JP3750955B2 - クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチンキナーゼの定量用またはクレアチンキナーゼのＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
被験者から採取した血液に含まれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なことは以前より知られており、臨床検査に利用されている。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）という三種のアイソザイムが存在すること、そしてＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在することも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症の発生の有無を検査するために有力な手段とされている。
【０００３】
上記のように、臨床検査に於て、クレアチンキナーゼを定量（すなわち、総クレアチンキナーゼを定量）すること、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムを定量することによって、被験者についての進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力な手掛かりを得ることができるため、従来より、それらの定量方法についての研究が進められ、現在では精度の高い定量方法が確立されている。
【０００４】
すなわち、クレアチンキナーゼの測定方法としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法により検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼの存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分けることができる。
【０００５】
１）検出反応系１
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
【０００６】
なお、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分光的定量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２４９９号公報参照）。
この検出反応系１を反応式により次に示す。
【０００７】
【０００８】
２）検出反応系２
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成させ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
この検出反応系２を反応式により次に示す。
【０００９】
【００１０】
一方、前記のように、クレアチンキナーゼには、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。すなわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザイムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要がある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に少なく、その存在は無視することができる。従って、ＭＢアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離することができれば可能となるが、その分離は非常に困難である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイムおよびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することによってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量が可能となる。
【００１１】
以前のクレアチンキナーゼの臨床検査およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査では、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されていた。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点があった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくない。
【００１２】
臨床検査の結果を短時間に得る手段として、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以前より知られている。そして、上記のクレアチンキナーゼ検査反応あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層したクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子も既に開発され、実際に使用されている。このようなクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成については、下記の特許公開公報に詳しい記載がある。
特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報、前記の特開平６３−３２４９９号公報。
【００１３】
上記の公知のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナーゼおよびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間での定量分析のために利用できる優れた分析用具であるが、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまでの間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生することが見出されている。従って、これらの乾式分析素子を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍保存する必要があった。このような分析素子の保存に、冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これまでに知られているクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、支持体上に、クレアチンキナーゼの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼ検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子にある。
【００１６】
本発明はまた、支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にもある。
【００１７】
