JP4106270B2 - 新規測定方法 - Google Patents
新規測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4106270B2 JP4106270B2 JP2002565130A JP2002565130A JP4106270B2 JP 4106270 B2 JP4106270 B2 JP 4106270B2 JP 2002565130 A JP2002565130 A JP 2002565130A JP 2002565130 A JP2002565130 A JP 2002565130A JP 4106270 B2 JP4106270 B2 JP 4106270B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nad
- reagent
- glucose
- coenzyme
- reaction system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、生体試料について酵素反応を利用した測定反応系を用いて被検物質を測定する場合に、試料に含まれる溶血成分によって生じる測定誤差を回避した測定方法に関する。
【０００２】
背景技術
臨床検査の分野では、補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰＨ）の変化量を吸光度変化として捕らえ、目的成分を定量する方法がよく用いられる。検体としては一般的に血清を使用するが、血清取得のための採血時に物理的衝撃が加わったり、人為的な誤操作で血球が破裂することがあり、溶血する場合がある。また、溶血性疾患を持つ患者から採血した場合には、該疾患により溶血を認める場合もある。さらに、最近では検査時間の短縮のために全血を検体として用いた測定の試みもあり、このような検体にも溶血を認める場合がある。
【０００３】
血球が破裂して溶血状態になると、赤血球中の成分であるミオキナーゼ（アデニル酸キナーゼ（以下「ＭＫ」と略す。））、グルコース６リン酸脱水素酵素（以下「Ｇ６ＰＤＨ」と略す。）等の酵素が血清に混入することになる。臨床検査項目によっては、これらの酵素が測定値に影響を与えるため、それぞれの酵素に対する対策が図られてきた。例えば、グルコース成分を測定する場合の溶血による測定誤差を回避するために、ＮａＦ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨ２ＰＯ４および抗凝固剤の混合物からなる臨床検査用解糖防止剤を用いることが報告されており（特開平５−１２６８３４公報）、またＭＫ活性に対してはＡＰ５Ａが報告されている。
【０００４】
しかし、酵素反応を利用した臨床検査の測定において、試料に含まれる赤血球中の成分によって生じる測定誤差、すなわち溶血干渉の問題は未だ十分に解決された状況とはいえない。
【０００５】
発明の開示
本発明の課題は、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合に、正確な測定値を得るための測定方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、補酵素でグルコースを測定する反応系の最終生成物は、６ホスホグルコン酸（以下「６ＰＧ」と略す。）であることに着目し、血球中の６ＰＧ脱水素酵素（以下「６ＰＧＤＨ」と略す。）がＮＡＤＰを補酵素として反応し、グルコース測定系の結果としての６ＰＧ値に正誤差を与えることを見出した。
【０００７】
そこで、補酵素でグルコースを測定する反応系において、６ＰＧＤＨを反応系外におくことにより、正確なグルコースの測定値を得る方法を見出した。従来は溶血時の６ＰＧＤＨ活性の影響は報告されておらず、本発明者が初めて見出したものである。これまでは溶血の影響をＭＫ活性や血球中のグルコース、リン酸として考えて問題にしていなかったと考えられる。
【０００８】
すなわち本発明は、以下からなる。
１．ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼと、グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有し、前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬。
２．マグネシウムイオンをさらに含有する、前項１記載の試薬。
３．ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼとを含有する第１試薬と、
グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有する第２試薬と、を含み、
前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬キット。
４．マグネシウムイオンをさらに含有する、前項３記載の試薬キット。
５．６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて生体試料中の中性脂肪を測定する方法であって、
６ホスホグルコン酸脱水素酵素とは反応しないＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤを用いて前記６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におき、
シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つによって、乳酸脱水素酵素を反応系外におくことを特徴とする、中性脂肪測定方法。
【０００９】
発明を実施するための最良の形態
本発明において、生体試料について６ＰＧを生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合とは、例えば上記試料について酵素反応を利用して、補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系が挙げられる。ここでヘキソースとは六炭糖をいい、代表的なものとしてグルコースが挙げられる。このような測定系を用いて測定する臨床検査項目として、グルコース（ＧＬＵ）、中性脂肪（ＴＧ）、無機リン（ＩＰ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、シュークロース、イヌリン、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニンなどが挙げられる。
【００１０】
例えば、第１図および第２図に示すように、グルコースや中性脂肪について測定を行うに際し、グルコースを生成する反応系を用いた最終生成物は６ＰＧである。
【００１１】
補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系では、試料に溶血があった場合に、測定値に正誤差を与える現象があり、このような現象を溶血干渉という。
【００１２】
