JP3036709B2 - Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents
Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等におけるＬ−グリセロール−３−リン酸またはジ
ヒドロキシアセトンリン酸の酵素サイクリング反応を用
いた新規な高感度定量法および定量用組成物に関する。
検査等におけるＬ−グリセロール−３−リン酸またはジ
ヒドロキシアセトンリン酸の酵素サイクリング反応を用
いた新規な高感度定量法および定量用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、臨床検査分野において、成分分析
には化学法に代わり、より特異性の高い酵素法が普及し
つつある。Ｌ−グリセロール−３−リン酸を測定する方
法としては、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（ＥＣ １．１．３．２１）を用いて、生じた過酸化水
素をペルオキシダーゼ反応等を用いて検出可能な物質に
変換する方法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ホスフエート）（ＮＡＤ（Ｐ））の存在下にグリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．８、ＥＣ １．１．１．９４）を用いて還元型補酵
素の３４０ｎｍにおける吸収を分光学的に測定する方法
等が知られており、これらの方法は、例えば血清中のト
リグリセライドやグリセロールを測定する際に、Ｌ−グ
リセロール−３−リン酸を生成する他の酵素反応系と併
せて、共役反応系として用いられている。
には化学法に代わり、より特異性の高い酵素法が普及し
つつある。Ｌ−グリセロール−３−リン酸を測定する方
法としては、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（ＥＣ １．１．３．２１）を用いて、生じた過酸化水
素をペルオキシダーゼ反応等を用いて検出可能な物質に
変換する方法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ホスフエート）（ＮＡＤ（Ｐ））の存在下にグリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．
１．８、ＥＣ １．１．１．９４）を用いて還元型補酵
素の３４０ｎｍにおける吸収を分光学的に測定する方法
等が知られており、これらの方法は、例えば血清中のト
リグリセライドやグリセロールを測定する際に、Ｌ−グ
リセロール−３−リン酸を生成する他の酵素反応系と併
せて、共役反応系として用いられている。
【０００３】このうち、グリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼは下記の反応を触媒する酵素である。
ドロゲナーゼは下記の反応を触媒する酵素である。
【０００４】
【化２】
【０００５】この反応は、平衡が大きく左側に偏ってい
るため、Ｌ−グリセロール−３−リン酸を定量するとき
のように、正反応の方向に反応を進行させるためには、
反応液のpHを９〜１０のアルカリ側にし、しかも、生成
物であるジヒドロキシアセトンリン酸を反応系から除去
することが必要になる。このためには、反応液にヒドラ
ジンやセミカルバジド等の捕捉剤を加え正反応を促進さ
せなければならない。
るため、Ｌ−グリセロール−３−リン酸を定量するとき
のように、正反応の方向に反応を進行させるためには、
反応液のpHを９〜１０のアルカリ側にし、しかも、生成
物であるジヒドロキシアセトンリン酸を反応系から除去
することが必要になる。このためには、反応液にヒドラ
ジンやセミカルバジド等の捕捉剤を加え正反応を促進さ
せなければならない。
【０００６】また、生成した還元型ＮＡＤ（Ｐ）をジア
ホラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを用いてホルマ
ザン色素とし、測定する方法もあるが、この色素は不溶
性であり、自動分析器には適さない。グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼは、その逆反応を利用して、
ジヒドロキシアセトンリン酸の定量のためにも用いられ
る。この反応系はアルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．１
３）、トリオ−スリン酸イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．
１．１）活性測定等に活用されている。
ホラーゼ、ニトロブルーテトラゾリウムを用いてホルマ
ザン色素とし、測定する方法もあるが、この色素は不溶
性であり、自動分析器には適さない。グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼは、その逆反応を利用して、
ジヒドロキシアセトンリン酸の定量のためにも用いられ
る。この反応系はアルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．１
３）、トリオ−スリン酸イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．
１．１）活性測定等に活用されている。
【０００７】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行われ、
この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象
物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普及し
ているが、これも感度上に限界があり、測定対象物の含
量が少ない場合適さないという欠点があった。そこで、
測定対象物の含量が少ない場合や、測定対象物を含む被
検体が少量の場合等は、分光分析よりも感度の優れた蛍
光分析、発光分析等が行われている。しかしながら、こ
れらの方法も臨床検査等の汎用検査においては、機器の
普及という点からはあまり適したものではなかった。
定しようとする対象物質を分光学的に検出可能な過酸化
水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行われ、
この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定対象
物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定する
方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普及し
ているが、これも感度上に限界があり、測定対象物の含
量が少ない場合適さないという欠点があった。そこで、
測定対象物の含量が少ない場合や、測定対象物を含む被
検体が少量の場合等は、分光分析よりも感度の優れた蛍
光分析、発光分析等が行われている。しかしながら、こ
れらの方法も臨床検査等の汎用検査においては、機器の
普及という点からはあまり適したものではなかった。
【０００８】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる場合、
２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆる酵
素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡＤサイ
クリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリングな
どがあるが、これらの方法は臨床検査等のルーチン分析
においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられていない
のが現状であった。
としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる場合、
２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆる酵
素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡＤサイ
クリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリングな
どがあるが、これらの方法は臨床検査等のルーチン分析
においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられていない
のが現状であった。
【０００９】しかしながら、最近、グリセロール−３−
リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを組合せた、操作の簡便な酵素サイクリン
グ反応によるＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の高感度定量法が報告されてい
るが（特公平２−２０２３９号）、これらは具体的に
は、該サイクリング反応によって減少する還元型ＮＡＤ
の量または増加する過酸化水素量を検出するものであ
り、還元型ＮＡＤの３４０ｎｍにおける吸光度の減少を
分光学的に測定する以外には、別の検出のための反応系
を組み合わせて、これらの変化量を検出しなければなら
ない。
リン酸オキシダーゼ及びグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼを組合せた、操作の簡便な酵素サイクリン
グ反応によるＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の高感度定量法が報告されてい
るが（特公平２−２０２３９号）、これらは具体的に
は、該サイクリング反応によって減少する還元型ＮＡＤ
の量または増加する過酸化水素量を検出するものであ
り、還元型ＮＡＤの３４０ｎｍにおける吸光度の減少を
分光学的に測定する以外には、別の検出のための反応系
を組み合わせて、これらの変化量を検出しなければなら
ない。
【００１０】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができ
る。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を
増やすことも可能である。更に、検体が人血液である場
合などは、採血量を減らすことができるため、被採血者
への心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の
減少により環境汚染を軽減することに貢献することにも
なる。
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができ
る。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を
増やすことも可能である。更に、検体が人血液である場
合などは、採血量を減らすことができるため、被採血者
への心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の
減少により環境汚染を軽減することに貢献することにも
なる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】前述のごとくＬ−グリ
セロール−３−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸
の酵素を用いた測定について種々の方法が知られてお
り、酵素サイクリング法による高感度な測定法も報告さ
れているが、それらの欠点を有さない更に簡便で高感度
な方法が望まれている。
セロール−３−リン酸及びジヒドロキシアセトンリン酸
の酵素を用いた測定について種々の方法が知られてお
り、酵素サイクリング法による高感度な測定法も報告さ
れているが、それらの欠点を有さない更に簡便で高感度
な方法が望まれている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、Ｌ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の定量におい