上記の本発明のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子では、クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成のためのクレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応に必要なｐＨ環境を提供する緩衝剤組成物として、従来において一般的に用いられていたトリス（Ｔｒｉｓ）やイミダゾールに代わって、スルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いることを特徴としている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記の検出反応系１あるいは検出反応系２である。従って、アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物としては、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物のいずれもが使用することができる。すなわち、指示薬組成物の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができる。
【００１９】
１）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む指示薬組成物。
２）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびテトラゾリウム塩を含む指示薬組成物。
３）グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含む指示薬組成物。
なお、分析対象物質（アナライト）が、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムである場合には、そのアナライトの血液試料中の存在量が比較的微量なこと（心筋梗塞の発症があった場合でも）、そして血液試料中には本来的にグルコースが含まれていることから、その血液試料中のグルコースが検出反応に関与するグルコース（Ｇｌｕ）として利用することができる。従って、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子においては、上記の試薬組成物１）及び２）から、グルコースを除くことができる。
【００２０】
本発明の乾式分析素子、すなわち、クレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成、及びそれらを構成する各種試薬は、既に知られており、本発明の乾式分析素子に於ても、前述の特定の緩衝剤化合物を使用する以外は、同様の構成と同様の各種試薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
【００２１】
次に、本発明の特徴的構成要件である「スルホン酸基を有する緩衝性化合物」について詳しく説明する。
クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成の為のリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応には、特定のｐＨ環境、すなわちｐＨ５．５〜８．５のｐＨ環境が必要であることは以前より知られており、このため、初期の頃にはビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）と略称されるグッドの緩衝剤組成物が使用されていたが、その後、クレアチンキナーゼの定量に関するＪＳＣＣ勧告により、イミダゾールが緩衝性化合物として一般的に用いられてきた。
【００２２】
一方、本発明の発明者の研究によると、従来のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在しない状態で、徐々に反応を起こすことに起因することが判明した。すなわち、前記の検出反応系１では、ＣＫやＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応してＧ６Ｐを生成させる現象が確認され、一方、検出反応系２では、ＣＰとＡＤＰとの部分な反応によるＡＴＰの生成の他、またＣＰとグリセロールとの反応によるＬ−α−グリセロリン酸の生成が確認された。従って、これらのクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の大きな低下をもたらす結果となる。
【００２３】
上記の理由から、本発明者は、上記の様な乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、従来の緩衝剤組成物あるいは緩衝性化合物に代わって、スルホン酸基（スルホン酸塩基の状態にあっていてもよい）を有する緩衝性化合物を用いることにより、乾式分析素子の保存中に於ける上記の望ましくない反応を顕著に抑制することが可能となることを見出し、本発明に到達したものである。
【００２４】
本発明で用いるスルホン酸基を有する緩衝性化合物は、グッドの緩衝剤と一般的に呼ばれている緩衝性化合物から選ばれることが好ましい。すなわち、グッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてスルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明で用いる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物である。なお、グッドの緩衝剤（あるいは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例えば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
【００２５】
グッドの緩衝剤に属し、かつ本発明の乾式分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けられている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳとＴＡＰＳＯである。
次に、本発明において好ましく用いられる緩衝性化合物である、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳの化学構造を示す。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明の乾式分析素子におけるスルホン酸基を持つ緩衝性化合物の使用量については特に制限はない。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当な使用量を決定することができる。なお、本発明のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物は、二種以上のものを組合せて使用することも可能であり、またスルホン酸基を持たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せて使用することもできる。
【００２８】
クレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許公開公報に記載されているように、既に知られており、本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫあるいはＣＫＭＢの定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施することができる。