これは溶血により、血球中の６ＰＧＤＨが測定系にてＮＡＤＰを補酵素として６ＰＧと反応し、その結果、６ＰＧの正確な測定値が得られず、干渉作用を起こすものと考えられた。本発明は、溶血により生じる６ＰＧＤＨが、干渉作用をおこすこと、さらに上記測定系において６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことにより、溶血により生じる干渉作用が回避されることを見出したことである。
【００１３】
この６ＰＧＤＨを反応系外におく手段としては、反応系では６ＰＧＤＨとは反応しない補酵素を用いること、６ＰＧＤＨの活性阻害剤を用いること、６ＰＧＤＨの抗体を添加すること若しくは、６ＰＧＤＨを免疫除去すること等が例示される。さらに、本発明者は、６ＰＧＤＨはＮＡＤＰを補酵素として反応するがＮＡＤは補酵素として認識しないことをつきとめ、ＮＡＤで反応系を組むことにより、６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことになることを見出し、溶血の影響を回避した新規測定方法の発明を行った。
【００１４】
また、ＮＡＤまたはＮＡＤＨは試料中の脱水素酵素、特に乳酸脱水素酵素（以下「ＬＤＨ」という。；ＮＡＤ依存）の影響を受けるが、シュウ酸、オキサミン酸またはそれらの塩類を含ませることで完全にＬＤＨの影響も回避できるので、この測定方法と組み合わせることができる。
【００１５】
また、本発明の補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系は、補酵素以外に、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ヘキソース、Ｇ６Ｐから選ばれる酵素又は糖を一つまたは二つ以上組み合わせて用いられる。これらの酵素法によるグルコースの測定法は広く公知である。
【００１６】
（実施例）
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１）
採血管で採血した後、血液を３０００ｒｐｍで遠心して人赤血球を得た。この赤血球を−２０℃で凍結し、更に室温で溶解した。このことにより血球が破裂、溶血成分を得た。これを生理的食塩水で希釈し、ヘモグロビンとして５００ｍｇ／ｄＬとした。以下に示す試薬を調製した。
【００１８】
０．１Ｍ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤＰ ２．０ｍＭ、６ＰＧ １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ａ）０．１Ｍ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤ ２．０ｍＭ、６ＰＧ １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ｂ）を調製した。
【００１９】
試薬Ａならびに試薬Ｂを３７℃で５分間加温後、溶血した試料を１５μＬ添加し、波長３４０〜７５０ｎｍにおける吸光度を１分おきに測定した。この溶血液を測定したところ、第３図に示すようにＮＡＤを用いたときには吸光度の上昇は認められなかった。一方、第４図に示すようにＮＡＤＰを補酵素として反応させたときにはＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度が上昇した。この結果、ＮＡＤを用いることにより溶血干渉が回避されることが示唆された。
【００２０】
（実施例２）
以下に示す試薬を調製し、グルコース（ＧＬＵ）の測定に供した。
【００２１】
［第１試薬］
【００２２】
［第２試薬］
また、上記の試薬組成でβ−ＮＡＤの代わりにβ−ＮＡＤＰを用いた試薬も調製した。
【００２３】
［操作方法］
試料５μＬに第１試薬２１０μＬ、第２試薬を７０μＬ添加し、主波長３４０ｎｍの条件で日立７１７０型自動分析装置を用いてエンドポイントアッセイを行い、予め作成した検量線よりグルコース濃度を算出した。
【００２４】
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第５図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ａはグルコース測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときのグルコースは８０ｍｇ／ｄＬであった。
【００２５】
（実施例３）
以下に示す試薬を調製し、中性脂肪（ＴＧ）の測定に供した。
【００２６】
［第１試薬］
【００２７】
［第２試薬］
【００２８】
また、上記の試薬組成でβ−ＮＡＤの代わりにβ−ＮＡＤＰを用いた試薬も調製した。
測定操作は、グルコース測定と同様に行い、中性脂肪を測定した。
【００２９】
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第６図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ｂは中性脂肪測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの中性脂肪の濃度は９５ｍｇ／ｄＬであった。
【００３０】
産業上の利用分野
以上説明したように、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことで、溶血干渉が防止でき、被検物質の正確な測定値を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、グルコース測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第２図は、中性脂肪（ＴＧ）測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第３図は、ＮＡＤ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第４図は、ＮＡＤＰ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第５図は、グルコース測定値の変動を示す図である（実施例２）。
第６図は、中性脂肪測定値の変動を示す図である（実施例３）。
技術分野
本発明は、生体試料について酵素反応を利用した測定反応系を用いて被検物質を測定する場合に、試料に含まれる溶血成分によって生じる測定誤差を回避した測定方法に関する。
【０００２】
背景技術
臨床検査の分野では、補酵素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＨ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ、Ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰＨ）の変化量を吸光度変化として捕らえ、目的成分を定量する方法がよく用いられる。検体としては一般的に血清を使用するが、血清取得のための採血時に物理的衝撃が加わったり、人為的な誤操作で血球が破裂することがあり、溶血する場合がある。また、溶血性疾患を持つ患者から採血した場合には、該疾患により溶血を認める場合もある。さらに、最近では検査時間の短縮のために全血を検体として用いた測定の試みもあり、このような検体にも溶血を認める場合がある。
【０００３】
血球が破裂して溶血状態になると、赤血球中の成分であるミオキナーゼ（アデニル酸キナーゼ（以下「ＭＫ」と略す。））、グルコース６リン酸脱水素酵素（以下「Ｇ６ＰＤＨ」と略す。）等の酵素が血清に混入することになる。臨床検査項目によっては、これらの酵素が測定値に影響を与えるため、それぞれの酵素に対する対策が図られてきた。例えば、グルコース成分を測定する場合の溶血による測定誤差を回避するために、ＮａＦ、ＭｇＣｌ２、ＮａＨ２ＰＯ４および抗凝固剤の混合物からなる臨床検査用解糖防止剤を用いることが報告されており（特開平５−１２６８３４公報）、またＭＫ活性に対してはＡＰ５Ａが報告されている。
【０００４】
しかし、酵素反応を利用した臨床検査の測定において、試料に含まれる赤血球中の成分によって生じる測定誤差、すなわち溶血干渉の問題は未だ十分に解決された状況とはいえない。
【０００５】
発明の開示
本発明の課題は、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合に、正確な測定値を得るための測定方法を提供することにある。
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、補酵素でグルコースを測定する反応系の最終生成物は、６ホスホグルコン酸（以下「６ＰＧ」と略す。）であることに着目し、血球中の６ＰＧ脱水素酵素（以下「６ＰＧＤＨ」と略す。）がＮＡＤＰを補酵素として反応し、グルコース測定系の結果としての６ＰＧ値に正誤差を与えることを見出した。
【０００７】
そこで、補酵素でグルコースを測定する反応系において、６ＰＧＤＨを反応系外におくことにより、正確なグルコースの測定値を得る方法を見出した。従来は溶血時の６ＰＧＤＨ活性の影響は報告されておらず、本発明者が初めて見出したものである。これまでは溶血の影響をＭＫ活性や血球中のグルコース、リン酸として考えて問題にしていなかったと考えられる。
【０００８】
すなわち本発明は、以下からなる。
１．ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼと、グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有し、前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬。
２．マグネシウムイオンをさらに含有する、前項１記載の試薬。
３．ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼとを含有する第１試薬と、
グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有する第２試薬と、を含み、
前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬キット。
４．マグネシウムイオンをさらに含有する、前項３記載の試薬キット。
５．６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて生体試料中の中性脂肪を測定する方法であって、
６ホスホグルコン酸脱水素酵素とは反応しないＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤを用いて前記６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におき、
シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つによって、乳酸脱水素酵素を反応系外におくことを特徴とする、中性脂肪測定方法。
【０００９】
発明を実施するための最良の形態
本発明において、生体試料について６ＰＧを生成しうる反応系を用いて被検物質を測定する場合とは、例えば上記試料について酵素反応を利用して、補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系が挙げられる。ここでヘキソースとは六炭糖をいい、代表的なものとしてグルコースが挙げられる。このような測定系を用いて測定する臨床検査項目として、グルコース（ＧＬＵ）、中性脂肪（ＴＧ）、無機リン（ＩＰ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、シュークロース、イヌリン、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニンなどが挙げられる。
【００１０】
例えば、第１図および第２図に示すように、グルコースや中性脂肪について測定を行うに際し、グルコースを生成する反応系を用いた最終生成物は６ＰＧである。
【００１１】
補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系では、試料に溶血があった場合に、測定値に正誤差を与える現象があり、このような現象を溶血干渉という。
【００１２】
これは溶血により、血球中の６ＰＧＤＨが測定系にてＮＡＤＰを補酵素として６ＰＧと反応し、その結果、６ＰＧの正確な測定値が得られず、干渉作用を起こすものと考えられた。本発明は、溶血により生じる６ＰＧＤＨが、干渉作用をおこすこと、さらに上記測定系において６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことにより、溶血により生じる干渉作用が回避されることを見出したことである。
【００１３】
この６ＰＧＤＨを反応系外におく手段としては、反応系では６ＰＧＤＨとは反応しない補酵素を用いること、６ＰＧＤＨの活性阻害剤を用いること、６ＰＧＤＨの抗体を添加すること若しくは、６ＰＧＤＨを免疫除去すること等が例示される。さらに、本発明者は、６ＰＧＤＨはＮＡＤＰを補酵素として反応するがＮＡＤは補酵素として認識しないことをつきとめ、ＮＡＤで反応系を組むことにより、６ＰＧＤＨを測定反応系外におくことになることを見出し、溶血の影響を回避した新規測定方法の発明を行った。
【００１４】
また、ＮＡＤまたはＮＡＤＨは試料中の脱水素酵素、特に乳酸脱水素酵素（以下「ＬＤＨ」という。；ＮＡＤ依存）の影響を受けるが、シュウ酸、オキサミン酸またはそれらの塩類を含ませることで完全にＬＤＨの影響も回避できるので、この測定方法と組み合わせることができる。
【００１５】
また、本発明の補酵素でヘキソースまたはリン酸化したヘキソースを測定する反応系は、補酵素以外に、ＨＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ヘキソース、Ｇ６Ｐから選ばれる酵素又は糖を一つまたは二つ以上組み合わせて用いられる。これらの酵素法によるグルコースの測定法は広く公知である。
【００１６】
（実施例）
