DE2830453C2 - Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms - Google Patents

Description

dadurch gekennzeichnet, daß als Effektor ein das Isoenzym spezifisch inhibierendes Amphiphil verwendet wird.

2. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von mehr als einem Isoenzym in einer Probe nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils, das die Aktivität eines jeden Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, auf jedes Isoenzym mengenmäßig erfaßt, in Gegenwart verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils so viele Bestimmungen durchführt, wie Isoenzyme vorliegen, und aus den erhaltenen Werten die jeweiligen Aktivitäten berechnet.

3. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines oder mehrerer LDH-Isoenzyme nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Heparin, Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat, Natriumisopropylnaphthalinsulfonat, Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat, Natriumoctylphenolpoly(äthenoxy)sulfonat, Alkylsulfonat, Perfluoralkylcarbonsäure, Natriumoctylsulfat, Natriumdecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natriumtetradecylsulfat, das Ölsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes, das Laurinsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes, Nonatrimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Cetylpyridiniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumbromid, Dodecylaminhydrochlorid und/oder Perfluordimethylsulfat-quaternäres Amin, als Amphiphil verwendet.

4. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines LDH-Isoenzyms nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumdecylsulfat oder Natriumdodecylsulfat als Amphiphil verwendet und das Isoenzym LDi bestimmt.

5. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines LDH-Isoenzyms nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Cetylpyridiniumbromid oder Hexadecyltrimethylammoniumbromid als Amphiphil verwendet und das Isoenzym LD5 bestimmt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms in einer Probe, wobei man

a) in einer ersten Bestimmung die Gesamtenzymaktivität in der Probe ermittelt und

b) in Gegenwart eines die Isoenzymaktivität verändernden Effektors eine zweite Bestimmung durchführt und

c) aus der Differenz der beiden Bestimmungen die Aktivität des in der Probe vorliegenden Isoenzyms ermittelt

Isoenzyme sind bekanntlich enzymatisch aktive Proteine, die dieselbe Reaktion katalysieren und in derselben Spezies auftreten, die sich jedoch hinsichtlich bestimmter physikalischchemischer Eigenschaften unterscheiden. So ist beispielsweise die Lactatdehydrogenase (L-Lactat: NAD-Oxidoreductase, EC 1.1.1.27; LDH) ein tetrameres Enzym, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 140 000, abhängig von der jeweiligen Quelle, aufweist. Das Enzmy ist durch zwei Strukturgene kodiert, die zu zwei Untereinheiten (H und M) führen, welche unter Bildung des aktiven tetrameren LDH-Enzyms sich vereinigen. Die Permutationen von H- und M-Untereinheiten im aktiven Enzym führen zu fünf Isoenzymen, nämlich H«, H3M, H2M2, HM₂, HM3 und M4. Derzeit beruht die Nomenklatur für die LDH-Isoenzyme auf deren relativer Wanderung in einem elektrischen Feld, d. h. bei der Elektrophorese.

Die Reihenfolge zunehmender Wanderungsgeschwindigkeit nach der Anode ist: H, > H₃M > H₂M₂ > HM₃ > M* und sie werden als LD₁, LD₂, LD₃, LDh bzw. LD₅ bezeichnet
Seit einigen Jahren konzentriert sich die Aufmerk-

jo samkeit auf den diagnostischen Wert von Isoenzymen. Es wurde festgestellt, daß Bestimmungen der Serumspiegel der Isoenzyme von Cholinesterase, Amylase, Kreatinkinase, Lactatdehydrogenase, alkalischer Phosphatase und Hexosaminidase von klinischer Bedeutung sind. So sind beispielsweise die relativen Mengen dieser LDH-Isoenzyme im Serum eines Patienten zusätzlich zur Gesamt-LDH-Aktivität von diagnostischer Bedeutung. Diese Bedeutung rührt daher, daß LDi und LD2 Isoenzyme in Herz, Nieren und Erythrocytes LD4 und LD5 Isoenzyme in der Skelettmuskulatur und in der Leber, sowie LD₃ Isoenzyme in der Milz, den Lungen, der Bauchspeicheldrüse, der Schilddrüse, in den Nebennierendrüsen und in den Lymphknoten in relativ großer Menge vorliegen. Eine Nekrose der Zellen in geschädigten Organen führt zur Freisetzung ihrer entsprechenden Enzyme in den Blutkreislauf. So kann der Nachweis und die Mengenmäßige Erfassung der LDH-Isoenzyme wertvolle Informationen hinsichtlich der Lage von geschädigtem Gewebe geben, beispielsweise beim Myocardinfarkt und bei Leberschädigungen. Bisher wurden die Isoenzymspiegel nach physikalisch-chemischen, elektrophoretischen und immunochemischen Methoden bestimmt. Da eine große Anzahl der Veröffentlichungen in der Literatur Forschungsarbeiten mit LDH-Isoenzymen beschreibt, konzentriert sich die nachfolgende Erörterung auf LDH, obgleich sie auch für andere Isoenzyme gültig ist.