て、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下、チオＮＡＤ類という）およびチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート類（以下、チオＮＡ
ＤＰ類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類と
いう）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）からなる群よ
り選ばれた一つの補酵素に作用するグリセロール−３−
リン酸デヒロゲナーゼおよびチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡ
Ｄ（Ｐ）類との２種類の補酵素を用いることにより、サ
イクリング反応を形成せしめることを見出し、かつその
反応における吸光度の測定に際し、ＮＡＤ（Ｐ）類のア
ナログであるチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類の還
元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ付
近と異なつていることを利用し、他物質の吸収波長の混
雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、高感
度な測定が可能であることを確認し、本発明を完成する
に至った。
題点につき鋭意検討した結果、Ｌ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の定量におい
て、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以
下、チオＮＡＤ類という）およびチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート類（以下、チオＮＡ
ＤＰ類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類と
いう）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スフエート類（以下、ＮＡＤＰ類という）からなる群よ
り選ばれた一つの補酵素に作用するグリセロール−３−
リン酸デヒロゲナーゼおよびチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡ
Ｄ（Ｐ）類との２種類の補酵素を用いることにより、サ
イクリング反応を形成せしめることを見出し、かつその
反応における吸光度の測定に際し、ＮＡＤ（Ｐ）類のア
ナログであるチオＮＡＤ（Ｐ）類とＮＡＤ（Ｐ）類の還
元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎｍ付
近と異なつていることを利用し、他物質の吸収波長の混
雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、高感
度な測定が可能であることを確認し、本発明を完成する
に至った。
【００１３】即ち、グリセロール−３−リンデヒドロゲ
ナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに当
り、上記二種類の補酵素の一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類を
使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別定
量するものであり、その結果、Ｌ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を高感度の測
定できるものである。
ナーゼを用いた酵素サイクリング反応を実施するに当
り、上記二種類の補酵素の一つにチオＮＡＤ（Ｐ）類を
使用して、どちらか一方の補酵素の変化量のみを分別定
量するものであり、その結果、Ｌ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を高感度の測
定できるものである。
【００１４】本発明は、上記のような知見に基づいて完
成されたものであって、Ｌ−グリセロール−３−リン酸
またはジヒドロキシアセトンリン酸を含有する被検液
に、 （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チオド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれ
る一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
成されたものであって、Ｌ−グリセロール−３−リン酸
またはジヒドロキシアセトンリン酸を含有する被検液
に、 （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チオド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれ
る一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式
【００１５】
【化３】
【００１６】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイ
クリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ
２またはＢ１の量を測定することを特徴とするＬ−グリ
セロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン
酸の高感度定量法を提供するものである。
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）で表されるサイ
クリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ
２またはＢ１の量を測定することを特徴とするＬ−グリ
セロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン
酸の高感度定量法を提供するものである。
【００１７】更にまた本発明は、次の成分（１）〜
（３） （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれ
た一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 （但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有する
ことを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸の定量用組成物を提供する
ものである。
（３） （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下チオＮＡＤＰ類という）及びチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下チオＮＡＤ
類という）からなる群より選ばれた一つと、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以下ＮＡ
ＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれ
た一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセロール−
３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトンリン酸を
生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 （但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有する
ことを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸の定量用組成物を提供する
ものである。
【００１８】本発明において用いられる、グリセロール
−３−リン酸デヒドロゲナーゼとは少なくともＬ−グリ
セロール−３−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ＝ジヒドロキシ
アセトンリン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+ なる反応を触媒
するものであって、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類
からなる群より選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡ
Ｄ類からなる群より選ばれた一つを補酵素とするものな
ら特に限定されない。
−３−リン酸デヒドロゲナーゼとは少なくともＬ−グリ
セロール−３−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）+ ＝ジヒドロキシ
アセトンリン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ+ なる反応を触媒
するものであって、チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類
からなる群より選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡ
Ｄ類からなる群より選ばれた一つを補酵素とするものな
ら特に限定されない。
【００１９】本酵素の具体例としては、ウサギ筋肉やサ
ツカロミセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）等に由
来するＮＡＤに特異的な酵素（ＥＣ １．１．１．８）
と、ＮＡＤおよびＮＡＤＰ両方の補酵素に作用する大腸
菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の酵素（ＥＣ １．１．１．９
４）が知られている（酵素ハンドブツク、ｐ３、ｐ３
５、朝倉書店（１９８３）。このうち、ウサギ筋肉由来
の酵素は例えば、ベーリンガーマンハイム社、シグマ社
より市販されており、補酵素に対する相対活性は１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）ではＮＡＤを用い
た時を１００％とすると、チオＮＡＤで２％程度であ
り、ＮＡＤＰには作用しなかった。
ツカロミセス カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）等に由
来するＮＡＤに特異的な酵素（ＥＣ １．１．１．８）
と、ＮＡＤおよびＮＡＤＰ両方の補酵素に作用する大腸
菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の酵素（ＥＣ １．１．１．９
４）が知られている（酵素ハンドブツク、ｐ３、ｐ３
５、朝倉書店（１９８３）。このうち、ウサギ筋肉由来
の酵素は例えば、ベーリンガーマンハイム社、シグマ社
より市販されており、補酵素に対する相対活性は１００
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）ではＮＡＤを用い
た時を１００％とすると、チオＮＡＤで２％程度であ
り、ＮＡＤＰには作用しなかった。
【００２０】ＮＡＤＰについては、逆反応で１０％程度
の活性を示すという報告もある（臨床酵素ハンドブツ
ク、ｐ２６０、講談社（１９８２））。他の起源の酵素
についても適宜の系に使用可能であり、使用する酵素の
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する特
異性としては、基質であるＬ−グリセロール−３−リン
酸に対して反応性を有するものであればよく、そのよう
な酵素の性質はこれら補酵素と基質を用いて確認できる
ものである。
の活性を示すという報告もある（臨床酵素ハンドブツ
ク、ｐ２６０、講談社（１９８２））。他の起源の酵素
についても適宜の系に使用可能であり、使用する酵素の
補酵素ＮＡＤ（Ｐ）類、チオＮＡＤ（Ｐ）類に対する特
異性としては、基質であるＬ−グリセロール−３−リン
酸に対して反応性を有するものであればよく、そのよう
な酵素の性質はこれら補酵素と基質を用いて確認できる
ものである。
【００２１】又、Ａ１およびＢ２で示される補酵素はチ
オＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を
示すが、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、
例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチドホスフエート、およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げ
られる。
オＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤＰ類、ＮＡＤ類を
示すが、チオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ類としては、
例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチドホスフエート、およびチオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チ
オニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドが挙げ
られる。
【００２２】又、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類としては、
例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、ニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエー
ト（デアミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
ヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられ
る。
例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチドホスフエート（アセチルＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエート、ニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフエー
ト（デアミノＮＡＤＰ）；及びニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニン
ジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジン
ヒポキサンチンジヌクレオチド、ニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）が挙げられ
る。
【００２３】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ１の
関係において一つのチオ型補酵素を使用するものであ
る。又、定量に用いるグリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合
は、上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いる
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）
ＮＡＤＰ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡ
ＤＰ類及びＮＡＤＰ類より、また用いるグリセロール−
３−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び
（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合は、上述の
チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類お
よびＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。
１がチオＮＡＤ（Ｐ）類である場合、Ｂ１はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ類であることが必要であり、Ａ１およびＢ１の
関係において一つのチオ型補酵素を使用するものであ
る。又、定量に用いるグリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類のみを補酵素とする場合
は、上述のチオＮＡＤ類とＮＡＤ類より、また、用いる
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）
ＮＡＤＰ類のみを補酵素とする場合は、上述のチオＮＡ
ＤＰ類及びＮＡＤＰ類より、また用いるグリセロール−
３−リン酸デヒドロゲナーゼが（チオ）ＮＡＤ類及び
（チオ）ＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合は、上述の
チオＮＡＤ類およびチオＮＡＤＰ類と上述のＮＡＤ類お
よびＮＡＤＰ類より適宜選択して用いればよい。
【００２４】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されているＬ−グリセロール−３−リ
ン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測定すること
ができるが、更に、これらの物質を遊離または生成する
酵素系における基質や、その酵素活性を測定することも
できる。更に、本発明の高感度定量法を用いれば、上記
のようなＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロ
キシアセトンリン酸を遊離、または生成する酵素系と連
結し得る、単一の、もしくは複数の工程からなる酵素系
における基質や、その酵素活性をも測定することができ
る。これらの酵素系は、特に限定されるものではない
が、例えば以下に示す種々の酵素の反応系が挙げられ
る。
中にもともと含有されているＬ−グリセロール−３−リ
ン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測定すること
ができるが、更に、これらの物質を遊離または生成する
酵素系における基質や、その酵素活性を測定することも
できる。更に、本発明の高感度定量法を用いれば、上記
のようなＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロ
キシアセトンリン酸を遊離、または生成する酵素系と連
結し得る、単一の、もしくは複数の工程からなる酵素系
における基質や、その酵素活性をも測定することができ
る。これらの酵素系は、特に限定されるものではない
が、例えば以下に示す種々の酵素の反応系が挙げられ
る。
【００２５】Ｌ−グリセロール−３−リン酸を遊離生成
する酵素反応系： （１）ＡＴＰ、グリセロールとグリセロキナーゼ（ＥＣ
２．７．１．３０）の酵素反応系によって遊離、生成
するＬ−グリセロール−３−リン酸を定量するためのも
の。 グリセロール＋ＡＴＰ→Ｌ−グリセロール−３−リン酸
＋ＡＤＰ （２）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロールが
ホスフアチジルグリセロールとホスホリパーゼＤ（ＥＣ
３．１．４．４）の酵素反応系由来である場合 ホスフアチジルグリセロール＋Ｈ2 Ｏ→グリセロール＋
ホスフアチジン酸 （３）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロール
が、モノ、ジまたはトリグリセライドとリパーゼ（ＥＣ
３．１．１．３）の酵素反応系由来である場合
する酵素反応系： （１）ＡＴＰ、グリセロールとグリセロキナーゼ（ＥＣ
２．７．１．３０）の酵素反応系によって遊離、生成
するＬ−グリセロール−３−リン酸を定量するためのも
の。 グリセロール＋ＡＴＰ→Ｌ−グリセロール−３−リン酸
＋ＡＤＰ （２）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロールが
ホスフアチジルグリセロールとホスホリパーゼＤ（ＥＣ
３．１．４．４）の酵素反応系由来である場合 ホスフアチジルグリセロール＋Ｈ2 Ｏ→グリセロール＋
ホスフアチジン酸 （３）上記（１）の酵素反応系におけるグリセロール
が、モノ、ジまたはトリグリセライドとリパーゼ（ＥＣ
３．１．１．３）の酵素反応系由来である場合
【００２６】 グリセライド＋ｎＨ2 Ｏ→ｎ脂肪酸＋グリセロール （４）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、クレ
アチンリン酸、ＡＤＰとクレアチンキナーゼ（ＥＣ
２．７．３．２）の酵素反応系由来である場合 クレアチンリン酸＋ＡＤＰ→クレアチン＋ＡＴＰ （５）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、ホス
フオエノールピルビン酸、ＡＤＰとピルビン酸キナーゼ
（ＥＣ ２．７．１．４０）の酵素反応系由来である場
合 ホスフオエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋Ａ
ＴＰ （６）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、アセ
チルリン酸、ＡＤＰと酢酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．
２．１）の酵素反応系である場合
アチンリン酸、ＡＤＰとクレアチンキナーゼ（ＥＣ
２．７．３．２）の酵素反応系由来である場合 クレアチンリン酸＋ＡＤＰ→クレアチン＋ＡＴＰ （５）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、ホス
フオエノールピルビン酸、ＡＤＰとピルビン酸キナーゼ
（ＥＣ ２．７．１．４０）の酵素反応系由来である場
合 ホスフオエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋Ａ
ＴＰ （６）上記（１）の酵素反応系におけるＡＴＰが、アセ
チルリン酸、ＡＤＰと酢酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．
２．１）の酵素反応系である場合
【００２７】アセチルリン酸＋ＡＤＰ→酢酸＋ＡＴＰ（７）１−アシルグリセロール−３−リン酸、ＣｏＡと
グリセロリン酸アシルトランスフエラーゼ（ＥＣ ２．
３．１．１５）の酵素反応系によって遊離、生成するＬ
−グリセロール−３−リン酸を定量するためのもの 。１−アシルグリセロール−３−リン酸＋ＣｏＡ→アシル
−ＣｏＡ＋Ｌ−グリセロール−３−リン酸 （８）Ｌ−グリセロール−３−ホスホコリンとグリセロ
ホスホコリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．
４．２）の酵素反応系によって遊離、生成するＬ−グリ
セロール−３−リン酸を定量するためのもの。 Ｌ−グリセロール−３−ホスホコリン＋Ｈ 2 Ｏ→Ｌ−グ
リセロール−３−リン酸＋コリン （９）上記（８）の酵素反応系におけるＬ−グリセロー
ル−３−ホスホコリンがリゾレシチンとリゾホスホリパ
ーゼ（ＥＣ ３．１．１．５）の酵素反応系由来である
場合。 リゾレシチン＋Ｈ2 Ｏ→Ｌ−グリセロール−３−ホスホ
コリン＋脂肪酸
グリセロリン酸アシルトランスフエラーゼ（ＥＣ ２．
３．１．１５）の酵素反応系によって遊離、生成するＬ
−グリセロール−３−リン酸を定量するためのもの 。１−アシルグリセロール−３−リン酸＋ＣｏＡ→アシル
−ＣｏＡ＋Ｌ−グリセロール−３−リン酸 （８）Ｌ−グリセロール−３−ホスホコリンとグリセロ
ホスホコリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．
４．２）の酵素反応系によって遊離、生成するＬ−グリ
セロール−３−リン酸を定量するためのもの。 Ｌ−グリセロール−３−ホスホコリン＋Ｈ 2 Ｏ→Ｌ−グ
リセロール−３−リン酸＋コリン （９）上記（８）の酵素反応系におけるＬ−グリセロー
ル−３−ホスホコリンがリゾレシチンとリゾホスホリパ
ーゼ（ＥＣ ３．１．１．５）の酵素反応系由来である
場合。 リゾレシチン＋Ｈ2 Ｏ→Ｌ−グリセロール−３−ホスホ
コリン＋脂肪酸
【００２８】ジヒドロキシアセトンリン酸を遊離、生成