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１７】
（実施例１）
採血管で採血した後、血液を３０００ｒｐｍで遠心して人赤血球を得た。この赤血球を−２０℃で凍結し、更に室温で溶解した。このことにより血球が破裂、溶血成分を得た。これを生理的食塩水で希釈し、ヘモグロビンとして５００ｍｇ／ｄＬとした。以下に示す試薬を調製した。
【００１８】
０．１Ｍ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤＰ ２．０ｍＭ、６ＰＧ １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ａ）０．１Ｍ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．５）にＮＡＤ ２．０ｍＭ、６ＰＧ １．０ｍＭを溶解した試薬溶液（試薬Ｂ）を調製した。
【００１９】
試薬Ａならびに試薬Ｂを３７℃で５分間加温後、溶血した試料を１５μＬ添加し、波長３４０〜７５０ｎｍにおける吸光度を１分おきに測定した。この溶血液を測定したところ、第３図に示すようにＮＡＤを用いたときには吸光度の上昇は認められなかった。一方、第４図に示すようにＮＡＤＰを補酵素として反応させたときにはＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度が上昇した。この結果、ＮＡＤを用いることにより溶血干渉が回避されることが示唆された。
【００２０】
（実施例２）
以下に示す試薬を調製し、グルコース（ＧＬＵ）の測定に供した。
【００２１】
［第１試薬］
［第２試薬］
【００２３】
［操作方法］
試料５μＬに第１試薬２１０μＬ、第２試薬を７０μＬ添加し、主波長３４０ｎｍの条件で日立７１７０型自動分析装置を用いてエンドポイントアッセイを行い、予め作成した検量線よりグルコース濃度を算出した。
【００２４】
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第５図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ａはグルコース測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときのグルコースは８０ｍｇ／ｄＬであった。
【００２５】
（実施例３）
以下に示す試薬を調製し、中性脂肪（ＴＧ）の測定に供した。
【００２６】
［第１試薬］
［第２試薬］
また、上記の試薬組成でβ−ＮＡＤの代わりにβ−ＮＡＤＰを用いた試薬も調製した。
測定操作は、グルコース測定と同様に行い、中性脂肪を測定した。
【００２９】
溶血液を、ヘモグロビン濃度が０、１００、２００、３００、４００、５００ｍｇ／ｄＬとなり、人血清成分濃度は一定になるように試料を調製した。第６図に示すように、ＮＡＤＰを補酵素とした試薬Ｂは中性脂肪測定値がヘモグロビン濃度依存的に上昇したが、ＮＡＤを用いたときには測定値の上昇が観られず、溶血による正誤差を生じなかった。ヘモグロビン濃度が０ｍｇ／ｄＬのときの中性脂肪の濃度は９５ｍｇ／ｄＬであった。
【００３０】
産業上の利用分野
以上説明したように、生体試料について６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて被検物質の測定する場合において、６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におくことで、溶血干渉が防止でき、被検物質の正確な測定値を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、グルコース測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第２図は、中性脂肪（ＴＧ）測定に際し、６ＰＧを生成しうる反応系を示す図である。
第３図は、ＮＡＤ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第４図は、ＮＡＤＰ反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図である（実施例１）。
第５図は、グルコース測定値の変動を示す図である（実施例２）。
第６図は、中性脂肪測定値の変動を示す図である（実施例３）。
Claims (5)
- ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼと、グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有し、前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬。
- マグネシウムイオンをさらに含有する、請求項１記載の試薬。
- ＡＴＰと、グルコース６リン酸脱水素酵素と、グリセロールキナーゼとを含有する第１試薬と、
グルコースと、補酵素と、ＡＤＰヘキソキナーゼと、リパーゼと、シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つとを含有する第２試薬と、を含み、
前記補酵素がＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤである、中性脂肪測定用試薬キット。 - マグネシウムイオンをさらに含有する、請求項３記載の試薬キット。
- ６ホスホグルコン酸を生成しうる反応系を用いて生体試料中の中性脂肪を測定する方法であって、
６ホスホグルコン酸脱水素酵素とは反応しないＮＡＤまたはＴｈｉｏ−ＮＡＤを用いて前記６ホスホグルコン酸脱水素酵素を反応系外におき、
シュウ酸、オキサミン酸およびそれらの塩類からなる群より選択される少なくとも一つによって、乳酸脱水素酵素を反応系外におくことを特徴とする、中性脂肪測定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001036863 | 2001-02-14 | ||
| JP2001036863 | 2001-02-14 | ||
| PCT/JP2002/001173 WO2002064819A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-13 | Novel assay method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2002064819A1 JPWO2002064819A1 (ja) | 2004-06-17 |
| JP4106270B2 true JP4106270B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=18900077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002565130A Expired - Fee Related JP4106270B2 (ja) | 2001-02-14 | 2002-02-13 | 新規測定方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1361283A4 (ja) |
