DE3811084C2

DE3811084C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Polyaminen

Info

Publication number: DE3811084C2
Application number: DE3811084A
Authority: DE
Inventors: Masato Okada; Makoto Sakamoto; Masayoshi Kikuchi
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1987-04-04
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: GB2204951A; US5082770A; DE3811084A1; GB8807548D0; GB2204951B

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Polyaminen. Genauer ausgedrückt betrifft sie ein Verfahren, welches die Menge an Aminen mit einfachen Arbeitsschritten genau bestimmen kann.

Die in lebenden Körpern weit verbreiteten Polyamine sind medizinisch wichtige Substanzen, weil sie sich in großen Mengen in wuchernden Zellen, insbesondere in Tumorzellen finden. Russell et al. berichtete 1975, daß die Körperflüssigkeit (z. B. Urin und Blut) von Krebspatienten Polyamine im Vergleich mit normalen Personen in größeren Mengen enthält. Seither haben viele Forscher die Korrelation zwischen Krebs und dem Gehalt an Polyaminen in Körperflüssigkeit studiert, wobei die Gültigkeit des Berichtes von Russell et al. bestätigt wurde. Die quantitative Bestimmung von Polyaminen in Körperflüssigkeiten ist sehr schwierig, auf Grund der äußerst niedrigen Konzentration und vieler anderer Substanzen, die in der Untersuchungsprobe enthalten sind. Kürzlich hat das enzymatische Verfahren als Mittel zur schnellen Bestimmung der Menge an Polyaminen in Körperflüssigkeit Beachtung gefunden. In einem typischen Beispiel läßt man eine Polyamine enthaltende Probenlösung mit einem Enzym reagieren, welches in der Lage ist, diese unter Bildung von Wassserstoffperoxid zu oxidieren (nachfolgend als Polyamin oxidierendes Enzym bezeichnet), welches einem farbbildenden System zugeführt wird, welches 4-Aminoantipyrin, ein Phenol und eine Peroxydase enthält, gefolgt von der colorimetrischen Messung des gebildeten Farbstoffs.

Von den beiden US-PS 45 50 078 und 46 17 263 sind Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Polyaminen in wäßriger Lösung bekannt, bei denen die Substrate enzymatisch unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert werden und die Menge des gebildeten H₂O₂ bestimmt wird.

Das Problem bei diesen Verfahren besteht darin, daß das gebildete Wasserstoffperoxid durch die in Körperflüssigkeit vorhandenen reduzierenden Substanzen, wie z. B. Ascorbinsäure und Harnsäure sehr leicht eine Zersetzung eingeht. Deshalb müssen diese reduzierenden Substanzen zur genauen Bestimmung von Polyaminen vorher aus der Probenlösung entfernt oder davon abgetrennt werden, was die einbezogenen Arbeitsschritte kompliziert und die zur Analyse erforderliche Zeit erhöht. Daneben wohnt diesem Verfahren, das auf der Messung von Wasserstoffperoxid aufbaut, das Problem inne, daß Meßfehler auf Grund von Verlust dieser instabilen Verbindung unvermeidbar sind.

Zur quantitativen Bestimmung von Spermin und Spermidin ist auch eine Methode bekannt, die auf dem Prinzip des Doppel-Antikörper-Enzym-Immunoassay (DA-EIA) beruht, jedoch relativ aufwendig durchzuführen ist.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur genauen Bestimmung der Menge an Polyaminen zur Verfügung zu stellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Menge an Polyaminen mit einfachen Arbeitsschritten zur Verfügung zu stellen.

Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur genauen und einfachen Bestimmung der in Körperflüssigkeit enthaltenen Menge an Polyaminen zur Verfügung zu stellen.

Andere Aufgaben der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung deutlich.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Polyaminen, bei der man ein Polyamin oxidierendes Enzym, 4-Aminobutanal-Dehydrogenase und ein oxidiertes Nicotinamid-Coenzym auf eine Polyamine enthaltende Probenlösung einwirken läßt und das so gebildete reduzierte Nicotin-Coenzym mißt, wodurch man die Menge an Polyaminen bestimmt.

Anders als das herkömmliche Verfahren, welches als Hauptschritt die Messung des Wasserstoffperoxids vorsieht, welches gebildet wird, wenn man ein Polyamin oxidierendes Enzym auf ein Polyamin einwirken läßt, ist es das wesentliche Merkmal der Erfindung, daß als Hauptschritt die Messung eines Aminoaldehyds vorgesehen ist, der zusammen mit Wasserstoffperoxid gebildet wird.

Der Reaktionsmechanismus des erfindungsgemäßen Verfahrens ist noch nicht vollständig klar, kann jedoch wie nachfolgend beschrieben, vermutet werden. Ein in einer Probenlösung enthaltenes Polyamin wird umgewandelt zu ω-Aminoalkylaldehyd durch die Wirkung eines Polyamin oxidierenden Mittels, welches man seinerseits durch die Wirkung der 4-Aminobutanal- Dehydrogenase mit einem oxidierten Nicotinamid-Coenzym reagieren läßt, und die Menge des durch diese Reaktion gebildeten Nicotinamid-Coenzyms in der reduzierten Form wird zur Analyse gemessen. Die Menge an Polyamin kann erhalten werden aus der quantitativen Beziehung zwischen Polyamin und Nicotinamid-Coenzym der reduzierten Form, welches vorher unter Verwendung von Proben mit bekannten Polyaminkonzentrationen bestimmt wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf alle Arten von Polyamine enthaltende Proben angewendet werden, jedoch ist die Anwendung auf Körperflüssigkeit, wie z. B. Urin, Blut und Galle die wirkungsvollste.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmbare Polyamine sind freie Polyamine (nachfolgend einfach als Polyamine bezeichnet), wie z. B. Spermidin, Putreszin, Spermin und Cadaverin. Wenn man im Urin vorhandene konjugierte Polyamine (Acetylderivate dieser freien Amine) mißt, kann man das erfindungsgemäße Verfahren anwenden, nachdem die Acetylpolyamine mit der bekannten Technik unter Verwendung einer Acylpolyaminamidohydrolase hydrolisiert wurden. Die Hydrolyse sollte bevorzugt vor oder gleichzeitig mit der Umwandlung von Polyaminen in ω-Aminoalkylaldehyde durchgeführt werden.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Umwandlung von Polyaminen in ω-Aminoalkylaldehyde durch die Wirkung eines Polyamin oxidierenden Enzyms. Die so gebildeten Aldehyde haben im Vergleich zu Wasserstoffperoxid gegenüber den in Probenlösungen enthaltenen reduzierenden Substanzen eine höhere Stabilität und können somit selbst in Anwesenheit von reduzierenden Substanzen zur übereinstimmenden Bestimmung von Polyaminen verwendet werden.