【００２９】
次に本発明の実施例と比較例とを記載する。なお、下記の実施例と比較例とに於いては、検出反応系１を利用するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子のみを示すが、本発明で使用する緩衝性化合物の機能は、検出反応系が、検出反応系１でも、検出反応系２であっても、またクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用であっても、クレアチンキナーゼ（総クレアチンキナーゼ）定量用であっても、実質的な変りはない。
従って、下記の実施例によって、前述のいずれの態様の乾式分析素子においても、本発明のスルホン酸基を有する緩衝性化合物が明らかにされていると理解すべきである。
【００３０】
【実施例】
［実施例１］ＴＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの指示薬層を形成した。
【００３１】
脱イオンゼラチン ２００ｇ
水 １１００ｇ
５％非イオン系界面活性剤水溶液 ８０ｇ
ニトロテトラゾリウムブルー １０ｇ
【００３２】
上記指示薬層をゼラチン架橋剤を含む溶液で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリコット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。
次に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
【００３３】
【００３４】
最後に、上記にて形成した、支持体上に指示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、ＴＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得られたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬分布を調べたところ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの大部分が展開層に移動していることが確認された。
【００３５】
［実施例２］ＴＡＰＳＯを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＴＡＰＳＯ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３６】
［実施例３］ＭＯＰＳＯを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＯＰＳＯ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３７】
［実施例４］ＭＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＥＳ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３８】
［比較例１］イミダゾールを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造緩衝性化合物として用いたＴＥＳ（５．１ｇ）を、１．５ｇのイミダゾールに替え、１Ｎ−ＮａＯＨ（１０．０ｇ）を１０．０ｇの１Ｎ−ＨＣｌに替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３９】
［比較例２］Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００４０】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中のＡＴＰの生成］
実施例１乃至４で得られた分析素子、そして比較例１及び２で得られた分析素子を、それぞれ４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで水を用いて、指示薬層と反応試薬含有展開層にて生成したＡＴＰを抽出した。各抽出液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に掛けて、各分析素子中でのＡＴＰの生成量を測定した。この測定により判明した各分析素子のＡＴＰ生成量を下記の第１表に示す。
【００４１】
【表１】
【００４２】
上記の第１表の結果から、本発明で採用するスルホン酸基を有する緩衝性化合物が、クレアチンキナーゼ（あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム）の不存在下でのＡＴＰの副生を効果的に抑制していることが明らかである。
【００４３】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中の感度変動］
実施例で得られた分析素子そして比較例１得られた分析素子のそれぞれについて、製造直後のもの、そして３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保存した後のものを用意し、それぞれの分析素子について、ＣＫＭＢ含有量が１０Ｕ／Ｌ附近の検体とＣＫＭＢ含有量が１００Ｕ／Ｌ附近の検体とを点着した。
検体が点着された分析素子について、３７℃でインキュベーションを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行ない、予め作成しておいた検量線を参照することにより、反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結果を下記の第２表に示す。
【００４４】
【表２】
【００４５】
上記の第２表の結果から、本発明で採用するスルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いたＣＫＭＢ定量用分析素子（実施例１）を用いた場合には、通常の保存条件よりも苛酷な保存条件においてもＣＫＭＢ測定に関する感度の変動は僅かであることが分る。一方、従来のイミダゾール緩衝剤を用いたＣＫＭＢ定量用分析素子（比較例１）は、その製造直後に於ては満足すべき感度を示すが、保存を行なうことにより明らかな感度低下（ＡＴＰの副生によるバックグランド発色の発生）が発生している。
【００４６】
【発明の効果】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）或はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析用の乾式分析素子に導入する緩衝剤として、本発明で規定したスルホン酸基を持つ緩衝性化合物を使用することにより、分析素子の保存性が顕著に向上する。このため、本発明に従うクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量のための乾式分析素子は、従来のＣＫあるいはＣＫＭＢ定量分析用乾式分析素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の冷凍保存の必要が無くなるため、実用において非常に有利となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、クレアチンキナーゼの定量用またはクレアチンキナーゼのＭＢアイソザイムの定量用の乾式分析素子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
