JP3034986B2 - Ｄ−ソルビトール又はｄ−フルクトースの高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents
Ｄ−ソルビトール又はｄ−フルクトースの高感度定量法および定量用組成物Info
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等の分野におけるＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースの高感度定量法および定量用組成物に関する。
検査等の分野におけるＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースの高感度定量法および定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、臨床的にポリオール代謝経路のア
ルドースレダクターゼに対する阻害剤が糖尿病性合併症
を有する患者に投与され、効果が得られている。このと
き、赤血球中のＤ−ソルビトール濃度の低下度と臨床所
見の改善度との間には有意な相関が認められており、ま
た末梢神経細胞のＤ−ソルビトール濃度も低下すること
から、赤血球中Ｄ−ソルビトールの測定が糖尿病性合併
症に関連する組織中Ｄ−ソルビトールの動態把握になる
（日本臨床、48巻、糖尿病上巻426〜431頁、1990年増刊
号）。
ルドースレダクターゼに対する阻害剤が糖尿病性合併症
を有する患者に投与され、効果が得られている。このと
き、赤血球中のＤ−ソルビトール濃度の低下度と臨床所
見の改善度との間には有意な相関が認められており、ま
た末梢神経細胞のＤ−ソルビトール濃度も低下すること
から、赤血球中Ｄ−ソルビトールの測定が糖尿病性合併
症に関連する組織中Ｄ−ソルビトールの動態把握になる
（日本臨床、48巻、糖尿病上巻426〜431頁、1990年増刊
号）。
【０００３】一方、赤血球中のＤ−ソルビトールは、赤
血球中のソルビトールデヒドロゲナーゼによりＤ−フル
クトースに転換され血清に放出されることから、赤血球
中のＤ−ソルビトールの測定と同様に、血清中のＤ−フ
ルクトースの測定も糖尿病性合併症の病態把握に有用と
思われる。
血球中のソルビトールデヒドロゲナーゼによりＤ−フル
クトースに転換され血清に放出されることから、赤血球
中のＤ−ソルビトールの測定と同様に、血清中のＤ−フ
ルクトースの測定も糖尿病性合併症の病態把握に有用と
思われる。
【０００４】実際、血清中のＤ−フルクトースは糖尿病
により上昇するとの報告もある（日本臨床、47巻、468
頁、1989年増刊号）。
により上昇するとの報告もある（日本臨床、47巻、468
頁、1989年増刊号）。
【０００５】Ｄ−ソルビトールまたはＤ−フルクトース
の測定は、食品分析においても重要であり、たとえばベ
ーリンガー マンハイム社よりキットとして市販されて
いる。さらに、Ｄ−フルクトースは精子中の運動エネル
ギーに関係することが知られており、無精子症の診断に
も有用である。
の測定は、食品分析においても重要であり、たとえばベ
ーリンガー マンハイム社よりキットとして市販されて
いる。さらに、Ｄ−フルクトースは精子中の運動エネル
ギーに関係することが知られており、無精子症の診断に
も有用である。
【０００６】Ｄ−ソルビトールの測定法としては、ガス
クロマトグラフィ（GLC）法、高速液体クロマトグラフ
ィ（HPLC）法、酵素法等が使用されているが、前２者は
操作が煩雑なため、酵素法が最も実用化されている。こ
の方法は、Ｄ−ソルビトールを基質とし、ソルビトール
デヒドロゲナーゼを用いて補酵素NADが還元型に変化さ
れる量を吸光度あるいは蛍光強度により測定するもので
ある。
クロマトグラフィ（GLC）法、高速液体クロマトグラフ
ィ（HPLC）法、酵素法等が使用されているが、前２者は
操作が煩雑なため、酵素法が最も実用化されている。こ
の方法は、Ｄ−ソルビトールを基質とし、ソルビトール
デヒドロゲナーゼを用いて補酵素NADが還元型に変化さ
れる量を吸光度あるいは蛍光強度により測定するもので
ある。
【０００７】また、Ｄ−フルクトースは、ヘキソキナー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼを用いてグルコース
-6-リン酸とした後、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナ
ーゼと補酵素NAD(P)により測定されている。しかし、ヘ
キソキナーゼはＤ−グルコースにも作用するため、Ｄ−
フルクトースに特異的なフルクトキナーゼを用いる測定
法も報告されている（Anal. Biochem., 54, p205, 197
3) 。
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼを用いてグルコース
-6-リン酸とした後、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナ
ーゼと補酵素NAD(P)により測定されている。しかし、ヘ
キソキナーゼはＤ−グルコースにも作用するため、Ｄ−
フルクトースに特異的なフルクトキナーゼを用いる測定
法も報告されている（Anal. Biochem., 54, p205, 197
3) 。
【０００８】一般に、酵素を用いて分析を行なう場合、
測定しようとする物質を分光学的に検出可能な過酸化水
素や還元型NAD(P)等に変換する。このとき検出可能な物
質の量は化学量論的に対象物と等しくなる。現在、この
検出可能物質の測定法としては、分光分析機器を用いる
ものが最も普及しているが、この方法も感度に限界があ
り、測定物質含量が少ない場合には適用できないという
欠点があった。
測定しようとする物質を分光学的に検出可能な過酸化水
素や還元型NAD(P)等に変換する。このとき検出可能な物
質の量は化学量論的に対象物と等しくなる。現在、この
検出可能物質の測定法としては、分光分析機器を用いる
ものが最も普及しているが、この方法も感度に限界があ
り、測定物質含量が少ない場合には適用できないという
欠点があった。
【０００９】そこで、測定対象物含量が少ない場合や、
被検体が少ない場合などには、前記分光分析よりも高感
度の蛍光分析、発光分析等が行なわれている。しかしな
がら、これらの方法も臨床検査等の汎用検査において
は、機器の普及という点であまり適したものではない。
被検体が少ない場合などには、前記分光分析よりも高感
度の蛍光分析、発光分析等が行なわれている。しかしな
がら、これらの方法も臨床検査等の汎用検査において
は、機器の普及という点であまり適したものではない。
【００１０】微量物質を測定する他の方法としては、該
物質が等量の補酵素等に変換できる場合、２種の酵素を
用い補酵素等を増幅する、いわゆる酵素サイクリング法
が知られている。たとえば、NADサイクリング、CoAサイ
クリング、ATPサイクリング等があるが、これらは臨床
検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑なため殆
んど実用されていない。
物質が等量の補酵素等に変換できる場合、２種の酵素を
用い補酵素等を増幅する、いわゆる酵素サイクリング法
が知られている。たとえば、NADサイクリング、CoAサイ
クリング、ATPサイクリング等があるが、これらは臨床
検査等のルーチン分析においては、操作が煩雑なため殆
んど実用されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】前記測定の感度を向上
させることが可能ならば、測定対象物の含量が少ない場
合はもとより、測定に必要な検体量を減らすことができ
るため、例えば血清のように種々の成分を含むものを被
検体に用いる場合には、共存物質によるその測定系に及
ぼす影響を小さくすることができる。また、ある限られ
た被検体量で検査できる項目数を増やすことも可能であ
り、さらには検体が人血液である場合などは、採血量を
減らすことができるため、被採血者への心理的な負担を
軽減することもできる。このように、検出感度を高くす
ることは、臨床検査においては血液という貴重な検体を
用いることや微量成分を測定する必要性から考えて、必
然の要求である。
させることが可能ならば、測定対象物の含量が少ない場
合はもとより、測定に必要な検体量を減らすことができ
るため、例えば血清のように種々の成分を含むものを被
検体に用いる場合には、共存物質によるその測定系に及
ぼす影響を小さくすることができる。また、ある限られ
た被検体量で検査できる項目数を増やすことも可能であ
り、さらには検体が人血液である場合などは、採血量を
減らすことができるため、被採血者への心理的な負担を
軽減することもできる。このように、検出感度を高くす
ることは、臨床検査においては血液という貴重な検体を
用いることや微量成分を測定する必要性から考えて、必
然の要求である。
【００１２】前述のごとく、従来のＤ−ソルビトールま
たはＤ−フルクトースの定量法はいまだ満足のいくもの
ではなく、簡便で、かつ高感度の定量法の開発が望まれ