Für den Zweck der Erfindung kann jedes beliebige bekannte Enzym verwendet werden, das in der Lage ist, Polyamine unter Bildung äquimolarer Mengen von ω-Aminoalkylaldehyden zu oxidieren. Typische und bevorzugte Beispiele sind Putreszinoxidasen mikrobieller Herkunft, die aus Stämmen der Gattungen Micrococcus, Nocardia, Aspergillus und Arthrobacter abgeleitet sind; aus gekeimten Sojabohnen abgeleitete Putreszinoxidasen pflanzlicher Herkunft und dergleichen; und aus Schweineleber abgeleitete Putreszinoxidasen tierischer Herkunft und dergleichen.

Wenn man ein Polyamin oxidierendes Enzym verwendet, das auf Spermin nicht wirkt - z. B. Putreszinoxidase-, ist es notwendig, das Spermin in der Probenlösung vorher in Putreszin überzuführen und das so gebildete 3-Aminopropanal durch Säulenbehandlung oder andere geeignete Verfahren zu entfernen. Zur Umwandlung von Spermin in Putreszin kann jede bekannte Technik eingesetzt werden, jedoch wird die Verwendung eines Enzyms, das eine solche Aktivität aufweist, bevorzugt. Typische Beispiele für solche Enzyme sind aus Rinderplasma, Rattenleber und dergleichen abgeleitete Polyaminoxidasen tierischer Herkunft und solche mikrobieller Herkunft, die aus Stämmen der Gattungen Aspergillus, Penicillium und Streptomyces abgeleitet sind.

Es ist auch möglich, Spermin unmittelbar in den korrespondierenden ω-Aminoalkylaldehyd - N-(3-Aminopropyl)aminobutylaldehyd - überzuführen, indem man ein Enzym verwendet, das eine solche Aktivität aufweist und damit die Notwendigkeit einer Säulenbehandlung und anderer schwieriger Arbeitsschritte ausschaltet. Als Beispiele für solche Enzyme können aus Gerste, Hafer, Roggen und Erbsen abgeleitete Polyaminoxidasen pflanzlicher Herkunft erwähnt werden.

Es ist bekannt, daß Polyamine in Urin hauptsächlich konjugiertes Spermidin, Putreszin und Cadaverin (Acetylderivate dieser freien Polyamine) sind. Wenn man deshalb eine Urinprobe analysiert, erfüllt der Einsatz von Putreszinoxidase allein den Zweck. In diesem Fall kann das erfindungsgemäße Verfahren gleichzeitig mit oder nach Hydrolyse der Acetylpolyamine mit der bekannten Technik unter Verwendung einer Acylpolyaminamidohydrolase angewandt werden.

Acylpolyaminamidohydrolasen sind Enzyme, die in der Lage sind, die Amidbindung in einem Acylpolyamin unter Bildung freier Polyamine zu spalten. Diese können erhalten werden aus tierischen Organen, wie z. B. Leber, Niere, Pankreas und Herz von Rindern, Schweinen und Hühnern, oder sie können von einer Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt werden. Im letzteren Fall werden Stämme von Streptomyces, insbesondere Streptomyces avellaneus R-20 (FERM-P Nr. 5443) bevorzugt verwendet.

Zur Einwirkung von Polyamin oxidierendem Enzym (und, falls erforderlich, von Enzym zur Umwandlung von Spermin in Putreszin und/oder von Enzym, um es in N-(3-Aminopropyl)aminobutylaldehyd überzuführen) auf Polyamine enthaltende Probenlösungen können alle wohlbekannten Bedingungen angewandt werden. Gewöhnlich führt man die Reaktion bevorzugt nahe dem pH-Optimum und dem Temperaturoptimum des eingesetzten Enzyms durch. Die geeignete einzusetzende Enzymmenge variiert mit dessen Aktivität und anderen Reaktionsbedingungen, liegt jedoch allgemein im Bereich von 0,01 bis 50 IE (Internationale Einheit für Enzyme, International Enzyme Unit U), bevorzugt von 0,1 bis 30 IE.

Man kann für die Zwecke der Erfindung jede 4-Aminobutanal-Dehydrogenase verwenden, die in der Lage ist, mit einem ω-Aminoalkylaldehyd in Gegenwart eines oxidierten Nicotinamid-Coenzyms eine äquimolare Menge von Nicotinamid-Coenzym in der reduzierten Form zu bilden. Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete 4-Aminobutanaldehydrogenase, weist die folgenden Eigenschaften auf:

(1) Wirkung:
Wirkt auf 4-Aminobutanal in Gegenwart von oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotid oder oxidiertem Nicotinamidadenindinucleotidphosphat unter Bildung von 4-Aminobuttersäure und reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid oder reduziertem Nicotinamidadenindinucleotidphosphat.
(2) Substratspezifität:
Wirkt auf oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotid und oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat als Nicotinamid- Coenzym in oxidierter Form, und auf 4-Aminobutanal und 5-Aminopentanal als ω-Aminoalkylaldehyd.
(3) pH-Optimum: 7,7 bis 8,3
(4) pH-Stabilität:
Bei Lagerung über 24 Stunden bei 5°C bleibt beim pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 8,5 mehr als 90% der Aktivität erhalten.
(5) Molekulargewicht: 102 000 ± 5000
(6) Molekulargewicht der Untereinheiten: 50 000 ± 5000
(7) Anzahl der Untereinheiten: 2

Diese 4-Aminobutanal-Dehydrogenase kann man durch Züchten eines Micrococcusstammes erhalten, der in der Lage ist, sie zu produzieren. Zu diesem Zweck kann jede Art von Medium verwendet werden, so lange dieses Kohlenstoffquellen (z. B. Glucose), Stickstoffquellen (z. B. Polypepton) und anorganische Salze enthält. Man kann die Enzymproduktivität erhöhen, wenn man dem Kulturmedium weiterhin ein Polyamin, wie z. B. Putreszin, Spermidin, Diaminopropan und Cardin zusetzt. Die Kultivierung wird bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 40°C (am meisten bevorzugt von 20 bis 35°C) und bei einem pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 9,0 (am meisten bevorzugt von 5,0 bis 8,0) durchgeführt. Bezüglich der Kultivierungszeit gibt es keine besondere Begrenzung, jedoch sollte im Hinblick auf die Enzymproduktivität und andere wirtschaftliche Faktoren die Zeit nach dem Start der Ruheperiode bevorzugt innerhalb von zehn Stunden liegen.

