＡＧの定量法は公知であ
り、特開平３−２４２００号、特開昭６３−１８５３９
７号、特開平１−３２０９９８号公報等に記載された方
法に従って行うことができる。
【００４３】例えば次のようにして行うことができる。
即ち、例えば前記Ａ、Ａ’、Ｂ又はＣの組み合わせによ
り試料中のグルコースを消去した後、これに、酸素等の
電子受容体の存在下、ピラノースオキシダーゼ叉はＬ−
ソルボースオキシダーゼを添加し、４〜５０℃好ましく
は２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、好ましくは２分〜
１時間インキュベートし、次いで生成する過酸化水素等
の電子受容体の還元体等を測定し、別に作製した検量線
から１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
即ち、例えば前記Ａ、Ａ’、Ｂ又はＣの組み合わせによ
り試料中のグルコースを消去した後、これに、酸素等の
電子受容体の存在下、ピラノースオキシダーゼ叉はＬ−
ソルボースオキシダーゼを添加し、４〜５０℃好ましく
は２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、好ましくは２分〜
１時間インキュベートし、次いで生成する過酸化水素等
の電子受容体の還元体等を測定し、別に作製した検量線
から１，５−ＡＧ量を求めれば良い。
【００４４】ピラノースオキシダーゼ及び／またはＬ−
ソルボースオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法
でそれぞれＥＣ１．１．３．１０及びＥＣ１．１．３．
１１に分類しうるものであれば、特に制限はなく、市販
のものを使用しうる。これら酵素は、通常０．５〜５０
０Ｕ／mL好ましくは１〜５０Ｕ／mLの濃度で使用され
る。
ソルボースオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法
でそれぞれＥＣ１．１．３．１０及びＥＣ１．１．３．
１１に分類しうるものであれば、特に制限はなく、市販
のものを使用しうる。これら酵素は、通常０．５〜５０
０Ｕ／mL好ましくは１〜５０Ｕ／mLの濃度で使用され
る。
【００４５】具体例を示すとつぎのとおりである。例え
ば、電子受容体の還元体が過酸化水素の場合、過酸化水
素を検出する方法としては、高感度に検出できる方法で
あればいずれであっても良く、数多くの方法が利用でき
る。これらのうちで最も一般的に用いられている方法
は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
触媒酵素として、各種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化
するものであり、酸化反応の結果生成した色素、ケイ光
物質や化学発光をそれぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び
発光測定すれば良い。
ば、電子受容体の還元体が過酸化水素の場合、過酸化水
素を検出する方法としては、高感度に検出できる方法で
あればいずれであっても良く、数多くの方法が利用でき
る。これらのうちで最も一般的に用いられている方法
は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
触媒酵素として、各種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化
するものであり、酸化反応の結果生成した色素、ケイ光
物質や化学発光をそれぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び
発光測定すれば良い。
【００４６】色素を生成するＨＲＰの基質としては２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム
塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノー
ル類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組み
合わせによるいわゆるトリンダー系発色剤などがある。
ケイ光物質を生成するＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒド
ロキシフェニル酢酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）
プロピオン酸（ＨＰＰＡ）などがある。また、化学発光
するＨＲＰの基質としては、ルミノール、イソルミノー
ルなどが知られている。
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム
塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノー
ル類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジ
ンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−ス
ルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組み
合わせによるいわゆるトリンダー系発色剤などがある。
ケイ光物質を生成するＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒド
ロキシフェニル酢酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）
プロピオン酸（ＨＰＰＡ）などがある。また、化学発光
するＨＲＰの基質としては、ルミノール、イソルミノー
ルなどが知られている。
【００４７】ＨＲＰなしに化学発光で検出する方法もい
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いても良い。
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いても良い。
【００４８】特開平２−１０４２９８号公報において示
されているＡＴＰ供給系としてピルビン酸キナーゼと、
その基質であるホスフォエノールピルビン酸を作用させ
る方法が提案されているが、この方法の場合、大量のグ
ルコースが存在する場合、グルコース−６−リン酸が大
量に蓄積する事で、反応が阻害され、完全には試料中の
夾雑糖類を除去しきれない。本発明によれば、グルコー
ス−６−リン酸は酵素的に別物質に変換されるので、グ
ルコキナーゼおよび／またはヘキソキナーゼによるグル
コースのグルコース−６−リン酸への変換が効率よく行
われる。
されているＡＴＰ供給系としてピルビン酸キナーゼと、
その基質であるホスフォエノールピルビン酸を作用させ
る方法が提案されているが、この方法の場合、大量のグ
ルコースが存在する場合、グルコース−６−リン酸が大
量に蓄積する事で、反応が阻害され、完全には試料中の
夾雑糖類を除去しきれない。本発明によれば、グルコー
ス−６−リン酸は酵素的に別物質に変換されるので、グ
ルコキナーゼおよび／またはヘキソキナーゼによるグル
コースのグルコース−６−リン酸への変換が効率よく行
われる。
【００４９】ＡＴＰ供給系としてピルビン酸キナーゼ
と、その基質であるホスフォエノールピルビン酸を用い
る上記公報の場合、グルコース２０００mg/dL では１，
５−ＡＧの測定が不能になったが、本発明によれば、正
常に測定することができる。
と、その基質であるホスフォエノールピルビン酸を用い
る上記公報の場合、グルコース２０００mg/dL では１，
５−ＡＧの測定が不能になったが、本発明によれば、正
常に測定することができる。
【００５０】ＡＴＰ供給系としてピルビン酸キナーゼ
と、その基質であるホスフォエノールピルビン酸を用い
る上記公報の場合、血清にグルコースを添加して、その
影響を調べる試験では血清中グルコース濃度５００mg/d
L 以上では明かな正の影響があったが、本発明によれ
ば、正常に測定する事ができる。
と、その基質であるホスフォエノールピルビン酸を用い
る上記公報の場合、血清にグルコースを添加して、その
影響を調べる試験では血清中グルコース濃度５００mg/d
L 以上では明かな正の影響があったが、本発明によれ
ば、正常に測定する事ができる。
【００５１】本発明によれば、グルコースからグルコー
ス−６−リン酸への反応をほぼ完全に行うことができ
る。グルコース−６−リン酸はリン酸がはずれるとグル
コースに戻り、血清中には各種のリン酸脱離酵素ホスフ
ァターゼが存在するため、この反応が少しでも起こると
測定値を上げてしまう。本発明ではグルコース−６−リ
ン酸をさらに別物質に変換する酵素を用いているためグ
ルコース−６−リン酸は６−ホスフォグルコン酸、フル
クトース−６−リン酸あるいは フルクトース−１，６
−二リン酸に変わるため、ホスファターゼ類の作用でリ
ン酸が脱離してもその影響は少ない。このため血清中グ
ルコースの影響を全く受ける事なく、１，５−ＡＧの定
量を高い精度で行うことができる。更に、特開平２−１
０４２９８号公報に記載の方法に比べて、グルコースの
処理能力が高く、より精度の高い測定結果が得られる。
このように、本発明によれば、迅速で簡便な方法によ
り、１，５−ＡＧを精度良く定量することが可能であ
り、汎用の生化学分析装置により自動測定が可能であ
る。
ス−６−リン酸への反応をほぼ完全に行うことができ
る。グルコース−６−リン酸はリン酸がはずれるとグル
コースに戻り、血清中には各種のリン酸脱離酵素ホスフ
ァターゼが存在するため、この反応が少しでも起こると
測定値を上げてしまう。本発明ではグルコース−６−リ
ン酸をさらに別物質に変換する酵素を用いているためグ
ルコース−６−リン酸は６−ホスフォグルコン酸、フル
クトース−６−リン酸あるいは フルクトース−１，６
−二リン酸に変わるため、ホスファターゼ類の作用でリ
ン酸が脱離してもその影響は少ない。このため血清中グ
ルコースの影響を全く受ける事なく、１，５−ＡＧの定
量を高い精度で行うことができる。更に、特開平２−１
０４２９８号公報に記載の方法に比べて、グルコースの