Aus »Annotiations of the New York Academy of Science«, Band 94, Seite 912 (1961) ist die thermische Denaturierung als Methode zur Bestimmung von LDH-Isoenzymen bekannt. Hierbei macht man von der unterschiedlichen Hitzestabilität der Isoenzyme Gebrauch. Aus dem »Journal of Clinical Pathology«, Band 28, Seite 803 (1S65) ist die selektive Inhibierung von LDH-Isoenzymen mit Reagenzien wie Harnstoff und Oxalat bekannt. Aus »Enzymologie«, Band 26, Seite 125 (1963) und »Nature«, Band 198, Seite 386 (1963) ist es bekannt, organische Lösungsmittel zur Ausfällung von

LDH-Isoenzymen zu verwenden. Aus den US-PS 33 88 044 und 33 26 777 sowie »Proceedings of the National Academy of Science«, Band 69, Seite 1761 (1972) ist weiterhin bekannt, Pyruvat und Lactat dazu zu verwenden, um LDH-Isoenzyme unterschiedlich zu inhibieren. In der Zeitschrift »American Journal of Clinical Pathology«, Band 45, Seite 737 (1966) werden femer elektrophoretische Arbeitsweisen zur Auftrennung von LDH-Isoenzymen beschrieben. Aus der Zeitschrift »Journal of Biological Chemistry«, Band 236, Seite 401 (1961) ist femer eine Methode zur Inhibierung von LDH-Isoenzymen unter Verwendung von Antiseren bei Enzymen des menschlichen Herzens und der Leber bekannt Aus der US-PS 39 94 783 ist weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Serumspiegels von Kxeatin-Phosphokinase-MB-Isoenzym (CPL-MB) bekannt, bei dem die CPK vor und nach der MB-Aktivierung mit l,4-Dimercapto-23-dihydroxybutan oder 2-Mercaptoäthanol ermittelt wird. Aus der GB-PS 14 81463 ist schließlich ein Verfahren zur Isolierung spezifischer Isoenzyme, beispielsweise CPK und LDH, unter Einsatz eines Ionenaustauschers bekannt

Weitere einschlägige Differenzierungsmögfichkeiten bestehen in der Anwendung unterschiedlicher Substratkonzentrationen (vgl. DE-AS 16 98 629), in der Anwendung von Schwermetallsalzlösungen (vgl. DE-OS 25 13 407) oder im ZusaU von Aktivatoren, um durch Differenzbestimmungen die gewünschten Isoenzymaktivitäten zu ermitteln (vgL DE-OS 26 42 855).

Die vorstehend beschriebenen bekannten Arbeitsweisen weisen verschiedene Nachteile auf. Den physikalisch-chemischen Arbeitsweisen fehlt es an ausreichender Spezifität So unterschieden sie beispielsweise nicht ausreichend zwischen LDH-lsoenzymen des Herzens, d.h. LDi und LD₂, und Isoenzymen des Muskels, d. h. LD₄ und LD₅. Darüber hinaus sind die Arbeitsweisen zeitraubend und umständlich. Dennoch ist diese Art von Isoenzymbestimmung im allgemeinen noch imme-· schneller als eine elektrophoretische Arbeitsweise.

Auch elektrophoretische Methoden sind mit dem Nachteil behaftet daß sie zeitraubend und aufwendig sind. So ist nicht nur die Durchführung einer Elektrophorese erforderlich, sondern es ist auch erforderlich, die Reagenzien für <üe LD H-Reaktion herzustellen. Da derartige Reagenzien im allgemeinen instabil sind, müssen sie für jeden Ansatz frisch hergestellt werden. Schließlich muß man die Elektrophoreseplatten nach der Behandlung mit Reagenzlösung inkubieren, eine Fixierwäsche durchführen und eine densitometrische Ablesung vornehmen.

Die Bestimmung von Isoenzymen unter Anwendung von immunochemischen Methoden hat sich als eine vielversprechende Technik angeboten. So führt beispielsweise die Verwendung von LDH-Isoenzymen als Antigene zur Produktion von Antiseren, bei denen es sich um relativ spezifische Diskriminatoren unter den Isoenzymen handelt. Jedoch erfolgt die Produktion aktiver Antikörper nur dann, wenn man als Antigen das native LDH-Enzym einsetzt. Wenn LDi das Antigen ist, werden Antiseren für LDi produziert, die auf LD4<LD3>LD₂ einen inhibierenden Effekt ausüben. Wenn man dagegen LDj als Antigen einsetzt, werden Antiseren produziert, die für LDs spezifisch sind und die auf LDj<LD₃<LD4 einen inhibierenden Effekt ausüben. Darüber hinaus giVj es Anzeichen, daß nicht-neutralisierende Antikörper gebildet werden, wodurch die Isoenzyme vor einer Inaktivierung durch Antikörper geschützt werden. Schließlich ist die Produktion von Antiseren zeitraubend. Deren Reinigung ist darüberhir.-aus schwierig.
Es ist ebenfalls bekannt, oberflächenaktive Verbindüngen (AmphiphUe) zur Reinigung und Charakterisierung von Proteinen einzusetzen. So eignen sich beispielsweise nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen zur Extraktion von Enzymen aus Zellen. Aus »Biochimica et Biophysica Acta«, Band 371, Seiten 442 bis 450 (1974) ist femer bekannt, Cetyltrimethylamrnoniumbromid bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese hydrophiler Proteine zur Bestimmung des Molekulargewichts einzusetzen. Aus der Zeitschrift »Journal of Biochemistry«, Band 135, Seite 231 bis 236 (1973) ist weiterhin die Wechselwirkung zwischen Ribonuclease A und Natrium-n-dodecylsulfat sowie n-Dodecyltrimethylammoniumbromid bekannt Die Tatsache, daß Amphiphile die Aktivität der Ribonuclease A zu beeinflussen vermögen, ist ebenfalls aus »Biochem. J«, 135 (1973), Seite 547-549 bekannt

Aufgabe der Erfindung ist es, eb verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms des eingangs beschriebenen Typs anzugeben.
Es wurde gefunden, daß AmphiphUe die Aktivität von Isoenzymen spezifisch oder unterschiedlich beeinflussen können, wodurch ein Weg zur Unterscheidung der in einer Probe anwesenden Isoenzyme geschaffen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet daß als Effektor ein das Isoenzym spezifisch inhibierendes Amphiphil verwendet wird.