Die gezüchteten mikrobiellen Zellen kann man aus der Kulturlösung durch zentrifugierende Trennung, Filtration und andere bekannte Verfahren isolieren, jedoch ist die Zentrifugation am meisten bevorzugt.

4-Aminobutanal-Dehydrogenase, die normalerweise innerhalb der mikrobiellen Zellen angesammelt ist, wird mit Verfahren extrahiert, wie sie gewöhnlich zur Enzymextraktion verwendet werden, wie z. B. Zell-Abbau durch Mahlen oder Ultraschallbehandlung und Zerstörung von Zellwänden bei Einwirkung eines Enzyms (z. B. Lysozym) oder Zerstörung von Zellmitgliedern mit einem organischen Lösemittel (z. B. Toluol).

Die so erhaltene Rohenzymlösung kann nach Erfordernis weiter gereinigt werden durch geeignetes Kombinieren oder Wiederholen von Techniken, die gewöhnlich zur Enzymreinigung verwendet werden, wie z. B. Fällung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Chromatographie mit Hydroxyapatitsäulen und präperative Elektrophorese.

Die Aktivität von 4-Aminobutanal-Dehydrogenase wird wie nachstehend beschrieben gemessen und ausgedrückt.

0,1M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCL-Pufferlösung (pH = 8,0; 2,5 ml) enthaltend 10 mM Putreszindihydrochlorid wird in eine Küvette gegeben (optische Länge: 1 cm), 20 µl (5 IE Putreszinoxidase, abgeleitet aus einem Micrococcus-Stamm, werden hinzugegeben und das Gemisch wird zehn Minuten lang bei 30°C inkubiert. Zur entstehenden Lösung werden - in dieser Reihenfolge - 0,5 ml einer wäßrigen 20 mM NAD-Lösung und 50 µl Probenlösung gegeben, die 4-Aminobutanaldehyddehydrogenase enthält und es wird die Geschwindigkeit der Absorptionszunahme bei 340 nm gemessen. Die Enzymaktivität für 1,0 ml Probenlösung kann berechnet werden aus der Absorbanzzunahme pro Minute (A) unter Verwendung der folgenden Umwandlungsgleichung (1), wobei die Enzymmenge, die 1 µmol NADH bildet, als 1 IE (internationale Einheit für Enzyme) bezeichnet wird (µmol/min).

Die relative Aktivität der für diese Erfindung verwendeten 4-Aminobutanal-Dehydrogenase beträgt 120 bis 140 IE/mg Protein. Die Elektrophorese dieses Enzyms auf Polyacrylamidgel zeigt eine einzelne Proteinbande sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Natriumdodecylsulfat.

Die vorerwähnte 4-Aminobutanal-Dehydrogenase kann unter allen Bedingungen der Reaktion unterworfen werden, die die Wirkung dieses Enzyms gestattet. Normalerweise sollte die Reaktion jedoch bevorzugt nahe dem pH-Optimum und dem Temperaturoptimum des verwendeten Enzyms durchgeführt werden. Die Enzymkonzentration liegt normalerweise im Bereich von 0,1 bis 50 IE.

Für das erfindungsgemäße Verfahren kann jeder beliebige Typ von oxidiertem Nicotinamid-Coenzym verwendet werden, wobei oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) und oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP) erläuternde Beispiele darstellen. Diese Coenzyme wirken bei der Reaktion als Wasserstoffrezeptor unter Bildung von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) bzw. reduziertem Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren läßt man normalerweise alle Enzyme (Polyamin oxidierendes Enzym, 4-Aminobutanal- Dehydrogenase, oxidiertes Nicotinamid-Coenzym und, nach Erfordernis, Acylpolyaminamidohydrolase) gleichzeitig auf die Probenlösung einwirken. Es kann jedoch auch eine Zweischritt- Technik (Zugabe von Polyamin oxidierendem Enzym, gefolgt von Zugabe von oxidiertem Nicotinamid-Coenzym und 4-Aminobutanal- Dehydrogenase) angewandt werden, weil ein Polyamin in der Probenlösung zuerst in den korrespondierenden ω-Amino alkylaldehyd durch die Wirkung des Polyamin oxidierenden Enzyms übergeführt wird, welches seinerseits mit dem oxidierten Nicotinamid-Coenzym durch die Wirkung von 4-Aminobutanal- Dehydrogenase reagiert und somit Nicotinamid-Coenzym in der reduzierten Form bildet.

Die Reaktion der Erfindung kann unter allen Bedingungen ausgeführt werden, die eine normale Wirkung eines jeden der Enzyme gestattet. Bevorzugt liegt der pH-Wert im allgemeinen im Bereich von 6,5 bis 8,5. Die gleichzeitige Wirkung der Enzyme kann auf verschiedene Weise bewirkt werden: gleichzeitige Zugabe aller Enzyme zur Probenlösung; Zugabe von 4-Aminobutanal- Dehydrogenase, während die Oxidation von Polyaminen durch Polyamin oxidierendes Enzym abläuft; und Zugabe von 4-Aminobutanal-Dehydrogenase gefolgt von Zugabe von Polyamin oxidierendem Enzym.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann jede beliebige bekannte Technik zur quantitativen Bestimmung von reduziertem Nicotinamid- Coenzym verwendet werden. Das am meisten bevorzugte ist das colorimetrische Verfahren, bei dem reduziertes Nicotinamid- Coenzym durch die Wirkung eines Farbbildungssystems, welches aus einem Tetrazoliumsalz und einem Elektronenträger aufgebaut ist, in einen Formazanfarbstoff übergeführt wird. Für die Zwecke der Erfindung kann jeder beliebige Typ von Tetrazoliumsalz (unter Einschluß von Mono- und Di-Tetrazoliumsalzen) verwendet werden. Beispiele zur Erläuterung sind

3- (p-Iodophenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (nachfolgend mit INT abgekürzt), 3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4, 4′-biphenylen)-bis [2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid] (Nitro-TB), 3,3′-(4,4′-Biphenylen)-bis(2,5-diphenyl- 2H-tetrazoliumchlorid) (Neo-TB), 3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′- biphenylen)-bis [2,5-bis(p-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumchlorid] (TNTB), und 3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4-biphenylen)-bis [2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid] (TB).