処理能力が高く、より精度の高い測定結果が得られる。
このように、本発明によれば、迅速で簡便な方法によ
り、１，５−ＡＧを精度良く定量することが可能であ
り、汎用の生化学分析装置により自動測定が可能であ
る。
【００５２】
【実施例】以下、比較例、参考例及び実施例により本発
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に
限定されるものではない。
明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に
限定されるものではない。
【００５３】比較例１（ホスフォエノールピルビン酸−
ピルビン酸キナーゼ系） １，５−ＡＧを蒸留水及び１０，０００mg/L濃度のグル
コース水溶液で溶解し、倍々希釈して、１，５−ＡＧ濃
度として０，１．５，３．１，６．３，１２．５，２
５，５０mg/Lの標準液の希釈系列を作製した。これらの
検体０．０５mLにグルコキナーゼ２Ｕ／mL、ＡＴＰ１m
M、ピルビン酸キナーゼ３Ｕ／mL、ホスフォエノールピ
ルビン酸４mM、４−アミノアンチピリン１．２mM、ＴＯ
ＯＳ１．２mM、ＨＲＰ５Ｕ／mL、ＭｇＣｌ2 を３０mM、
ＫＣｌを７５mM含む５０mMイミダゾール緩衝液（ｐＨ
７．８）１．１５mLを加え３０℃で３０分間反応させ
た。
ピルビン酸キナーゼ系） １，５−ＡＧを蒸留水及び１０，０００mg/L濃度のグル
コース水溶液で溶解し、倍々希釈して、１，５−ＡＧ濃
度として０，１．５，３．１，６．３，１２．５，２
５，５０mg/Lの標準液の希釈系列を作製した。これらの
検体０．０５mLにグルコキナーゼ２Ｕ／mL、ＡＴＰ１m
M、ピルビン酸キナーゼ３Ｕ／mL、ホスフォエノールピ
ルビン酸４mM、４−アミノアンチピリン１．２mM、ＴＯ
ＯＳ１．２mM、ＨＲＰ５Ｕ／mL、ＭｇＣｌ2 を３０mM、
ＫＣｌを７５mM含む５０mMイミダゾール緩衝液（ｐＨ
７．８）１．１５mLを加え３０℃で３０分間反応させ
た。
【００５４】さらに、この反応液に１００Ｕ／mL濃度の
ピラノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤと略す）５０μ
Ｌを加え、３０℃でさらに３０分間反応させた後、５５
０nmにおける吸光度を測定した。１０，０００mg/Lグル
コース水溶液を含有する系の検量線とグルコースを含有
しない系の検量線の結果を図１に示した。
ピラノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤと略す）５０μ
Ｌを加え、３０℃でさらに３０分間反応させた後、５５
０nmにおける吸光度を測定した。１０，０００mg/Lグル
コース水溶液を含有する系の検量線とグルコースを含有
しない系の検量線の結果を図１に示した。
【００５５】参考例１（本発明（Ａ−２）による検量
線） 比較例１と同様にして作製した１，５−ＡＧ濃度０，
１．５，３．１，６．３，１２．５，２５，５０mg/Lの
標準液の希釈系列０．０５mLにグルコキナーゼ２Ｕ／m
L、ＡＴＰ１mM、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素１
２Ｕ／mL、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド）１mM、乳酸脱水素酵素２Ｕ／mL、ピルビン酸キナ
ーゼ３Ｕ／mL、ホスフォエノールピルビン酸４mM、４−
アミノアンチピリン１．２mM、ＴＯＯＳ１．２mM、ＨＲ
Ｐ５Ｕ／mL、ＭｇＣｌ2 を３０mM、ＫＣｌを７５mM含む
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．１５mLを加え３０
℃で３０分間反応させた。
線） 比較例１と同様にして作製した１，５−ＡＧ濃度０，
１．５，３．１，６．３，１２．５，２５，５０mg/Lの
標準液の希釈系列０．０５mLにグルコキナーゼ２Ｕ／m
L、ＡＴＰ１mM、グルコ−ス−６−リン酸脱水素酵素１
２Ｕ／mL、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド）１mM、乳酸脱水素酵素２Ｕ／mL、ピルビン酸キナ
ーゼ３Ｕ／mL、ホスフォエノールピルビン酸４mM、４−
アミノアンチピリン１．２mM、ＴＯＯＳ１．２mM、ＨＲ
Ｐ５Ｕ／mL、ＭｇＣｌ2 を３０mM、ＫＣｌを７５mM含む
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．１５mLを加え３０
℃で３０分間反応させた。
【００５６】さらに、この反応液に１００Ｕ／mL濃度の
ＰＲＯＤ５０μＬを加え、３０℃でさらに３０分間反応
させた後、５５０nmにおける吸光度を測定した。１０，
０００mg/Lグルコース水溶液を含有する系の検量線とグ
ルコースを含有しない系の検量線の結果を図２に示し
た。
ＰＲＯＤ５０μＬを加え、３０℃でさらに３０分間反応
させた後、５５０nmにおける吸光度を測定した。１０，
０００mg/Lグルコース水溶液を含有する系の検量線とグ
ルコースを含有しない系の検量線の結果を図２に示し