| JP (1) | JP4106270B2 (ja) |
| KR (1) | KR100836179B1 (ja) |
| CN (1) | CN1228636C (ja) |
| TW (1) | TWI275795B (ja) |
| WO (1) | WO2002064819A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7074581B2 (en) * | 2002-08-09 | 2006-07-11 | Sysmex Corporation | Reagent for assaying lipid |
| CN100430487C (zh) * | 2002-11-15 | 2008-11-05 | 江西特康科技有限公司 | 单一稳定烟酰胺辅酶液体试剂的制备方法 |
| CN101324613A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷的浓度测定方法 |
| JP5843072B2 (ja) * | 2010-04-30 | 2016-01-13 | 日東紡績株式会社 | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット |
| WO2015094852A2 (en) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Preparation of multi-hapten mutant g6pdh conjugates and their use for detection of multiple analytes |
| CN105699640B (zh) * | 2014-05-07 | 2017-06-06 | 北京中生金域诊断技术股份有限公司 | 一种检测肠道屏障功能的试剂盒 |
| CN115078341B (zh) * | 2022-08-22 | 2022-11-29 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的试剂及其应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1598067A1 (de) * | 1951-01-28 | 1970-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und diagnostische Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose |
| GB1318568A (en) * | 1970-09-17 | 1973-05-31 | Miles Lab | Colourimetric assay of dehydrogenases |
| US3956069A (en) * | 1974-04-29 | 1976-05-11 | Abbott Laboratories | Enzymatic assays for glucose, creatine phosphokinase or plasma ammonia |
| DE3303098A1 (de) * | 1983-01-31 | 1984-08-02 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur glucosebestimmung im haemolysierten blut |
| JPH0244520B2 (ja) * | 1988-06-07 | 1990-10-04 | Mitsubishi Petrochemical Co | Gurukoosusokuteiyososeibutsu |
| EP0469154B1 (en) * | 1990-02-20 | 1994-10-05 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of determining glucose-6-phosphate and composition therefor |
| CA2144174A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Jianmin Bao | Electrophoretically mediated chemical analysis |
| JP3685268B2 (ja) * | 1995-03-10 | 2005-08-17 | 東洋紡績株式会社 | α−アミラーゼ活性測定法および測定試薬組成物 |
| JPH07250698A (ja) * | 1995-03-15 | 1995-10-03 | Unitika Ltd | 分析用試薬と分析方法 |
| JP3674018B2 (ja) * | 1996-12-26 | 2005-07-20 | 日東紡績株式会社 | 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 |
| DE19756238A1 (de) * | 1996-12-26 | 1998-07-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Unterbrecher für die Konjugationsdehydrogenasereaktion, Unterbrechungsverfahren und Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz |
| US5801006A (en) * | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
| US6162618A (en) * | 1998-04-10 | 2000-12-19 | Smithkline Beecham Corporation | 6-phosphogluconate dehydrogenase of Streptococcus pneumoniae |
-
2001
- 2001-12-31 TW TW090133584A patent/TWI275795B/zh not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-01-08 KR KR1020020000955A patent/KR100836179B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-02-09 CN CNB021045992A patent/CN1228636C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-13 WO PCT/JP2002/001173 patent/WO2002064819A1/ja not_active Application Discontinuation