Von diesen sind INT (Monotetrazoliumsalz) und Nitro-TB (Ditetrazoliumsalz) die am meisten bevorzugten. Die geeignete Konzentration des Tetrazoliumsalzes kann mit den anderen Reaktionsbedingungen variieren, liegt jedoch normalerweise im Bereich von 0,01 bis 50 mM. Der Elektronenträger dient dazu, Wasserstoff von Nicotinamid- Coenzym in der reduzierten Form zum Tetrazoliumsalz zu transportieren und es somit in einen Formazanfarbstoff umzuwandeln, der eine Resonanzstruktur aufweist. Erläuternde Beispiele sind Diaphorase und 1-Methoxy-5-Methylphenaziniummethylsulfat (1-Methoxy-PMS), wobei die Verwendung von Diaphorase bevorzugt ist. Ihre geeignete Menge kann mit den anderen Reaktionsbedingungen variieren, liegt jedoch normalerweise im Bereich von 0,1 bis 50 IE.

Die Menge an reduziertem Nicotinamid-Coenzym wird am meisten bevorzugt dadurch bestimmt, daß man ein Tetrazoliumsalz bei einem pH-Pegel im Bereich von 4 bis 7 (bevorzugt von 5 bis 6,5) in Gegenwart eines nichtionischen Tensids in einer Menge von 0,3 bis 10 Gewichtsprozent (bevorzugt 0,5 bis 2 Gewichtsprozent) auf eine Probenlösung einwirken läßt, die dieses Coenzym enthält, daß man die Intensität der so entwickelten Farbe mit dem bekannten colorimetrischen Verfahren mißt, und daß man die Menge an Coenzym aus der quantitativen Beziehung zwischen Polyamin und Nicotinamid-Coenzym in der reduzierten Form berechnet, die vorher unter Verwendung von Proben mit bekannten Polyaminkonzentrationen bestimmt wurde.

Der pH-Wert der Probenlösung kann mit jedem bekannten Verfahren eingestellt werden, bevorzugt durch Verwendung einer Pufferlösung (Regelbereich des pH-Wertes: 4 bis 7). Bevorzugt verwendet werden z. B. Puffer des Aminosäure-Typs und einige Good-Puffer, wie z. B. MES-[2-(N-Morpholino)ethansulfonsäuremonohydrat], Bis-Tris-[Bis(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl) methan] und PIPES-[Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure)]- puffer. Der pH-Wert sollte unter Berücksichtigung der Stabilität des Elektronenträgers (z. B. Diaphorase) bei einem Pegel im Bereich von 4 bis 7, am meisten bevorzugt im Bereich von 5 bis 6,5 eingeregelt werden. Die Pufferlösung kann mit jeder beliebigen Konzentration verwendet werden, die eine stabile pH-Regelung ermöglicht, normalerweise bei einem Pegel im Bereich von 0,1 bis 1,0 M.

Es gibt keine besondere Beschränkung in bezug auf den Typ von nichtionischem Tensid, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, solange er die Reaktion nicht verzögert. Jedoch werden im Hinblick auf die Stabilität und auf den molekularen Extinktionskoeffizienten des gebildeten Formazanfarbstoffs und im Hinblick auf den fällungsverhindernden Effekt Polyoxyethylenalkylarylether, Polyoxyethylen-styrierte Phenole, Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyethylenether höherer Alkohole und Polyoxyethylenester von Fettsäuren bevorzugt eingesetzt. Erläuternde Beispiele sind Emulgen 935®, Penerol N-100N/C®, Penerol SP-24®, Emulsit 25® und Triton X-100®. Diese Tenside zeigen ihre Wirkung bei einer Konzentration im Bereich von 0,3 bis 10 Gewichtsprozent, wie vorstehend erwähnt wurde, jedoch wird die Reaktion bevorzugt in Gegenwart eines nichtionischen Tensids mit einer Menge von 0,5 bis 2,0 Gewichtsprozent durchgeführt.

Das vorstehend beschriebene Verfahren zur quantitativen Bestimmung von reduziertem Nicotinamid-Coenzym hat den Vorteil, daß die Verwendung einer großen Menge an nichtionischem Tensid es möglich macht, die colorimetrische Messung auf der sauren Seite durchzuführen. Bei herkömmlichen Verfahren wird zu einem Gemisch, in dem unter sauren Bedingungen reduziertes Nicotinamid- Coenzym gebildet wurde, ein Farbentwickler zugesetzt und die Farbe wird unter alkalischen Bedingungen entwickelt und gemessen. Eine solche Entwicklung und Messung von Farbe unter alkalischen Bedingungen wird oft von reduzierenden Substanzen nachteilig beeinflußt, die in Körperflüssigkeit vorhanden sind, wodurch es schwierig ist, die Menge dieses Coenzyms genau zu bestimmen. Das erfindungsgsgemäße Verfahren, das die colorimetrische Messung unter sauren Bedingungen ermöglicht, stellt somit eine sehr wichtige Technik zur Verfügung, die das vorerwähnte, mit herkömmlichen Verfahren verbundene Problem überwindet. Ein anderer Vorteil besteht darin, daß das nichtionische Tensid und der Farbentwickler nicht notwendigerweise dem System zugesetzt werden müssen, in dem reduziertes Nicotinamid-Coenzym gebildet wurde, sondern sie können der Polyamine enthaltenden Probenlösung gleichzeitig mit oder vor dem Zusatz der vorstehend erwähnten Enzyme zugesetzt werden.

Die colorimetrische Messung kann unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, z. B. bei einem pH-Wert unter 4 (eingestellt unabhängig von pH-Bereich von 4 bis 7, der zur Farbentwicklung benötigt wird).

Beim vorstehend in Einzelheiten geschilderten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von reduziertem Nicotinamid-Coenzym kann das Tetrazoliumsalz mit Konzentrationen über einen weiten Bereich verwendet werden, weil es keine Reduktion mit reduzierenden Substanzen eingeht, die in der Probenlösung (z. B. Körperflüssigkeit) enthalten sind. Somit ist dieses Verfahren nicht nur anwendbar auf die Bestimmung von reduziertem Nicotinamid- Coenzym, das aus Polyaminen abgeleitet wurde, sondern auch auf viele andere Fälle, z. B. auf die Bestimmung von reduziertem Nicotinamid-Coenzym, das über die nachstehend aufgelisteten Reaktionswege gebildet wurde.

