WO2002064819A1 - Novel assay method - Google Patents

Description

明細書 新規測定方法 技術分野

本発明は、 生体試料について酵素反応を利用した測定反応系を 用いて被検物質を測定する場合に、 試料に含まれる溶血成分によ つて生じる測定誤差を回避した測定方法に関する。 背景技術

臨床検査の分野では、捕酵素 （NAD、 NADP、 NADH、 NADPH、 Thio -NAD , Thio-NAD、 T io -NADH , Thio -NADP , Thio -NADPH ) の変化量を吸光度変化と して捕らえ、 目的成分を定量する方法が よ く用いられる。 検体と しては一般的に血清を使用するが、 血清 取得のための採血時に物理的衝撃が加わったり、 人為的な誤操作 で血球が破裂することがあ り 、 溶血する場合がある。 また、 溶血 性疾患を持つ患者から採血した場合には、 該疾患によ り溶血を認 める場合もある。 さ らに、 最近では検査時間の短縮のために全血 を検体と して用いた測定の試みもあ り 、 このよ う な検体にも溶血 を認める場合がある。

血球が破裂して溶血状態になる と、 赤血球中の成分である ミオ キナーゼ （アデニル酸キナーゼ （以下 「 M K」 と略す。））、 ダル コ ース 6 リ ン酸脱水素酵素 （以下 「 G 6 P D H」 と略す。） 等の 酵素が血清に混入するこ と になる。 臨床検查項目によっては、 こ れらの酵素が測定値に影響を与えるため、 それぞれの酵素に対す る対策が図られてきた。 例えば、 グルコース成分を測定する場合 の溶血による測定誤差を回避するために、 NaF、 MgCl₂、 NaH₂P0₄ および抗凝固剤の混合物からなる臨床検査用解糖防止剤を用い ることが報告されており （特開平 5-126834公報）、 また M K活性 に対しては A P ₅Aが報告されている。

しかし、 酵素反応を利用した臨床検査の測定において、 試料に 含まれる赤血球中の成分によって生じる測定誤差、 すなわち溶血 干渉の問題は未だ十分に解決された状況とはいえない。 発明の開示

本発明の課題は、 生体試料について 6 ホスホダルコン酸を生成 しう る反応系を用いて被検物質を測定する場合に、 正確な測定値 を得るための測定方法を提供するこ とにある。

本発明者は、 上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 補酵素 でグルコースを測定する反応系の最終生成物は、 6 ホスホダルコ ン酸 （以下 「 6 P G」 と略す。） であるこ と に着目 し、 血球中の 6 P G脱水素酵素 （以下 「 6 P G D H」 と略す。） が N A D Pを 補酵素と して反応し、 グルコース測定系の結果と しての 6 P G値 に正誤差を与える こ とを見出した。

そこで、 補酵素でグルコースを測定する反応系において、 6 P G D Hを反応系外におく ことによ り 、 正確なグルコースの測定値 を得る方法を見出した。 従来は溶血時の 6 P G D H活性の影響は 報告されておらず、 本発明者が初めて見出したものである。 これ までは溶血の影響を M K活性や血球中のグルコース、 リ ン酸と し て考えて問題にしていなかったと考えられる。

すなわち本発明は、

1 - 生体試料について 6 P Gを生成し う 反応系を用いて被検 物質の測定する場合において、 6 P G D Hを反応系外におく こ と を特徴とする被検物質測定方法、

2. 6 P G D Hを反応系外におく 手段が、 反応系において 6 P G D Hと は反応 しない補酵素を用いる こ と を特徴とする前項 1 に記載の被検物質測定方法、

3 . 6 P G D H と は反応しない補酵素 と して NAD または Thio-NAD を用いるこ とを特徴とする前項 2 に記載の被検物質測 定方法、

4. 6 P G D Hを反応系外におく 手段と して、 6 P G D H活性 阻害剤を用いる こ と を特徴とする前項 1 に記載の被検物質測定 方法、

5 . 6 P G D Hを反応系外におく 手段と して、 抗 6 P G D H抗 体を用いるこ と を特徴とする前項 1 に記載の被検物質測定方法、

6 . さ らに乳酸脱水素酵素を反応系外に置く こ とを特徴とする 前項 1 〜 5のいずれか 1 に記載の被検物質測定方法、

7. 乳酸脱水素酵素を反応系外におく手段と してシユウ酸若し く はォキサミ ン酸、 またはそれらの塩類を含ませることを特徴と する前項 6 に記載の被検物質測定方法、

8 . 被検物質が、 グルコースを生成する反応系を用いて測定可 能な物質である こ と を特徴とする前項 1 〜 7 のいずれか 1 に記 載の測定方法、

9. 被検物質が、少なく と もへキソース、 中性脂肪、無機リ ン、 ク レアチンキナーゼ若 し く はそのアイ ソザィ ムまたはア ミ ラー ゼ若しく はそのアイ ソザィムから選ばれる 1 または 2以上の物 質である こ と を特徴とする前項 1 〜 8 のいずれか 1 に記載の測 定方法、 1 0 . 溶血によって生じる 6 P G D Hを反応系外におく ことを 特徴とする溶血干渉の回避方法、

1 1 . 前項 1〜 9 のいずれか 1 に記載の方法に必要な試薬をキ ッ ト化または単品で構成してなる試薬、 からなる。 図面の簡単な説明

第 1 図は、 グルコース測定に際し、 6 P Gを生成しう る反応系 を示す図である。

第 2図は、 中性脂肪 （ T G) 測定に際し、 6 P Gを生成しう る 反応系を示す図である。

第 3図は、 N A D反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図で ある （実施例 1 )。

第 4図は、 N A D P反応系での溶血液の吸光度の変動を示す図 である （実施例 1 )。

第 5図は、 グルコース測定値の変動を示す図である （実施例 2 ), 第 6図は、 中性脂肪測定値の変動を示す図である （実施例 3 )。 発明を実施するための最良の形態

本発明において、 生体試料について 6 P Gを生成しう る反応系 を用いて被検物質を測定する場合と は、 例えば上記試料について 酵素反応を利用 して、 補酵素でへキソースまたはリ ン酸化したへ キソースを測定する反応系が挙げられる。 ここでへキソース とは 六炭糖をいい、 代表的なものと してグルコースが挙げられる。 こ のよ う な測定系を用いて測定する臨床検査項目 と して、 ダルコ一 ス （ G L U)、 中性脂肪 （T G )、 無機リ ン （ I P )、 ク レアチン キナーゼ （ C P K；)、 シユーク ロース、 ィヌ リ ン、 尿素窒素 （ B U N )、 ク レアチェンなどが挙げられる。

例えば、 第 1 図および第 2図に示すよ う に、 グルコースや中性 脂肪について測定を行う に際し、 グルコースを生成する反応系を 用いた最終生成物は 6 P Gである。

補酵素でへキソースまたはリ ン酸化したへキソースを測定す る反応系では、 試料に溶血があった場合に、 測定値に正誤差を与 える現象があり 、 このよ う な現象を溶血干渉という。

これは溶血によ り 、 血球中の 6 P G D Hが測定系にて N A D P を補酵素と して 6 P Gと反応し、 その結果、 6 P Gの正確な測定 値が得られず、 干渉作用を起こすものと考えられた。 本発明は、 溶血によ り生じる 6 P G D Hが、 干渉作用をおこすこ と、 さ らに 上記測定系において 6 P G D Hを測定反応系外におく こ と によ り 、 溶血によ り 生じる干渉作用が回避されるこ とを見出したこ と である。

この 6 P G D Hを反応系外におく手段と しては、 反応系では 6 P G D Hとは反応しない補酵素を用いる こ と、 6 P G D Hの活性 阻害剤を用いるこ と、 6 P G D Hの抗体を添加するこ と若しく は 6 P G D Hを免疫除去する こと等が例示される。 さ らに、 本発明 者は、 6 P G D Hは N A D Pを捕酵素と して反応するが N A Dは 補酵素と して認識しないこ とをつき とめ、 N A Dで反応系を組む こ とによ り 、 6 P G D Hを測定反応系外におく こ と になるこ とを 見出し、 溶血の影響を回避した新規測定方法の発明を行った。

また、 N A Dまたは N A D Hは試料中の脱水素酵素、 特に乳酸 脱水素酵素 （以下 「 L D H」 という。 ； N A D依存） の影響を受 けるが、 シユ ウ酸、 ォキサミ ン酸またはそれらの塩類を含ませる こ とで完全に L D Hの影響も回避できるので、 この測定方法と組 み合わせるこ とができる。

また、 本発明の補酵素でへキソースまたはリ ン酸化したへキソ ース を測定する反応系は、 補酵素以外に、 H K、 G 6 P D H、 へ キソース、 G 6 Pから選ばれる酵素又は糖を一つまたは二つ以上 組み合わせて用いられる。 これらの酵素法によるグルコースの測 定法は広く公知である。

(実施例）

以下、 実施例によ り本発明を具体的に説明するが、 本発明はこ れら実施例に限定される も のではない。

(実施例 1 )

採血管で採血した後、 血液を 3000 rpmで遠心して人赤血球を 得た。 この赤血球を一 2 0 °Cで凍結し、 更に室温で溶解した。 こ のこ とによ り血球が破裂、 溶血成分を得た。 これを生理的食塩水 で希釈し、 ヘモグロ ビンと して 500mg/dL と した。 以下に示す試 薬を調製した。

0.1M ト リ エタ ノ ールァ ミ ン緩衝液 （ ρΗ7·5 ) に N A D Ρ 2.0mM、 6 P G l.OmM を溶解した試薬溶液 （試薬 A) 0.1M ト リ エタ ノールア ミ ン緩衝液 （pH7.5) に N A D 2.0mM、 6 P G l.OmMを溶解した試薬溶液 （試薬 B ) を調製した。

試薬 Aならびに試薬 Bを 3 7 °Cで 5分間加温後、 溶血した試料 を 15 μ L添加し、 波長 340〜750 nm における吸光度を 1 分お きに測定した。 この溶血液を測定したと ころ、 第 3図に示すよ う に N A Dを用いたときには吸光度の上昇は認められなかった。 一 方、 第 4図に示すよ う に N A D Pを補酵素と して反応させたとき には N A D P Hの 340 nm における吸光度が上昇した。この結果、 N A Dを用いる こ と によ り溶血干渉が回避される こ とが示唆さ れた。 (実施例 2 )

以下に示す試薬を調製し、 グルコース （ G L U ) の測定に供し た。

[第 1試薬]

ト リ ス 1 0 0 m M

H K 3 . 5 U / m L

G 6 P D H 5 . 0 U / m L

β - N Α Ό 3 mM

酢酸マグネシウム 1 0 m M

ρ Η 6 . 0

[第 2試薬]

卜 リ ス 2 0 0 mM

A Τ Ρ 6 mM

p H 9 . 0

また、 上記の試薬組成で ]3 N A Dの代わり に β 一 N A D Pを 用いた試薬も調製した。

[操作方法]

試料 に第 1試薬 210 i L、 第 2試薬を 70 /i L添加し、 主 波長 340ιιπιの条件で日立 7170型自動分析装置を用いてエン ドポ イ ン トアツセィを行い、 予め作成した検量線よ り グルコース濃度 を算出した。

溶血液を、 ヘモグロ ビン濃度が 0、 100、 200、 300、 400、 500 mg/dL となり、 人血清成分濃度は一定になるよ う に試料を調製し た。 第 5 図に示すよ う に、 N A D Pを補酵素と した試薬 Aはダル コース測定値がへモグロ ビン濃度依存的に上昇したが、 N A Dを 用いたと きには測定値の上昇が観られず、 溶血による正誤差を生 じなかった。へモグロ ビン濃度が 0 mg/dLの と きのグルコースは 80mg/dLであった。

(実施例 3 )

以下に示す試薬を調製し、 中性脂肪 （ T G ) の測定に供した。

[第 1試薬]

B i c i n e 5 0 m M 塩化カ リ ウム 1 0 0 m M 塩化マグネシゥム 1 0 m M ノ ニオン A— 1 O R 0 . 5 % ト リ ト ン X— 1 0 0 0 . 2 % ァジ化ナ ト リ ウム 0 . 1 % P E P 4 . 0 m M A T P 3 . 0 m M G 6 P D H 4 . 5 U / m L P K 3 . 0 U / m L G K 3 . 0 U /m L P H 8 . 5

[第 2試薬] M E S 5 0 m M シユウ酸 1 0 0 mM グ /レコース 8 0 mM ト リ トン X— 0 0 0 . 2 5 %

アジ化ナ ト リ ウム 0 . 1 %

A D P - H K 1 0. 0 U /m L Uパ一ゼ 1 5 0 O U/m L p H 6 . 5

また、 上記の試薬組成で /3 N A Dの代わり に — N A D Pを 用いた試薬も調製した。

測定操作は、 グルコース測定と同様に行い、 中性脂肪を測定し た。

溶血液を、 ヘモグロ ビン濃度が 0、 100、 200、 300、 400、 500 mg/dL となり、 人血清成分濃度は一定になるよ う に試料を調製し た。 第 6 図に示すよ う に、 N A D Pを補酵素と した試薬 Bは中性 脂肪測定値がヘモグロ ビン濃度依存的に上昇したが、 N A Dを用 いたと きには測定値の上昇が観られず、 溶血による正誤差を生じ なかった。 へモグロ ビン濃度が 0 mg/dL のときの中性脂肪の濃 度は 95 mg/dLであった。 産業上の利用分野

以上説明したよ う に、 生体試料について 6 ホスホダルコン酸を 生成しう る反応系を用いて被検物質の測定する場合において、 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素を反応系外におく こ とで、 溶血干渉 が防止でき、 被検物質の正確な測定値を得るこ とができた。

Claims

請求の範囲

1 . 生体試料について 6 ホスホダルコン酸を生成しう る反応系を 用いて被検物質の測定する場合において、 6 ホスホダルコン酸脱 水素酵素を反応系外におく こ と を特徴とする被検物質測定方法。

2 . 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段が、 反 応系において 6 ホスホダルコ ン酸脱水素酵素とは反応しない補 酵素を用いる こ と を特徴とする請求の範囲 1 に記載の被検物質 測定方法。

3 . 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素とは反応しない補酵素と して NAD または Thio-NAD を用いる こ とを特徴とする請求の範囲 2 に記載の被検物質測定方法。

4 . 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段と して 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素活性阻害剤を用いる こ と を特徴 とする請求の範囲 1 に記載の被検物質測定方法。

5 . 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素を反応系外におく手段と して 抗 6 ホス ホ ダルコ ン酸脱水素酵素抗体を用いる こ と を特徴とす る請求の範囲 1 に記載の被検物質測定方法。

6 . さ らに乳酸脱水素酵素を反応系外に置く ことを特徴とする請 求の範囲 1 〜 5 のいずれか 1 に記載の被検物質測定方法。

7 . 乳酸脱水素酵素を反応系外におく手段と してシユウ酸若しく はォキサミ ン酸、 またはそれらの塩類を含ませるこ とを特徴とす る請求の範囲 6 に記載の被検物質測定方法。

8 . 被検物質が、 グルコースを生成する反応系を用いて測定可能 な物質である こ と を特徴とする請求の範囲 1 〜 7 のいずれか 1 に記載の測定方法。

9 . 被検物質が、 少なく と もへキソース、 中性脂肪、 無機リ ン、 ク レアチンキナーゼ若しく はそのアイ ソザィムまたはア ミ ラー ゼ若しく はそのアイ ソザィ ムから選ばれる 1 または 2以上の物 質である こ と を特徴とする請求の範囲 1 〜 8 のいずれか 1 に記 载の測定方法。

1 0 . 溶血によって生じる 6 ホスホダルコン酸脱水素酵素を反応 系外におく こ とを特徴とする溶血干渉の回避方法。

1 1 . 請求の範囲 1 〜 9のいずれか 1 に記載の方法に必要な試薬 をキッ ト化または単品で構成してなる試薬。