する酵素反応系： （１０）フルクトース１，６−ジリン酸とフルクトース
ジリン酸アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．１３）の酵
素反応系によって遊離、生成するジヒドロキシアセトン
リン酸を定量するためのもの フルクトース−１，６−ジリン酸→Ｄ−グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸＋ジヒドロキシアセトンリン酸 （１１）Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とトリオ
ースホスフエートイソメラーゼ（ＥＣ ５．３．１．
１）の酵素反応系由来である場合
する酵素反応系： （１０）フルクトース１，６−ジリン酸とフルクトース
ジリン酸アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．１３）の酵
素反応系によって遊離、生成するジヒドロキシアセトン
リン酸を定量するためのもの フルクトース−１，６−ジリン酸→Ｄ−グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸＋ジヒドロキシアセトンリン酸 （１１）Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とトリオ
ースホスフエートイソメラーゼ（ＥＣ ５．３．１．
１）の酵素反応系由来である場合
【００２９】Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸→ジ
ヒドロキシアセトンリン酸（１２）ジヒドロキシアセトン、ＡＴＰとグリセロキナ
ーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０）の酵素反応系によって
遊離、生成するジヒドロキシアセトンリン酸を定量する
ためのもの。 ジヒドロキシアセトン＋ＡＴＰ→ジヒドロキシアセトン
リン酸＋ＡＤＰ （１３）上記（１）のＤ−グリセロアルデヒド−３−リ
ン酸がＤ−グリセロアルデヒド、ＡＴＰとトリオキナー
ゼ（ＥＣ ２．７．１．２８）の酵素反応系由来である
場合。 Ｄ−グリセロアルデヒド＋ＡＴＰ→Ｄ−グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸＋ＡＤＰ
ヒドロキシアセトンリン酸（１２）ジヒドロキシアセトン、ＡＴＰとグリセロキナ
ーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０）の酵素反応系によって
遊離、生成するジヒドロキシアセトンリン酸を定量する
ためのもの。 ジヒドロキシアセトン＋ＡＴＰ→ジヒドロキシアセトン
リン酸＋ＡＤＰ （１３）上記（１）のＤ−グリセロアルデヒド−３−リ
ン酸がＤ−グリセロアルデヒド、ＡＴＰとトリオキナー
ゼ（ＥＣ ２．７．１．２８）の酵素反応系由来である
場合。 Ｄ−グリセロアルデヒド＋ＡＴＰ→Ｄ−グリセロアルデ
ヒド−３−リン酸＋ＡＤＰ
【００３０】Ａ１およびＢ１の量は被検体中のＬ−グリ
セロール−３−リン酸とヒドロキシアセトンリン酸の合
計量に比較して過剰量であること、かつグリセロール−
３−リン酸デヒドロゲナーゼのＡ１及びＢ１それぞれに
対するKm値に比較して過剰量であることが必要であり、
特にＬ−グリセロール−３−リン酸とジヒドロキシアセ
トンリン酸の合計量の２０〜１００００倍モルが好まし
い。
セロール−３−リン酸とヒドロキシアセトンリン酸の合
計量に比較して過剰量であること、かつグリセロール−
３−リン酸デヒドロゲナーゼのＡ１及びＢ１それぞれに
対するKm値に比較して過剰量であることが必要であり、
特にＬ−グリセロール−３−リン酸とジヒドロキシアセ
トンリン酸の合計量の２０〜１００００倍モルが好まし
い。
【００３１】本発明のＬ−グリセロール−３−リン酸ま
たはジヒドロキシアセトンリン酸定量用組成物において
は、Ａ１及びＢ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に
０．０５〜２０ｍＭが好ましく、グリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの量は１０〜１０００ｕ／ml、特
に２０〜４００ｕ／mlが好ましいが、その量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。
たはジヒドロキシアセトンリン酸定量用組成物において
は、Ａ１及びＢ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特に
０．０５〜２０ｍＭが好ましく、グリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの量は１０〜１０００ｕ／ml、特
に２０〜４００ｕ／mlが好ましいが、その量は被検体の
種類等により適宜決定することができ、これ以上の量を
用いることもできる。
【００３２】また本発明にはその変形例として、以下の
方法も包含するものである。即ち、本発明はＬ−グリセ
ロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸
を含有する被検液に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１または／およびＢ２、 （４）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２
からＢ１への反応を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬
を作用せしめて、次の反応式
方法も包含するものである。即ち、本発明はＬ−グリセ
ロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸
を含有する被検液に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１または／およびＢ２、 （４）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２
からＢ１への反応を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬
を作用せしめて、次の反応式
【００３３】
【化４】
【００３４】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応
はＢ２を補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１
を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反
応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２の量を測
定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸
またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法であ
る。
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を、Ｂ
２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反応
はＢ２を補酵素として第二のデヒドロゲナーゼにてＢ１
を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリング反
応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２の量を測
定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸
またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法であ
る。
【００３５】本発明に包含される上記の方法において
は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡ
Ｄ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合、２つの補
酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との
組合せ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類との組合せを選んだときには、被検体に（４）成
分のＬ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２か
らＢ１への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼ及び
該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることに
より、後記反応式（II）のごとく、Ｂ１とＢ２の間にＢ
１の再生のための反応系を付与せしめることにより当該
サイクリング反応を形成させるのである。
は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡ
Ｄ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とする場合、２つの補
酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との
組合せ、またはチオＮＡＤＰ類とＮＡＤ類もしくはＮＡ
ＤＰ類との組合せを選んだときには、被検体に（４）成
分のＬ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２か
らＢ１への反応を形成する第二のデヒドロゲナーゼ及び
該第二のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることに
より、後記反応式（II）のごとく、Ｂ１とＢ２の間にＢ
１の再生のための反応系を付与せしめることにより当該
サイクリング反応を形成させるのである。
【００３６】この場合、第二のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＡ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ａ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができる。定量に際して
は反応により生成したＡ２の量を測定する。
ては、この測定系において実質的にＡ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ａ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ａ１とＢ２の量的関係により第二のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＡ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができる。定量に際して
は反応により生成したＡ２の量を測定する。
【００３７】
【化５】
【００３８】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型Ｎ
ＡＤ類を、Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、
Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反
応はＢ２を補酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示
す）
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はＮＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型Ｎ
ＡＤ類を、Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示し、
Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ｂ２からＢ１への反
応はＢ２を補酵素としてＢ１を生成する酵素反応を示