1. Lactatdehydrogenase
L-Lactat + NAD⁺ ⇆ Pyruvat + NADH + H⁺
2. Isocitratdehydrogenase
Isocitrat + NAD⁺ ⇆ 2-Oxogluterat + CO₂ + NADH
3. Glucose-6-phosphatdehydrogenase
D-Glucose-6-phosphat + NADP⁺ ⇆ D-Glucono-δ-Lacton-6-phosphat + NADPH + H⁺
4. Galactosedehydrogenase
D-Galactofuranose + NAD⁺ ⇆ D-Galacton-γ-lacton + NADH + H⁺
5. Pyruvatdehydrogenase
Pyruvat + CoA-SH + NAD⁺ ⇆ Acetyl-S-CoA + CO₂ + NADH + H⁺
6. Alkoholdehydrogenase
R-CH₂OH + NAD⁺ ⇆ R-CHO + NADH+H⁺
7. Glycerindehydrogenase
Glycerin + NAD⁺ ⇆ Dihydroxyaceton + NADH + H⁺
8. D-Xylulosereductase
Xylitol + NAD⁺ ⇆ D-Xylulose + NADH + H⁺
9. Malatdehydrogenase
L-Malat + NAD⁺ ⇆ Oxaloacetat + NADH
10. Glucosedehydrogenase
β-D-Glucopyranose + NAD(P)⁺ ⇆ D-Glucon-δ-lacton + NAD(P)H + H⁺
11. 6-Phosphogluconatdehydrogenase
6-Phospho-D-gluconat + NAD⁺ ⇆ 2-Keto-6-phospho-D-gluconat + NADH
12. Ureidoglycollatdehydrogenase
Ureidoglycollat + NAD(P)⁺ ⇆ Oxalurat + NAD(P)H + H⁺
13. Formatdehydrogenase
Format + NAD⁺ ⇆ CO₂ + NADH
14. Aldehyddehydrogenase
R-CHO + NAD⁺ + H₂O ⇆ R-COO^- + NADH + 2H⁺
15. Alanindehydrogenase
L-Alanin + H₂O + NAD⁺ ⇆ Pyruvat + NH₄⁺ + NADH + H⁺
16. Glutamatdehydrogenase
L-Glutamat + H₂O + NAD⁺ ⇆ 2-Oxoglutarat + NH₄⁺ + NADH + H⁺
17. Serindehydrogenase
Serin + NAD⁺ + H₂O ⇆ Hydroxypyruvat + NADH + NH₄⁺ + H⁺
18. Valindehydrogenase
Valin + H₂O + NADP⁺ ⇆ 2-Oxoisovalerat + NH₄⁺ + NADPH + H⁺
19. Leucindehydrogenase
L-Leucin + H₂O + NAD⁺ ⇆ 2-Oxoisocaproat + NH₄⁺ + NADH + H⁺
20. Glycindehydrogenase
Glycin + H₂O + NAD⁺ ⇆ Glyoxylat + NH₄⁺ + NADH + H⁺
21. 3 α-Hydroxysteroiddehydrogenase
3 α-Hydroxysteroid + NAD(P)⁺ ⇆ 3-Oxosteroid + NAD(P)H + H⁺

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, sind jedoch nicht als Begrenzung ihres Bereichs gedacht.

Referenzbeispiel

Eine 240 µmol/l-Lösung von Acetylpolyaminen (Acetylputreszin zu Acetylcadaverin zu Acetylspermidin = 8 : 1 : 1, wobei das Acetylspermidin zusammengesetzt war aus N¹-Acetylspermidin zu N⁸- Acetylspermidin = 3 : 1) wurde hergestellt, und es wurden Reihenverdünnungen davon bereitet. Jede der Verdünnungen (0,5 ml) wurde mit 0,5 ml des in Tabelle 1 gezeigten Reagens 1 gemischt und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C erwärmt. Reagens 2 (0,5 ml), gezeigt in Tabelle 2, wurde dann zugegeben und die Reaktion wurde fünf Minuten lang bei 37°C bei pH = 6,0 und bei einer Tensidkonzentration von 1,33 Gewichtsprozent durchgeführt. Nach Zugabe von 1 mol/l Salzsäure (0,5 ml) wurde die Absorbanz bei 530 nm gemessen. Die Absorbanzdaten für wechselnde Polyaminkonzentrationen sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Getrennt davon wurde eine 200 µmol/l-Lösung von Polyaminen (Putreszin zu Cadaverin zu Spermidin = 3 : 1 : 1) hergestellt und es wurden Reihenverdünnungen davon bereitet. Jede der Verdünnungen (0,5 ml) wurde mit 0,5 ml eines Reagens gemischt, das eine dem Reagens 1 ähnliche Zusammensetzung hatte, jedoch mit der Ausnahme, daß die Acylpolyaminamidohydrolase weggelassen wurde, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei 37°C erwärmt. Reagens 2 (0,5 ml) wurde dann zugegeben und die Reaktion wurde 5 Minuten lang bei 37°C, bei pH = 6,0 und bei einer Tensidkonzentration von 1,33 Gewichtsprozent durchgeführt. Nach Zugabe von 1 Mol/l Salzsäure (0,5 ml) wurde die Absorbanz bei 530 nm gemessen. Die so erhaltenen Daten sind ebenfalls in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 1 (Reagens 1)
Acylpolyaminamidohydrolase (abgeleitet aus Streptomyces\|240 IE
Putreszinoxidase (abgeleitet aus Micrococcus)	80 IE
4-Aminobutanal-Dehydrogenase (abgeleitet aus Micrococcus)	10 IE
Oxidiertes Nicotinamid-Coenzym (Wako Junyaku Co., Ltd.)	10,2 mg
Ascorbatoxidase (Toyo Jozo Co., Ltd.)	45 IE
Emulgen 935 (Kao Soap Co., Ltd.)	0,4 g
Oxamsäure (Aldrich Chemical Company, Inc.)	35,6 mg

Die obigen Komponenten werden in 10 ml 0,4 M Tris- HCl-Puffer (pH = 8,0) gelöst.

Tabelle 2 (Reagens 2)
Nitrotetrazoliumblau (Dojin Chemical Research Laboratories)\|5,0 mg
Diaphorase (Oriental Enzyme Co., Ltd.)	80 IE

Die obigen Komponenten wurden in 20 ml 0,6 M MES- Puffer (pH = 6,0; Dojin Chemical Research Laboratories) gelöst.