ていた。
たはＤ−フルクトースの定量法はいまだ満足のいくもの
ではなく、簡便で、かつ高感度の定量法の開発が望まれ
ていた。
【００１３】したがって、本発明の第一の目的は、高感
度かつ精度良好で、簡便なＤ−ソルビトールまたはＤ−
フルクトースの定量法を提供することにある。
度かつ精度良好で、簡便なＤ−ソルビトールまたはＤ−
フルクトースの定量法を提供することにある。
【００１４】さらに、本発明の第二の目的は、前記Ｄ−
ソルビトールまたはＤ−フルクトースの高感度定量法に
好適に供せられる組成物を提供することにある。
ソルビトールまたはＤ−フルクトースの高感度定量法に
好適に供せられる組成物を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、チオNAD類およびチオN
ADP類からなる群（以下、チオ型NAD(P)類ともいう）よ
り選ばれる１つと、NAD類およびNADP類からなる群（以
下、非チオ型NAD(P)ともいう）より選ばれる１つの補酵
素に作用するソルビトールデヒドロゲナーゼおよびチオ
型NAD(P)類を非チオ型NAD(P)類との２種類の補酵素を用
いることにより、吸光度測定の際、チオ型NAD(P)類の還
元型と非チオ型NAD(P)類の還元型との吸収波長がそれぞ
れ400nm付近、340nm付近と異なることを利用して他物質
吸収波長の混雑を回避可能な酵素サイクリング反応を実
施でき、かつ高感度の測定が可能なことを見出し、本発
明を完成するに至った。ここで、前記酵素サイクリング
反応の実施にあたっては、前記２種の補酵素のうち、ど
ちらか一方の変化量のみを分別定量すればよい。
を解決すべく鋭意検討した結果、チオNAD類およびチオN
ADP類からなる群（以下、チオ型NAD(P)類ともいう）よ
り選ばれる１つと、NAD類およびNADP類からなる群（以
下、非チオ型NAD(P)ともいう）より選ばれる１つの補酵
素に作用するソルビトールデヒドロゲナーゼおよびチオ
型NAD(P)類を非チオ型NAD(P)類との２種類の補酵素を用
いることにより、吸光度測定の際、チオ型NAD(P)類の還
元型と非チオ型NAD(P)類の還元型との吸収波長がそれぞ
れ400nm付近、340nm付近と異なることを利用して他物質
吸収波長の混雑を回避可能な酵素サイクリング反応を実
施でき、かつ高感度の測定が可能なことを見出し、本発
明を完成するに至った。ここで、前記酵素サイクリング
反応の実施にあたっては、前記２種の補酵素のうち、ど
ちらか一方の変化量のみを分別定量すればよい。
【００１６】すなわち、本発明のＤ−ソルビトールまた
はＤ−フルクトースの高感度定量法は、Ｄ−ソルビトー
ルおよびＤ−フルクトースからなる群より選ばれる少な
くとも１種の被検成分を含有する被検体に、次の成分
(1)〜(3) (1)チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれる
１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる１
つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基質
としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソル
ビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕
はＤ−フルクトースの高感度定量法は、Ｄ−ソルビトー
ルおよびＤ−フルクトースからなる群より選ばれる少な
くとも１種の被検成分を含有する被検体に、次の成分
(1)〜(3) (1)チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれる
１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる１
つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基質
としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソル
ビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1 を含有する試薬を作用せしめ、下記反応式〔１〕
【００１７】
【化２】
【００１８】（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NAD
P類またはNAD類を示し、A2 はA1の還元型生成物を示
し、B1はA1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元
型NADP類または還元型NAD類を、またA1がNADP類またはN
AD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類
を示し、B2はB1の酸化型生成物を示す）で表わされるサ
イクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化する
A2またはB1の量を測定することを特徴とする。
P類またはNAD類を示し、A2 はA1の還元型生成物を示
し、B1はA1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元
型NADP類または還元型NAD類を、またA1がNADP類またはN
AD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類
を示し、B2はB1の酸化型生成物を示す）で表わされるサ
イクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化する
A2またはB1の量を測定することを特徴とする。
【００１９】さらに本発明のＤ−ソルビトールまたはＤ
−フルクトースの定量用組成物は、前記(1)〜(3)を含有
することを特徴とする。
−フルクトースの定量用組成物は、前記(1)〜(3)を含有
することを特徴とする。
【００２０】本発明において使用されるソルビトールデ
ヒドロゲナーゼは、少なくとも Ｄ−ソルビトール＋NAD(P)+＝Ｄ−フルクトース＋NAD(P)H＋H+ なる反応を触媒するものであって、チオNADP類およびチ
オNAD類からなる群より選ばれた１つと、NADP類およびN
AD類からなる群より選ばれた１つとを補酵素とするもの
ならいずれをも用いることができる。
ヒドロゲナーゼは、少なくとも Ｄ−ソルビトール＋NAD(P)+＝Ｄ−フルクトース＋NAD(P)H＋H+ なる反応を触媒するものであって、チオNADP類およびチ
オNAD類からなる群より選ばれた１つと、NADP類およびN
AD類からなる群より選ばれた１つとを補酵素とするもの
ならいずれをも用いることができる。
【００２１】具体的にはEC1.1.1.14の酵素が挙げられ、
バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis) 等の微生
物、ヒト、ヒツジ、ネズミ等の肝や精液に見出されてい
る。
バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis) 等の微生
物、ヒト、ヒツジ、ネズミ等の肝や精液に見出されてい
る。
【００２２】基質としては、Ｄ−キシロ(D-xylo-) およ
びＤ−リボ(D-ribo-) 構造のポリオールに作用するとい
われている（酵素ハンドブック、５頁、朝倉書店、1983
年）。
びＤ−リボ(D-ribo-) 構造のポリオールに作用するとい
われている（酵素ハンドブック、５頁、朝倉書店、1983
年）。
【００２３】ベーリンガー マンハイム社より市販され
ている羊肝由来の酵素についてみれば、Ｄ−ソルビトー
ルに対する活性を100％としたとき、Ｌ−イディトール
には96％、キシリトールには85％、リビトールには49
％、アリトールには45％であり、エリスリトール、Ｄ−
およびＬ−アラビトール、Ｄ−イディトール、Ｄ−マン
ニトール、イノシトールには作用しない。
ている羊肝由来の酵素についてみれば、Ｄ−ソルビトー
ルに対する活性を100％としたとき、Ｌ−イディトール
には96％、キシリトールには85％、リビトールには49
％、アリトールには45％であり、エリスリトール、Ｄ−
およびＬ−アラビトール、Ｄ−イディトール、Ｄ−マン
ニトール、イノシトールには作用しない。
【００２４】また、補酵素に対する特異性は、NADのみ
ならず、NADPにも1/10〜1/100程度の強さで働く（Bioch
emica Information,p79 Boehringer Mannheim Biochemi
cals,1987）。
ならず、NADPにも1/10〜1/100程度の強さで働く（Bioch
emica Information,p79 Boehringer Mannheim Biochemi
cals,1987）。
【００２５】バチルス ズブチリス由来の酵素について
は、NADの他チオNAD、アセチルNAD、デアミノNADに対し