被験者から採取した血液に含まれているクレアチンキナーゼ（ＣＫ、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）とも云われる）を定量することにより、進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断が可能なことは以前より知られており、臨床検査に利用されている。また、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）には、クレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫＭＢ）、そしてクレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）という三種のアイソザイムが存在すること、そしてＣＫＭＭは主として骨格筋中に、ＣＫＭＢは主として心筋中に、そしてＣＫＢＢは主として脳や脊髄中に存在することも知られている。さらにＣＫＭＢは、心筋梗塞症が発生すると、心筋より血液中に排出され、その結果、血液中のＣＫＭＢ量が増加することも判明している。従って、被験者の血液中のＣＫＭＢの定量は、心筋梗塞症の発生の有無を検査するために有力な手段とされている。
【０００３】
上記のように、臨床検査に於て、クレアチンキナーゼを定量（すなわち、総クレアチンキナーゼを定量）すること、及び／又はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムを定量することによって、被験者についての進行性筋萎縮症、皮膚筋炎、心筋梗塞などの診断に有力な手掛かりを得ることができるため、従来より、それらの定量方法についての研究が進められ、現在では精度の高い定量方法が確立されている。
【０００４】
すなわち、クレアチンキナーゼの測定方法としては、被験者から採取した血液から血清あるいは血漿を得て、この血清や血漿中に含まれるクレアチンキナーゼの酵素活性を利用することにより、分光的方法により検出できる化学種を定量的に生成させ、その化学種の生成量から、血清あるいは血漿中のクレアチンキナーゼの存在量を定量する方法である。さらに詳しく云えば、この定量方法に利用される検出反応系は次の二つに分けることができる。
【０００５】
１）検出反応系１
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域にて緩衝能を示す緩衝性化合物を用いて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグルコース（Ｇｌｕ）とをヘキソキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）を生成させ、次にこのＧ６Ｐをニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型（ＮＡＤ（Ｐ））と、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下に反応させてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）還元型（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生成させ、最後に、このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
【０００６】
なお、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分光的定量の精度が充分でない傾向があるため、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを更にテトラゾリウム塩と反応させてホルマザン色素を生成させて、そのホルマザン色素の生成量を定量することによって、被検液中のクレアチンキナーゼを定量する方法も既に開発されている（特開昭６３−３２４９９号公報参照）。
この検出反応系１を反応式により次に示す。
【０００７】
２）検出反応系２
クレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを、ｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物にて酵素反応のｐＨ環境を調整しながら、被検液（血清や血漿など）中の存在するクレアチンキナーゼ（ＣＫ）と接触させることにより反応させ、そのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の量に比例する量のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成させ、ついで、そのＡＴＰとグリセロールとをグリセロールキナーゼ（ＨＫ）の存在下に反応させてＬ−α−グリセロリン酸を生成させ、次にこのＬ−α−グリセロリン酸をＬ−α−グリセロリン酸オキシダーゼの存在下に酸素と反応させて過酸化水素を発生させ、最後に過酸化水素とロイコ色素とを反応させて青色の色素を生成させ、この青色色素の生成量を分光的測定方法により測定し、別に調製した検量線を利用して、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）を定量する方法である。
この検出反応系２を反応式により次に示す。
【０００９】
一方、前記のように、クレアチンキナーゼには、三種類のアイソザイムが存在するため、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量は容易ではない。すなわち、原理的には、ＭＭアイソザイムとＢＢアイソザイムとからＭＢアイソザイムを分離して定量する必要がある。ただし、ＢＢアイソザイムは、本来的に脳や脊髄中に存在するものであるため、血液中の存在量は非常に少なく、その存在は無視することができる。従って、ＭＢアイソザイムの定量には、ＭＭアイソザイムを分離することができれば可能となるが、その分離は非常に困難である。このため、クレアチンキナーゼを含む血液試料（血清や血漿など）中のＭＭアイソザイムを分離する代わりに、ＭＢアイソザイムの活性に影響を与えること無く、ＭＭアイソザイムの活性を阻害させる方法により、実質的なＭＢアイソザイムの分離を実現する方法が既に開発されている（特公昭５６−１９２３９号公報参照）。この方法では、予め調製したクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム中のサブユニットＢの酵素活性を阻害することなく、クレアチンキナーゼのＭＭアイソザイムおよびＭＢアイソザイム中のサブユニットＭの酵素活性を完全に阻害する抗体を使用する。すなわち、被検液を先ずこのＭサブユニット不活性化抗体で処理することによってクレアチンキナーゼの活性をクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムに起因するもののみに限定させ、この酵素活性を前記の検出反応系１あるいは検出反応系２を利用して測定することによって、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量が可能となる。
【００１１】