Tabelle 3

Die Daten von Tabelle 3 zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen Polyaminkonzentration und Absorbanz, womit gezeigt wird, daß sowohl konjugierte als auch freie Polyamine colorimetrisch gemessen werden können.

Die in Tabelle 1 verwendete 4-Aminobutanal-Dehydrogenase wurde gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt. Mit Micrococcus flavidus wurden 10 l eines Mediums (pH = 7,5) beimpft, welches 0,5% Glucose, 0,5% Pepton, 0,1% NaCl, 0,2% Hefeextrakt und 0,04% eines oberflächenaktiven Mittels (LG 294; Asahi Denka Kogyo K.K.) enthielt und 24 Stunden lang bei 26°C inkubiert. Die so erhaltene Stammkultur wurde zu 160 l eines Mediums (pH = 6,5) gegeben, das 0,5% Glucose, 0,5% Pepton, 0,13% NaCl, 0,15% Hefeextrakt, 0,3% Putreszin und 0,04% LG 294 enthielt und die Kultivierung wurde 24 Stunden lang bei 26°C durchgeführt. Die gezüchteten mikrobiellen Zellen (3 kg) wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 0,01 M Phosphat-Puffer (pH = 7,0) gewaschen, im gleichen Typ von Phosphat-Puffer suspendiert und in einer Mühle zerstört. Die so erhaltene Suspension aus Zellteilen wurde zentrifugiert und der Überstand gesammelt, was eine Lösung von roher 4-Aminobutanal-Dehydrogenase (etwa 80 000 IE) ergab.

Diese Lösung wurde durch eine DE-52-Säule (5,0 l) geleitet, die vorher mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH = 7,0) equilibriert wurde, die Säule wurde dem gleichen Typ von Phosphatpuffer, der 0,1 M Ammoniumsulfat enthielt, gewaschen und die adsorbierte 4-Aminobutanal-Dehydrogenase wurde mit dem gleichen Typ von Phosphatpuffer, der 0,4 M Ammoniumsulfat enthielt, eluiert.

Das so erhaltene Eluat wurde der wiederholten Entsalzung (mit 0,01 M Phosphatpuffer von pH = 7,0) und der Konzentration unterworfen, was eine Lösung von 4-Aminobutanal-Dehydrogenase (40 000 IE) ergab. Die Rückgewinnungsrate betrug 50%, bezogen auf die Lösung des Rohprodukts.

Beispiel 1 (Quantitative Bestimmung von Polyaminen im Blut)

Zu 1,0 ml einer Blutprobe wurden 1,0 ml einer 10% Trichloressigsäure- Lösung gegeben und das Gemisch zur Bewirkung der Entfernung von Protein heftig gerührt und fünf Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Überstand (1,0 ml) wurde gesammelt und durch Zugabe einer 0,3 M Tris(hydroxymethyl) aminomethan-Lösung (1,0 ml) neutralisiert, was eine Untersuchungslösung ergab.

Zu dieser Untersuchungslösung (0,5 ml) wurden 0,5 ml eines Reagens (Reagens 1′) gegeben, das eine Zusammensetzung ähnlich der von Reagens 1 hatte, jedoch mit der Ausnahme, daß 240 IE der Acylpolyaminamidohydrolase (abgeleitet aus Streptomyces) mit 50 IE Polyaminoxidase (abgeleitet aus Gerste) ersetzt wurde, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei pH= 8,0 auf 37°C erwärmt. Es wurde dann Reagens 2 (0,5 ml) zugegeben und die Reaktion fünf Minuten lang bei pH = 6,0, bei 37°C und bei einer Tensidkonzentration von 1,33 Gewichtsprozent durchgeführt. Nach Zugabe von 1 Mol/l Salzsäure (0,5 ml) wurde die Absorbanz bei 530 nm gemessen (E_s). Getrennt davon wurden 0,5 ml des in Tabelle 4 gezeigten Reagens 3 zu 0,5 ml der Untersuchungslösung gegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten auf 37°C erwärmt und dann in der gleichen Art wie oben zur Messung der Absorbanz des Blindwertes (E_s′) behandelt.

Tabelle 4 (Reagens 3)
Oxidiertes Nicotinamid-Coenzym (Wako Junyaku Co., Ltd.)\|10,2 mg
Ascorbatoxidase (Toyo Jozo Co., Ltd.)	45 IE
Emulgen 935 (Kao Soap Co., Ltd.)	0,4 g
Oxamsäure (Aldrich Chemical Company, Inc.)	35,6 mg

Die obigen Komponenten wurden in 10 ml 0,4 M Tris- HCL-Puffer (pH = 7,8) gelöst.

Andererseits wurden auch gemäß den zur Messung von E_s und E_s′ verwendeten Verfahren die Absorbanz von 30 µM Putreszindihydrochlorid- Lösung (als Standard) und von reinem Wasser (als Testblindwert) gemessen (E_st und E_st′ für den Standard und E_H₂O und E_H₂O′ für den Testblindwert). Die vorstehend beschriebenen Meßverfahren sind in Tabelle 5 zusammengefaßt.

Die Menge an Polyaminen in der Blutprobe kann aus den oben erhaltenen Absorbanzdaten unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden:

Es wurden drei Arten von Blutproben gemäß dem näher ausgeführten Verfahren untersucht, um die in jeder Probe enthaltene Menge an Polyaminen zu bestimmen. Das Ergebnis ist in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 5

Die gleichen Blutproben wie oben wurden zur Bestimmung der Menge an Polyaminen mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) untersucht. Das Ergebnis wird ebenfalls in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6

Aus der Tabelle wird deutlich, daß die Menge an Polyaminen in Blut mit dem erfindungsgemäßen Verfahren korrekt bestimmt werden kann.

Beispiel 2 (Quantitative Bestimmung von Polyaminen in Urin)

Die Menge an Polyaminen in Urinproben wurde im wesentlichen in der gleichen Art wie in Beispiel 1 bestimmt, jedoch mit der Ausnahme, daß anstelle der aus Blutproben hergestellten Untersuchungslösungen Urinproben (0,5 ml) verwendet wurden, und daß Reagens 1 anstelle von Reagens 1′ eingesetzt wurde.