てもNADとほぼ同等に作用することが知られている（J.
Biol. Chem.,239,p830〜838,1964）。
は、NADの他チオNAD、アセチルNAD、デアミノNADに対し
てもNADとほぼ同等に作用することが知られている（J.
Biol. Chem.,239,p830〜838,1964）。
【００２６】他の起源の酵素についても適宜使用可能で
あり、補酵素NAD(P)類、チオNAD(P)類に対する特異性
は、基質であるＤ−ソルビトールに対し反応性を有しＤ
−フルクトースを生成するものであればよく、その特異
性はこれら補酵素と基質とを用い確認できる。
あり、補酵素NAD(P)類、チオNAD(P)類に対する特異性
は、基質であるＤ−ソルビトールに対し反応性を有しＤ
−フルクトースを生成するものであればよく、その特異
性はこれら補酵素と基質とを用い確認できる。
【００２７】また、本発明において、A1およびB2の補酵
素はチオNADP類、チオNAD類、NADP類、NAD類を示すが、
このうちチオNADP類またはチオNAD類としては、例えば
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフェート；およびチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。ま
た、NADP類またはNAD類としては、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（ア
セチルNADP）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート（デアミノNADP）；および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNA
D）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノNAD）が挙げられる。なお、これら補酵素の還元
型は、各々チオNADPH類、チオNADH類、NADPH類、NADH類
として表示する。
素はチオNADP類、チオNAD類、NADP類、NAD類を示すが、
このうちチオNADP類またはチオNAD類としては、例えば
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドホスフェート；およびチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。ま
た、NADP類またはNAD類としては、例えばニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチドホスフェート（ア
セチルNADP）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌク
レオチドホスフェート、ニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチドホスフェート（デアミノNADP）；および
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルNA
D）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノNAD）が挙げられる。なお、これら補酵素の還元
型は、各々チオNADPH類、チオNADH類、NADPH類、NADH類
として表示する。
【００２８】本発明において、A1およびB1については例
えばA1がチオNAD(P)類である場合、B1はNAD(P)H類であ
ることが必要であり、A1およびB1の関係において１つの
チオ型補酵素を使用する。
えばA1がチオNAD(P)類である場合、B1はNAD(P)H類であ
ることが必要であり、A1およびB1の関係において１つの
チオ型補酵素を使用する。
【００２９】定量に用いるソルビトールデヒドロゲナー
ゼが（チオ）NAD類のみを補酵素とする場合は、上述の
チオNAD類とNAD類より、また、用いるソルビトールデヒ
ドロゲナーゼが（チオ）NADP類のみを補酵素とする場合
は、上述のチオNADP類およびNADP類より、更に用いるソ
ルビトールデヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および
（チオ）NADP類を共に補酵素にする場合は上述のチオNA
D類およびチオNADP類と上述のNAD類およびNADP類より適
宜選択して用いればよい。
ゼが（チオ）NAD類のみを補酵素とする場合は、上述の
チオNAD類とNAD類より、また、用いるソルビトールデヒ
ドロゲナーゼが（チオ）NADP類のみを補酵素とする場合
は、上述のチオNADP類およびNADP類より、更に用いるソ
ルビトールデヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および
（チオ）NADP類を共に補酵素にする場合は上述のチオNA
D類およびチオNADP類と上述のNAD類およびNADP類より適
宜選択して用いればよい。
【００３０】本発明の定量法を用いれば、被検体中にも
ともと含有されているＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを測定することができるが、又、これらの物質
を遊離、生成する酵素系における基質やその酵素活性を
測定することもできる。さらに、本発明の定量法を用い
ることにより、前記のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを遊離、生成する酵素系と連結し得る単一の、
もしくは複数の工程からなる酵素系における基質やその
酵素活性をも測定することができる。これらの酵素系
は、特に限定されるものではないが、例えば以下に示す
種々の反応系が挙げられる。
ともと含有されているＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを測定することができるが、又、これらの物質
を遊離、生成する酵素系における基質やその酵素活性を
測定することもできる。さらに、本発明の定量法を用い
ることにより、前記のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを遊離、生成する酵素系と連結し得る単一の、
もしくは複数の工程からなる酵素系における基質やその
酵素活性をも測定することができる。これらの酵素系
は、特に限定されるものではないが、例えば以下に示す
種々の反応系が挙げられる。
【００３１】(1)Ｄ−グルコースとアルドースレダクタ
ーゼ（EC 1.1.1.21）との酵素反応系。この系におい
て、遊離、生成するＤ−ソルビトールを定量することに
より、Ｄ−グルコースの定量またはアルドースレダクタ
ーゼの活性測定をすることができる。 Ｄ−グルコース＋NAD(P)H →Ｄ−ソルビトール＋NAD(P)
ーゼ（EC 1.1.1.21）との酵素反応系。この系におい
て、遊離、生成するＤ−ソルビトールを定量することに
より、Ｄ−グルコースの定量またはアルドースレダクタ
ーゼの活性測定をすることができる。 Ｄ−グルコース＋NAD(P)H →Ｄ−ソルビトール＋NAD(P)
【００３２】(2)Ｄ−マンノースとマンノースイソメラ
ーゼ（EC 5.3.1.7）との酵素反応系。この系において、
遊離、生成するＤ−フルクトースを定量することによ
り、Ｄ−マンノースの定量またはマンノースイソメラー
ゼの活性測定をすることができる。 Ｄ−マンノース→Ｄ−フルクトース
ーゼ（EC 5.3.1.7）との酵素反応系。この系において、
遊離、生成するＤ−フルクトースを定量することによ
り、Ｄ−マンノースの定量またはマンノースイソメラー
ゼの活性測定をすることができる。 Ｄ−マンノース→Ｄ−フルクトース
【００３３】(3)Ｄ−フルクトース-6-リン酸とアルカリ
ホスファターゼ（EC 3.1.3.1）との酵素反応系。この系
において、遊離、生成するＤ−フルクトースを定量する
ことにより、Ｄ−フルクトース-6-リン酸の定量または
アルカリホスファターゼの活性測定をすることができ
る。 Ｄ−フルクトース-6-リン酸＋H2O →Ｄ−フルクトース＋リン酸
ホスファターゼ（EC 3.1.3.1）との酵素反応系。この系
において、遊離、生成するＤ−フルクトースを定量する
ことにより、Ｄ−フルクトース-6-リン酸の定量または
アルカリホスファターゼの活性測定をすることができ
る。 Ｄ−フルクトース-6-リン酸＋H2O →Ｄ−フルクトース＋リン酸
【００３４】(4)スクロースとα−グルコシダーゼ（E
C 3.2.1.20）またはβ−フルクトシダーゼ（EC 3.2.1.2
6）との酵素反応系。この系において、遊離、生成する
Ｄ−フルクトースを定量することによりスクロースの定
量あるいはα−グルコシダーゼまたはβ−フルクトシダ
ーゼの活性測定をすることができる。 スクロース＋H2O →Ｄ−フルクトース＋Ｄ−グルコース
C 3.2.1.20）またはβ−フルクトシダーゼ（EC 3.2.1.2
6）との酵素反応系。この系において、遊離、生成する