た。
【００５７】図１と図２の比較から明かなように、グル
コースの消去の効率は、ホスフォエノールピルビン酸−
ピルビン酸キナーゼの系よりも本発明のＡ−２の組み合
わせによる方法の方が良かった。
コースの消去の効率は、ホスフォエノールピルビン酸−
ピルビン酸キナーゼの系よりも本発明のＡ−２の組み合
わせによる方法の方が良かった。
【００５８】（１）グルコースのリン酸化酵素としてグ
ルコキナーゼを用いた場合 実施例１〜１５ ヒト血清０．０５mLに試薬Ｒ−１を１．３mL添加し、３
７℃で５分間反応させた。その後試薬Ｒ−２を０．６５
mL添加し、５分後の５５０nmでの精製水を対照とした吸
光度を測定した。あらかじめ作製した１，５−ＡＧの検
量線を用いて、血清中１，５−ＡＧ濃度を測定した。以
下に実施例１〜１５の試薬Ｒ−１、Ｒ−２の組成を示
す。
ルコキナーゼを用いた場合 実施例１〜１５ ヒト血清０．０５mLに試薬Ｒ−１を１．３mL添加し、３
７℃で５分間反応させた。その後試薬Ｒ−２を０．６５
mL添加し、５分後の５５０nmでの精製水を対照とした吸
光度を測定した。あらかじめ作製した１，５−ＡＧの検
量線を用いて、血清中１，５−ＡＧ濃度を測定した。以
下に実施例１〜１５の試薬Ｒ−１、Ｒ−２の組成を示
す。
【００５９】実施例１（Ａ−１） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ 塩化アンモニウム ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL グルタミン酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ２−ケトグルタル酸 ２ｍＭ ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォエノールピルビン酸 ４ｍＭ ＮＡＤ ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６０】実施例２（Ａ−２） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL 乳酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォエノールピルビン酸 ４ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６１】実施例３（Ａ−３） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL リンゴ酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL オキザロ酢酸 ２ｍＭ ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォエノールピルビン酸 ４ｍＭ ＮＡＤ ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６２】実施例４（Ａ−４） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ 塩化アンモニウム ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL グルタミン酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ２−ケトグルタル酸 ２ｍＭ アセテートキナーゼ ３Ｕ／mL アセチルリン酸 ６ｍＭ ＮＡＤ ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６３】実施例５（Ａ−５） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL 乳酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ピルビン酸 ２ｍＭ アセテートキナーゼ ３Ｕ／mL アセチルリン酸 ６ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６４】実施例６（Ａ−６） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL リンゴ酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL オキザロ酢酸 ２ｍＭ アセテートキナーゼ ３Ｕ／mL アセチルリン酸 ６ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６５】実施例７（Ａ−７） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ 塩化アンモニウム ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL グルタミン酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ２−ケトグルタル酸 ２ｍＭ ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォグリセリン酸ムターゼ １２Ｕ／mL エノラーゼ １２Ｕ／mL ３−ホスフォグリセリン酸 １２ｍＭ ＮＡＤ ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６６】実施例８（Ａ−８） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL 乳酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォグリセリン酸ムターゼ １２Ｕ／mL エノラーゼ １２Ｕ／mL ３−ホスフォグリセリン酸 １２ｍＭ ＮＡＤ １ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６７】実施例９（Ａ−９） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＫＣｌ ５０ｍＭ ＡＴＰ ５ｍＭ グルコキナーゼ ２Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコース−６−リン酸脱水素酵素 １２Ｕ／mL リンゴ酸脱水素酵素 ２Ｕ／mL オキザロ酢酸 ２ｍＭ ホスフォグリセリン酸ムターゼ １２Ｕ／mL エノラーゼ １２Ｕ／mL ３−ホスフォグリセリン酸 １２ｍＭ ＮＡＤ ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６８】実施例１０（Ｂ−１） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL ６−ホスフォフルクトキナーゼ ５Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォエノールピルビン酸 ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００６９】実施例１１（Ｂ−２） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL ６−ホスフォフルクトキナーゼ ５Ｕ／mL アセテートキナーゼ ３Ｕ／mL アセチルリン酸 ６ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００７０】実施例１２（Ｂ−３） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL ６−ホスフォフルクトキナーゼ ５Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォグリセリン酸ムターゼ １２Ｕ／mL エノラーゼ １２Ｕ／mL ３−ホスフォグリセリン酸 １２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００７１】実施例１３（Ｃ−１） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォエノールピルビン酸 ４ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００７２】実施例１４（Ｃ−２） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL アセテートキナーゼ ３Ｕ／mL アセチルリン酸 ６ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００７３】実施例１５（Ｃ−３） 試薬 Ｒ−１ ４−アミノアンチピリン １．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 １０ｍＭ ＫＣｌ ２５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ４０ｍＭ ＣａＣｌ2 １．５ｍＭ ＡＴＰ １５ｍＭ グルコキナーゼ ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ ５Ｕ／mL グルコースリン酸イソメラーゼ ３．５Ｕ／mL ピルビン酸キナーゼ ３Ｕ／mL ホスフォグリセリン酸ムターゼ １２Ｕ／mL エノラーゼ １２Ｕ／mL ３−ホスフォグリセリン酸 １２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液 ２０ｍＭ（ｐＨ
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
８．０） 試薬 Ｒ−２ ＴＯＯＳ ４．５ｍＭ ピラノースオキシダーゼ １００Ｕ／mL ＨＲＰ ３．７５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ
８．０）
【００７４】以上実施例１〜１５の測定結果を表１に示
す。 （２）グルコースのリン酸化酵素としてヘキソキナーゼ
を用いた場合 実施例１６〜３０ 実施例１〜１５の試薬Ｒ−１中のグルコキナーゼの代わ