Unter einem »Amphiphil« ist dabei eine ionogene Verbindung zu verstehen, die einen hydrophilen und einen hydrophoben Teil aufweist, beispielsweise eine oberflächenaktive Verbindung.

J5 Erfindungsgemäß verfährt man somit bei der Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms in der Weise, daß man in einer ersten Bestimmung die Gesamtenzymaktivität in der Probe ermittelt, in Gegenwart einer vorgegebenen Konzentration eines Amphiphils, das spezifisch das Isoenzym inhibiert eine zweite Bestimmung durchführt und aus der Differenz der beiden Bestimmungen die Aktivität des in der Probe vorliegenden Isoenzyms ermittelt. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert eine vorgegebene Konzentration an Amphiphil spezifisch die Aktivität aller anwesenden Isoenzyme mit Ausnahme des besonderen, zu bestimmenden Isoenzyms. Auf diese Weise kann die Aktivität des gewünschten Isoenzyms direkt durch einen Bestimmungsvorgang ermittelt werden.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht auch die Bestimmung der Aktivität von mehr als einem Isoenzym in einer Probe. In diesem Falle verfährt man in der Weise, daß man die Wirkung verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils, das die Aktivität eines jeden Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, auf jedes Isoenzym mengenmäßig erfaßt, in Gegenwart verschiedener Amphiphile oder verschiedene·· Konzentralionen eines einzelnen Amphiphils so viele Bestimmungen durchführt, wie Isoenzyme Vorliegen Und aus den erhaltenen Warten die jeweiligen Aktivitäten berechnet. Letz'eres erfolgt dadurch, daß man aus der Anzahl der einzelnen Bestimmungen eine Anzahl von Gleichungen bildet, die eine der Anzahl an Gleichungen entsprechende Anzahl

f>5 an Unbekannten, entsprechend der Anzahl an Isoenzymen, deren Aktivität bestimmt werden soll, enthalten. Diese Gleichungen werden gelöst, wodurch man die Aktivität eines jeden Isoenzyms in der Probe erhält.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedes Amphiphil, das zur Unterscheidung des jeweiligen Isoenzyms geeignet ist, d. h. das die Aktivität des Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, verwendet werden. Geeignete Amphiphile sind beispielsweise Heparin und ionische oberflächenaktive Verbindungen, z. B. Hexadecyltrimethyjammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumbromid, N-Äthylpyridiniumbromid, Tetraprapylammoniumbromid, Nonatrimeth) lammoniumbromid, Dodecylaminhydrochlorid. Dodecyltrimethylammoniumbromid, Trioctylpropylammoniumbromid, Cetylpyridiniumbromid, Natriumdodecyldiphenyläthersulfonat, Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat, Natriumisopropylnaphthalinsulfonat, Natriumsulfosuccinat-dialkylester, Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat. Natrium-N-methyl-N-oleoyltaurat, Natriumoctylphenolpoly(äthenoxy)sulfonat, Natriumalkylsulfonat,

Uctyiphenoipoill-oxiipropenjoxaathencarbonsaure-Natriumsalz, Dodecansäure-Natriumsalz. Perfluoroctylcarhonsäure. Perfluorheptylcarbonsäure, Dehydrochols?ure-Natriumsalz. Natrium-stearat. Natriumbutylsulfat. Natriumoctylsulfat. Natriumdecylsulfat. Natriumdodecylsulfat. Natriumtetradecylsulfat. Cz-e-Fluoralkylphosphat.das Laurinsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes. das ölsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes. Tetradecyltrimethylammoniumbromid, C;-«- Dimethylsulfat-quaternäres Amin und perfluorierte aromatische quaternäre -Xmine.

Das im Einzelfalle vorteilhafteste Amphiphil und dessen Konzentration hängen vom jeweils zu bestimmenden Isoenzym ab. Nicht jedes Amphiphil besitzt Unterscheidungswirkung hinsichtlich der Aktivität von Isoenzymen in einem jeden Isoenzymsystem. So hat sich beispielsweise gezeigt, daß Hexadecytrimethylammoniumbromid und Natriumdccyisulfat Verbindungen sind. die ausgezeichnete Diskriminatoren für LDH-Isoenzyme darstellen. Diese beiden Amphiphile weisen jedoch hinsichtlich der Aktivitäten der Isoenzyme von Kreatinin-Phosphokinase (CBK) keinen diskriminatorischen Effekt auf. zumindest dann nicht, wenn sie anhand einer üblicheii Bestimmungsmethode unter Verwendung gekuppelter Reaktionen und einer Bestimmungslösung, die Hexokinase und Glucose-6-phosphat-Dehvdrogenase enthält, eingesetzt werden.

Will man feststellen, ob ein Amphiphil die Aktivität eines Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, so läßt sich der nachfolgende Test durchführen. Man stellt für jedes Amphiphil eine Reihe von Lösungen her, die einen weiten Konzentrationsbereich überdecken. Im allgemeinen reicht ein Konzentrationsbereich von ungefähr 0.0! bis ungefähr 100 mM aus. Dann bestimmt man die Aktivität eines jeden Isoenzyms in Gegenwart des Amphiphils und vergleicht mit seiner Aktivität in einem Puffer (ohne Amphiphil), und zwar bei jeder Konzentration des Amphiphils in der Reihe. Die Bestimmung der Konzentration an Amphiphil. bei der eine maximale Diskriminierung auftritt, wird durch eine graphische Darstellung der relativen Aktivität gegen die Konzentration erleichtert.

Wie gesagt, ist es bevorzugt. Amphiphile zu wählen, die ein Isoenzym selektiv inhibieren. Jedoch ist dies zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich. Es ist nur erforderlich, Amphiphile zu wählen, die zu einer Unterscheidung zwischen den isoenzyme!! führen, indem sie die Aktivität der Isoenzyme τ -erschiedlich beeinflussen. Man stelle sich beispielsv. iise eine Situation vor. in der die Bestimmung der Isoenzyme I». K. und \_z, die in einer Probe vorliegen.

gewünscht wird. Aus Bestimmungen mit reinem I_n I_rund I» wurde festgestellt, daß bei Bestimmung in Gegenwart von 1,0 mM eines Amphiphils Ai die Aktivität von I» um 50%, die Aktivität von K um 75% inhibiert wird und die Aktivität von I₇ unverändert bleibt. Man führt eine Gesamtbestimniung in Gegenwart von 1,0 mM Amphiphil Ai durch, was zu einer Aktivität von 650 Einheiten U pro Liter führen soll. Auf der Grundlage dieser Information läßt sich die folgende Gleichung schreiben:

0,5 A-+ 0,25 y+/ -650

worin x, y und ζ für die in der Probe festgestellten Aktivitäten der Isoenzyme I_n Kund ^stehen.

Aus Bestimmungen mit reinem I_n I, und I₁ wurde festgestellt, daß bei der Bestimmung in Gegenwart von 0,5 mM Amphiphil A2 die Aktivität von 1, um 25% ansteigt, die Aktivität von I, um 25% inhibiert wird und die Aktivität von \, vollständig inhibiert wird, ivian fuhrt eine Gesamtbestimmung in Gegenwart von 0.5 mM \> durch, was zu einer Aktivität von 500 Finheiten U pro Liter führen soll. Aus dieser Information läßt sich die nachfolgende Gleichung schreiben:

1.25x4-0.75^=500

Dann führt man eine Gesamtbestimmiing ohne Anwesenheit eines Amphiphils durch, wobei eine Aktivität von 1000 Einheiten U pro Liter gefunden wird. Daraufhin läßt sich die nachfolgende Gleichung schreiben:

*4->+-z=1000

Die drei vorstehenden Gleichungen können nunmehr gleichzeitig gelöst werden, um die Aktivität eines jeden einzelnen Isoenzyms zu ermitteln. Bei der vorstehend

r. dargelegten hypothetischen Situation wurden die Aktivitäten der Isoenzyme als I, = 200 Einheiten U pro Liter. I, = 333 Einheiten U pro Liter und I/ = 467 Einheiten U pro Liter, bestimmt. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß jede Gruppe von Isoenzvmen

j., auf vergleichbare Weise wie bei der zuvor beschriebenen hypothetischen Situation, die zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen soll, bestimmt werden kann. Bei der Durchführung einer derartigen Bestimmung versteht es sich, daß für jedes in der Probe

■15 vorhandene Isoenzym eine Bestimmung durchgeführt werden muß, wenn man getrennte Aktivitäten jedes einzelnen Isoenzyms erhalten will. Es versteht sich ferner, daß man anstelle von zwei verschiedenen Amphiphilen dasselbe Amphiphil bei zwei verschier⁴·;-nen Konzentrationen verwenden kann und daß an die Stelle einer Bestimmung mit einem vorliegenden Amphiphii eine Bestimmung in Abwesenheit eines Amphiphils treten kann, so soll hier der Begriff »verschiedene Arnphiphile« auch den Fall umfassen, daß einmal verschiedene Konzentrationen desselben Amph.phils vorliegen, oder auch der Fall, daß einmal kein Amphiphil vorliegt.

Im allgemeinen kann man irgendeine übliche Bestimmungsmethode zur Bestimmung der Aktivität des interessierenden Isoenzyms beim erfindungsgemäßen Verfahren anwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen ist brauchbar bei üblichen flüssigen Bestimmungen. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß sämtliche Reagenzien in trockener oder lyophilisierter Form eingesetzt und unmittelbar vor der Verwendung mit Wasser rekonstituiert werden können. Somit umfaßt die Erfindung auch den Einsatz lyophilisierter Reagenzien.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders brauchbar, wenn die Analytbestimmung in einem Mehrschichtelement des in der US-Patentschrift 39 92 158 beschriebenen Typs durchgeführt wird. Elemente dieses Typs enthalten im allgemeinen:

(1) -;ine Ausbreit- oder Verteilungsschicht,

(2) ei-ne Reagenzschicht, die unter den Einsatzbedingungen mit der Ausbreit- oder Verteilungsschicht in fluidem Kontakt steht, und

(3) gewünschtenfalls einem Schichtträger.

Bevorzugte Elemente dieser Art umfassen eine nicht-faserige Ausbreit- oder Verteilungsschicht.

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens brauchbaren Mehrschichtelemente können auch eine Aufzeichnungsschicht umfassen, d. h. eine Schicht, die unter der Ausbreit- oder Verteilungsschicht und unter der Reagenzschicht angeordnet ist und die keine wechselwirkenden Materialien enthält und lediglich zur Aufnahme der in den darüber liegenden Schichten gebildeten Farbstoffe dient. Derartige Schichten umfassen im allgemeinen eine Matrix, die für den Farbstoff permeabel ist und, gewünschtenfalls, andere Zusätze, wie Beizen, oberflächenaktive Mittel und dergleichen, die zu einer Verstärkung der Wirkungen in den Schichten führen können. Deren Anordnung in analytischen Elemenen ist ausführlicher in der belgischen Patentschrift 8 31 660 beschrieben.

D^;e nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Anwendung und der erzielbaren Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiele 1 bis 9 erläutern die unterschiedlichen Einwirkungen bestimmter Amphiphile auf die Aktivitäten der LDH-Isoenzyme.

Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgenden Ausführungen auf sämtliche Beispiele I bis 9:

1. Die Amphiphile werden entweder aus Äthanol-Wasser- oder Äthanol-Acetonlösungen umkristallisiert und vor ihrer Verwendung gründlich im Vakuum getrocknet.

2. Zur Herstellung der Puffer und sämtlicher anderer Puffer-enthaltender Lösungen verwendet man destilliertes Wasser, das durch eine Ionenaustauschersäule gegeben wurde.

3. In den Beispielen werden Rinderherz-LDH (Sigma Chemical Co, Typ III), Kaninchenmuskel-LDH (Sigma Chemical Co, Typ V) und Schweine-LDH, LDi, LD2, LD3, LD« und LD5 in Form von Ammoniumsulfatsuspensionen verwendet.

4. Beim eingesetzten NADH handelt es sich um das aus Hefe isolierte Dinatriumsalz der Reinheitsstufe III. Der Cofaktor wird unter wasserfreien Bedingungen als Pulver bei Raumtemperatur gelagert und vor Licht geschützt

5. Bestimmung der LDH-Aktivität

Die Bestimmung der LDH-Aktivität in Abwesenheit und in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels wird wie folgt durchgeführt Man stellt täglich frisch Vorratslösungen von NADH (1,8 mM) und Pyruvat (9,8 mM) in 30 mM Natriumphosphatpuffer mit pH 7,4 her. Die Enzymlösungen werden täglich frisch hergestellt, indem man mit einer Hamilton-Injektionsspritze aus den Enzymvorratslösungen 5 μΐ entnimmt und mit 30 mM Phosphatpuffer auf 5 ml verdünnt Die erhaltene Lösung enthält angenähert 5 Einheiten/ml. Man führt die Enzymbestimmung durch, indem man 2,7 ml Puffer oder Puffer-oberflächenaktives Mittel-Lösung in eine 10 ml QuartzkUvette pipettiert und anschließend jeweils 100 μ! der NADH-Vorratslösungen und der Pyruvat-Vorratslösungen zugibt. Man gibt die Küvette in einen thermostatisierten Zellenhalter, setzt in einen Cary 118-Spektrophotometer ein und läßt 1 Minute bei 25°C äquilibrieren. Zur äquilibrierten Lösung gibt man 100 ml Enzymlösung zu und schüttelt die Küvette schnell, während das Oberteil der Küvette mit einem kleinen Stück Parafilm® bedeckt ist und setzt sie dann wieder in den Spektrophotometer ein.

ti Man mißt die Absorptionsabnahme bei 340nm als Funktion der Zeit. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bestimmt, indem man die Neigung der anfänglirhpn Ahsorptionsäbp.Ehme, d. h. innerhalb der erster. 50 Sekunden der Reaktion, mißt.

6. Amphiphil-Vorratslösung

Man stellt Lösungen des Amphiphils her, indem man eine gegebene Menge an Amphiphil auswiegt, beispielsweise 100 mg, und eine Vorratslösung in 3OmM Natriumphosphatpuffer in einem 100 ml Meßkolben herstellt. Lösungen mit einer geringeren Konzentration an Amphiphil werden hergestellt, indem man mit der Vorratslösung entsprechende Verdünnungen durchführt.

Beispiel 1
Wechselwirkung des Amphiphils mit LDH-Isoenzymen

Die LDH-Enzymbestimmung (Pyruvat + NADH -►) wird durch Abnahme der NADH-Absorption bei nm als Funktion der Zeit durchgeführt. In Gegenwart eines Amphiphils tritt eine hoch spezifische Inaktivierung der LDH-isoenzyme auf wie dies in den

•tu Fig. la und Ib dargestellt ist. In Fig. la ist das Aktivitätsprofil von LD₅ (Kaninchenmuskel) in Gegenwart von 8,65 mM Natriumdecylsulfat (DSS) und 1 mM Cetylpyridiniumbromid (CP) erläutert. Es ist deutlich zu ersehen, daß das anionische Detergenz zu einer schnellen Inaktivierung des LD₅-Isoenzyms führt, wogegen in Gegenwart eines kationischen Detergenz beinahe kein Aktivitätsverlust beobachtet wird. Die gegenteilige Beobachtung macht man bei LDi (Rinderherz), wie dies in F i g. Ib erläutert ist Dies bedeutet, daß in Gegenwart von CP (Ib) eine vollständige Inaktivierung des LDi erfolgt, wogegen im anionischen Detergens beinahe kein Aktivitätsverlust der LDi beobachtet wird. Darüber hinaus ist die spezifische Inaktivierung von LDi und LD5 durch die kationischen bzw. anionischen Detergenzein schnell. Das heißt die vollständige Inaktivierung erfolgt innerhalb der Ansprechzeit des Instruments (ungefähr 5 Sekunden).

Beispiel 2

Wechselwirkung zwischen kationischem Amphiphil
und LDH-Isoenzymen

Es wurde eine Anzahl kationischer Amphiphile hinsichtlich ihrer spezifischen Inaktivierung von LDi in Gegenwart von LDs untersucht Diese Verbindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt

Tabelle 1

Einfluß kationischer Amphiphile auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Amphiphil

Für eine 50%ige Inaktivierung des angegebenen Isoenzyms benötigte Amphiphilkon7entration

N-Äthylpyridiniumbromid
Tetrapropylammoniumbromid

Nonatrimethylammoniumbromid

Dodecyltrimethylammoniumbromid

Trioctylpropylammonium-Hromid

Hexadecylpyridiniumbromid

Hexadecyltrirnethylarnmoniumbromid

Dimethyldioctadecylammoniumbromid

Didodecyldimethylammoniumbromid

*) Nicht löslich in wäßrigem Puffer.

keine Wirkung keine Wirkung (LD₅) 0,15 mM 0,35 mM

6.5 mivi 13 mM

1OmM 12 mM

1.6 mM 2,2 mM 0,07 mM 0,4 mM 0,9 mM

(LD₁)

(LD₅) (LD,)

(LD₁) (LD₅) (LD₁) (LD₅)

(LD₁) (LD₅)

(LD₁)

(LD₅) >10mM

Beispiel 3

Wirkung von Cetylpyridiniumbromid (CP) auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Die Wirkung von CP auf die LDH-Isoenzyme LDi, LD₂, LD₃, LD₄ und LD₅ ist in Fig.2 erläutert. Die vollständige Inaktivierung aller Isoenzyme mit Ausnahme von LD₅ erfolgt angenähert bei derselben Amphiphilkonzentration, d. h. bei 0,1 mM. Bei diesem Amphiphilspiegel verbleibt jedoch eine 100%ige LD₅-Aktivität, bezogen auf eine Pufferkontrolle. Mit zunehmender Amphiphilkonzentration geht jedoch die LD₅-Aktivität allmählich verloren. Das Verhalten von LD_t und LD₅ über einen weiteren Bereich der Konzentration des oberflächenaktiven Mittels ist in F i g. 3 dargestellt. Es lassen sich mehrere Beobachtungen machen. (1) Bei höheren Konzentrationen an CP, d. h. 1 mM, wird die LDs-Aktivität wesentlich vermindert (2) LD₅ aus zwei verschiedenen Spezies, d.h. Kaninchenmuskel und Schweinemuskel, ergibt eine unterschiedliche Stabilität gegenüber der CP-Inaktivierung, wobei das Enzym des Schweinemuskels stabiler als das Enzym des Kaninchenmuskesl ist (3) Nach vollständiger Inaktivierung des LD₅ (Kaninchenmuskel) führen weitere Zunahmen der CP-konzentration dazu, daß der Inaktivierungieffekt auf das LDs verringert wird. Dieser Effekt bei steigender C?-Konzentration wird bei LDi nicht beobachtet

Beispiel 4

Einfluß von Hexadecyltrimethylammoniumbromid
auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Die Wirkung des Hexadecyltrimethylammoniumbromids (CTAB) auf die fünf LDH-Isoenzyme ist in Fi g. 4 dargestellt. Die allgemeine Charakteristik der Isoenzym-Detergens-Wechselwirkung entspricht der mit CP. Jedoch erfolgt die Inaktivierung von LDi, LD₂, LD3 und LD4 bei einer höheren Konzentration nn oberflächenaktivem Mittel, und die LDs-lnaktivierung erfolgt in geringerem Ausmaß.

Das Verhalten von LDi und LDs (aus Kaninchen- und Schweinemuskel) über einen breiten Konzentrationsbereich an CTAB ist in Fig. 5 dargestellt. Es lassen sich mehrere Beobachtungen machen. (I) Ungleich dem CP zeigen das LD₅ aus Kaninchen- und aus Schweinequelien in Gegenwart von CTAB beinahe identische Inaktivierungsprofile. (2) Selbst bei 10 mM Lösungen an oberflächenaktivem Mittel geht nicht mehr als 30% der LDs-Kontrollaktivität in den CTAB-Lösungen verloren. (3) LDi spricht offensichtlich weniger auf eine Inaktivierung bei hohen Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel an, d. h. bei ungefähr 10 mM.

Beispiel 5

Verwendung von CTAB zur Bestimmung von
LDj-Isoenzym in Lösung

in Eine Lösung, die alle fünf LDH-Isoenzyme enthält, wird bei unterschiedlichen Konzentrationen an LD₅ mit einer 0,275 mM CTAB-Lösung in 30 mM Phosphatpuffer mit pH 7,4, untersucht. Die Prozedur umfaßt eine Bestimmung des LD₅ in Puffer, des LD₅ in CTAB-Lö-

r> sung und dann des LD₅ in Gegenwart der anderen vier LDH-Isoenzyme in CTAB-Lösung. Die Ergebnisse sind in F i g. 6 gezeigt. Man erhält für alle drei Lösungstypen eine lineare Aktivitäts-LDs-Konzentrationskurve, d. h. LD₅-Puffer, LD₅-CTAB, LD₅+ andere Isoenzy-

■»n me-CTA B. Da die Aktivität von LD₅ in CTAB angenähert 90 bis 95% des Pufferwerts ausmacht, kann man die etwas erniedrigten Werte für LD₅-CTAB und LD₅, LD₄, LD₃, LD₂, LD,-CTAB korrigieren.

Beispiel 6

Verwendung von CP zur Bestimmung von
LD₅-Isoenzym in Lösung

Man führt eine Bestimmung ähnlich der des Beispiels 5 mit CP als Amphiphil durch. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Im Falle von CP führt die Bestimmung zu einem angenähert 30%igen Verlust an LD₅-Aktivität; folglich ist zu erwarten, daß die LDs-Aktivität in den LD₃-CP und LD₅, LD₄, LD₃, LD₂, LDi-CP-Lösungen bezogen auf die Puffenverte herabgesetzt ist Diese Verminderung der LD5 -Aktivität wird in der Tat beobachtet Man erhält jedoch eine lineare Aktivitäts-LD₅-Konzentrationskurve, anhand derer die LD₅-Bestimmung durchgeführt werden kann.

Beispiel 7

Einfluß anionischer Amphiphile auf die
Aktivität von LDH-Isoenzymen

Es wurde eine Anzahl anionischer Amphiphile hinsichtlich ihrer spezifischen Inaktivierung von LD₅ in Gegenwart von LDi untersucht Diese Verbindungen sind in Tabelle 2 aufgeführt

Tabelle 2

Auf spezifische Wechselwirkung mit LDH-Isoenzymen untersuchte anionische Amphiphile

Amphiphil

Wechselwirkung

1) Butylsulfat

2) Octylsulfat

3) Dehydrocholsäure

4) Laurinsäure

5) Lithiumstearat

6) Natriumdecylsulfat

7) Natriumdodecylsulfat

kein Einfluß
kein Einfluß
kein Einfluß
kein Einfluß
kein Einfluß
spezifisch
spezifisch

Von den untersuchten anionischen Amphiphilen ergeben das N-uriumdecylsulfat (DSS) und das Natriumdodecylsulfat 'SDS) brauchbare, positive Ergebnisse.

Beispiel 8

Einfluß von Natriumdecylsulfat und

Natriumdodecylsulfat auf die Aktivität

der LDH-Isoenzyme

Die Wechselwirkung von Natriumdecylsulfat (DSS) mit den fünf LDH-Isoenzymen ist in F i g. 8 erläutert. Man beobachtet eine klar gegliederte Sequenz bei der Inaktivierung der Isoenzyme. Bei einer DSS-Konzentration von 7 mM wird die gesamte LD5 und LD₄-Aktivität zerstört, wobei rund 30% LD₃, 60% LD₂ und 65% LDi-Aktivität, bezogen auf die Pufferaktivitäten, verbieiben. Oberhalb einer Konzentration von 9 mM an Amphiphil zeigt nur noch das LDi eine Aktivität. Daher kann eine Bestimmung, die zu Informationen über die LDl und LD₂-Spiegel führt, unter Verwendung von DSS als Reagens durchgeführt werden.

Die Wechselwirkung der LDH-Isoenzyme mit SDS ist in Fig.9 dargestellt. Im Vergleich mit den Wirkungen des DSS handelt es sich beim SDS um einen wirksameren Inaktivator, d. h. die Inaktivierung sämtlicher Isoenzyme erfolgt bei einer niedrigeren Amphiphilkonzentration, und das SDS-System ermöglicht offensichtlich eine spezifischere Bestimmung des Isoenzyms LD,, d. h. bei 3,5 mM SDS ist r'ie LD₂-Aktivität Null, wogegen die LDi-Aktivität 78% der Aktivität der Pufferkontrolle ausmacht. Von Interesse ist die Feststellung, daß bei 1,5 mM SDS die LD₄ und LD₅-Aktivitäten Null betragen, wogegen 50% LD₃, 65% LD₂ und 95% LDi-Aktivitäten verbleiben. Somit ist es durch geeignete Wahl der SDS-Konzentration möglich, die LDi oder LDi, LD₂ und LD₃-Aktivitäten in Gegenwart der anderen LDH-Isoenzyme zu bestimmen.

Beispiel 9

Verwendung von DSS zur Bestimmung des
LD|-Isoenzyms in Lösung

Man untersucht eine Lösung, die alle fünf LDH-Isoenzyme enthält, bei wechselnden Konzentrationen von LDi mit 9 mM DSS-Lösung in 30 mM Phosphatpuffer von pH 7,4. Das Versuchsprotokoll entspricht den in den Beispielen 5 und 6 angegebenen Beschreibungen. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt Es können verschiedene Beobachtungen gemacht werden. (1) Das Aktivitäts-LDi-Konzentrationsprofil ist linear. (2) In Gegenwart anderer Enzyme stellt man ein leichtes Ansteigen von LDi in Detergenzlösung im Vergleich zu LDi alleine in Detergenzlösung, fest. Diese gesteigerte Aktivitäi beruht vermutlich auf einer LD₂-Aktivität. (3) Wie erwartet, ist die LDi-Aktivität in der Amphiphillösung geringer als die LD|-Kontrollaktivität im Puffer, und zwar aufgrund einer LDi-Inaktivierung durch das Amphiphil. (4) Es läßt sich feststellen, daß eine genaue Arbeitsweise zur Bestimmung der LDi-Aktivität in Gegenwart der anderen vier LDH-Isoenzyme geschaffen ist.