Ｄ−フルクトースを定量することによりスクロースの定
量あるいはα−グルコシダーゼまたはβ−フルクトシダ
ーゼの活性測定をすることができる。 スクロース＋H2O →Ｄ−フルクトース＋Ｄ−グルコース
【００３５】(5)ラフィノースとβ−フルクトシダーゼ
（EC 3.2.1.26）との酵素反応系。この系において、遊
離、生成するＤ−フルクトースを定量することにより、
ラフィノースの定量またはβ−フルクトシダーゼの活性
測定をすることができる。 ラフィノース＋H2O →Ｄ−フルクトース＋メリビオース
（EC 3.2.1.26）との酵素反応系。この系において、遊
離、生成するＤ−フルクトースを定量することにより、
ラフィノースの定量またはβ−フルクトシダーゼの活性
測定をすることができる。 ラフィノース＋H2O →Ｄ−フルクトース＋メリビオース
【００３６】(6)スクロース、無機リンとスクロースホ
スホリラーゼ（EC 2.4.1.7）との酵素反応系。この系に
おいて、遊離、生成するＤ−フルクトースを定量するこ
とにより、スクロースまたは無機リンの定量あるいはス
クロースホスホリラーゼの活性測定をすることができ
る。 スクロース＋無機リン→Ｄ−フルクトース＋Ｄ−グルコース-1-リン酸
スホリラーゼ（EC 2.4.1.7）との酵素反応系。この系に
おいて、遊離、生成するＤ−フルクトースを定量するこ
とにより、スクロースまたは無機リンの定量あるいはス
クロースホスホリラーゼの活性測定をすることができ
る。 スクロース＋無機リン→Ｄ−フルクトース＋Ｄ−グルコース-1-リン酸
【００３７】(7)(4)のスクロースがラフィノースとα
−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22）との酵素反応系に
由来する場合。この系において最終的に生成するＤ−フ
ルクトースを定量することにより、ラフィノースの定量
またはα−ガラクトシダーゼの活性測定をすることがで
きる。 ラフィノース＋H2O →ガラクトース＋スクロース
−ガラクトシダーゼ（EC 3.2.1.22）との酵素反応系に
由来する場合。この系において最終的に生成するＤ−フ
ルクトースを定量することにより、ラフィノースの定量
またはα−ガラクトシダーゼの活性測定をすることがで
きる。 ラフィノース＋H2O →ガラクトース＋スクロース
【００３８】本発明の定量用組成物においては、A1およ
びB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好まし
く、ソルビトールデヒドロゲナーゼの量は１〜1000u/m
l、特に２〜400u/ml が好ましいが、その量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。
びB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好まし
く、ソルビトールデヒドロゲナーゼの量は１〜1000u/m
l、特に２〜400u/ml が好ましいが、その量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。
【００３９】本発明における、A1およびB1の量は被検体
中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フ−フルクトースの合
計量と比較して過剰量であること、かつソルビトールデ
ヒドロゲナーゼのA1およびB1それぞれに対するKm値と比
較して過剰量であることが必要であり、特に被検成分の
20〜10000倍モルが好ましい。
中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フ−フルクトースの合
計量と比較して過剰量であること、かつソルビトールデ
ヒドロゲナーゼのA1およびB1それぞれに対するKm値と比
較して過剰量であることが必要であり、特に被検成分の
20〜10000倍モルが好ましい。
【００４０】また、本発明の前記定量法はソルビトール
デヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP
類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチ
オNAD類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオ
NADP類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだとき
には、さらに被検体に(4)成分としてＤ−ソルビトール
に作用せず、B2→B1の反応を形成する第二のデヒドロゲ
ナーゼを使用し、さらに該第二のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめることにより、後記反応式〔２〕のごと
く、B1とB2の間にB1の再生のための反応系を付与せしめ
ることによりサイクリング反応を形成せしめ得る。
デヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NADP
類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素にチ
オNAD類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチオ
NADP類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだとき
には、さらに被検体に(4)成分としてＤ−ソルビトール
に作用せず、B2→B1の反応を形成する第二のデヒドロゲ
ナーゼを使用し、さらに該第二のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめることにより、後記反応式〔２〕のごと
く、B1とB2の間にB1の再生のための反応系を付与せしめ
ることによりサイクリング反応を形成せしめ得る。
【００４１】すなわち、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−フ
ルクトースからなる群より選ばれる一種以上の被検成分
を含有する被検体に、次の成分(1)〜(4) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基
質としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1または／およびB2 (4) Ｄ−ソルビトールに作用せずB2→B1の反応を形成す
る第二のデヒドロゲナーゼおよび該デヒドロゲナーゼの
基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式〔２〕
ルクトースからなる群より選ばれる一種以上の被検成分
を含有する被検体に、次の成分(1)〜(4) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基
質としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1または／およびB2 (4) Ｄ−ソルビトールに作用せずB2→B1の反応を形成す
る第二のデヒドロゲナーゼおよび該デヒドロゲナーゼの
基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式〔２〕
【００４２】
【化３】
【００４３】（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NAD
P類またはNAD類を示し、A2 はA1の還元型生成物を示
し、B1 はA1 がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またA1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示し、B2→B1はB2
を補酵素としてB1を生成する酸素反応を示す）で表わさ
れるサイクリング反応を形成せしめ得るものである。
P類またはNAD類を示し、A2 はA1の還元型生成物を示
し、B1 はA1 がチオNADP類またはチオNAD類のときは還
元型NADP類または還元型NAD類を、またA1がNADP類また
はNAD類のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD
類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示し、B2→B1はB2
を補酵素としてB1を生成する酸素反応を示す）で表わさ
れるサイクリング反応を形成せしめ得るものである。
【００４４】この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にA1に作用し得ない条
件を設定することが好ましく、例えばA1を本質的に補酵
素として利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択する
組合せ、A1とB2の量的関係により第二のデヒドロゲナー