りに２０Ｕ／mLのヘキソキナーゼを使用した以外は
（１）（実施例１〜１５）と同様に操作した。その結果
を表１に示す。
す。 （２）グルコースのリン酸化酵素としてヘキソキナーゼ
を用いた場合 実施例１６〜３０ 実施例１〜１５の試薬Ｒ−１中のグルコキナーゼの代わ
りに２０Ｕ／mLのヘキソキナーゼを使用した以外は
（１）（実施例１〜１５）と同様に操作した。その結果
を表１に示す。
【００７５】（３）ＡＤＰを用いた場合 実施例３０〜４５ 実施例１〜１５の試薬Ｒ−１中のＡＴＰをＡＤＰに変え
た以外は（１）（実施例１〜１５）と同様に操作した。
その結果を表１に示す。
た以外は（１）（実施例１〜１５）と同様に操作した。
その結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】 表１ 実施例 濃度(mg/L) 実施例 濃度(mg/L) 実施例 濃度(mg/L) １ ２２．２ １６ ２１．４ ３１ ２１．２ ２ ２３．０ １７ ２１．８ ３２ ２１．３ ３ ２２．５ １８ ２１．７ ３３ ２１．０ ４ ２２．０ １９ ２１．７ ３４ ２１．７ ５ ２２．０ ２０ ２１．９ ３５ ２１．４ ６ ２２．４ ２１ ２２．３ ３６ ２１．１ ７ ２２．６ ２２ ２２．２ ３７ ２１．３ ８ ２２．５ ２３ ２１．４ ３８ ２１．２ ９ ２２．３ ２４ ２２．９ ３９ ２２．１ １０ ２２．１ ２５ ２２．５ ４０ ２２．０ １１ ２１．６ ２６ ２２．４ ４１ ２１．５ １２ ２２．０ ２７ ２２．２ ４２ ２２．３ １３ ２２．５ ２８ ２１．７ ４３ ２２．５ １４ ２２．９ ２９ ２２．３ ４４ ２１．８ １５ ２１．４ ３０ ２１．４ ４５ ２２．４
【００７７】（４）ＮＡＤＰを用いた場合 実施例４６〜５４ 実施例１〜９の試薬Ｒ−１中のＮＡＤをＮＡＤＰ（酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）に変
えた以外は実施例１〜９と同様の組成を用い、日立７１
５０型自動分析装置（日立製作所製）を用いて測定し
た。即ち、検体１０μＬに試薬Ｒ−１を２６０μＬ添加
して３７℃５分間反応させ、さらに試薬Ｒ−２を１３０
μＬ添加して、３７℃５分後、主波長５４６ｎｍ、副波
長７００ｎｍで吸光度の変化を測定し、０mg/L（生理食
塩水）および５０mg/Lの標準液より得た検量線から１，
５−ＡＧの定量値を得た。この結果を表２に示す。
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）に変
えた以外は実施例１〜９と同様の組成を用い、日立７１
５０型自動分析装置（日立製作所製）を用いて測定し
た。即ち、検体１０μＬに試薬Ｒ−１を２６０μＬ添加
して３７℃５分間反応させ、さらに試薬Ｒ−２を１３０
μＬ添加して、３７℃５分後、主波長５４６ｎｍ、副波
長７００ｎｍで吸光度の変化を測定し、０mg/L（生理食
塩水）および５０mg/Lの標準液より得た検量線から１，
５−ＡＧの定量値を得た。この結果を表２に示す。
【００７８】（５）ＮＡＤＨを用いた場合 実施例５５〜６３ 実施例１〜９の試薬Ｒ−１中のＮＡＤをＮＡＤＨ（還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）に変えた以
外は実施例１〜９と同様の組成を用い、実施例４６〜５
４と同様に自動分析機を用いて測定した。この結果を表
２に示す。
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）に変えた以
外は実施例１〜９と同様の組成を用い、実施例４６〜５
４と同様に自動分析機を用いて測定した。この結果を表
２に示す。
【００７９】
【表２】 表２ 実施例 濃度(mg/L) 実施例 濃度(mg/L) ４６ ２１．８ ５５ ２０．９ ４７ ２２．０ ５６ ２１．６ ４８ ２２．３ ５７ ２１．６ ４９ ２１．９ ５８ ２１．３ ５０ ２２．０ ５９ ２１．７ ５１ ２１．８ ６０ ２０．７ ５２ ２１．９ ６１ ２１．１ ５３ ２１．９ ６２ ２１．４ ５４ ２２．３ ６３ ２１．０
【００８０】
【本発明の効果】本発明によれば試料中の１，５−ＡＧ
を迅速で簡便な方法により精度良く、夾雑糖類の影響を
受ける事なしに定量することができ自動分析装置での測
定が可能である。
を迅速で簡便な方法により精度良く、夾雑糖類の影響を
受ける事なしに定量することができ自動分析装置での測
定が可能である。
【図１】１，５−ＡＧ検量線（グルコース処理をホスフ
ォエノールピルビン酸−ピルビン酸キナーゼ系で行った
もの）
ォエノールピルビン酸−ピルビン酸キナーゼ系で行った
もの）
【図２】１，５−ＡＧ検量線（グルコース処理を本発明
の方法で行ったもの）
の方法で行ったもの）
Claims (5)
- 【請求項１】試料中の１，５−アンヒドログルシトール
をピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを用いて測定する際に、試料に対して予め、グル
コキナーゼ及び／またはヘキソキナーゼによる酵素反応
と、ＡＴＰリサイクル供給反応と、グルコースのリン酸