す）
【００３９】上記の成分（４）を用いるＬ−グリセロー
ル−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸定量
用組成物において、Ａ１の濃度は０．０２〜１００ｍ
Ｍ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／
及びＢ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５
００μＭが好ましい。Ｌ−グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ml、特に２
０〜５００ｕ／mlが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼ
はＢ２に対するKm値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ml単
位）以上になるように調製すればよく、例えば１〜１０
０ｕ／mlが好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの基
質は過剰量、例えば０．０５〜２０mMが好ましい。これ
らの量は被検体の種類等により適宜決定することがで
き、これ以上の量を用いることもできる。
ル−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸定量
用組成物において、Ａ１の濃度は０．０２〜１００ｍ
Ｍ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ｂ２または／
及びＢ１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５
００μＭが好ましい。Ｌ−グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ml、特に２
０〜５００ｕ／mlが好ましく、第二のデヒドロゲナーゼ
はＢ２に対するKm値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ml単
位）以上になるように調製すればよく、例えば１〜１０
０ｕ／mlが好ましく、また第二のデヒドロゲナーゼの基
質は過剰量、例えば０．０５〜２０mMが好ましい。これ
らの量は被検体の種類等により適宜決定することがで
き、これ以上の量を用いることもできる。
【００４０】第二のデヒドロゲナーゼはＢ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。又、Ｂ１の代わりにＢ２あるいは
Ｂ１とＢ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。この
場合、Ｂ１または／及びＢ２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以下が
好ましい。
めに補助的に添加するものであり、これによってＢ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＢ１が高価
な場合は有効である。又、Ｂ１の代わりにＢ２あるいは
Ｂ１とＢ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。この
場合、Ｂ１または／及びＢ２の使用量は特に限定される
ものではないが、一般的にはＡ１の１／１０モル以下が
好ましい。
【００４１】第二のデヒドロゲナーゼ及びその基質とし
ては、例えばＢ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリセロ
ール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１
１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ
酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．
Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン
酸が挙げられる。
ては、例えばＢ２がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のとき
は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．
１）とエタノール、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ １．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とグリセロ
ール、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１
１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ
酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、Ｅ．
Ｃｏｌｉ由来）とＤ−グリセロアルデヒドリン酸とリン
酸が挙げられる。
【００４２】また、Ｂ２がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（酵母由来）とグルコー
ス−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソク
エン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｘａｌａ
ｔｉｃｕｓ由来）、ＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）
（ラツト肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホ
スホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン
酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（酵母由来）とグルコー
ス−６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．４２）（酵母、ブタ心筋由来）とイソク
エン酸、グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
２．１．１７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｘａｌａ
ｔｉｃｕｓ由来）、ＣｏＡとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）
（ラツト肝、ビール酵母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と６−ホ
スホ−Ｄ−グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）とＤ−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン
酸、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．
２．１．７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
【００４３】さらに、本発明の別の変形例としては、以
下の各方法もまた本発明に包含される。即ち、本発明は
Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセ
トンリン酸を含有する被検液に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１または／およびＡ２、 （３）Ｂ１、 （５）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ａ２
からＡ１への反応を形成する第三のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬
を作用せしめて、次の反応式（III ）
下の各方法もまた本発明に包含される。即ち、本発明は
Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセ
トンリン酸を含有する被検液に、 （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１または／およびＡ２、 （３）Ｂ１、 （５）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ａ２
からＡ１への反応を形成する第三のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、を含有する試薬
を作用せしめて、次の反応式（III ）
【００４４】
【化６】
【００４５】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１へ
の反応はＡ２を補酵素として第三のデヒドロゲナーゼに
てＡ１を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリ
ング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＢ１の
量を測定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量
法である。
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１へ
の反応はＡ２を補酵素として第三のデヒドロゲナーゼに
てＡ１を生成する酵素反応を示す）で表されるサイクリ
ング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＢ１の
量を測定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量
法である。
【００４６】更に、本発明は次の成分（１）〜（４） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１または／およびＢ２、 （４）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２
からＢ１への反応を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１または／およびＢ２、 （４）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ｂ２
からＢ１への反応を形成する第二のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第二のデヒドロゲナーゼの基質、
【００４７】（但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有すること
を特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有すること
を特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。
【００４８】更にまた、本発明は次の成分（１）〜
（３）および（５） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１または／およびＡ２、 （３）Ｂ１、 （５）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ａ２
からＡ１への反応を形成する第三のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、
（３）および（５） （１）チオＮＡＤＰ類及びチオＮＡＤ類からなる群より
選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリセ
ロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセトン
リン酸を生成する可逆反応をなすＬ−グリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１または／およびＡ２、 （３）Ｂ１、 （５）Ｌ−グリセロール−３−リン酸に作用せず、Ａ２
からＡ１への反応を形成する第三のデヒドゲロゲナーゼ
及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質、
【００４９】（但し、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有すること
を特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは
還元型チオＮＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す）を含有すること
を特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒ
ドロキシアセトンリン酸の定量用組成物である。
【００５０】上記した本発明に包含される測定方法、定
量組成物においては、グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とす
る場合、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしく
はＮＡＤＰ類との組合せ、または、チオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せを選んだときに
は、被検体に（５）成分のＬ−グリセロール−３−リン
酸に作用せず、Ａ２からＡ１への反応を形成する第三の
デヒドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質
を作用せしめることにより、後記反応式（III ）のごと
く、Ａ１とＡ２の間にＡ１の再生のための反応系を付与
せしめることにより当該サイクリング反応を形成させる
のである。
量組成物においては、グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼがＮＡＤ類及びＮＡＤＰ類を共に補酵素とす
る場合、２つの補酵素にチオＮＡＤ類とＮＡＤ類もしく
はＮＡＤＰ類との組合せ、または、チオＮＡＤＰ類とＮ
ＡＤ類もしくはＮＡＤＰ類との組合せを選んだときに
は、被検体に（５）成分のＬ−グリセロール−３−リン
酸に作用せず、Ａ２からＡ１への反応を形成する第三の
デヒドロゲナーゼ及び該第三のデヒドロゲナーゼの基質
を作用せしめることにより、後記反応式（III ）のごと
く、Ａ１とＡ２の間にＡ１の再生のための反応系を付与
せしめることにより当該サイクリング反応を形成させる
のである。
【００５１】この場合、第三のデヒドロゲナーゼに関し
ては、この測定系において実質的にＢ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ｂ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ｂ１とＡ２の量的関係により第三のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＢ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができ、定量に際しては
Ｂ１の消費量を測定する。
ては、この測定系において実質的にＢ１に作用し得ない
条件を設定することが好ましく、そのためには、例えば
Ｂ１を本質的に補酵素として利用しない酵素を選択する
組合せ、Ｂ１とＡ２の量的関係により第三のデヒドロゲ
ナーゼが実質的にＢ１に作用しない条件を選択する組合
せ等により条件を設定することができ、定量に際しては
Ｂ１の消費量を測定する。
【００５２】
【化７】
【００５３】（式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡ
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はＮＡＤＰ類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のとき
は還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１へ
の反応はＡ２を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を
示す）
Ｄ類、ＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の
還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類また
はＮＡＤＰ類のときは還元型チオＮＡＤ類または還元型
ＮＡＤ類を、Ａ１がチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類のとき
は還元型チオＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤＰ類を示
し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示し、Ａ２からＡ１へ
の反応はＡ２を補酵素としてＡ１を生成する酵素反応を
示す）
【００５４】この成分（５）を用いるＬ−グリセロール
−３−リン酸またはジドロキシアセトンリン酸定量用組
成物において、Ｂ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特
に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２または／及びＡ
１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μ
Ｍが好ましい。
−３−リン酸またはジドロキシアセトンリン酸定量用組
成物において、Ｂ１の濃度は０．０２〜１００ｍＭ、特
に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、Ａ２または／及びＡ
１の濃度は０．０５〜５０００μＭ、特に５〜５００μ
Ｍが好ましい。
【００５５】グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ml、特に２０〜５００ｕ
／mlが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ２に対す
るKm値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ml単位）以上にな
るように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ／mlが好
ましく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、
例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましく、また第三のデヒ
ドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍ
Ｍが好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜
決定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。
ゼの濃度は１０〜１０００ｕ／ml、特に２０〜５００ｕ
／mlが好ましく、第三のデヒドロゲナーゼはＡ２に対す
るKm値（ｍＭ単位）の２０倍量（ｕ／ml単位）以上にな
るように調製すればよく、例えば１〜１００ｕ／mlが好
ましく、また第三のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、
例えば０．０５〜２０ｍＭが好ましく、また第三のデヒ
ドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば０．０５〜２０ｍ
Ｍが好ましい。これらの量は被検体の種類等により適宜
決定することができ、これ以上の量を用いることもでき
る。
【００５６】第三のデヒドロゲナーゼはＡ１の再生のた
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価
な場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２ある
いはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。
この場合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＢ１／１０モル以下が
好ましい。
めに補助的に添加するものであり、これによってＡ１の
使用量を少なくすることが可能となり、特にＡ１が高価
な場合には有効である。また、Ａ１の代わりにＡ２ある
いはＡ１とＡ２の混合物を用いて反応を行ってもよい。
この場合、Ａ１または／及びＡ２の使用量は特に限定さ
れるものではないが、一般的にはＢ１／１０モル以下が
好ましい。
【００５７】第三のデヒドロゲナーゼの基質としては、
例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）
とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒ
ドロキシアセトン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオキ
ザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵
母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリ
セリン酸が挙げられる。
例えば、Ａ１がＮＡＤ類またはチオＮＡＤ類のときは、
アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１）
とアセトアルデヒド、グリセロールデヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．６）（Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）とジヒ
ドロキシアセトン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ
１．１．１．３７）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオキ
ザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（ＥＣ １．１．１．１２）（ウサギ骨格筋、肝、酵
母、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリ
セリン酸が挙げられる。
【００５８】また、Ａ１がＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（酵母由来）とグルコノ
ラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げ
られる。
Ｐ類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＥＣ １．１．１．４９）（酵母由来）とグルコノ
ラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１３）（植物葉緑体
由来）と１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げ
られる。
【００５９】反応液組成については、使用するグリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相
対活性等を考慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後
正反応／逆反応の至適pH条件を酵素サイクリング反応が
効率よく進行するように設定すればよい。これら使用す
る酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせ
て用いてもよい。
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの各種補酵素間の相
対活性等を考慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後