Die Messung wurde an drei Arten von Urinproben durchgeführt (für jede fünfmal). Die Werte für E_s - E_s′ einer jeden Probe sind in Tabelle 7 gezeigt, die die hohe Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigen. Die Werte für E_st - E_st′ und für E_H₂O - E_H₂O′ betrugen 0,146 bzw. 0,013. Die Menge an Polyaminen in jeder Probe wurde aus dem Wert für E_s - E_s′ berechnet, der im ersten Versuch von fünf Untersuchungen erhalten wurde. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 7 gezeigt. Getrennt davon wurden die Mengen an Polyaminen in diesen Urinproben gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren mit HPLC gemessen. Zu jeder der Urinproben (1 ml) wurden 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 7,2) gegeben, der 240 IE Acylpolyaminamidohydrolase enthielt und die Probe wurde eine Stunde lang auf 37°C erwärmt, um alle enthaltenen Acylpolyamine in freie Polyamine überzuführen. Die Fällung wurde durch Zentrifugation entfernt, der Überstand (3 ml) durch eine Minisäule geschickt, die mit schwach saurem Kationenaustauscherharz gefüllt war, die Säule mit reinem Wasser gewaschen und die adsorbierten Polyamine mit 1 ml 0,4 M Trichloressigsäure- Lösung eluiert. Das so erhaltene Eluat wurde zur Bestimmung der Menge an Polyaminen der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterworfen. Das Ergebnis ist ebenso in Tabelle 7 gezeigt.

Aus der Tabelle wird deutlich, daß die in Urin enthaltene Menge an Polyaminen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren korrekt bestimmt werden kann.

Tabelle 7

Beispiel 3

Es wurde eine Urinprobe hergestellt, die 120 µmol/l Polyamine (Putreszin zu Cadaverin zu Spermidin = 8 : 1 : 1) enthielt. Getrennt davon wurde eine Probenlösung hergestellt, die den gleichen Urin wie oben enthielt, und die anstelle der Polyamine reines Wasser enthielt. Die Menge an Polyaminen in der Urinprobe wurde gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren bestimmt, wobei die Reagenzien der folgenden Zusammensetzungen verwendet wurden.

a) Reagenzien (Reagens 4)
Ascorbatoxidase (Toyo Jozo Co., Ltd.)\|45 IE
Putreszinoxidase (abgeleitet aus Micrococcus)	80 IE
4-Aminobutanal-Dehydrogenase (abgeleitet aus Mikrococcus)	10 IE
Oxidiertes Nicotinamid-Coenzym (Wako Junyaku Co., Ltd.)	10,2 mg
Emulgen 935 (Kao Soap Co., Ltd.)	0,4 g

Die obigen Komponenten wurden in 10 ml 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) gelöst.

(Reagens 5)
Nitrotetrazoliumblau (Nitro-TB) (Dojin Chemical Research Laboratories\|5,0 mg
Diaphorase (Oriental Enzyme Co., Ltd.)	80 IE

Die obigen Komponenten wurden in 0,6 M MES-Puffer (pH = 6,0; Dojin Chemical Research Laboratories) zu einem Gesamtvolumen von 20 ml gelöst.

(Reagens 6)

1 M Salzsäure

b) Untersuchungsverfahren

Die oben hergestellten Urinproben wurden gemäß dem in Tabelle 8 gezeigten Verfahren, wie nachstehend beschrieben, behandelt. Zu jeder der Probenlösungen (0,5 ml) wurden 0,5 ml von Reagens 4 gegeben, und das Gemisch wurde 20 Minuten lang auf 37°C erwärmt. Es wurde dann Reagens 5 (0,5 ml) zugegeben, der pH- Wert wurde auf 6,0 eingestellt, ein Tetrazolium-Farbentwickler wurde zugesetzt und die Reaktion wurde 5 Minuten lang bei 37°C durchgeführt. Nach Zugabe von 1 Mol/l Salzsäure (0,5 ml) wurde die Absorbanz bei 530 nm gemessen.

Tabelle 8

Bei dem in dieser Tabelle gezeigten Verfahren wurde die Menge an Emulgen 935 in Reagens 4 variiert, so daß seine Konzentration nach der Zugabe von Reagens 5 0,8%, 1,2%, 3,0% und 5,0% beträgt.

Die Menge an reduziertem Nicotinamid-Coenzym im Urin wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung aus den oben erhaltenen Absorbanzdaten berechnet:

(wobei der Verdünnungsfaktor denjenigen der Urinprobe im letzten Schritt des analytischen Verfahrens darstellt, und wobei unter dem molek. Extinktionskoeffizienten der theoretische Wert für den Formazanfarbstoff verstanden wird).

Die Messung wurde unter den gleichen Bedingungen fünfmal wiederholt und das Ergebnis ist in Tabelle 9 zusammengefaßt. Aus den oben erhaltenen Absorbanzdaten wurden molekulare Extinktionskoeffizienten des Formazanfarbstoffs unter den unterschiedlichen Bedingungen berechnet, die ebenfalls in Tabelle 9 gezeigt sind.

Aus der Tabelle wird deutlich, daß die Menge an Polyaminen auf Grund des ausreichend großen Wertes des molekularen Extinktionskoeffizienten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei hoher Empfindlichkeit sehr genau und übereinstimmend bestimmt werden kann.

Tabelle 9

Beispiel 4

Dieses Beispiel untersucht die möglichen Auswirkungen von reduzierenden Substanzen bei der quantitativen Bestimmung von Polyaminen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der Reagenzien der folgenden Zusammensetzungen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengestellt.

a) Reagenzien (Reagens 7)
Putreszinoxidase (abgeleitet aus Micrococcus)\|80 IE
4-Aminobutanal-Dehydrogenase (abgeleitet aus Micrococcus)	10 IE
Oxidiertes Nicotinamid-Coenzym (Wako Junyaku Co., Ltd.)	10,2 mg
Ascorbatoxidase (Toyo Jozo Co., Ltd.)	40 IE

(Reagens 8)
Nitrotetrazoliumblau (Nitro-TB) (Dojin Chemical Research Laboratories)\|1,5 mg
Diaphorase (Oriental Enzyme Co., Ltd.)	40 IE
Emulgen 935	0,4 g

Die obigen Komponenten wurden in 20 ml 0,2 M MES-Puffer gelöst.

b) Untersuchungsverfahren

Lösungen, die bekannte Konzentrationen an Polyaminen und einer reduzierenden Substanz enthielten, wurden mit einer Lösung verdünnt, die Polyamine einer bestimmten Konzentration enthielten, wodurch Reihenverdünnungen der gleichen Polyaminkonzentration und variierenden Konzentrationen an reduzierender Substanz entstanden. Getrennt davon wurden ähnliche Reihenverdünnungen hergestellt, bei denen anstelle der Polyamine reines Wasser verwendet wurde. Die Untersuchungslösungen wurden zur Untersuchung der Auswirkung der verschiedenen reduzierenden Mittel unter Verwendung eines Hitachi Automatic Analyser, Modell 7050, auf die Menge an Polyaminen analysiert.