ゼが実質的にA1に作用しない条件を選択する組合せ等が
例示される。定量の際には反応により生成したA2の量を
測定する。
ては、この測定系において実質的にA1に作用し得ない条
件を設定することが好ましく、例えばA1を本質的に補酵
素として利用しない第二のデヒドロゲナーゼを選択する
組合せ、A1とB2の量的関係により第二のデヒドロゲナー
ゼが実質的にA1に作用しない条件を選択する組合せ等が
例示される。定量の際には反応により生成したA2の量を
測定する。
【００４５】上記の成分(4)を用いる定量用組成物にお
いて、A1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好ま
しく、B2または／およびB1の濃度は0.05〜5000μM、特
に５〜500μMが好ましく、ソルビトールデヒドロゲナー
ゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２〜400u/mlが好まし
く、第二のデヒドロゲナーゼはB2に対するKm値（mM単
位）の20倍量（u/ml単位）以上になるように調製すれば
よく、例えば１〜100u/mlが好ましく、また第二のデヒ
ドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05〜20mMが好ま
しい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定する
ことができ、これ以上の量を用いることもできる。
いて、A1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜20mMが好ま
しく、B2または／およびB1の濃度は0.05〜5000μM、特
に５〜500μMが好ましく、ソルビトールデヒドロゲナー
ゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２〜400u/mlが好まし
く、第二のデヒドロゲナーゼはB2に対するKm値（mM単
位）の20倍量（u/ml単位）以上になるように調製すれば
よく、例えば１〜100u/mlが好ましく、また第二のデヒ
ドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05〜20mMが好ま
しい。これらの量は被検体の種類等により適宜決定する
ことができ、これ以上の量を用いることもできる。
【００４６】すなわち、第二のデヒドロゲナーゼはB1の
再生のために補助的に添加するものであり、これによっ
てB1の使用量を少なくすることが可能となり、特にB1が
高価な場合は有効である。また、B1の代わりにB2あるい
はB1とB2の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、B1または／およびB2の使用量は特に限定されるもの
ではないが、一般的にはA1の1/10モル以下、好ましくは
1/100以下である。
再生のために補助的に添加するものであり、これによっ
てB1の使用量を少なくすることが可能となり、特にB1が
高価な場合は有効である。また、B1の代わりにB2あるい
はB1とB2の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、B1または／およびB2の使用量は特に限定されるもの
ではないが、一般的にはA1の1/10モル以下、好ましくは
1/100以下である。
【００４７】第二のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、B2がNAD類またはチオNAD類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1)とエタノー
ル、Ｌ−グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.8)（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール-3-リ
ン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.12) （ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.Coli由来）と
Ｄ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、グリセロール
デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.6)（E.Coli由来）とグリセ
ロール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37)（ブ
タ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、B2がNADP類ま
たはチオNADP類のときは、グルコース-6-リン酸デヒド
ロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)（酵母由来）とグルコース-6-
リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.42)
（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル
酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.17)（Pseudomonas oxala
ticus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸
デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.44)（ラット肝、ビール酵
母、E.Coli由来）と6-ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセ
ロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.13)
（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド-3- リン
酸とリン酸等が挙げられる。
しては、例えば、B2がNAD類またはチオNAD類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.1)とエタノー
ル、Ｌ−グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.8)（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロール-3-リ
ン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC
1.1.1.12) （ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.Coli由来）と
Ｄ−グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、グリセロール
デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.6)（E.Coli由来）とグリセ
ロール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37)（ブ
タ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、B2がNADP類ま
たはチオNADP類のときは、グルコース-6-リン酸デヒド
ロゲナーゼ(EC 1.1.1.49)（酵母由来）とグルコース-6-
リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.42)
（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオキシル
酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.17)（Pseudomonas oxala
ticus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグルコン酸
デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.44)（ラット肝、ビール酵
母、E.Coli由来）と6-ホスホ−Ｄ−グルコン酸、グリセ
ロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.13)
（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロアルデヒド-3- リン
酸とリン酸等が挙げられる。
【００４８】さらに本発明の前記定量法は、ソルビトー
ルデヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NAD
P類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素に
チオNAD類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチ
オNADP類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだと
きには、更に被検体に(5)成分としてＤ−ソルビトール
に作用せず、A2→A1の反応を形成する第三のデヒドロゲ
ナーゼを使用し、さらに該第三のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめることにより、後記反応式〔３〕のごと
く、A1とA2の間にA1の再生の為の反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成し得る。
ルデヒドロゲナーゼが（チオ）NAD類および（チオ）NAD
P類を共に補酵素とする場合において、２つの補酵素に
チオNAD類とNAD類もしくはNADP類との組合せ、またはチ
オNADP類とNAD類もしくはNADP類との組合せを選んだと
きには、更に被検体に(5)成分としてＤ−ソルビトール
に作用せず、A2→A1の反応を形成する第三のデヒドロゲ
ナーゼを使用し、さらに該第三のデヒドロゲナーゼの基
質を作用せしめることにより、後記反応式〔３〕のごと
く、A1とA2の間にA1の再生の為の反応系を付与せしめる
ことによりサイクリング反応を形成し得る。
【００４９】すなわち、Ｄ−ソルビトールおよびＤ−フ
ルクトースからなる群より選ばれる一種以上の被検成分
を含有する被検体に、次の成分(1)〜(3)および(5) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基
質としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1または／およびA2 (3) B1 (5) Ｄ−ソルビトールに作用せず、A2→A1の反応を形成
する第三のデヒドロゲナーゼおよび該デヒドロゲナーゼ
の基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式〔３〕
ルクトースからなる群より選ばれる一種以上の被検成分
を含有する被検体に、次の成分(1)〜(3)および(5) (1) チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれ
る１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる
１つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基
質としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソ
ルビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1または／およびA2 (3) B1 (5) Ｄ−ソルビトールに作用せず、A2→A1の反応を形成
する第三のデヒドロゲナーゼおよび該デヒドロゲナーゼ
の基質 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式〔３〕
【００５０】
【化４】
【００５１】（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NAD
P類またはNAD類を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、
B1はA1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NAD
P類または還元型NAD類を、またA1がNADP類またはNAD類
のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示
し、B2はB1の酸化型生成物を示し、A2→A1はA2を補酵素
としてA1を生成する酵素反応を示す）で表わされるサイ
クリング反応を形成せしめ得るものである。
P類またはNAD類を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、
B1はA1がチオNADP類またはチオNAD類のときは還元型NAD
P類または還元型NAD類を、またA1がNADP類またはNAD類
のときは還元型チオNADP類または還元型チオNAD類を示
し、B2はB1の酸化型生成物を示し、A2→A1はA2を補酵素
としてA1を生成する酵素反応を示す）で表わされるサイ
クリング反応を形成せしめ得るものである。
【００５２】この場合、第三のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にB1に作用し得ない条
件を設定することが好ましく、例えばB1を本質的に補酵
素として利用しない酵素を選択する組合せ、B1とA2の量
的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的にB1に作
用しない条件を選択する組合せ等が例示される。定量の
際にはB1の消費量を測定する。
ては、この測定系において実質的にB1に作用し得ない条
件を設定することが好ましく、例えばB1を本質的に補酵
素として利用しない酵素を選択する組合せ、B1とA2の量
的関係により第三のデヒドロゲナーゼが実質的にB1に作
用しない条件を選択する組合せ等が例示される。定量の
際にはB1の消費量を測定する。
【００５３】この成分(5)を用いる本発明の前記定量用
組成物において、B1の濃度は0.02〜100mM 、特に0.05〜
20mMが好ましく、A2または／およびA1の濃度は0.05〜50
00μM、特に５〜500μMが好ましく、ソルビトールデヒ
ドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２〜400u/ml
が好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはA2に対するKm値
（mM単位）の20倍量（u/ml単位）以上になるように調整
すればよく、例えば１〜100u/mlが好ましく、また第三
のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05〜20mM
が好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決
定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。
組成物において、B1の濃度は0.02〜100mM 、特に0.05〜
20mMが好ましく、A2または／およびA1の濃度は0.05〜50
00μM、特に５〜500μMが好ましく、ソルビトールデヒ
ドロゲナーゼの濃度は１〜1000u/ml、特に２〜400u/ml
が好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはA2に対するKm値
（mM単位）の20倍量（u/ml単位）以上になるように調整
すればよく、例えば１〜100u/mlが好ましく、また第三
のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05〜20mM
が好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜決
定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。
【００５４】すなわち、第三デヒドロゲナーゼはA1の再
生のために補助的に添加するものであり、これによって
A1の使用量を少なくすることが可能となり、特にA1が高
価な場合には有効である。また、A1の代わりにA2あるい
はA1とA2の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、A1または／およびA2の使用量は特に限定されるもの
ではないが、一般的にはB1の1/10モル以下、好ましくは
1/100以下である。
生のために補助的に添加するものであり、これによって
A1の使用量を少なくすることが可能となり、特にA1が高
価な場合には有効である。また、A1の代わりにA2あるい
はA1とA2の混合物を用いて反応を行ってもよい。この場
合、A1または／およびA2の使用量は特に限定されるもの
ではないが、一般的にはB1の1/10モル以下、好ましくは
1/100以下である。
【００５５】第三のデヒドロゲナーゼおよびその基質と
しては、例えば、A1がNAD類またはチオNAD類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセトア
ルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.