正反応／逆反応の至適pH条件を酵素サイクリング反応が
効率よく進行するように設定すればよい。これら使用す
る酵素は単独でも、あるいは適宜２種以上を組み合わせ
て用いてもよい。
【００６０】斯くして、調製された本発明のＬ−グリセ
ロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸
定量用組成物によって被検体中のＬ−グリセロール−３
−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測定する
には、上記成分（１）〜（３）、（１）〜（４）、ある
いは（１）〜（３）及び（５）を含有する組成物に被検
体０．００１〜０．５mlを加え、約３７℃の温度にて反
応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十
分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分後と
８分後の５分間における生成されたＡ２の量または消費
されたＢ１の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度
の変化によって測定すればよい。
ロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸
定量用組成物によって被検体中のＬ−グリセロール−３
−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸を測定する
には、上記成分（１）〜（３）、（１）〜（４）、ある
いは（１）〜（３）及び（５）を含有する組成物に被検
体０．００１〜０．５mlを加え、約３７℃の温度にて反
応させ、反応開始一定時間後の２点間の数分ないし数十
分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分後と
８分後の５分間における生成されたＡ２の量または消費
されたＢ１の量を、それぞれの吸収波長に基づく吸光度
の変化によって測定すればよい。
【００６１】例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１がＮＡ
ＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増
加により測定するか、あるいはＢ１の消費量を３４０ｎ
ｍ付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のＬ−グ
ルセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリ
ン酸を用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中
のＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシア
セトンリン酸量をリアルタイムで求めることができる。
ＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増
加により測定するか、あるいはＢ１の消費量を３４０ｎ
ｍ付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度のＬ−グ
ルセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリ
ン酸を用いて測定したときの値と比較すれば、被検液中
のＬ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシア
セトンリン酸量をリアルタイムで求めることができる。
【００６２】また、本発明定量法は、被検体中のＬ−グ
リセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリ
ン酸そのもを酵素サイクリング反応に導くものであり、
被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液の
ブランク測定を省略することができ、レイトアツセイに
よる簡便な測定を成し得る。尚、本発明においてはＡ２
またはＢ１の測定に当り、吸光度測定の代わりに他の公
知の測定法を使用して定量を行うことができる。
リセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリ
ン酸そのもを酵素サイクリング反応に導くものであり、
被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液の
ブランク測定を省略することができ、レイトアツセイに
よる簡便な測定を成し得る。尚、本発明においてはＡ２
またはＢ１の測定に当り、吸光度測定の代わりに他の公
知の測定法を使用して定量を行うことができる。
【００６３】
【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、ま
た、酵素サイクリング反応を組合せることによつて感度
を増大させることができるため、少量の検体で迅速かつ
正確に被検体中のＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸を定量することができる。
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、ま
た、酵素サイクリング反応を組合せることによつて感度
を増大させることができるため、少量の検体で迅速かつ
正確に被検体中のＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸を定量することができる。
【００６４】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例 １ Ｌ−グリセロール−３−リン酸の定量 ＜反応液＞ ４０ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ４ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製） ０．１ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） ２ ｍＭ ＥＤＴＡ ２００ｕ／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー 社製：ウサギ筋肉由来）
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例 １ Ｌ−グリセロール−３−リン酸の定量 ＜反応液＞ ４０ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ４ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製） ０．１ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） ２ ｍＭ ＥＤＴＡ ２００ｕ／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー 社製：ウサギ筋肉由来）
【００６５】＜操作＞ 上記試薬１mlをキユベツトにとり、０、２０、４０、６
０、８０、１００μＭのＬ−グリセロール−３−リン酸
（ベーリンガー社製）溶液をそれぞれ２０μl添加し、
３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と５分
目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求
めた。その結果を図１に示した。図１から明らかなよう
に、Ｌ−グリセロール−３−リン酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
０、８０、１００μＭのＬ−グリセロール−３−リン酸
（ベーリンガー社製）溶液をそれぞれ２０μl添加し、
３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と５分
目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求
めた。その結果を図１に示した。図１から明らかなよう
に、Ｌ−グリセロール−３−リン酸量に対する吸光度変
化量は良好な直線性を示した。
【００６６】実施例 ２ グリセロールの定量 ＜反応液（１）＞ ２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） １ ｍＭ ＡＴＰ（シグマ社製） １ ｍＭ 塩化マグネシウム ０．３ｕ／ml グリセロールキナーゼ（東洋醸造社製：ストレプトマイセス カナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ）由来）
【００６７】 ＜反応液（２）＞ １００ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ８ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製） ０．２ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） ５ ｍＭ ＥＤＴＡ ４００ｕ／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー 社製：ウサギ筋肉由来）
【００６８】＜操作＞ 上記の反応液（１）０．５mlをキユベツトにとり、０、
２０、４０、６０、８０、１００μＭのグリセロール溶
液をそれぞれ２０μl 添加し、３７℃に加温した。グリ
セロール添加後２分目に反応液（２）を０．５ml添加
し、３７℃にて酵素サイクリング反応を開始した。反応
液（２）添加後２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図２に示
した。図２から明らかなように、グリセロール量に対す
る吸光度変化量は良好な直線性を示した。
２０、４０、６０、８０、１００μＭのグリセロール溶
液をそれぞれ２０μl 添加し、３７℃に加温した。グリ
セロール添加後２分目に反応液（２）を０．５ml添加
し、３７℃にて酵素サイクリング反応を開始した。反応
液（２）添加後２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図２に示
した。図２から明らかなように、グリセロール量に対す
る吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００６９】実施例 ３ Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロールの定量 ＜反応液（１）＞ ２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） １ ｍＭ ＡＴＰ（シグマ社製） １ ｍＭ 塩化マグネシウム １ ｍＭ 塩化カルシウム ０．３ｕ／ml グリセロールキナーゼ（東洋醸造社製：ストレプトマイセス カナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ）由来） ２ｕ／ml ホスホリパーゼ−Ｄ（東洋醸造社製：ストレプトマイセス クロモフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｏｍｏ ｆｕｓｃｕｓ）由来）
【００７０】 ＜反応液（２）＞ １００ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０） ８ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製） ０．１６ ｍＭ 還元型デアミノＮＡＤ（シグマ社製） ５ ｍＭ ＥＤＴＡ １３６０ｕ／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー 社製：ウサギ筋肉由来）
【００７１】＜操作＞ １００mg／mlのＬ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセ
ロール溶液（クロロホルム：メタノール（９８：２））
（シグマ社製）をエバポレータにて蒸発乾固し、２５０
０倍容の０．５％トリトンＸ−１００（シグマ社製）溶
液を用いて溶解させた（４．０μｇ／ml）。このものを
水で希釈し０、８、１６、２４、３２、４０μｇ／mlの
Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール溶液を調
製した。
ロール溶液（クロロホルム：メタノール（９８：２））
（シグマ社製）をエバポレータにて蒸発乾固し、２５０
０倍容の０．５％トリトンＸ−１００（シグマ社製）溶
液を用いて溶解させた（４．０μｇ／ml）。このものを
水で希釈し０、８、１６、２４、３２、４０μｇ／mlの
Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール溶液を調
製した。
【００７２】上記反応液（１）０．５mlをキユベツトに
とり、０、８、１６、２４、３２、４０μｇ／mlのＬ−
α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール溶液をそれぞ
れ５０μl 添加し、３７℃に加温した。Ｌ−α−ホスフ
アチジル−ＤＬ−グリセロール添加後５分目に反応液
（２）を０．５ml添加し、３７℃にて酵素サイクリング
反応を開始した。反応液（２）添加後２分目と７分目の
４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求め、
その結果を図３に示した。図３から明らかなように、Ｌ
−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール量に対する
吸光度変化量は良好な直線性を示した。
とり、０、８、１６、２４、３２、４０μｇ／mlのＬ−
α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール溶液をそれぞ
れ５０μl 添加し、３７℃に加温した。Ｌ−α−ホスフ
アチジル−ＤＬ−グリセロール添加後５分目に反応液
（２）を０．５ml添加し、３７℃にて酵素サイクリング
反応を開始した。反応液（２）添加後２分目と７分目の
４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求め、
その結果を図３に示した。図３から明らかなように、Ｌ
−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール量に対する
吸光度変化量は良好な直線性を示した。
【００７３】実施例 ４ 血清中トリグリセリドの定量 ＜反応液（１）＞ １００ｕ／ml リパーゼ（東洋醸造社製：クロモバクテリウム・ビスコサム （Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ）由 来 ５ ｍＭ 塩化カルシウム １ ％ トライトンＸ−１００ ２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．０）
【００７４】 ＜反応液（２）＞ ２０ ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．０） １ ｍＭ ＡＴＰ（シグマ社製） １ ｍＭ 塩化マグネシウム ０．３ｕ／ml グリセロールキナーゼ（東洋醸造社製：ストレプトマイセス カナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｎｕｓ）由来）
【００７５】 ＜反応液（３）＞ １００ ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（pH１０．０） ８ ｍＭ チオＮＡＤ（シグマ社製） ０．２ ｍＭ 還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） ５ ｍＭ ＥＤＴＡ ４００ｕ／ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー 社製：ウサギ筋肉由来）
【００７６】＜操作＞ 上記の反応液（１）０．２mlをキユベツトにとり、３７
℃にて予備加熱した。３種類の血清サンプルをそれぞれ
につき４μl 各キユベツトに加え、３０℃にて反応を５
分間行った。その後、反応液（２）を０．３ ml 添加
し、３７℃にて３分間反応せしめた後に反応液（３）を
０．５ ml 添加し、３７℃にて酵素サイクリング反応を
開始した。
℃にて予備加熱した。３種類の血清サンプルをそれぞれ
につき４μl 各キユベツトに加え、３０℃にて反応を５
分間行った。その後、反応液（２）を０．３ ml 添加
し、３７℃にて３分間反応せしめた後に反応液（３）を
０．５ ml 添加し、３７℃にて酵素サイクリング反応を
開始した。
【００７７】反応液（３）添加後２分目と５分目の４０
０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。試
薬ブランクとして血清サンプルの代わりに蒸留水を加え
たものについて同様の測定を行った。図２の標準曲線よ
りグリセロール量を求め、血清中のトリグリセリド量を
求めた結果を表１に示す。
０ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。試
薬ブランクとして血清サンプルの代わりに蒸留水を加え
たものについて同様の測定を行った。図２の標準曲線よ
りグリセロール量を求め、血清中のトリグリセリド量を
求めた結果を表１に示す。
【００７８】
【表１】
【図１】Ｌ−グリセロール−３−リン酸の定量曲線であ
る。
る。
【図２】グリセロールの定量曲線である。
【図３】Ｌ−α−ホスフアチジル−ＤＬ−グリセロール
の定量曲線である。
の定量曲線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 被検体に、 （１）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエート類（以下、チオＮＡＤＰ類という）およびチオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオ
ＮＡＤ類という）からなる群より選ばれる一つと、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエート類（以
下、ＮＡＤＰ類という）およびニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド類（以下、ＮＡＤ類という）からなる群
より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グリ
セロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセト
ンリン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 【化１】 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とするＬ−グリセロール−３−
リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量
法。 - 【請求項２】 チオＮＡＤＰ類がチオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート（チオＮＡＤＰ）ま
たはチオニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
ホスフエートである請求項１記載の高感度定量法。 - 【請求項３】 チオＮＡＤ類がチオニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）またはチオニコチン
アミドヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１記
載の高感度定量法。 - 【請求項４】 ＮＡＤＰ類が、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエート（ＮＡＤＰ）、アセチルピ
リジンアデニンジヌクレオチドホスフエート（アセチル
ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレ
オチドホスフエートおよびニコチンアミドヒポキサンチ
ンジヌクレオチドホスフエート（デアミノＮＡＤＰ）か
らなる群より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感
度定量法。 - 【請求項５】 ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒ
ポキサンチンヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキ
サンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群
より選ばれた補酵素である請求項１記載の高感度定量
法。 - 【請求項６】 次の成分（１）〜（３） （１）チオＮＡＤＰ類およびチオＮＡＤ類からなる群よ
り選ばれた一つと、ＮＡＤＰ類およびＮＡＤ類からなる
群より選ばれる一つとを補酵素とし、少なくともＬ−グ
リセロール−３−リン酸を基質としてジヒドロキシアセ
トンリン酸を生成する可逆反応をなすグリセロール−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、 （２）Ａ１、 （３）Ｂ１、 （式中、Ａ１はチオＮＡＤＰ類、チオＮＡＤ類、ＮＡＤ
Ｐ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物
を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡＤＰ類またはチオＮＡＤ
類のときは還元型ＮＡＤＰ類または還元型ＮＡＤ類を、
Ａ１がＮＡＤＰ類またはＮＡＤ類のときは還元型チオＮ
ＡＤＰ類または還元型チオＮＡＤ類を示す）を含有する
ことを特徴とするＬ−グリセロール−３−リン酸または
ジヒドロキシアセトンリン酸の定量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138325A JP3036709B2 (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3138325A JP3036709B2 (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335899A JPH04335899A (ja) | 1992-11-24 |
| JP3036709B2 true JP3036709B2 (ja) | 2000-04-24 |
Family
ID=15219269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3138325A Expired - Lifetime JP3036709B2 (ja) | 1991-05-14 | 1991-05-14 | Ｌ−グリセロール−３−リン酸またはジヒドロキシアセトンリン酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3036709B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08280399A (ja) * | 1995-02-17 | 1996-10-29 | Kureha Chem Ind Co Ltd | トレハロースまたは無機リンの定量法 |
| US6380380B1 (en) * | 1999-01-04 | 2002-04-30 | Specialty Assays, Inc. | Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates |
| US20030017523A1 (en) * | 2000-02-08 | 2003-01-23 | Osamu Hotta | Method of measuring lipid components and method of examining of renal failure |
-
1991
- 1991-05-14 JP JP3138325A patent/JP3036709B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04335899A (ja) | 1992-11-24 |
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