化によって生じたグルコース−６−リン酸をさらに別物
質に変換する酵素反応の処理を同時に行うことを特徴と
する１，５−アンヒドログルシトールの定量法。 - 【請求項２】ＡＴＰリサイクル供給反応が、 １．ピルビン酸キナーゼとホスフォエノールピルビン
酸、 ２．アセテートキナーゼとアセチルリン酸、 ３．ピルビン酸キナーゼ、ホスフォグリセリン酸ムター
ゼ、エノラーゼと３−ホスフォグリセリン酸、又は、 ４．クレアチンキナーゼとクレアチンホスフェート を使用する酵素反応である請求項１記載の定量法。 - 【請求項３】グルコース−６−リン酸を別物質に変換す
る酵素反応が、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とする酸化還元酵
素、該酸化還元酵素の基質およびＮＡＤ（Ｐ）および／
またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いる酵素反応である請求項１
または２記載の定量法。 - 【請求項４】グルコース−６−リン酸を別物質に変換す
る酵素反応が、グルコースリン酸イソメラーゼを用いる
方法である請求項１叉は２記載の定量法。 - 【請求項５】ＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素と
する酸化還元酵素及び該酸化還元酵素の基質が １．グルタミン酸脱水素酵素と２−ケトグルタル酸とア
ンモニウム塩、 ２．乳酸脱水素酵素とピルビン酸、又は、 ３．リンゴ酸脱水素酵素とオキザロ酢酸 である請求項３の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6597993A JPH06253894A (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6597993A JPH06253894A (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253894A true JPH06253894A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=13302635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6597993A Pending JPH06253894A (ja) | 1993-03-03 | 1993-03-03 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06253894A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001116756A (ja) * | 1999-08-09 | 2001-04-27 | Nippon Kayaku Co Ltd | 液状試薬および保存方法 |
| JP2002233363A (ja) * | 2001-02-08 | 2002-08-20 | Unitika Ltd | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬 |
| CN111455020A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-07-28 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | 一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒及检测方法 |
-
1993
- 1993-03-03 JP JP6597993A patent/JPH06253894A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001116756A (ja) * | 1999-08-09 | 2001-04-27 | Nippon Kayaku Co Ltd | 液状試薬および保存方法 |
| JP4544598B2 (ja) * | 1999-08-09 | 2010-09-15 | 日本化薬株式会社 | 液状試薬および保存方法 |
| JP2002233363A (ja) * | 2001-02-08 | 2002-08-20 | Unitika Ltd | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬 |
| JP4620881B2 (ja) * | 2001-02-08 | 2011-01-26 | ユニチカ株式会社 | アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬 |
| CN111455020A (zh) * | 2020-02-25 | 2020-07-28 | 深圳市安帝宝科技有限公司 | 一种1,5-脱水山梨醇检测试剂盒及检测方法 |
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