- 2002-02-13 JP JP2002565130A patent/JP4106270B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-13 EP EP02712305A patent/EP1361283A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1361283A4 (en) | 2004-03-17 |
| KR100836179B1 (ko) | 2008-06-09 |
| CN1228636C (zh) | 2005-11-23 |
| TWI275795B (en) | 2007-03-11 |
| CN1370994A (zh) | 2002-09-25 |
| EP1361283A1 (en) | 2003-11-12 |
| WO2002064819A1 (en) | 2002-08-22 |
| JPWO2002064819A1 (ja) | 2004-06-17 |
| KR20020066953A (ko) | 2002-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5906604B2 (ja) | 全血検体の成分測定方法 | |
| US20080138793A1 (en) | Method for cholesterol determination | |
| CN106868096B (zh) | 一种稳定性强且成本低的己糖激酶法葡萄糖检测试剂 | |
| JP4106270B2 (ja) | 新規測定方法 | |
| CN100526473C (zh) | 检测轻症葡萄糖耐量异常或胰岛素分泌缺陷的方法 | |
| CA2881611C (en) | Composition and use of substances for the in vitro stabilization of glucose, lactate and homocysteine in blood | |
| US6287796B1 (en) | Biochemical method to measure niacin status in a biological sample | |
| WO1992020817A1 (en) | High precision determination of d-glucose-6-phosphate and composition therefor | |
| CN101514984B (zh) | 测定血清游离肉碱的试剂 | |
| JP3034987B2 (ja) | Ｄ−グリセロアルデヒド−３−リン酸、無機リン、または１，３−ジホスホグリセリン酸の高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP4217815B2 (ja) | グルコースデヒドロゲナーゼによるグルコースの定量方法およびグルコース定量用試薬 | |
| JP5425062B2 (ja) | Ｄ−マンニトールを含有する管理試料を用いるグリコアルブミン等の測定方法 | |
| WO2023145872A1 (ja) | ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの安定化方法及び安定化用組成物 | |
| EP1105524A1 (en) | Diagnosis of hepatocellular injuries using serum fructose-1,6-biphosphatase | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| JPH11195A (ja) | クレアチンキナーゼまたはそのｍｂアイソザイムの定量用乾式分析素子 | |
| JPH03232498A (ja) | ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の測定方法 | |
| WO1997023643A1 (fr) | Methode pour determiner les acides biliaires conjugues avec l'acide sulfurique et kit prevu a cet effet | |
| JP3034984B2 (ja) | Ｄ−ガラクトースの高感度定量法および定量用組成物 | |
| JP4067147B2 (ja) | クレアチンホスホキナーゼ活性の測定方法及び試薬 | |
| Shaherawala et al. | Study of various glycolytic inhibitors for preservation of blood glucose and clinical biochemical parameters | |
| CN116783486A (zh) | 用于测量尿中海藻糖酶的溶液以及使用该溶液的测量方法 | |
| JPH0698035B2 (ja) | 体液中のカルシウム測定方法 | |
| US5998158A (en) | Glucose free, stable dry analytical element for quantitative analysis of creatine kinase MB isozyme | |
| Panteghini et al. | Evaluation of a new commercial assay kit for quantification of lactate dehydrogenase isoenzyme 1 in serum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050210 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20050930 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071031 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071221 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080122 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080207 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080304 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080331 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110404 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |