DE19756238A1 - Unterbrecher für die Konjugationsdehydrogenasereaktion, Unterbrechungsverfahren und Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Unterbrecher für die Konjugationsdehydrogenasereaktion, ein Verfahren zur Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion und ein Kit für diesen Zweck. Genauer betrifft sie einen Unterbrecher zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion, die zur Umwandlung (Reduktion) der oxidierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid (nachfolgend als "NAD⁺" abgekürzt) oder der oxidierten Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (nachfolgend als "NADP⁺" abgekürzt) zur reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid (nachfolgend als "NADH" abgekürzt) oder zur reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (nachfolgend als "NADPH" abgekürzt) in einem System zur Messung einer spezifischen Substanz angewandt wird, insbesondere einer Glucose-6- phosphat-Dehydrogenase (nachfolgend als G6PDH" abgekürzt)- Reaktion, einer 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (nachfolgend als "6-PGDH" abgekürzt)-Reaktion oder einer L-Fucosedehydrogenase (nachfolgend als "FCDH" abgekürzt)- Reaktion, sowie ein Verfahren zur Beendigung der obigen Reaktionen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz, nach dem aus der spezifischen Substanz Ammoniak freigesetzt und die spezifische Substanz auf Grundlage des Ammoniaks gemessen wird, wobei in dem Verfahren die spezifische Substanz durch Eliminierung von intrinsischem Ammoniak, das von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, genau gemessen wird, sowie ein für die Messung verwendetes Kit.

Derzeit ist die klinische Untersuchung ein wesentlicher Bestandteil in der Diagnose eines Krankheitszustandes und der Bestimmung eines therapeutischen Effekts. Die klinische Untersuchung dient der Untersuchung einer organischen Funktion und wird grob eingeteilt in (1) eine Untersuchung direkter physiologischer Daten aus dem Inneren eines Organismus als Untersuchungsgegenstand (physiologische Untersuchung) und (2) eine Untersuchung von Veränderungen im Inneren eines Organismus durch Probennahme organischer Bestandteile wie beispielsweise Blut, Urin, Gewebe usw. (Probenuntersuchung).

Im Bereich der klinischen Untersuchungen werden aufgrund der nachfolgenden Vorteile weitverbreitet Enzymverfahren angewandt. (a) Ein Enzym besitzt eine Substratspezifität und eine exzellente Meßgenauigkeit und Meßempfindlichkeit. (b) Die Meßbedingungen sind moderat. (c) Die Messung kann leicht durchgeführt werden. (d) Es genügt eine geringe Probenmenge. (e) Es kann eine weniger teure Nachweisvorrichtung oder ein weniger teures Nachweisgerät (Kolorimeter oder Spektrophotometer) verwendet werden.

Bei der obigen Probenuntersuchung mittels eines Enzymverfahrens wird berücksichtigt, daß das Co-Enzym NAD(P)H (steht für NADH oder NADPH) eine Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm zeigt, und es ist eine übliche Praxis, die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Reaktionsmenge bei der Umwandlung von NAD(P)H zu NAD(P)⁺ (steht für NAD⁺ oder NADP⁺) auf Grundlage der Veränderung der Absorbanz bei einer Wellenlänge von 340 nm zu messen, wodurch die in einer Probe enthaltenen spezifischen Substanzen oder die Aktivitäten verschiedener Enzyme, die daran teilnehmen, bestimmt werden.

Wenn beispielsweise Harnstoffstickstoff als spezifische Substanz in einer Probe gemessen wird, wird üblicherweise ein Verfahren angewandt, worin die Abnahmegeschwindigkeit oder die Abnahmemenge von NAD(P)H zur quantitativen Bestimmung von Harnstoffstickstoff in einer Probe auf nachfolgender Grundlage gemessen wird. Wie folgendes Reaktionsschema zeigt

wird Harnstoff mit dem Enzym Urease unter Erzeugung von Ammoniak hydrolysiert, Glutamat-Dehydrogenase (nachfolgend als "GLDH" abgekürzt) reagiert mit dem erzeugten Ammoniak in Gegenwart von α-Ketoglutarsäure (α-KG) und NAD(P)H (steht für NADH oder NADPH), und durch diese Reaktion wird NAD(P)H zu NAD(P)⁺ (steht für NAD⁺ oder NADP⁺) umgewandelt.

In einigen Fällen wird jedoch Ammoniak, das mit dem als Zwischenprodukt gebildeten Ammoniak identisch ist, bereits in einer Probe vorliegen, und es ist daher erforderlich, das Ammoniak durch eine Vorbehandlung zu entfernen. Die Entfernung wird üblicherweise mit α-KG, NAD(P)H und GLDH durchgeführt. Wenn die Menge an NAD(P)H jedoch groß ist, wird bei der Messung der spezifischen Substanz ein Problem hervorgerufen. Wenn die Menge an NAD(P)H abnimmt, kann die Menge an NAD(P)H zur effektiven Entfernung von Ammoniak unzureichend sein. Es ist ein Verfahren bekannt, in dem Isocitrat-Dehydrogenase (ICDH) als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, die einen Mangel an NAD(P)H abdeckt, und aus NAD(P)H gebildetes NAD(P)⁺ wird in Gegenwart von ICDH zu NAD(P)H regeneriert.

Ferner ist ein Verfahren offenbart, in dem die Reaktion der obigen ICDH durch Zugabe von ATP (Adenosin-5'-triphosphat) oder eines Chelatisierungsmittels in das Meßsystem der spezifischen Substanz terminiert wird, wodurch die spezifische Substanz genau gemessen wird (JP-B-6-73475, JP-B-6-73476 und JP-B-75516).

In dem obigen Verfahren kann die Zugabe von ATP in ein Reaktionssystem, in dem ATP gebildet wird, jedoch einen Nachteil hervorrufen, wenn eine spezifische Substanz gemessen wird. Wenn die Reaktion ferner durch Zugabe eines Chelatisierungsmittels beendet wird, kann das Metall­ benötigende Enzym stark inhibiert werden, wenn das Metall­ benötigende Enzym an dem Meßsystem der spezifischen Substanz beteiligt ist. Daher weist das obige Verfahren den Nachteil auf, daß das Meßsystem für eine spezifische Substanz, auf das das Verfahren angewandt werden kann, unvermeidlich limitiert ist.

Ferner wurde als ein Verfahren zur Abdeckung eines Mangels an NAD(P)H ein Verfahren vorgeschlagen, in dem NAD(P)H unter Verwendung von Glucose und Glucose-Dehydrogenase regeneriert wird (JP-A-5-103697). Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Regenerierung von NAD(P)H unzureichend ist, da die K_m (Michaelis-Konstante) von Glucose-Dehydrogenase mit Glucose relativ groß ist, d. h. ungefähr 10⁻² mol/l.

Zur Abdeckung eines Mangels an NAD(P)H ist es denkbar, ein Verfahren unter Verwendung einer G6PDH-Reaktion, einer 6-PGDH-Reaktion oder einer FCDH-Reaktion anzuwenden. In diesem Falle ist es jedoch schwierig, diese Reaktionen mit ATP oder ADP (Adenosin-5'-diphosphat), das allgemein als G6PDH-Inhibitor, als 6-PGDH-Inhibitor oder als FCDH-Inhibitor bekannt ist, vollständig zu beendigen.

Es ist daher gegenwärtig erwünscht, ein neues Verfahren zu entwickeln, in dem Ammoniak mit GLDH, α-KG, einer Konjugationsdehydrogenase und dessen Substrat eliminiert und die Konjugationsdehydrogenase anschließend effektiv inhibiert wird, und ferner eine Komponente, die zur Erzeugung von Ammoniak aus einer spezifischen Substanz dient, mit der spezifischen Substanz umgesetzt wird, wodurch die spezifische Substanz in der Probe genau gemessen wird.

Darüber hinaus entwickeln sich die klinischen Untersuchungen in den letzten Jahren in Richtung Mikroanalyse und sofortige Anwendbarkeit im Bereich der medizinischen Praxis, weshalb eine hohe Empfindlichkeit und eine kurze Meßdauer wesentliche Bedingungen für ein Testreagens sind. Zur Verringerung der Reaktionszeit ist es erforderlich, eine Erhöhung der Enzym- Konzentration (V_max) oder ein Enzym mit einem geringen K_m-Wert auszuwählen. Die Erhöhung der Enzym-Konzentration weist jedoch hinsichtlich der Kosten einen begrenzenden Faktor auf, und es besteht die Tendenz, ein Enzym zu verwenden, das eine hohe Affinität zu dem Substrat besitzt, so daß es wünschenswert ist, ein Enzym mit einem niedrigen K_m-Wert zu verwenden.

Unter diesen Umständen ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, einen Unterbrecher zur effektiven Beendigung der Reaktion einer Konjugationsdehydrogenase wie beispielsweise G6PDH, 6-PGDH, FCDH usw. bereitzustellen, die zur Konvertierung von in einer Vorbehandlung erzeugtem NAD(P)⁺ zu NAD(P)H verwendet wird, insbesondere in einem System zur Messung einer spezifischen Substanz in einer Probe, und ein Verfahren zur Unterbrechung der Reaktion der Konjugationsdehydrogenase.

Ferner ist es ein erfindungsgemäßes Ziel, ein Verfahren zur Erzeugung von Ammoniak aus einer spezifischen Substanz und Messung der spezifischen Substanz auf Basis des gebildeten Ammoniaks bereitzustellen, das Verfahren umfaßt die genaue Messung der spezifischen Substanz in einer Probe durch vorhergehende entfernt von Ammoniak, das einen Meßfehler hervorruft, sowie ein Kit zur Verwendung in diesem Verfahren.

Die hiesigen Erfinder haben zum Erreichen der obigen Ziele sorgfältige Studien durchgeführt, und haben als Ergebnis herausgefunden, daß zur Unterbrechung der Konjugationsdehydrogenasereaktion ein Benetzungsmittel bemerkenswert wirksam ist. Ferner haben die hiesigen Erfinder folgendes herausgefunden. Wenn α-Kg und GLDH zur Umwandlung von intrinsischem Ammoniak zu Glutaminsäure mit dem intrinsischem Ammoniak umgesetzt werden, wird das Ammoniak bei gleichzeitiger Anwesenheit einer Konjugationsdehydrogenase und eines Substrates davon eliminiert, und nach der Eliminierung wird zur Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion ein Benetzungsmittel zugegeben. Gleichzeitig mit oder nach der Beendigung wird Ammoniak aus einer spezifischen Substanz in der Probe durch Einwirkung des Enzyms gebildet, α-KG, GLDH und NAD(P)H werden mit dem erzeugten Ammoniak umgesetzt, und die Abnahme des NAD(P)H wird gemessen, wodurch die spezifische Substanz in der Probe bemerkenswert genau gemessen werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage der obigen Befunde vervollständigt.

Folglich wird erfindungsgemäß ein Unterbrecher für eine Konjugationsdehydrogenasereaktion bereitgestellt, der ein Benetzungsmittel enthält.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion bereitgestellt, das die Reaktion einer Konjugationsdehydrogenase und eines Substrates der Konjugationsdehydrogenase, wodurch NAD⁺ oder NADP⁺ zu NADH bzw. NADPH kovertiert wird, und anschließende Zugabe eines Benetzungsmittels zur Beendigung der Reaktion umfaßt.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz in einer Probe bereitgestellt, nach dem Ammoniak aus der spezifischen Substanz gebildet und das Ammoniak gemessen wird, umfassend die Eliminierung von intrinsischem Ammoniak in der Probe unter Einwirkung von Glutamat-Dehydrogenase, α-Ketoglutarsäure, entweder NADH oder NADPH, einer Konjugationsdehydrogenase und einem Substrat der Konjugationsdehydrogenase, Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion unter Einwirkung eines Benetzungsmittels, Zugabe einer Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der umzusetzenden spezifischen Substanz gleichzeitig mit oder nach der Beendigung, wodurch Ammoniak gebildet wird, und Messung des gebildeten Ammoniaks.

Ferner wird erfindungsgemäß ein Kit zur Messung einer spezifischen Substanz bereitgestellt, das als wesentliche Bestandteile (A) ein Reagens, das Glutamat-Dehydrogenase, α-Ketoglutarsäure, entweder NADH oder NADPH, eine Konjugationsdehydrogenase und ein Substrat der Konjugationsdehydrogenase einschließt, und (B) ein Reagens, das eine Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz und ein Benetzungsmittel einschließt, umfaßt.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel der Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von G6PDH (mit bakteriellem Ursprung) als Konjugationsdehydrogenase in der Messung von Harnstoffstickstoff und einem herkömmlichen Verfahren, in dem ein kommerziell erhältliches Kit zur gleichen Messung verwendet wird.

Fig. 2 zeigt ein weiteres Beispiel der Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von G6PDH (aus Hefe) als Konjugationsdehydrogenase bei der Messung von Harnstoffstickstoff und einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits in der gleichen Messung.

Fig. 3 zeigt ein weiteres Beispiel der Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von 6-PGDH (aus Hefe) als Konjugationsdehydrogenase bei der Messung von Harnstoffstickstoff und einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits in der gleichen Messung.

Fig. 4 zeigt ein weiteres Beispiel der Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von FCDH (mit bakteriellem Ursprung) als Konjugationsdehydrogenase bei der Messung von Harnstoffstickstoff und einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits in der gleichen Messung.

Zunächst wird der erfindungsgemäß bereitgestellte Unterbrecher für die Konjugationsdehydrogenasereaktion erläutert.

Der erfindungsgemäße Unterbrecher enthält ein Benetzungsmittel und ist besonders wirksam, wenn die Konjugationsdehydrogenase eine G6PDH-Reaktion, eine 6-PGDH- Reaktion oder eine FCDH-Reaktion darstellt.

Erfindungsgemäß verwendetes G6PDH ist ein Enzym, das eine Reaktion nach dem Reaktionsschema (a)

Glucose-6-phosphat + NADP⁺ → 6-Phosphoglucono-δ-lacton + NADPH + H⁺ (a)

katalysiert, und wird in einem Pentosephosphat-Zyklus (ein Weg des Glucose-Metabolismus') gefunden. Es ist G6PDH mit bakteriellem Ursprung sowie aus Hefe bekannt. Aus Bakterien stammendes G6PDH katalysiert nicht nur NADP⁺ sondern auch NAD⁺ als ein Coenzym in der Reaktion gemäß dem Reaktionsschema (b).

Glucose-6-phosphat + NAD⁺ → 6-Phosphoglucono-δ-lacton + NADH + H⁺ (b)

Aus Hefe stammendes G6PDH katalysiert die obige Reaktion (b) jedoch nicht.

G6PDH besitzt eine Substrataffinität und hat einen K_m-Wert von 3,5 × 10⁻⁵ mol/l (Glucose-6-phosphat) und einen K_m von 4,2 × 10⁻⁶ mol/l (NADP⁺). Die Enzymaktivität von G6PDH aus Bakterien wird relativ leicht durch ein kationisches Benetzungsmittel inhibiert, und die Enzymaktivität von G6PDH aus Hefe wird relativ leicht durch anionisches Benetzungsmittel inhibiert. Aus Bakterien stammendes G6PDH und aus Hefe stammendes G6PDH sind daher beide bevorzugt.

Erfindungsgemäß verwendetes 6-PGDH ist ein Enzym, das eine Reaktion gemäß dem Reaktionsschema (c) oder (d) katalysiert

6-Phosphogluconsäure + NADP⁺ → Ribulose-5-phosphat + CO₂ + NADPH + H⁺ (c)

6-Phosphogluconsäure + NAD⁺ → Ribulose-5-phosphat + CO₂ + NADH + H⁺ (d)

und wird in einem Pentosephosphat-Zyklus (einem Wege des Glucose-Metabolismus') gefunden. Es ist 6-PGDH aus tierischer Leber, 6-PGDH aus Human-Erythrozyten, 6-PGDH aus Bakterien und 6-PGDH aus Hefe bekannt. 6-PGDH aus Hefe katalysiert die obige Reaktion (c) wohingegen es die Reaktion (d) nicht katalysiert. Ferner schließt aus Bakterien stammendes 6-PGDH solches ein, daß nur die obige Reaktion (c) katalysiert, solches, das die obige Reaktion (d) katalysiert und solches, das beide obigen Reaktionen (c) und (d) katalysiert.

6-PGDH besitzt eine hohe Substrataffinität, und hat einen K_m-Wert von 5,4 × 10⁻⁵ mol/l (6-Phosphogluconsäure) und einen K_m-Wert von 2,0 × 10⁻⁵ mol/l (NADP⁺).

Als 6-PGDH ist aus Hefe stammendes 6-PGDH bevorzugt, da seine Enzymaktivität relativ leicht durch kationisches Benetzungsmittel inhibiert werden kann.

Erfindungsgemäß verwendetes FCDH ist hingegen ein Enzym, das eine Reaktion gemäß dem Reaktionsschema (e) oder (f) katalysiert

L-Fucose + NADP⁺ → L-Fucono-δ-lacton + NADPH + H⁺ (e)

L-Fucose + NAD⁺ → L-Fucono-δ-lacton + NADH + H⁺ (f)

und es ist aus tierischer Leber stammendes FCDH und aus Bakterien stammendes FCDH bekannt. FCDH besitzt eine hohe Substrataffinität, und hat einen K_m-Wert von 1,9 × 10⁻³ mol/l (L-Fucose) und einen K_m-Wert von 1,6 × 10⁻⁵ mol/l (NADP⁺).

Als FCDH ist ein aus Bakterien stammendes FCDH bevorzugt, da dessen Enzymaktivität relativ leicht durch ein kationisches Benetzungsmittel inhibiert werden kann.

Das obige kationische Benetzungsmittel ist nicht sonderlich beschränkt und kann ein beliebiges kationisches Benetzungsmittel sein, sofern es die Reaktion von aus Bakterien stammendem G6PGDH, die Reaktion von aus Hefe stammendem 6-PGDH oder die Reaktion von aus Bakterien stammendem FCDH wirksam inhibieren kann. Bevorzugt ist ein kationisches Benetzungsmittel, das nur die obige G6PDH, 6-PGDH oder FCDH in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in einer Probe inhibiert und im wesentlichen keine weiteren Beeinflussungen hervorruft. Hinsichtlich der Fähigkeit zur Inhibierung von G6PDH, 6-PGDH oder FCDH und der Löslichkeit wird das obige kationische Benetzungsmittel vorzugsweise ausgewählt aus einem quaternären Ammoniumsalz der Formel (I):

worin R¹, R² und R³ unabhängig voneinander eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, X^m⁻ ist ein Anion mit einer Valenz von m, m ist 1 oder 2, und n ist eine ganze Zahl von 9 bis 17, oder
einem quaternärem Ammoniumsalz der Formel (II)

worin X^q⁻ ein Anion mit der Valenz q darstellt, q ist 1 oder 2, und p ist eine ganze Zahl von 9 bis 17.

In der obigen Formel (1) ist R¹, R² und R³ jeweils eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl- Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen. Die obige Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen kann linear oder verzweigt sein, und Beispiele schließen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl und Octyl ein. Beispiele für die Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen schließen Cyclopentyl und Cyclohexyl ein. Beispiele für die Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen schließen Phenyl, Tolyl, Xylyl und Naphthyl ein. Beispiele für die Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen schließen Benzyl und Phenethyl ein. Jedes von R¹, R² und R³ kann mit den anderen identisch sein, oder kann von den unteren unterschiedlich sein.

Beispiele für 1/mX^m⁻ in Formel (1) oder 1/qX^q⁻ in Formel (2) schließen Halogen-Ionen wie beispielsweise F⁻, Cl⁻, Br⁻ und I⁻, sowie NO₃⁻, 1/2SO₄ ²⁻, 1/2SO₃ ²⁻, CH₃SO₄⁻ und p-Toluolsulfonsäure-Ionen ein.

Ferner ist, wenn n in Formel (I) oder p in Formel (II) 8 oder weniger ist, die Inhibitionsfähigkeit gegenüber G6PDH, 6-PGDH und FCDH in einigen Fällen unzureichend. Wenn das obige n oder p 18 oder mehr beträgt, ist die Löslichkeit des Benetzungsmittels in einigen Fällen schlecht. Daher sind n und p vorzugsweise 9 bis 17. Beispiele für die Gruppe CH₃(CH₂)_n oder CH₃(CH₂)_p schließen Decyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl und Octadecyl ein.

Beispiele für das quaternäre Ammoniumsalz der obigen Formel (I) oder (II) schließen Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Tetradecyltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltriethylammoniumchlorid, Tetradecyltriethylammoniumchlorid, Dodecyldimethylbenzylammoniumchlorid, Tetradecyldimethylbenzylammoniumchlorid, Dodecyldiethylbenzylammoniumchlorid, Tetradecyldiethylbenzylammoniumchlorid, Decylpyridiniumchlorid, Dodecylpyridiniumchlorid, Tetradecylpyridiniumchlorid ein, sowie die diesen Chloriden entsprechenden Bromide und Jodide. Die obigen quaternären Ammoniumsalze können alleine oder in Kombination miteinander verwendet werden.

Vorzugsweise inhibiert der erfindungsgemäß bereitgestellte Reaktionsunterbrecher, der das obige kationische Benetzungsmittel enthält, die Aktivität von aus Bakterien stammende G6PDH, aus Hefe stammende 6-PGDH oder aus Bakterien stammende FCDH besonders gut und bewirkt eine effektive Beendigung der Reaktion von G6PDH, 6-PGDH oder FCDH. Als kationisches Benetzungsmittel wird daher vorteilhafterweise ein kationisches Benetzungsmittel ausgewählt, mit dem folgendes erzielt wird. Wenn beispielsweise ein kationisches Benetzungsmittel zu einer Probenlösung hinzugegeben wird, die 0,01 U/ml aus Bakterien stammende G6PDH, aus Hefe stammende 6-PGDH oder aus Bakterien stammende FCDH enthält, wodurch eine Lösung mit einer kationischen Benetzungsmittelkonzentration von 0,6 g/100 ml gebildet wird, und diese Lösung für 4 min auf 37°C erwärmt wird, so wird die Aktivität von G6PDH, 6-PGDH oder FCDH so inhibiert, daß sie auf 10% oder weniger abnimmt.

Der erfindungsgemäße Reaktionsunterbrecher kann bei Bedarf zusätzlich zu dem kationischen Benetzungsmittel andere Inhibitoren gegen G6PDH, 6-PGDH oder FCDH enthalten, solange das erfindungsgemäße Ziel nicht beeinträchtigt wird.

Darüber hinaus kann das obige anionische Benetzungsmittel ein beliebiges anionisches Benetzungsmittel sein, das die Reaktion von aus Hefe erhaltenem G6PDH effektiv beenden kann und ist nicht sonderlich beschränkt. Bevorzugt ist ein anionisches Benetzungsmittel, das nur das obige G6PDH in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in einer Probe deaktiviert und weitestgehend keine weiteren Beeinflussungen hervorruft. Beispiele für das obige anionische Benetzungsmittel schließen Alkyl(oder Alkenyl)sulfonate der Formel (III) ein,

R⁴SO₃⁻ . 1/a(M¹)^a⁺ (III)

worin R⁴ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl- Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellt, (M¹)^a⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von a, und a ist 1 oder 2, sowie Alkylbenzolsulfonate der Formel (IV),

worin R⁵ eine lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen ist, (M²)^b⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von b, und b ist 1 oder 2, und
Polyoxyethylenalkyl(oder -alkenyl)ethersulfate der Formel (V),

R⁶O-(C₂H₄O)_c-SO₃⁻ . 1/k(M³)^k⁺ (V)

worin R⁶ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl- Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellt, (M³)^k⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von k, k ist 1 oder 2, und c ist eine ganze Zahl von mindestens 1.

In der obigen Formel (III) ist R⁴ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe schließen Octyl, Decyl, Dodecyl, Hexadecyl, Octadecyl und Oleyl ein. Beispiele für (M¹)^a⁺ schließen Natrium-, Kalium- und Calcium-Ionen ein.

Spezifische Beispiele für das Alkyl(oder Alkenyl)sulfonat der Formel (III) schließen Natriumdecansulfonat, Natriumdodecansulfonat, Kaliumdecansulfonat und Kaliumdodecansulfonat ein.

In der obigen Formel (IV) ist R⁵ eine lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe schließen Octyl, Nonyl, Decyl oder Dodecyl ein. Beispiele für (M²)^b⁺ schließen Natrium-, Kalium- und Calcium-Ionen ein.

Spezifische Beispiele für das Alkylbenzolsulfonat der Formel (IV) schließen Natriumoctylbenzolsulfonat, Natriumdodecylbenzolsulfonat, Kaliumoctylbenzolsulfonat und Kaliumdodecylbenzolsulfonat ein.

In der obigen Formel (V) ist R⁶ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele für die lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe schließen Octyl, Decyl, Lauryl, Myristyl, Palmityl, Stearyl und Oleyl ein. Beispiele für (M³)^k⁺ schließen Natrium-, Kalium- und Calcium-Ionen ein.

Spezifische Beispiele für das Polyoxyethylenalkyl (oder -alkenyl)ethersulfonat der Formel (V) schließen Natriumpolyoxyethylenlaurylethersulfat, Natriumpolyoxyethylenstearylethersulfat, Natriumpolyoxyethylenoleylethersulfat, Kaliumpolyoxyethylenlaurylethersulfat, Kaliumpolyoxyethylenstearylethersulfat und Kaliumpolyoxyethylenoleylethersulfat ein.

Erfindungsgemäß können die obigen anionischen Benetzungsmittel alleine oder in Kombination miteinander verwendet werden.

Vorzugsweise inhibiert der erfindungsgemäß bereitgestellte Reaktionsunterbrecher, der das obige anionische Benetzungsmittel enthält, besonders wirksam die Aktivität von aus Hefe stammender G6PDH, und bewirkt eine effektive Beendigung der Reaktion von G6PDH. Als anionisches Benetzungsmittel ist es daher vorteilhaft, ein anionisches Benetzungsmittel auszuwählen, mit dem folgendes erzielt wird. Wenn beispielsweise ein anionisches Benetzungsmittel zu einer Probenlösung hinzugegeben wird, die 0,01 U/ml aus Hefe stammendes G6PDH enthält, wodurch eine Lösung gebildet wird, die eine anionische Benetzungsmittelkonzentration von 0,3 g/100 ml aufweist, und diese Lösung für 4 min auf 37°C erwärmt wird, so wird die Aktivität von G6PDH so inhibiert, daß sie auf 10% oder weniger abnimmt.

Der erfindungsgemäße Reaktionsunterbrecher kann bei Bedarf zusätzlich zu dem anionischen Benetzungsmittel einen weiteren G6PDH-Inhibitor enthalten, so lange das erfindungsgemäße Ziel nicht beeinträchtigt wird.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte Verfahren zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion wird nachfolgend erläutert.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Beendigungen Konjugationsdehydrogenasereaktion wird NAD⁺ oder NADP⁺ unter Einwirkung einer Konjugationsdehydrogenase und eines Substrates der Konjugationsdehydrogenase zu NADH oder NADPH kovertiert, und dann wird die Reaktion unter Einwirkung des Benetzungsmittels beendet.

In dem obigen Verfahren ist der Ursprung des NAD(P)⁺ nicht sonderlich beschränkt, wobei NAD(P)⁺, das durch die Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird, bevorzugt ist. Das Benetzungsmittel ist vorzugsweise ein Benetzungsmittel, das die Konjugationsdehydrogenase weitestgehend desaktiviert, jedoch keine weiteren Beeinflussungen in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in einer Probe hervorruft.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion schließt drei Ausführungsformen ein, (1) ein Verfahren zur Beendigung einer G6PDH-Reaktion, (2) ein Verfahren zur Beendigung einer 6-PGDH-Reaktion und (3) ein Verfahren zur Beendigung einer FCDH-Reaktion.

In dem obigen Verfahren (1) zur Beendigung einer G6PDH- Reaktion wird NAD(P)⁺ unter Einwirkung von G6PDH und Glucose- 6-phosphat zu NAD(P)H umgewandelt, und anschließend wird die Reaktion durch Zugabe eines kationischen Benetzungsmittels oder eines anionischen Benetzungsmittels beendet. Der Ursprung des NAD(P)⁺ ist nicht sonderlich beschränkt, wobei NAD(P)⁺, das durch Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird, bevorzugt ist.

Wenn das NAD(P)⁺ dasjenige ist, das durch Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird, so ist das kationische Benetzungsmittel vorzugsweise eines, das G6PDH weitestgehend deaktiviert, jedoch keine weiteren Beeinflussungen in dem System hervorruft.

Es ist wesentlich, daß, wenn das G6PDH aus Bakterien stammende G6PDH ist, ein kationisches Benetzungsmittel verwendet wird, und wenn die G6PDH aus Hefe stammende G6PDH ist, ein anionisches Benetzungsmittel verwendet wird.

Die Menge des obigen kationischen oder anionischen Benetzungsmittels ist nicht sonderlich beschränkt, so lange es zur Beendigung der G6PDH-Reaktion ausreicht und im wesentlichen keine weitere Beeinflussungen in dem Meßsystem hervorruft. Beispielsweise ist bei Benutzung des kationischen Benetzungsmittels dessen Menge vorzugsweise so eingestellt, daß die Endkonzentration pro 1,0 U/ml G6PDH im allgemeinen 0,01 bis 2,00 g/100 ml beträgt, vorzugsweise 0,05 bis 1,00 g/100 ml, weiter bevorzugt 0,1 bis 0,5 g/100 ml. Wenn das anionische Benetzungsmittel verwendet wird, so ist dessen Menge vorzugsweise so eingestellt, daß die Endkonzentration pro 1,0 U/ml G6PDH im allgemeinen 0,01 bis 1,00 g/100 ml beträgt, vorzugsweise 0,05 bis 0,50 g/100 ml, weiter bevorzugt 0,1 bis 0,3 g/100 ml. Wenn ferner mindestens zwei kationische Benetzungsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, oder wenn mindestens zwei anionische Benetzungsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, so kann deren Gesamtmenge innerhalb des oben angegebenen Bereiches eingestellt werden. Wenn die Konzentration des Benetzungsmittels zu niedrig ist, so ist die Unterbrechung der G6PDH-Reaktion in unerwünschter Weise unzureichend. Wenn die Konzentration des Benetzungsmittel zu hoch ist, so kann das Benetzungsmittel in unerwünschter Weise eine andere Komponente in dem Meßsystem beeinflussen.

Es wird angenommen, daß das erfindungsgemäße Phänomen auf Grundlage der gegenseitigen Aktivitäten des kationischen Benetzungsmittels oder des anionischen Benetzungsmittels und des Enzyms aufeinander erklärt werden kann. D.h., daß das kationische Benetzungsmittel oder das anionische Benetzungsmittel eine proteindenaturierende Aktivität zeigt, wodurch das Enzym desaktiviert wird. Wenn ein anderes verwendetes Konjugationsenzym unter den Bedingungen, unter denen G6PDH desaktiviert wird, im wesentlichen kaum denaturiert, so kann G6PDH zur Regeneration von NAD(P)H verwendet werden.

Die Reaktion in dem obigen erfindungsgemäßen Beendigungsverfahren kann anhand des folgenden Reaktionsschemas gezeigt werden.

Glucose-6-phosphat (G6P) und NAD(P)⁺ werden unter Einwirkung von G6PDH zu 6-Phosphoglucono-δ-lacton bzw. NAD(P)H konvertiert, wohingegen diese Reaktion durch Einwirkung des Benetzungsmittels beendet wird.

Andererseits wird in dem obigen Verfahren (2) zur Unterbrechung von 6-PGDH NAD(P)⁺ unter Einwirkung von 6-PGDH und 6-Phosphogluconsäure zu NAD(P)H konvertiert, und dann wird diese Reaktion durch Einwirkung eines kationischen Benetzungsmittels beendet. Der Ursprung des obigen NAD(P)⁺ ist nicht sonderlich beschränkt, wobei NAD(P)⁺ bevorzugt ist, das durch die Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird.

Wenn NAD(P)⁺ dasjenige ist, das durch die Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird, so ist das kationische Benetzungsmittel vorzugsweise dasjenige, das 6-PGDH weitestgehend deaktiviert, und das keine anderen Beeinflussungen in dem System hervorruft.

Die Menge des obigen kationischen Benetzungsmittels ist nicht sonderlich beschränkt, so lange es zur Unterbrechung der 6-PGDH-Reaktion ausreicht und weitestgehend keine weiteren Beeinflussungen in dem Meßsystem hervorruft. Beispielsweise wird die Menge des kationischen Benetzungsmittels vorzugsweise so eingestellt, daß die Endkonzentration pro 1,0 U/ml an 6-PGDH im allgemeinen 0,01 bis 2,00 g/100 ml beträgt, vorzugsweise 0,05 bis 1,00 g/100 ml, weiter bevorzugt 0,1 bis 0,5 g/100 ml. Wenn darüber hinaus mindestens zwei kationische Benetzungsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, so kann deren Gesamtmenge innerhalb des oben angegebenen Bereiches eingestellt werden. Wenn die Konzentration an kationischem Benetzungsmittel zu gering ist, so wird die Unterbrechung der 6-PGDH-Reaktion in unerwünschter Weise unzureichend. Wenn die Konzentration des Benetzungsmittel zu hoch ist, so kann das Benetzungsmittel in unerwünschter Weise eine Beeinflussung anderer Komponenten in dem Meßsystem hervorrufen.

Die Reaktionen des obigen erfindungsgemäßen Unterbrechungsverfahrens wird anhand des folgenden Reaktionsschemas gezeigt.

6-Phosphogluconsäure (6-PG) und NAD(P)⁺ werden unter Einwirkung von 6-PGDH zu Ribulose-5-phosphat und CO₂ bzw. NAD(P)H konvertiert, wohingegen diese Reaktion durch Einwirkung des kationischen Benetzungsmittels beendet wird.

In dem obigen Verfahren (3) zur Beendigung einer FCDH- Reaktion wird NAD(P)⁺ unter Einwirkung von FCDH und L-Fucose zu NAD(P)H konvertiert, und dann wird diese Reaktion durch Einwirkung eines kationischen Benetzungsmittels beendet. Der Ursprung des obigen NAD(P)⁺ ist nicht sonderlich beschränkt, wobei NAD(P)⁺ bevorzugt ist, das durch die Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird.

Wenn das NAD(P)⁺ dasjenige ist, das durch die Vorbehandlung einer Probe in dem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird, so ist das kationische Benetzungsmittel vorzugsweise dasjenige, das FCDH weitestgehend deaktiviert, aber keine weiteren Beeinflussungen in dem System hervorruft.

Die Menge des obigen kationischen Benetzungsmittels ist nicht sonderlich beschränkt, so lange sie zur Unterbrechung der FCDH-Reaktion ausreicht und im wesentlichen keine weitere Beeinflussung des Meßsystems hervorruft. Beispielsweise wird die Menge an kationischem Benetzungsmittel so eingestellt, daß die Endkonzentration pro 1,0 U/ml an FCDH im allgemeinen 0,01 bis 2,00 g/100 ml beträgt, vorzugsweise 0,05 bis 1,00 g/100 ml, weiter bevorzugt 0,1 bis 0,5 g/100 ml. Wenn darüber hinaus mindestens zwei kationische Benetzungsmittel in Kombination miteinander verwendet werden, so kann deren Gesamtmenge innerhalb des oben angegebenen Bereichs eingestellt werden. Wenn die Konzentration des kationischen Benetzungsmittels zu niedrig ist, so wird die Unterbrechung der FCDH-Reaktion in unerwünschter Weise unzureichend. Wenn die Konzentration des Benetzungsmittels zu hoch ist, so kann das Benetzungsmittel in unerwünschter Weise eine Beeinflussung einer anderen Komponente in dem Meßsystem hervorrufen.

Die Reaktion des obigen erfindungsgemäßen Unterbrechungsverfahrens wird anhand des nachfolgenden Reaktionsschemas gezeigt.

L-Fucose (FC) und NAD(P)⁺ werden unter Einwirkung von FCDH zu L-Fucono-δ-lacton bzw. NAD(P)H konvertiert, wohingegen diese Reaktion durch Einwirkung des kationischen Benetzungsmittels beendet wird.

Erfindungsgemäß ist es bedeutsam, daß das verwendete Benetzungsmittel die Konjugationsdehydrogenase wie oben beschrieben selektiv inhibiert. Es ist noch nicht klar, wie das Benetzungsmittel die Konjugationsdehydrogenase inhibiert, es wird jedoch folgendes angenommen.

Wenn etwas Benetzungsmittel auf eine Konjugationsdehydrogenase einwirken kann, so werden einige Moleküle des Benetzungsmittels unter Bildung eines Komplexes an die Konjugationsdehydrogenase gebunden. In dem Komplex besitzt die Konjugationsdehydrogenase aufgrund der Ladung des Benetzungsmittels einen anderen Ladungszustand als denjenigen, der der Konjugationsdehydrogenase inhärent ist. Ferner wird angenommen, daß der ionische Zustand der Konjugationsdehydrogenase in einer Enzymreaktion besonders bedeutsam ist, da NAD(P)⁺, das ein Ion aufweist, zu NAD(P)H umgewandelt wird. Daher hat die an das Benetzungsmittel gebundene Konjugationsdehydrogenase einen Ladungszustand, der von dem der Konjugationsdehydrogenase inhärenten Ladungszustand unterschiedlich ist, und folglich kann sie die Enzymreaktion nicht leicht bewirken, in der der ionische Zustand von Bedeutung ist. Als Ergebnis kann das verwendete Benetzungsmittel die Konjugationsdehydrogenasereaktion selektiv inhibieren. Wenn ein nicht-ionisches Benetzungsmittel als Benetzungsmittel verwendet wird, so inhibiert das nicht-ionische Benetzungsmittel die Konjugationsdehydrogenasereaktion kaum, was die obige Erklärung unterstützt.

Nachfolgend wird wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz erläutert.

Als ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz durch Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz in einer Probe und Messung des Ammoniaks ist ein Verfahren bekannt, worin GLDH mit dem erzeugten Ammoniak in Gegenwart von α-Ketoglutarsäure (α-KG) und NAD(P)H umgesetzt wird, wodurch eine GLDH-Reaktion gemäß der Reaktion A in dem Schema (j) hervorgerufen wird:

und die Abnahme an NAD(P)H wird als Abnahmegeschwindigkeit der Absorbanz bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen, wodurch die spezifische Substanz quantitativ bestimmt wird.

Wenn in dem obigen Reaktionsschema (j) G6PDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, so wird das Reaktionsschema (j) nach dem folgenden Reaktionsschema (j-1) wiedergegeben.

Wenn in dem obigen Reaktionsschema (j) 6-PGDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, so wird das Reaktionsschema (j) nach dem folgenden Reaktionsschema (j-2) wiedergegeben.

Wenn in dem obigen Reaktionsschema (j) FCDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, so wird das Reaktionsschema (j) nach dem folgenden Reaktionsschema (j-3) wiedergegeben.

Wenn in dem obigen Verfahren jedoch Ammoniak von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, und wenn das Ammoniak nicht aus der Probe entfernt wird, so ist es schwierig, eine spezifische Substanz genau zu messen. Daher kann die GLDH- Reaktion in der Reaktion A im Reaktionsschema (j) in einer Vorbehandlung zur Entfernung des Ammoniaks, das von Anfang an in der Probe vorhanden ist, angewandt werden. Diese GLDH- Reaktion beinhaltet die Umwandlung NAD(P)H → NAD(P)⁺, und daher wird die Regenerationsreaktion NAD(P)⁺ → NAD(P)H durchgeführt, so daß das Ammoniak effektiv mit einer geringen Menge an NAD(P)H entfernt werden. Wenn NAD(P)H in der Vorbehandlung in einer großen Menge verwendet wird, so ist die Absorbanz bei einer Wellenlänge von 340 nm [Wellenlänge zur Messung der Anderungsgeschwindigkeit von NAD(P)H] zu groß, wenn die spezifische Substanz nach Entfernung des Ammoniaks, das von Anfang an vorhanden ist, gemessen wird, und die Messung der spezifischen Substanz kann unmöglich sein.

Erfindungsgemäß wird die Regenerationsreaktion NAD(P)⁺ → NAD(P)H durch Einwirkung der Konjugationsdehydrogenase und eines Substrates davon induziert, wie in Reaktion B in dem obigen Reaktionsschema (j) gezeigt. Insbesondere wird die obige Regenerationsreaktion durch Einwirkung von Glucose-6-phosphat (G6P) und G6PDH induziert, wie in Reaktion B im Reaktionsschema (j-1) gezeigt, durch Einwirkung von 6-Phosphogluconsäure (6-PG) und 6-PGDH, wie in Reaktion B im Reaktionsschema (j-2) gezeigt, oder durch Einwirkung von L-Fucose (FC) und FCDH, wie in Reaktion B im Reaktionsschema (j-3) gezeigt.

Wie oben erklärt wird Ammoniak, das von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, eliminiert, und Ammoniak wird aus einer spezifischen Substanz erzeugt, und die spezifische Substanz wird quantitativ bestimmt. In diesem Falle wird, wenn die Konjugationsdehydrogenase und deren Substrat in dem Meßsystem vorhanden sind, NAD(P)H durch die Konjugationsdehydrogenasereaktion aus NAD(P)⁺ regeneriert, auch wenn NAD(P)H mit dem erzeugten Ammoniak zu NAD(P)⁺ konvertiert wird. Daher ist es nicht möglich, die Veränderungsgeschwindigkeit des aus der spezifischen Substanz abgeleiteten NAD(P)H genau zu messen. Erfindungsgemäß läßt man daher das Benetzungsmittel auf die Konjugationsdehydrogenase einwirken, wodurch die Konjugationsdehydrogenasereaktion beendet wird, wodurch die Reaktion B im obigen Reaktionsschema (j) nicht stattfindet. Infolgedessen wird NAD(P)⁺ nicht zu NAD(P)H konvertiert, und die Veränderungsgeschwindigkeit von NAD(P)H in dem Reaktionssystem hängt ausschließlich von dem aus der spezifischen Substanz erzeugten Ammoniak ab, so daß die spezifische Substanz genau gemessen werden kann.

In dem Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz in einer Probe ist genauer zuerst ein erstes Reagens, das GLDH, α-Ketoglutarsäure, entweder NADH oder NADPH, die Konjugationsdehydrogenase und ein Substrat der Konjugationsdehydrogenase enthält, vorhanden, und es wird ein zweites Reagens hergestellt, das eine Komponente, die zur Erzeugung von Ammoniak aus einer spezifischen Substanz dient, und ein Benetzungsmittel, das die Reaktion der Konjugationsdehydrogenase inhibiert enthält. Das zweite Reagens kann ferner Komponenten enthalten, die zur Messung von Ammoniak verwendet werden, wie beispielsweise α-KG, GLDH und NAD(P)⁺. Ferner kann das erste wie das zweite Reagens als Reagenslösung bei gleichzeitiger Anwesenheit von Albumin, Metall-Ionen und Saccharid gelagert werden.

Dann wird das obige erste Reagens zur Eliminierung von Ammoniak, das in der Probe vorhanden ist, zu der Probe hinzugegeben, und dann wird das zweite Reagens zur Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion und zur Erzeugung von Ammoniak zugegeben. Das erzeugte Ammoniak wird zur quantitativen Bestimmung der spezifischen Substanz gemessen. Nach Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion kann anstelle des zweiten Reagens das Benetzungsmittel alleine zugegeben werden, und dann kann die Komponente zugegeben werden, die zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz dient.

In dem obigen Verfahren zur Messung einer spezifischen Substanz und in dem obigen Reagens wird, wenn G6PDH und Glucose-6-phosphat als Konjugationsdehydrogenase und ein Substrat davon verwendet werden, das kationische Benetzungsmittel (wenn die G6PDH aus Bakterien stammt) oder das anionische Benetzungsmittel (wenn die G6PDH aus Hefe stammt) als Benetzungsmittel verwendet, wie bereits erläutert. Wenn andererseits 6-PGDH und 6-Phosphogluconsäure verwendet werden, so wird, wie bereits erläutert, vorzugsweise das kationische Benetzungsmittel als Benetzungsmittel verwendet. Ferner wird, wie bereits erläutert, bei Verwendung von FCDH und L-Fucose vorzugsweise das kationische Benetzungsmittel als Benetzungsmittel verwendet.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Kit zur Messung einer spezifischen Substanz bereitgestellt. Das Kit ist zusammengesetzt aus dem obigen ersten Reagens und dem zweiten Reagens als wesentliche Reagenzien.

In dem obigen Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz, die in der Lage ist, in einer Probe Ammoniak zu erzeugen, wird Ammoniak im allgemeinen nach einem Verfahren unter Ausnutzung einer Enzym-Reaktion gebildet. Als Beispiele werden die folgenden spezifischen Substanzen erläutert.

(1) Harnstoff

Wie bereits beschrieben, wird Urease mit Harnstoff umgesetzt, und das Reaktionsprodukt wird unter Bildung von Ammoniak hydrolysiert. Bei der Messung von Harnstoff ist es bevorzugt, in Kombination mit der Urease eine Verbindung zu verwendenden, die eine SH-Gruppe enthält, wie beispielsweise Thioglycerol, da die Urease-Aktivität dadurch justiert wird.

(2) Creatin

Zuerst wird Creatin mit Creatinase unter Erhalt von Sarcosin und Harnstoff hydrolysiert. Dann wird der Harnstoff unter Bildung von Ammoniak hydrolysiert.

(3) Creatinin

Creatinin wird mit Creatinindeiminase hydrolysiert, wodurch Ammoniak gebildet wird.

Wie unten gezeigt wird Creatinin ferner durch Creatininase unter Bildung von Creatinin hydrolysiert und das Creatin wird in der gleichen Weise wie oben in (2) behandelt, wodurch Ammoniak gebildet wird.

(4) Leucinaminopeptidase

Leucinaminopeptidase wirkt unter Bildung von Ammoniak auf L-Leucinamid ein.

(5) Ca²⁺

Ca²⁺ wirkt auf apo-trans-Glutaminase ein, wodurch diese zu holo-trans-Glutaminase umgewandelt wird, und die holo-trans- Glutaminase hydrolysiert Z-Glutamin (Z-Gln), wodurch Z-Glutaminsäure (Z-Glu) und Ammoniak gebildet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz in einer Probe ist besonders geeignet zur quantitativen Bestimmung von Harnstoff in den obigen spezifischen Substanzen. In dem obigen Verfahren zur quantitativen Bestimmung ist es ferner essentiell, das zur Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion verwendete Benetzungsmittel aus den Benetzungsmitteln auszuwählen, die die Aktivität der Konjugationsdehydrogenase weitestgehend inhibieren, aber GLDH und das Enzym, das zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz dient, weitestgehend nicht inhibieren.

Die vorliegende Erfindung besitzt die folgenden charakteristischen Merkmale.

• (1) Wenn eine Probe eine große Menge an Ammoniak enthält, so wird NAD(P)⁺ leicht durch die Konjugationsdehydrogenasereaktion zu NAD (P) H konvertiert, und ferner wird die Konjugationsdehydrogenasereaktion leicht durch das Benetzungsmittel beendet, so daß Ammoniak leicht mit einer geringen Menge an NAD(P)H eliminiert und die nachfolgende Messung mit einer spezifischen Substanz in einer Probe genau durchgeführt werden kann.
  Wenn beispielsweise G6PDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, kann NAD(P)⁺ leicht durch G6PDH-Reaktion zu NAD(P)H konvertiert werden, da G6PDH einen K_m-Wert von nur 3,5 × 10⁻⁵ mol/l (Glucose-6-phosphat) oder 4,2 × 10⁻⁶ mol/l (NADP⁺) besitzt, und ferner wird die G6PDH-Reaktion leicht durch das kationische oder das anionische Benetzungsmittel beendet. Daher kann Ammoniak, das von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, leicht mit einer geringen Menge an NAD(P)H beseitigt werden, und die anschließende Messung der spezifischen Substanz in der Probe kann genau durchgeführt werden.
  Wenn 6-PGDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, so kann NAD(P)⁺ leicht durch die 6-PGDH-Reaktion zu NAD(P)H umgewandelt werden, da 6-PGDH einen K_m-Wert von nur 5,4 × 10⁻⁵ mol/l (6-Phosphogluconsäure) oder 2,0 × 10⁻⁵ mol/l (NADP⁺) besitzt, und ferner wird die 6-PGDH-Reaktion leicht durch das kationische Benetzungsmittel beendet. Daher kann Ammoniak, das von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, leicht mit einer geringen Menge an NAD(P)H entfernt werden, und die anschließende Messung einer spezifischen Substanz in der Probe kann genau durchgeführt werden.
  Wenn ferner FCDH als Konjugationsdehydrogenase verwendet wird, kann NAD(P)⁺ leicht durch die FCDH-Reaktion zu NAD(P)H umgewandelt werden, da FCDH einen relativ niedrigem K_m-Wert von 1,9 × 10⁻³ mol/l (L-Fucose) oder 1,6 × 10⁻⁵ mol/l (NADP⁺) besitzt, und ferner wird die FCDH-Reaktion leicht durch das kationische Benetzungsmittel beendet. Daher kann Ammoniak, das von Anfang an in einer Probe vorhanden ist, leicht mit einer geringen Menge an NAD(P)H beseitigt werden, und die anschließende Messung einer spezifischen Substanz in der Probe kann genau durchgeführt werden.
• (2) Selbst wenn das Meßsystem für die spezifische Substanz ein Reaktionssystem ist, in dem ATP erzeugt wird, weisen die Meßprinzipien keinen Nachteil auf.
• (3) Selbst wenn das Meßsystem für die spezifische Substanz ein metallbenötigendes Enzym enthält, tritt kein besonderer Nachteil auf.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, wobei die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Folgende Probe und Reagenzien wurden hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml aus Bakterien stammendes G6PDH enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8) [Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung]	100 mM
α-KG	10 mM
NADP⁺	4 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Glucose-6-phosphat	20 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wird in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 4 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von G6PDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die von Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 2

Es wurden die folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 4 U/ml GLDH (aus Bakterien) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Ammoniumchlorid	3 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von GLDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 3

Es wurden die folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml Urease (aus Jack-Bohnen (Jack beans)) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM
GLDH (aus Bakterien)	16 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Harnstoff	3 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von Urease wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 1

Beispiel 1 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationisch Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ersetzt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse

Vergleichsbeispiel 2

Beispiel 2 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationisch Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ersetzt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 3

Beispiel 3 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationisch Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ersetzt wurde. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 1

Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen folgendes. Die Aktivität von G6PDH (aus Bakterien) wird durch das kationische Vernetzungsmittel stark inhibiert, während GLDH und Urease, die Enzyme darstellen, die an der Reaktion für die Harnstoffstickstoff-Messung teilnehmen, in ihrer Aktivität im Vergleich zu G6PDH nicht sonderlich inhibiert werden, und eine hohe Restaktivität zeigen. Ferner sind ATP und ADP nicht als Inhibitor für G6PDH geeignet.

Die obigen Ergebnisse zeigen folgendes. NADPH wird mit aus Bakterien stammender G6PDH regeneriert, und während das NADPH auf seinem ursprünglichen Niveau verbleibt, kann die Reaktion für die Messung durchgeführt werden.

Der erfindungsgemäße Effekt wird genauer unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, in denen aus Bakterien stammende G6PDH als Reagens verwendet wurde, und worin eine Probe, der Ammoniak zugefügt wurde, auf Harnstoffstickstoff untersucht wurde

Beispiel 4

Proben und Reagenzien wurden wie folgt hergestellt.

Probe

Es wurde eine Probe A₀ hergestellt, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und kein Ammoniak enthielt, sowie eine Probe A₅, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und 500 mg/dl Ammoniak enthielt. Ferner wurde die Probe A₅ mit der Probe A₀ verdünnt, wodurch Proben hergestellt wurden, die Ammoniakkonzentrationen von 100, 200, 300 und 400 mg/dl aufwiesen und jeweils eine Harnstoffstickstoff-Konzentration von 25 mg/dl besaßen, und diese Proben wurden als Proben A₁, A₂, A₃ und A₄ bezeichnet.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,3 mM
GLDH (aus Bakterien)	10 U/ml
Glucose-6-phosphat	20 mM
G6PDH (aus Bakterien)	3 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Urease (aus Jack-Bohnen)	10 U/ml
Dodecyltrimethylammoniumbromid	3 g/100 ml
Thioglycerol	400 mM

Das erste Reagens wurde in einer Menge von je 300 µl zu je 3 µl jeder der obigen Proben A₀ bis A₅ hinzugegeben, und die Mischungen wurden 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 75 µl des zweiten Reagens zu jeder der Mischungen hinzugegeben, und die Mischungen wurden hinsichtlich der zeitlichen Veränderung der Absorbanz bei 340 nm untersucht. Die Harnstoffstickstoff- Konzentration in jeder Probe wurde auf Grundlage einer zuvor erstellten Eichkurve bestimmt. Die obige Absorbanzmessung wurde mit einem automatischen Analysator, Modell 7150 von Hitachi Ltd., durchgeführt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 2

Wie die Ergebnisse aus Tabelle 2 zeigen, wurde durch die Vorbehandlungsreaktion unter Verwendung des ersten Reagens Ammoniak eliminiert, und gleichzeitig wurde verbrauchtes NADPH aufgrund der Funktion von G6PDH regeneriert, wodurch der Mangel an NADPH überwunden wurde, und nach der Zugabe des zweiten Reagens war die Messung von Harnstoffstickstoff ohne Beeinflussung von Ammoniak möglich. In diesem Falle wurde die G6PDH-Reaktion aufgrund des erfindungsgemäßen Effektes unterbrochen, und es lief nur die Umwandlungsreaktion von NADHP zu NADP⁺ aufgrund des aus dem Harnstoffstickstoff gebildeten Ammoniaks ab, so daß genaue Meßergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 5

Nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren (dem erfindungsgemäßen Verfahren) wurde Harnstoffstickstoff unter Verwendung von Serum als Probe gemessen, und der Harnstoffstickstoff wurde ferner nach einem herkömmlichen ICDH-Verfahren unter Verwendung eines Nitto Medical K.K. N-Tests BUN-L (D-Typ) gemessen.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse. Die Abszisse zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentrationen (mg/dl) nach dem herkömmlichen Verfahren und die Ordinate zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentration (mg/dl) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Wie in Fig. 1 gezeigt ist, wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren und das herkömmliche Verfahren eine bemerkenswert signifikante Korrelation aufweisen.

Beispiel 6

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml G6PDH aus Hefe enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8) [Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung]	100 mM
α-KG	10 mM
NADP⁺	4 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Glucose-6-phosphat	20 mM
Natrium-1-decansulfonat	0,6 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein anionisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 4 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von G6PDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines anionischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 7

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 4 U/ml GLDH (aus Bakterien) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Ammoniumchlorid	3 mM
Natrium-1-decansulfat	0,6 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein anionisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von GLDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines anionischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 8

Es wurde die folgende Probe und die folgenden Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml Urease (aus Jack-Bohnen) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM
GLDH (aus Bakterien)	16 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Harnstoff	3 mM
Natrium-1-decansulfonat	0,6 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein anionisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Proe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von Urease wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines anionischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 4

Beispiel 6 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das Natrium-1-decansulfonat im zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 5

Beispiel 7 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das Natrium-1-decansulfonat im zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 6

Beispiel 8 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das Natrium-1-decansulfonat im zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 3

Die Ergebnisse aus Tabelle 3 zeigen folgendes. Insbesondere wird die Aktivität von aus Hefe stammender G6PDH durch das anionische Benetzungsmittel stark inhibiert, wohingegen GLDH und Urease, die Enzyme sind, die an der Reaktion für die Harnstoffstickstoffmessung teilnehmen, im Vergleich mit G6PDH nicht stark inhibiert werden, und eine hohe Restaktivität aufweisen. Wenn darüber hinaus ATP und ADP als Inhibitor verwendet werden, inhibieren ATP und ADP weder die Aktivitäten von GLDH und Urease noch inhibieren sie die Aktivität von G6PDH.

Die obigen Resultate zeigen folgendes. NADPH wird mit aus Hefe stammender G6PDH regeneriert, und während das NADPH auf dem ursprünglichen Niveau gehalten wird, kann die Reaktion für die Messung durchgeführt werden.

Der erfindungsgemäße Effekt wird genauer unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, worin aus Hefe stammende G6PDH als Reagens verwendet wurde, und eine Probe, zu der Ammoniak hinzugegeben wurde, auf Harnstoffstickstoff untersucht wurde.

Beispiel 9

Proben und Reagenzien wurden wie folgt hergestellt.

Probe

Es wurde eine Probe A₀ hergestellt, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und kein Ammoniak enthielt, sowie eine Probe A₅, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und 500 mg/dl Ammoniak enthielt. Ferner wurde die Probe A₅ mit der Probe A₀ verdünnt, wodurch Proben hergestellt wurden, die Ammoniakkonzentrationen von 100, 200, 300 und 400 mg/dl aufwiesen und jeweils eine Harnstoffstickstoff-Konzentration von 25 mg/dl besaßen, und diese Proben wurden als Proben A₁, A₂, A₃ und A₄ bezeichnet.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,3 mM
GLDH (aus Bakterien)	10 U/ml
Glucose-6-phosphat	20 mM
G6PDH (aus Bakterien)	3 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Urease (aus Jack-Bohnen)	10 U/ml
Natrium-1-decansulfonat	15 mg/ml
Thioglycerol	400 mM

Das erste Reagens wurde in einer Menge von je 300 µl zu je 3 µl jeder der obigen Proben A₀ bis A₅ hinzugegeben, und die Mischungen wurden für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 75 µl des zweiten Reagens zu jeder der Mischungen hinzugegeben, und die Mischungen wurden hinsichtlich der zeitlichen Veränderung der Absorbanz bei 340 nm untersucht. Die Harnstoffstickstoff-Konzentration in jeder Probe wurde auf Grundlage einer zuvor erstellten Eichkurve bestimmt. Die obige Absorbanzmessung wurde mit einem automatischen Analysator, Modell 7150 von Hitachi Ltd., durchgeführt. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 4

Wie die Ergebnisse aus Tabelle 4 zeigen, wurde durch die Vorbehandlungsreaktion unter Verwendung des ersten Reagens Ammoniak eliminiert, und gleichzeitig wurde verbrauchtes NADPH aufgrund der Funktion von G6PDH regeneriert, wodurch der Mangel an NADPH überwunden wurde, und nach der Zugabe des zweiten Reagens war die Messung von Harnstoffstickstoff ohne Beeinflussung von Ammoniak möglich. In diesem Falle wurde die G6PDH-Reaktion aufgrund des erfindungsgemäßen Effektes unterbrochen, und es lief nur die Umwandlungsreaktion von NADHP zu NADP⁺ aufgrund des aus dem Harnstoffstickstoff gebildeten Ammoniaks ab, so daß genaue Meßergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 10

Nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren (dem erfindungsgemäßen Verfahren) wurde Harnstoffstickstoff unter Verwendung von Serum als Probe gemessen, und ferner wurde Harnstoffstickstoff nach einem kommerziell erhältlichen Isocitrat-Dehydrogenaseverfahren gemessen (unter Verwendung eines N-Tests BUN-L D Typ, geliefert von Nittobo Medical K.K.).

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. Die Abszisse zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentrationen (mg/dl) nach dem herkömmlichen Verfahren und die Ordinate zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentration (mg/dl) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Wie in Fig. 2 gezeigt ist, wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren und das herkömmliche Verfahren eine bemerkenswert signifikante Korrelation aufweisen.

Beispiel 11

Es wurden wie folgt eine Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml 6-PGDH aus Hefe enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8) [Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung]	100 mM
α-KG	10 mM
NADP⁺	4 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
6-Phosphogluconsäure	20 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 4 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von 6-PGDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 12

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 4 U/ml GLDH (aus Bakterien) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADP⁺	0,5 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Ammoniumchlorid	3 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von GLDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 13

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml Urease (aus Jack-Bohnen) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM
GLDH (aus Bakterien)	16 U/min

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Harnstoff	10 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von Urease wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 7

Beispiel 11 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 8

Beispiel 12 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 9

Beispiel 13 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 5

Die Ergebnisse in Tabelle 5 zeigen folgendes. Die Aktivität von 6-PGDH (aus Hefe) wird durch das kationische Vernetzungsmittel stark inhibiert, während GLDH und Urease, die Enzyme darstellen, die an der Reaktion für die Harnstoffstickstoff-Messung teilnehmen, in ihrer Aktivität im Vergleich zu 6-PGDH nicht sonderlich inhibiert werden, und eine hohe Restaktivität zeigen. Ferner sind ATP und ADP nicht als Inhibitor für 6-PGDH geeignet.

Die obigen Ergebnisse zeigen folgendes. NADPH wird mit aus Bakterien stammender 6-PGDH regeneriert, und während das NADPH auf seinem ursprünglichen Niveau verbleibt, kann die Reaktion für die Messung durchgeführt werden.

Der erfindungsgemäße Effekt wird genauer unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, in denen aus Hefe stammende 6-PGDH als Reagens verwendet wurde, und worin eine Probe, der Ammoniak zugefügt wurde, auf Harnstoffstickstoff untersucht wurde.

Beispiel 14

Proben und Reagenzien wurden wie folgt hergestellt.

Probe

Es wurde eine Probe A₀ hergestellt, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und kein Ammoniak enthielt, sowie eine Probe A₅, die 25 mg/dl Harnstoffstickstoff und 500 mg/dl Ammoniak enthielt. Ferner wurde die Probe A₅ mit der Probe A₀ verdünnt, wodurch Proben hergestellt wurden, die Ammoniakkonzentrationen von 100, 200, 300 und 400 mg/dl aufwiesen und jeweils eine Harnstoffstickstoff-Konzentration von 25 mg/dl besaßen, und diese Proben wurden als Proben A₁, A₂, A₃ und A₄ bezeichnet.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,3 mM
GLDH (aus Bakterien)	10 U/ml
6-Phosphogluconsäure	20 mM
6-PGDH (aus Hefe)	3 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Urease (aus Jack-Bohnen)	10 U/ml
Dodecyltrimethylammoniumbromid	3 g/100 ml
Thioglycerol	400 mM

Das erste Reagens wurde in einer Menge von je 300 µl zu je 3 µl jeder der obigen Proben A₀ bis A₅ hinzugegeben, und die Mischungen wurden für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 75 µl des zweiten Reagens zu jeder der Mischungen hinzugegeben, und die Mischungen wurden hinsichtlich der zeitlichen Veränderung der Absorbanz bei 340 nm untersucht. Die Harnstoffstickstoff-Konzentration in jeder Probe wurde auf Grundlage einer zuvor erstellten Eichkurve bestimmt. Die obige Absorbanzmessung wurde mit einem automatischen Analysator, Modell 7150 von Hitachi Ltd., durchgeführt. Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 6

Wie die Ergebnisse aus Tabelle 6 zeigen, wurde durch die Vorbehandlungsreaktion unter Verwendung des ersten Reagens Ammoniak eliminiert, und gleichzeitig wurde verbrauchtes NADPH aufgrund der Funktion von 6-PGDH regeneriert, wodurch der Mangel an NADPH überwunden wurde, und nach der Zugabe des zweiten Reagens war die Messung von Harnstoffstickstoff ohne Beeinflussung von Ammoniak möglich. In diesem Falle wurde G6PDH-Reaktion aufgrund des erfindungsgemäßen Effektes unterbrochen, und es lief nur die Umwandlungsreaktion von NADHP zu NADP⁺ aufgrund des aus dem Harnstoffstickstoff gebildeten Ammoniaks ab, so daß genaue Meßergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 15

Nach dem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren (dem erfindungsgemäßen Verfahren) wurde Harnstoffstickstoff unter Verwendung von Serum als Probe gemessen, und ferner wurde Harnstoffstickstoff nach einem kommerziell erhältlichen Isocitrat-Dehydrogenaseverfahren gemessen (unter Verwendung eines N-Tests BUN-L D Typ, geliefert von Nittobo Medical K.K.).

Fig. 3 zeigt die Ergebnisse. Die Abszisse zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentrationen (mg/dl) nach dem herkömmlichen Verfahren und die Ordinate zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentration (mg/dl) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Wie in Fig. 3 gezeigt ist, wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren und das herkömmliche Verfahren eine bemerkenswert signifikante Korrelation aufweisen.

Beispiel 16

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml FCDH (L-Fucose-Dehydrogenase) aus Bakterien enthielt.

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8) [Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung]	100 mM
α-KG	10 mM
NADP⁺	4 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
L-Fucose	20 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 4 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von FCDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 17

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 4 U/ml GLDH (aus Bakterien) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Ammoniumchlorid	3 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von GLDH wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die von Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 18

Es wurden folgende Probe und Reagenzien hergestellt.

Probe

Eine wäßrige Lösung, die 1 U/ml Urease (aus Jack-Bohnen) enthielt.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,5 mM
GLDH (aus Bakterien)	16 U/min

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Harnstoff	3 mM
Verschiedene kationische Benetzungsmittel	1,2 g/100 ml

Ferner wurde in der gleichen Weise als Kontrolle ein zweites Reagens hergestellt, das kein kationisches Benetzungsmittel enthielt.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 200 µl zu 4 µl der Probe hinzugegeben, und die Mischung wurde für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 200 µl des zweiten Reagenz hinzugegeben, und die Mischung wurde für 1 min bei 37°C stehen gelassen. Dann wurde die Mischung hinsichtlich der Veränderung der Absorbanz pro Minute bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Die Aktivität von Urease wurde auf der Grundlage bestimmt, daß die Veränderung der Absorbanz in Abwesenheit eines kationischen Benetzungsmittels zu 100% angenommen wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 10

Beispiel 16 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 11

Beispiel 17 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 12

Beispiel 18 wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß das kationische Benetzungsmittel in dem zweiten Reagens durch 50 mM ATP oder ADP ausgetauscht wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 7

Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen folgendes. Die Aktivität von FCDH (aus Bakterien) wird durch das kationische Vernetzungsmittel stark inhibiert, während GLDH und Urease, die Enzyme darstellen, die an der Reaktion für die Harnstoffstickstoff-Messung teilnehmen, in ihrer Aktivität im Vergleich zu FCDH nicht sonderlich inhibiert werden, und eine hohe Restaktivität zeigen. Ferner sind ATP und ADP nicht als Inhibitor für FCDH geeignet.

Die obigen Ergebnisse zeigen folgendes. NADPH wird mit aus Bakterien stammenden FCDH regeneriert, und während das NADPH auf seinem ursprünglichen Niveau verbleibt, kann die Reaktion für die Messung durchgeführt werden.

Der erfindungsgemäße Effekt wird genauer unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert, in denen aus Bakterien stammendes FCDH als Reagens verwendet wurde, und worin eine Probe, der Ammoniak zugefügt wurde, auf Harnstoffstickstoff untersucht wurde.

Beispiel 19

Proben und Reagenzien wurden wie folgt hergestellt.

Probe

Es wurden dieselben Proben wie die in Beispiel 4 hergestellten Proben A₀ bis A₅ verwendet.

Erstes Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
NADPH	0,3 mM
GLDH (aus Bakterien)	3 U/ml
L-Fucose	20 mM
FCDH (aus Bakterien)	3 U/ml

Zweites Reagens

Tris-Puffer-Lösung (pH 7,8)	100 mM
α-KG	10 mM
Urease (aus Jack-Bohnen)	10 U/ml
Dodecyltrimethylammoniumbromid	3 g/100 ml
Thioglycerol	400 mM

Das erste Reagens wurde in einer Menge von je 300 µl zu je 3 µl jeder der obigen Proben A₀ bis A₅ hinzugegeben, und die Mischungen wurden für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 75 µl des zweiten Reagens zu jeder der Mischungen hinzugegeben, und die Mischungen wurden hinsichtlich derzeitlichen Veränderung der Absorbanz bei 340 nm untersucht. Die Harnstoffstickstoff-Konzentration in jeder Probe wurde auf Grundlage einer zuvor erstellten Eichkurve bestimmt. Die obige Absorbanzmessung wurde mit einem automatischen Analysator, Modell 7150 von Hitachi Ltd., durchgeführt. Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 8

Wie die Ergebnisse aus Tabelle 8 zeigen, wurde durch die Vorbehandlungsreaktion unter Verwendung des ersten Reagens Ammoniak eliminiert, und gleichzeitig wurde verbrauchtes NADPH aufgrund der Funktion von FCDH regeneriert, wodurch der Mangel an NADPH überwunden wurde, und nach der Zugabe des zweiten Reagens war die Messung von Harnstoffstickstoff ohne Beeinflussung von Ammoniak möglich. In diesem Falle wurde die FCDH-Reaktion aufgrund des erfindungsgemäßen Effektes unterbrochen, und es lief nur die Umwandlungsreaktion von NADHP zu NADP⁺ aufgrund des aus dem Harnstoffstickstoff gebildeten Ammoniaks ab, so daß genaue Meßergebnisse erhalten wurden.

Beispiel 20

Nach dem in Beispiel 19 beschriebenen Verfahren (dem erfindungsgemäßen Verfahren) wurde Harnstoffstickstoff unter Verwendung von Serum als Probe gemessen, und ferner wurde Harnstoffstickstoff nach einem herkömmlichen ICDH-Verfahren unter Verwendung eines Nitto Medical K.K. N-Tests BUN-L (D-Typ) gemessen.

Fig. 4 zeigt die Ergebnisse. Die Abszisse zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentrationen (mg/dl) nach dem herkömmlichen Verfahren und die Ordinate zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentration (mg/dl) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Wie in Fig. 4 gezeigt ist, wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren und das herkömmliche Verfahren eine bemerkenswert signifikante Korrelation aufweisen.

Claims (25)

1. Unterbrecher zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion, der ein Benetzungsmittel enthält.

2. Unterbrecher gemäß Anspruch 1, worin das Benetzungsmittel ein kationisches oder anionisches Benetzungsmittel ist, und die Konjugationsdehydrogenasereaktion eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenasereaktion darstellt.

3. Unterbrecher gemäß Anspruch 2, worin das kationische Benetzungsmittel mindestens eines ist, das ausgewählt ist aus einem quaternären Ammoniumsalz der Formel (I):
worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellen, X^m⁻ ist ein Anion mit einer Valenz von m, m ist 1 oder 2, und n ist eine ganze Zahl von 9 bis 17, oder
einem quaternärem Ammoniumsalz der Formel (II):
worin X^q⁻ ein Anion mit der Valenz q ist, q ist 1 oder 2, und p ist eine ganze Zahl von 9 bis 17.

4. Unterbrecher gemäß Anspruch 2, worin das anionische Benetzungsmittel mindestens eines ist, das ausgewählt ist aus Alkyl(oder Alkenyl)sulfonaten der Formel (III):
R⁴SO₃⁻ . 1/a(M¹)^a⁺ (III)
worin R⁴ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellt, (M¹)^a⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von a, und a ist 1 oder 2,
Alkylbenzolsulfonaten der Formel (IV):
worin R⁵ eine lineare oder verzweigte Alkyl-Gruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen darstellt, (M²)^b⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von b, und b ist 1 oder 2, oder
Polyoxyethylenalkyl(oder -alkenyl)ethersulfaten der Formel (V):
R⁶O-(C₂H₄O)_c-SO₃⁻ . 1/k(M³)^k⁺ (V)
worin R⁶ eine lineare oder verzweigte Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellt, (M³)^k⁺ ist ein Kation mit einer Valenz von k, k ist 1 oder 2, und c ist eine ganze Zahl von mindestens 1.

5. Unterbrecher gemäß Anspruch 1, worin das Benetzungsmittel ein kationisches Benetzungsmittel und die Konjugationsdehydrogenasereaktion eine 6-Phosphogluconat-Dehydrogenasereaktion ist.

6. Unterbrecher gemäß Anspruch 5, worin das kationische Benetzungsmittel mindestens eines ist, das ausgewählt ist aus einem quaternären Ammoniumsalz der Formel (I):
worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellen, X^m⁻ ist ein Anion mit einer Valenz von m, m ist 1 oder 2, und n ist eine ganze Zahl von 9 bis 17, oder
einem quaternärem Ammoniumsalz der Formel (II):
worin X^q⁻ ein Anion mit der Valenz q ist, q ist 1 oder 2, und p ist eine ganze Zahl von 9 bis 17.

7. Unterbrecher gemäß Anspruch 1, worin das Benetzungsmittel ein kationisches Benetzungsmittel ist, und die Konjugationsdehydrogenasereaktion ist eine L-Fucose-Dehydrogenasereaktion.

8. Unterbrecher gemäß Anspruch 7, worin das kationische Benetzungsmittel mindestens eines ist, das ausgewählt ist aus einem quaternären Ammoniumsalz der Formel (I):
worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl-Gruppe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl-Gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellen, X^m⁻ ist ein Anion mit einer Valenz von m, m ist 1 oder 2, und n ist eine ganze Zahl von 9 bis 17, oder
einem quaternärem Ammoniumsalz der Formel (II):
worin X^q⁻ ein Anion mit der Valenz q ist, q ist 1 oder 2, und p ist eine ganze Zahl von 9 bis 17.

9. Verfahren zur Beendigung einer Konjugationsdehydrogenasereaktion, das die Umwandlung der oxidierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid oder der oxidierten Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat zur reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid bzw. der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat unter Einwirkung einer Konjugationsdehydrogenase und eines Substrates der Konjugationsdehydrogenase und die anschließende Beendigung der Reduktion durch Einwirkung eines Benetzungsmittels umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die oxidierte Form von Nicotinamidadenindinukleotid oder die oxidierte Form von Nicotinamidadenindinukleodidphosphat eine Substanz ist, die durch Vorbehandlung einer Probe in einem System zur Messung einer spezifischen Substanz in der Probe gebildet wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin das Benetzungsmittel ein Benetzungsmittel ist, das die Dehydrogenase weitestgehend desaktiviert, aber weitestgehend keinen weiteren Einfluß auf das System zur Messung der spezifischen Substanz in der Probe ausübt.

12. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Konjugationsdehydrogenase Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist Glucose-6-phosphat, und worin ein kationisches oder anionisches Benetzungsmittel als Benetzungsmittel eingesetzt wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase eine Dehydrogenase ist, die aus Bakterien stammt, und worin ein kationisches Benetzungsmittel eingesetzt wird.

14. Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase eine Dehydrogenase ist, die aus Hefe stammt, und worin ein anionisches Benetzungsmittel eingesetzt wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Konjugationsdehydrogenase 6-Phosphogluconat- Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist 6-Phosphogluconsäure, und worin ein kationisches Benetzungsmittel als Benetzungsmittel eingesetzt wird.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, worin die die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase eine Dehydrogenase ist, die aus Hefe stammt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Konjugationsdehydrogenase L-Fucose-Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist L-Fucose, und worin ein kationisches Benetzungsmittel als Benetzungsmittel eingesetzt wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin die L-Fucose- Dehydrogenase eine Dehydrogenase ist, die aus Bakterien stammt.

19. Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer spezifischen Substanz durch Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz und Messung des Ammoniaks, das Verfahren umfaßt die Eliminierung von Ammoniak, das von Anfang an in der Probe enthalten ist, durch Einwirkung von Glutamat-Dehydrogenase, α-Ketoglutarsäure, entweder der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid oder der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, einer Konjugationsdehydrogenase und einem Substrat der Konjugationsdehydrogenase, die anschließende Beendigung der Konjugationsdehydrogenasereaktion unter Einwirkung eines Benetzungsmittels, Zugabe einer Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der umzusetzenden spezifischen Substanz, gleichzeitig mit oder nach der Einwirkung des Benetzungsmittels, wodurch Ammoniak erzeugt wird, und Messung des erzeugten Ammoniaks.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die Konjugationsdehydrogenase Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist Glucose-6-phosphat, und das Benetzungsmittel ist ein kationisch oder anionisches Benetzungsmittel.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die Konjugationsdehydrogenase 6-Phosphogluconat- Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist 6-Phosphogluconsäure, und das Benetzungsmittel ist ein kationisches Benetzungsmittel.

22. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die Konjugationsdehydrogenase L-Fucose-Dehydrogenase ist, das Substrat der Konjugationsdehydrogenase ist L-Fucose, und das Benetzungsmittel ist ein kationisches Benetzungsmittel.

23. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin die spezifische Substanz Harnstoff ist, und die Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz ist Urease.

24. Kit zur Messung einer spezifischen Substanz, das Kit ist zusammengesetzt aus (A) einem Reagens, das eine Glutamat-Dehydrogenase, α-Ketoglutarsäure, entweder die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinukleotid oder die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, eine Konjugationsdehydrogenase und ein Substrat der Konjugationsdehydrogenase enthält, und (B) einem Reagens, das ein Benetzungsmittel und eine Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz enthält, als essentielle Reagenzien.

25. Kit gemäß Anspruch 24, worin die spezifische Substanz Harnstoff ist, und die Komponente zur Erzeugung von Ammoniak aus der spezifischen Substanz ist Urease.