以前のクレアチンキナーゼの臨床検査およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの臨床検査では、これまでに述べてきた方法を利用して、検出反応を試薬溶液中で実施する湿式法が一般的に利用されていた。しかしながら、湿式法による定量分析操作は、結果を得るまでにかなりの長時間を必要とするという欠点があった。すなわち、例えば、心筋梗塞については、梗塞の発症から治療開始までの時間が短いほど治療の効果が高いことが知られており、このため特に心筋梗塞発症の診断については緊急性の要求が非常に高い。従って、検査の開始から検査結果の入手までの時間が長いことは、治療の開始の遅れを引き起こすことになり、好ましくない。
【００１２】
臨床検査の結果を短時間に得る手段として、透明支持体のうえに検出反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層した構成の各種の乾式分析素子が以前より知られている。そして、上記のクレアチンキナーゼ検査反応あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検査反応に関与する試薬組成物を含む試薬層を積層したクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子も既に開発され、実際に使用されている。このようなクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成については、下記の特許公開公報に詳しい記載がある。
特開平６１−２５４１９８号公報、特開平６１−２５４１９９号公報、特開平６１−２６０１６４号公報、前記の特開平６３−３２４９９号公報。
【００１３】
上記の公知のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子は、それぞれクレアチンキナーゼおよびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの短時間での定量分析のために利用できる優れた分析用具であるが、分析素子製造後から実際の定量分析に使用するまでの間における保存性に劣ると云う問題があった。すなわち、それぞれの分析素子を通常の保存条件にて保存を行なうと、製造後短い期間の内に、感度の低下が発生することが見出されている。従って、これらの乾式分析素子を良好な保存状態に維持するためには、分析素子を冷凍保存する必要があった。このような分析素子の保存に、冷凍保存が必要であると云うことは、その冷凍保存の設備が必要である上に、実際の臨床検査の開始に際しても時間的遅れが発生しやすいという問題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、これまでに知られているクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存性を解決することを目的とする。
本発明は特に、常温で保存しても感度低下が少なく、従って常温での保存が可能なクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、支持体上に、クレアチンキナーゼの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼ検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子にある。
【００１６】
本発明はまた、支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子にもある。
【００１７】
上記の本発明のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子では、クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成のためのクレアチンリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応に必要なｐＨ環境を提供する緩衝剤組成物として、従来において一般的に用いられていたトリス（Ｔｒｉｓ）やイミダゾールに代わって、スルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いることを特徴としている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢ定量用の乾式分析素子において利用される検出反応系は前記の検出反応系１あるいは検出反応系２である。従って、アデノシン三リン酸との反応によって分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物としては、前記の検出反応系に利用される指示薬組成物のいずれもが使用することができる。すなわち、指示薬組成物の例としては、下記の指示薬組成物を挙げることができる。
【００１９】
１）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む指示薬組成物。
２）グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（あるいは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびテトラゾリウム塩を含む指示薬組成物。
３）グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含む指示薬組成物。
なお、分析対象物質（アナライト）が、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムである場合には、そのアナライトの血液試料中の存在量が比較的微量なこと（心筋梗塞の発症があった場合でも）、そして血液試料中には本来的にグルコースが含まれていることから、その血液試料中のグルコースが検出反応に関与するグルコース（Ｇｌｕ）として利用することができる。従って、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子においては、上記の試薬組成物１）及び２）から、グルコースを除くことができる。
【００２０】
本発明の乾式分析素子、すなわち、クレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の構成、及びそれらを構成する各種試薬は、既に知られており、本発明の乾式分析素子に於ても、前述の特定の緩衝剤化合物を使用する以外は、同様の構成と同様の各種試薬が利用される。このような乾式分析素子の構成と試薬の例は、前述の特許公告公報および公開公報に詳しく記載されているので、ここに改めて詳しく記載しない。
【００２１】
次に、本発明の特徴的構成要件である「スルホン酸基を有する緩衝性化合物」について詳しく説明する。
クレアチンキナーゼまたはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの酵素作用によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生成の為のリン酸（ＣＰ）とアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）との反応には、特定のｐＨ環境、すなわちｐＨ５．５〜８．５のｐＨ環境が必要であることは以前より知られており、このため、初期の頃にはビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）と略称されるグッドの緩衝剤組成物が使用されていたが、その後、クレアチンキナーゼの定量に関するＪＳＣＣ勧告により、イミダゾールが緩衝性化合物として一般的に用いられてきた。