6）（E.Coli由来）とジヒドロキシアセトン、Ｌ−グリ
セロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由
来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）
とオギザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.C
oli由来）と1,3-ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、A1がNAD
P類またはチオNADP類のときは、グリセロアルデヒドリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由
来）と1,3-ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられ
る。
しては、例えば、A1がNAD類またはチオNAD類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセトア
ルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.
6）（E.Coli由来）とジヒドロキシアセトン、Ｌ−グリ
セロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ウサギ筋肉由
来）とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）
とオギザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ（EC 1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.C
oli由来）と1,3-ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、A1がNAD
P類またはチオNADP類のときは、グリセロアルデヒドリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由
来）と1,3-ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられ
る。
【００５６】反応液組成については、使用するソルビト
ールデヒドロゲナーゼの各種酵素間の相対活性等を考慮
して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反応
の至適pH条件を酵素サイクリング反応が効率的に進行す
るよう設定すればよい。使用する酵素は単独でも、ある
いは適宜２種以上組合せて用いてもよい。
ールデヒドロゲナーゼの各種酵素間の相対活性等を考慮
して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反応
の至適pH条件を酵素サイクリング反応が効率的に進行す
るよう設定すればよい。使用する酵素は単独でも、ある
いは適宜２種以上組合せて用いてもよい。
【００５７】かくして調製された本発明の前記定量用組
成物により被検体中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを測定するには、上記成分(1)〜(3)、(1)〜(4)
または(1)〜(3)および(5)を含有する組成物に被検体0.0
01〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開
始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３
分後の４分後の１分間、または３分後と８分後の５分間
における生成されたA2の量または消費されたB1の量を、
それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定
すればよい。例えば、A2がチオNADH、B1がNADHの場合、
A2の生成を400nm付近の吸光度の増加により測定する
か、あるいはB1の消費を340nm付近の吸光度の減少によ
り測定し、既知濃度のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを用いて測定したときの値と比較すれば、被検
体液中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フルクトース量を
リアルタイムで求めることができる。
成物により被検体中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを測定するには、上記成分(1)〜(3)、(1)〜(4)
または(1)〜(3)および(5)を含有する組成物に被検体0.0
01〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開
始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３
分後の４分後の１分間、または３分後と８分後の５分間
における生成されたA2の量または消費されたB1の量を、
それぞれの吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定
すればよい。例えば、A2がチオNADH、B1がNADHの場合、
A2の生成を400nm付近の吸光度の増加により測定する
か、あるいはB1の消費を340nm付近の吸光度の減少によ
り測定し、既知濃度のＤ−ソルビトールまたはＤ−フル
クトースを用いて測定したときの値と比較すれば、被検
体液中のＤ−ソルビトールまたはＤ−フルクトース量を
リアルタイムで求めることができる。
【００５８】また、被検体中にＤ−ソルビートおよびＤ
−フルクトースが共存している場合、本発明の前記定量
法によれば、これらの合計量が定量される。個々の成分
量を定量する場合には、被検体を予めどちらかの成分の
みに作用する酵素により消去する等の前処理をした後、
酵素サイクリング反応に導けばよい。例えば、ヘキソキ
ナーゼ（EC 2.7.1.1) またはフルクトキナーゼ（EC 2.
7.1.4）により前処理を行なえばＤ−フルクトースはＤ
−フルクトース-6-リン酸に転換されるため、ひき続き
本発明による酵素サイリング反応を実施することにより
Ｄ−ソルビトールのみを定量することができる。また、
Ｄ−ソルビトールとＤ−フルクトースの合計量から前記
Ｄ−ソルビトール量を差引くことにより、Ｄ−フルクト
ースのみの定量値を算出することができる。
−フルクトースが共存している場合、本発明の前記定量
法によれば、これらの合計量が定量される。個々の成分
量を定量する場合には、被検体を予めどちらかの成分の
みに作用する酵素により消去する等の前処理をした後、
酵素サイクリング反応に導けばよい。例えば、ヘキソキ
ナーゼ（EC 2.7.1.1) またはフルクトキナーゼ（EC 2.
7.1.4）により前処理を行なえばＤ−フルクトースはＤ
−フルクトース-6-リン酸に転換されるため、ひき続き
本発明による酵素サイリング反応を実施することにより
Ｄ−ソルビトールのみを定量することができる。また、
Ｄ−ソルビトールとＤ−フルクトースの合計量から前記
Ｄ−ソルビトール量を差引くことにより、Ｄ−フルクト
ースのみの定量値を算出することができる。
【００５９】また、本発明の前記定量法は、被検体中の
Ｄ−ソルビトールまたはＤ−フルクトースそのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、該液中の共存物
質の影響を受けにくいため、被検体のブランク測定を省
略できレイトアッセイによる簡便な測定をなしうる。
Ｄ−ソルビトールまたはＤ−フルクトースそのものを酵
素サイクリング反応に導くものであり、該液中の共存物
質の影響を受けにくいため、被検体のブランク測定を省
略できレイトアッセイによる簡便な測定をなしうる。
【００６０】尚、本発明においてはA2またはB1の測定に
当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使用
して定量を行なうこともできる。
当たり、吸光度測定の代わりに他の公知の測定法を使用
して定量を行なうこともできる。
【００６１】
【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらにより何等限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれらにより何等限定されるものではな
い。
【００６２】実施例１ Ｄ−ソルビトールの定量 ＜試薬＞ 100 mM トリエタノールアミン緩衝液（pH8.5） 4 mM チオNAD（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NAD（オリエンタル酵母社製） 500 u/ml ソルビトールデヒドロゲナーゼ（シグマ社
製；ヒツジ肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１m1をキュベットにとり、０、10、20、30、4
0、50μMのＤ−ソルビトール溶液（和光純薬製）をそれ
ぞれ20μl 添加し、37℃にて反応を開始した。反応開始
後の３分目と６分目の400nmにおける吸光度を読み取り
その差を求めた。濃度０を用いた時を試薬ブランクとし
て、それぞれの結果から試薬ブランクの値を差引き、そ
の結果を図１に示した。図１から明らかなように、Ｄ−
ソルビトール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を
示した。
製；ヒツジ肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１m1をキュベットにとり、０、10、20、30、4
0、50μMのＤ−ソルビトール溶液（和光純薬製）をそれ
ぞれ20μl 添加し、37℃にて反応を開始した。反応開始
後の３分目と６分目の400nmにおける吸光度を読み取り
その差を求めた。濃度０を用いた時を試薬ブランクとし
て、それぞれの結果から試薬ブランクの値を差引き、そ
の結果を図１に示した。図１から明らかなように、Ｄ−
ソルビトール量に対する吸光度変化量は良好な直線性を
示した。
【００６３】実施例２ Ｄ−フルクトースの定量 ＜試薬＞ 100 mM トリエタノールアミン緩衝液（pH8.5） 4 mM チオNAD（シグマ社製） 0.2 mM 還元型NADP（オリエンタル酵母社製） 625 u/ml ソルビトールデヒドロゲーゼ（シグマ社