Zu jeder der Untersuchungslösungen (20 µl) wurden 100 µl Reagens 7 gegeben und das Gemisch wurde 5 Minuten lang auf 37°C erwärmt. Es wurde dann Reagens 8 (250 µl) zugegeben und die Reaktion fünf Minuten lang bei pH = 6,0, bei 37°C und bei einer Tensidkonzentration von 1,35% durchgeführt, um die Menge an Polyaminen zu bestimmen. Eine vorläufige Untersuchung zeigte, daß die Absorbanz von physiologischer Kochsalzlösung, die 50 µmol/l Polyamine enthält (Standardlösung) 0,0475 beträgt (physiologische Kochsalzlösung als Blindwert verwendet). Auf der Grundlage dieses Wertes wurde die Umwandlung der Absorbanzdaten zur Polyaminkonzentration gemäß den folgenden Gleichungen durchgeführt:

wobei A 1 und A 2 die Absorption der Probe mit (A 3) bzw. ohne (A 2) Polyamin ist (Zunahme in blanks).

Die oben erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefaßt.

Aus Tabelle 11 wird deutlich, daß - obwohl mit Ascorbinsäure eine geringe Zunahme bei den Blindwerten festgestellt wurde - bei den anderen reduzierenden Substanzen keine Auswirkung beobachtet wurde. Im Hinblick auf die analytischen Werte der Polyamine (C 1 - C 2) hatte keine der reduzierenden Substanzen überhaupt eine Auswirkung. Die entwickelte Farbe des Formazan- Farbstoffs war auch sehr stabil, wobei weder Kontamination der im automatischen Analysator verwendeten Zellen noch Fällung von Farbstoff beobachtet wurde.

Beispiel 5

Es wurden die Mengen an Polyaminen gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren unter Verwendung der Reagenzien der folgenden Zusammensetzung bestimmt, wobei die Auswirkung des pH-Wertes auf die Bestimmung von Nicotinamid-Coenzym der reduzierten Form untersucht wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 12 gezeigt.

Tabelle 11

a) Reagenzien (Reagens 9)

Reagens ähnlich dem in Beispiel 3 beschriebenen Reagens 4, jedoch mit der Ausnahme, daß Emulgen 935 in einer Menge von 0,4 g verwendet wurde.

(Reagens 10)

Reagens ähnlich dem in Beispiel 3 beschriebenen Reagens 5, jedoch mit der Ausnahme, daß der 0,6 M MES-Puffer (pH = 6,0) durch Puffer mit unterschiedlichen pH-Pegeln, wie in Tabelle 12 gezeigt, ersetzt wurde.

(Reagens 11)

1 M Salzsäure

b) Untersuchungsverfahren

Es wurden Urinproben mit den gleichen Zusammensetzungen wie die des Beispiels 3 hergestellt, die 60,0 µmol/l Polyamine enthielten. Getrennt davon wurden den gleichen Urin wie oben enthaltende Lösungen hergestellt, die reines Wasser anstelle der Polyamine enthalten. Die obigen Urinproben wurden, wie nachfolgend beschrieben, behandelt. Zu jeder der Probenlösungen (0,5 ml) wurden 0,5 ml Reagens 9 zugegeben und das Gemisch wurde 20 Minuten lang bei pH = 8,0 und 37°C erwärmt. Es wurde dann Reagens 10 (0,5 ml) zugegeben und es wurde ein Tetrazolium- Farbentwickler bei unterschiedlichen pH-Pegeln fünf Minuten lang bei 37°C einwirken lassen, Reagens 11 (0,5 ml) wurde zugegeben und die Absorbanz bei 530 nm wurde gemessen. Die Messung wurde bei jedem pH-Wert fünfmal wiederholt. In ähnlicher Weise wurde die Absorbanz für eine 30 µmol/l-Polyaminlösung und für reines Wasser gemessen (0,146 bzw. 0,013).

Die in Tabelle 12 gezeigten gemessenen Mengen an Polyaminen wurden unter Verwendung der folgenden Gleichung aus den Absorbanzdaten von Probenlösungen (E_s) und denen von Blindlösungen (E_b) berechnet:

In der Tabelle sind auch die Mittelwerte und die Variationskoeffizienten (VK) von fünf Messungen bei jedem pH-Pegel gezeigt.

Tabelle 12

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Polyaminen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polyamin oxidierendes Enzym, 4-Aminobutanal-Dehydrogenase und ein oxidiertes Nicotinamid-Coenzym auf eine Polyamine enthaltende Probenlösung einwirken läßt und das so gebildete reduzierte Nicotinamid-Coenzym mißt, wodurch man die Menge an Polyaminen bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyamin oxidierende Enzym, die 4-Aminobutanal-Dehydrogenase und das oxidierte Nicotinamid-Coenzym vorher zur Bildung eines Reagens mischt, und daß man die Analyse dadurch ausführt, daß man dieses Reagens einer Polyamine enthaltenden Probenlösung beimischt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyamin oxidierende Enzym zuerst auf eine Polyamin enthaltende Probenlösung einwirken läßt, gefolgt vom gleichzeitigen oder getrennten Zusatz von 4-Aminobutanal- Dehydrogenase und oxidiertem Nicotinamid-Coenzym.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als oxidiertes Nicotinamid-Coenzym oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotid oder Nicotinamidadenindinucleotidphosphat verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge an Nicotinamid-Coenzym dadurch bestimmt, daß man einen Tetrazolium-Farbentwickler bei einem pH-Wert im Bereich von 4-7 in Gegenwart eines nichtionischen Tensids in einer Menge von 0,3-10 Gew.-% auf die das Coenzym in der reduzierten Form enthaltende Lösung einwirken läßt, und daß man die Intensität des so entwickelten Farbstoffs mißt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyamin Spermidin, Putreszin, Spermin, Cadaverin oder Gemische von zwei oder mehreren davon verwendet.