【００２２】
一方、本発明の発明者の研究によると、従来のクレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子およびクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子の低い保存安定性は、それらの保存中において、試薬組成物中の試薬が、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）やクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）が存在しない状態で、徐々に反応を起こすことに起因することが判明した。すなわち、前記の検出反応系１では、ＣＫやＣＫＭＢが存在しなくても、ＣＰとＡＤＰとが部分的に反応してＡＴＰが生成し、またＣＰとＧｌｕとが反応してＧ６Ｐを生成させる現象が確認され、一方、検出反応系２では、ＣＰとＡＤＰとの部分な反応によるＡＴＰの生成の他、またＣＰとグリセロールとの反応によるＬ−α−グリセロリン酸の生成が確認された。従って、これらのクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの不存在下で発生する反応が分析精度の大きな低下をもたらす結果となる。
【００２３】
上記の理由から、本発明者は、上記の様な乾式分析素子の常温での保存中に発生する望ましくない反応の抑制を目的として研究した。そして、その結果、従来の緩衝剤組成物あるいは緩衝性化合物に代わって、スルホン酸基（スルホン酸塩基の状態にあっていてもよい）を有する緩衝性化合物を用いることにより、乾式分析素子の保存中に於ける上記の望ましくない反応を顕著に抑制することが可能となることを見出し、本発明に到達したものである。
【００２４】
本発明で用いるスルホン酸基を有する緩衝性化合物は、グッドの緩衝剤と一般的に呼ばれている緩衝性化合物から選ばれることが好ましい。すなわち、グッドの緩衝剤には、スルホン酸基を持つもの、そしてスルホン酸基を持たないもののいずれもがあるが、本発明で用いる緩衝性化合物は、それらの内のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物である。なお、グッドの緩衝剤（あるいは、グッドの緩衝液とも呼ばれる）については、例えば、「化学辞典」（森北出版株式会社、１９８１年発行）、「化学大辞典」（株式会社東京化学同人、１９８９年発行）などに簡単な記載があり、また更に多くの臨床検査試薬に関する成書に詳しい記載がある。
【００２５】
グッドの緩衝剤に属し、かつ本発明の乾式分析素子に於ける使用に適した緩衝性化合物としては、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、ＭＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ，ＨＥＰＳＯと名付けられている化合物を挙げることができる。これらの化合物の中でも、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けられている化合物が好ましい。特に好ましいのは、ＴＥＳとＴＡＰＳＯである。
次に、本発明において好ましく用いられる緩衝性化合物である、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳの化学構造を示す。
【００２６】
【化１】
本発明の乾式分析素子におけるスルホン酸基を持つ緩衝性化合物の使用量については特に制限はない。すなわち、グッドの緩衝剤の一般的な使用の態様を参考にし、使用量を変動させての試験的使用などの一般的な使用量決定方法を利用することにより、容易に適当な使用量を決定することができる。なお、本発明のスルホン酸基を持つ緩衝性化合物は、二種以上のものを組合せて使用することも可能であり、またスルホン酸基を持たない緩衝性化合物あるいは他の緩衝剤組成物と組合せて使用することもできる。
【００２８】
クレアチンキナーゼ定量用の乾式分析素子あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子を用いてのクレアチンキナーゼ（ＣＫ）あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析の操作は、前述の特許公告公報及び特許公開公報に記載されているように、既に知られており、本発明の乾式分析素子を用いてのＣＫあるいはＣＫＭＢの定量分析操作は、それらと同様な操作に従って実施することができる。
【００２９】
次に本発明の実施例と比較例とを記載する。なお、下記の実施例と比較例とに於いては、検出反応系１を利用するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用の乾式分析素子のみを示すが、本発明で使用する緩衝性化合物の機能は、検出反応系が、検出反応系１でも、検出反応系２であっても、またクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用であっても、クレアチンキナーゼ（総クレアチンキナーゼ）定量用であっても、実質的な変りはない。
従って、下記の実施例によって、前述のいずれの態様の乾式分析素子においても、本発明のスルホン酸基を有する緩衝性化合物が明らかにされていると理解すべきである。
【００３０】
【実施例】
［実施例１］ＴＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
透明ポリエチレンテレフタレートフィルム（厚さ１８０μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面上に下記の組成の塗布液を塗布、乾燥して、乾燥層厚が１２μｍの指示薬層を形成した。
【００３１】
脱イオンゼラチン ２００ｇ
水 １１００ｇ
５％非イオン系界面活性剤水溶液 ８０ｇ
ニトロテトラゾリウムブルー １０ｇ
【００３２】
上記指示薬層をゼラチン架橋剤を含む溶液で湿らせた後（約３０ｇ／ｍ2 ）、その指示薬層の上に、ポリエチレンテトラフタレート紡績糸からなるトリコット編み物を圧着し、乾燥させて展開層とした。
次に、上記展開層の表面に下記の組成の塗布液を、塗布量１３０ｇ／ｍ2 にて塗布、乾燥した。
【００３３】
最後に、上記にて形成した、支持体上に指示薬層と反応試薬含有展開層とが積層された積層体を１２ｍｍ×１２ｍｍの寸法に裁断して、ＴＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。なお、得られたＣＫＭＢ定量用分析素子中の試薬分布を調べたところ、指示薬層に導入したニトロテトラゾリウムブルーの大部分が展開層に移動していることが確認された。
【００３５】
［実施例２］ＴＡＰＳＯを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＴＡＰＳＯ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３６】
［実施例３］ＭＯＰＳＯを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＯＰＳＯ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３７】