製；ヒツジ肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１m1をキュベットにとり、０、20、40、60、8
0、100μMのＤ−フルクトース溶液（和光純薬社製）を
それぞれ40μｌ添加し、37℃にて反応を開始した。反応
開始後の２分目と７分目の400nmにおける吸光度を読み
取りその差を求めた。濃度０を用いた時を試薬ブランク
として、それぞれの結果から試薬ブランクの値を差引
き、その結果を図２に示した。図２から明らかなよう
に、Ｄ−フルクトース量に対する吸光度変化量は良好な
直線性を示した。
製；ヒツジ肝臓由来） ＜操作＞ 上記試薬１m1をキュベットにとり、０、20、40、60、8
0、100μMのＤ−フルクトース溶液（和光純薬社製）を
それぞれ40μｌ添加し、37℃にて反応を開始した。反応
開始後の２分目と７分目の400nmにおける吸光度を読み
取りその差を求めた。濃度０を用いた時を試薬ブランク
として、それぞれの結果から試薬ブランクの値を差引
き、その結果を図２に示した。図２から明らかなよう
に、Ｄ−フルクトース量に対する吸光度変化量は良好な
直線性を示した。
【００６４】
【発明の効果】前述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生ずることな
く、また酵素サイクリング反応を組合せることにより測
定感度を増大させることができる。その結果、少量の検
体の使用により、簡便かつ精度よく被検体中のＤ−ソル
ビトールまたはＤ−フルクトースを定量することができ
る。
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生ずることな
く、また酵素サイクリング反応を組合せることにより測
定感度を増大させることができる。その結果、少量の検
体の使用により、簡便かつ精度よく被検体中のＤ−ソル
ビトールまたはＤ−フルクトースを定量することができ
る。
【図１】実施例１におけるＤ−ソルビトール量に対する
400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
【図２】実施例２におけるＤ−フルクトース量に対する
400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
400nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 Ｄ−ソルビトールおよびＤ−フルクトー
スからなる群より選ばれる少なくとも一種の被検成分を
含有する被検体に、次の成分(1)〜(3) (1)チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート類（以下チオNADP類という）およびチオニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD類とい
う）からなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類とい
う）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類
（以下NAD類という）からなる群より選ばれる１つとを
補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基質として
Ｄ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソルビトー
ルデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式〔１〕 【化１】 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類またはNAD
類を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオ
NADP類またはチオNAD類のときは還元型NADP類または還
元型NAD類を、またA1がNADP類またはNAD類のときは還元
型チオNADP類または還元型チオNAD類を示し、B2はB1の
酸化型生成物を示す）で表わされるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するA2またはB1の量を
測定することを特徴とするＤ−ソルビトールまたはＤ−
フルクトースの定量法。 - 【請求項２】 NADP類が、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェート（NADP）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルNADP）、
アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェートおよびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオ
チドホスフェート（デアミノNADP）からなる群より選ば
れるものである請求項１記載のＤ−ソルビトールまたは
Ｄ−フルクトースの定量法。 - 【請求項３】 NAD類が、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌク
レオチド（アセチルNAD）、アセチルピリジンヒポキサ
ンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサン
チンジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選
ばれるものである請求項１の記載のＤ−ソルビトールま
たはＤ−フルクトースの定量法。 - 【請求項４】 チオNADP類が、チオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフェート（チオNADP）およびチ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェートからなる群より選ばれるものである請求項１記載
のＤ−ソルビトールまたはＤ−フルクトースの定量法。 - 【請求項５】 チオNAD類が、チオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（チオNAD）およびチオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ば
れるものである請求項１記載のＤ−ソルビトールまたは
Ｄ−フルクトースの定量法。 - 【請求項６】 下記成分(1)〜(3) (1)チオNADP類およびチオNAD類からなる群より選ばれる
１つと、NADP類およびNAD類からなる群より選ばれる１
つとを補酵素とし、少なくともＤ−ソルビトールを基質
としてＤ−フルクトースを生成する可逆反応をなすソル
ビトールデヒドロゲナーゼ (2) A1 (3) B1 を含有することを特徴とするＤ−ソルビトールまたはＤ
−フルクトース定量用組成物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3125901A JP3034986B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | Ｄ−ソルビトール又はｄ−フルクトースの高感度定量法および定量用組成物 |
| PCT/JP1991/001788 WO1992021775A1 (en) | 1991-05-29 | 1991-12-27 | Highly sensitive determination of d-sorbitol or d-fructose and composition therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3125901A JP3034986B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | Ｄ−ソルビトール又はｄ−フルクトースの高感度定量法および定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04349897A JPH04349897A (ja) | 1992-12-04 |
| JP3034986B2 true JP3034986B2 (ja) | 2000-04-17 |
Family
ID=14921715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3125901A Expired - Lifetime JP3034986B2 (ja) | 1991-05-29 | 1991-05-29 | Ｄ−ソルビトール又はｄ−フルクトースの高感度定量法および定量用組成物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3034986B2 (ja) |
| WO (1) | WO1992021775A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005012557A1 (ja) * | 2003-08-04 | 2007-11-22 | 株式会社三和化学研究所 | 赤血球採取方法及びソルビトール測定方法 |
| JP6487711B2 (ja) * | 2015-02-20 | 2019-03-20 | 旭化成ファーマ株式会社 | プリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた、オルトリン酸、アルカリホスファターゼ、及びピロリン酸等の新規な測定方法、並びに組成物 |
-
1991
- 1991-05-29 JP JP3125901A patent/JP3034986B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-27 WO PCT/JP1991/001788 patent/WO1992021775A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1992021775A1 (en) | 1992-12-10 |
| JPH04349897A (ja) | 1992-12-04 |
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