［実施例４］ＭＥＳを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＭＥＳ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３８】
［比較例１］イミダゾールを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造緩衝性化合物として用いたＴＥＳ（５．１ｇ）を、１．５ｇのイミダゾールに替え、１Ｎ−ＮａＯＨ（１０．０ｇ）を１０．０ｇの１Ｎ−ＨＣｌに替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００３９】
［比較例２］Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを緩衝剤として用いたＣＫＭＢ定量用分析素子の製造
緩衝性化合物として用いたＴＥＳをＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（モル換算で同一のモル量）に替えた以外は実施例１と同様にしてＣＫＭＢ定量用分析素子を得た。
【００４０】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中のＡＴＰの生成］
実施例１乃至４で得られた分析素子、そして比較例１及び２で得られた分析素子を、それぞれ４５℃、１１％ＲＨの保存条件で１日間保存し、次いで水を用いて、指示薬層と反応試薬含有展開層にて生成したＡＴＰを抽出した。各抽出液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に掛けて、各分析素子中でのＡＴＰの生成量を測定した。この測定により判明した各分析素子のＡＴＰ生成量を下記の第１表に示す。
【００４１】
【表１】
上記の第１表の結果から、本発明で採用するスルホン酸基を有する緩衝性化合物が、クレアチンキナーゼ（あるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム）の不存在下でのＡＴＰの副生を効果的に抑制していることが明らかである。
【００４３】
［ＣＫＭＢ定量用分析素子の評価：保存中の感度変動］
実施例で得られた分析素子そして比較例１得られた分析素子のそれぞれについて、製造直後のもの、そして３５℃、１１ＲＨ％の保存条件で１０日間保存した後のものを用意し、それぞれの分析素子について、ＣＫＭＢ含有量が１０Ｕ／Ｌ附近の検体とＣＫＭＢ含有量が１００Ｕ／Ｌ附近の検体とを点着した。
検体が点着された分析素子について、３７℃でインキュベーションを行ない、次いで波長５４０ｎｍにて、インキュベーション開始後２分後、そして５分後に分光測定を行ない、予め作成しておいた検量線を参照することにより、反応速度法によりＣＫＭＢ量の定量を行なった。その結果を下記の第２表に示す。
【００４４】
【表２】
上記の第２表の結果から、本発明で採用するスルホン酸基を有する緩衝性化合物を用いたＣＫＭＢ定量用分析素子（実施例１）を用いた場合には、通常の保存条件よりも苛酷な保存条件においてもＣＫＭＢ測定に関する感度の変動は僅かであることが分る。一方、従来のイミダゾール緩衝剤を用いたＣＫＭＢ定量用分析素子（比較例１）は、その製造直後に於ては満足すべき感度を示すが、保存を行なうことにより明らかな感度低下（ＡＴＰの副生によるバックグランド発色の発生）が発生している。
【００４６】
【発明の効果】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）或はクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫＭＢ）の定量分析用の乾式分析素子に導入する緩衝剤として、本発明で規定したスルホン酸基を持つ緩衝性化合物を使用することにより、分析素子の保存性が顕著に向上する。このため、本発明に従うクレアチンキナーゼあるいはクレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの定量のための乾式分析素子は、従来のＣＫあるいはＣＫＭＢ定量分析用乾式分析素子の使用前の保存の際に必須とされていた分析素子の冷凍保存の必要が無くなるため、実用において非常に有利となる。
Claims (10)
- 支持体上に、クレアチンキナーゼの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼ検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むものである請求項１に記載のクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩を含むものである請求項１に記載のクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含むものである請求項１に記載のクレアチンキナーゼ定量用乾式分析素子。
- 支持体上に、クレアチンキナーゼのＭサブユニット活性を特異的に阻害する抗体、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイムの存在下で、アデノシン三リン酸を生成するクレアチンリン酸とアデノシン二リン酸、そしてそのアデノシン三リン酸の生成のためのｐＨ環境を提供するｐＨ５．５〜８．５の領域において緩衝能を示す緩衝性化合物を含有し、更に、生成したアデノシン三リン酸との反応により分光的測定方法により検出可能な化合物を生成させる指示薬組成物を含有するクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム検出試薬層を積層してなるクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子であって、該緩衝性化合物がスルホン酸基を有する化合物であることを特徴とするクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、グルコース、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含むものである請求項５に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、ヘキソキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）酸化型、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びテトラゾリウム塩を含むものである請求項５に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
- 指示薬組成物が、グリセロール、グリセロールキナーゼ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ及びロイコ色素を含むものである請求項５に記載のクレアチンキナーゼＭＢアイソザイム定量用乾式分析素子。
- 該緩衝性化合物がグッドの緩衝剤に属する化合物である請求項１乃至８の内のいずれかの項に記載の乾式分析素子。
- 該緩衝性化合物がグッドの緩衝剤に属し、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＯＰＳＯ、およびＭＥＳと名付けられている化合物の内の少なくとも一種である請求項１乃至８の内のいずれかの項に記載の乾式分析素子。
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