Beispiel 10

Untersuchung von Amphiphilen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zwischen LDi und LD₅ zu unterscheiden

Man stellt eine Reihe von Lösungen her, die Konzentrationsbereiche eines jeden zu untersuchenden Amphiphils überstreichen. Man bestimmt die Aktivitäten von LDi und von LD5 in Gegenwart verschiedener Konzentrationen eines jeden Amphiphils und vergleicht mit den Enzymaktivitäten im Puffer (relative Aktivität). In Tabelle 3 sind die Ergebnisse aufgeführt. Sie zeigen die Brauchbarkeit der untersuchten Amphiphile zur selektiven Inhibierung von LDi und LD5.

Die Enzymaktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Amphiphil wird nach dem folgenden Arbeitsverfahren gemessen: Man stellt täglich Vorratslösungen aus NADH (4 mM) und Pyruvat (4OmM) in 3OmM Natriumphosphatpuffer von pH 7.4 her. Ebenfalls

jo täglich werden Enzymlösungcn hergestellt, indem man mit einer Hamilton-Injektionsspritze 5 μΙ aus den Enzymvorratslösungen entnimmt und mit 30 mM Natriumphosphatpuffer auf 5 ml verdünnt (die erhaltene Lösung enthält angenähert 5 Einheiten U an Enzym/ml). Die Enzymbestimmung wird durchgeführt, indem man 2,7 ml Puffer oder Puffer-oberflächenaktives Mittel-Lösung in eine Quartzküvette mit 10 mm optischer Weglänge einpipettiert und jeweils 100 μΐ an NADH und Pyruvatvorratslösungen zusetzt. Man gibt die Küvette in einen thermostatisierten Zellenhalter in einem Cary 118-Spektrophotometer und läßt 1 Minute lang bei 25°C äquilibrieren. Unter gutem Mischen gibt man Enzymlösung zu. Die Absorptionsabnahiiie bei 340 nm wird rls Funktion der Zeit gemessen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bestimmt, indem man die Steigung der anfänglichen Absorptionsabnahme, d. h. innerhalb der ersten 50 Sekunden in der Reaktion, mißt.

Tabelle 3

Amphiphile, die hinsichtlich ihrer LDH-Isoenzym-Inhibierungsspezifität untersucht wurden

Amphiphil

Wirksamkeit

1. Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat -H (Dowfax® 3B2)

2. Natriumisopropylnaphthalinsulfonat + (Aerosol® O,S)

3. Natriumsulfosuccinatdialkylestcr O (Aerosol³ 196)

4. Natrium-N-methyl-N-oleoyltaurat O (Igepon^e)

Forisei/iing

Amphiphil

Wirksamkeit

5. Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat ++ (Aerosol® 18)

6. Natriumoctylphenolpoly(äthenoxy)- — sulfonat (Triton* X-200, zur Entfernung von Alkoholen gereinigt)

7. Alkylsulfonat(Monnor³31) ++

8. Oclylphenolpoly(l-oxapropen)oxaäthan- 0 tarbonsäure-Natriumsalz

(Akypo® OP-115, Natriumsalz)

9. Nairiumdodecanoat 0

10. CT-s-Perfluoralkylcarbonsäure ++ (Zonyl⁸ FSA)

11. Natriumdehydrocholat 0

12. Natriurnstearat 0

13. Natriumbutylsulfat*) 0

14. Natriumoctylsulfat*) +

15. Natriumdecylsulfat*) ++

16. Natriumdodecylsulfat*) ++

17. Natriumtetradecylsulfat*) ++

18. Heparin +

19. CT-g-Perfluoralkylphosphal 0 (Zonyl* FSP)

20. Ölsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes (Amine* O)

21. Laurinsäurederivat eines Imidazol- -alkylhalogenidsalzes (Amine* C)

22. Nonatrimethylammoniumbromid

23. Dodecyltrimethylammoniumbromid*)

24. Tetradecyltrimethylammoniumbromid*)

25. Hexadecyltrimethylammoniumbromid*) —

26. Hexadecylpyridiniumbromid*)

27. Dodecylaminhydrochlorid*) ++

28. Trioctylpropylammoniumbromid*) 0

29. N->Hydroxyäthyl-N,N-dimethyl-N-3- ++ palmitamidopropylammoniumchlorid

30. Tetrapropylammoniumbromid 0

31. CT-e-PerfluordimethylsuIfatquaternäres Amin (Zonyl® FSC)

*) Die oberflächenaktiven Mittel werden mindestens einmal umkristallisiert, bevor die Wechselwirkung mit LDH bestimmt wird.

++ Spezifische Inhibierung von LD₅, bezogen auf LDi.

+ Teilweise selektive Inhibierung von LD₅, bezogen auf LD|.

0 Keine selektive Inhibierung von LDi oder LD₅.

- Teilweise selektive Inhibierung von LD,, bezogen auf LD₅.

— Spezifische Inhibierung von LDi, bezogen auf LD₅.

Aufschlüsselung der Warenzeichen

1. Dowfax* - The Dow Chemical Company.

Es wurden auch mehrere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zusammen mit LDH untersucht, und man stellt fest, daß bei Lösungen bis zu 2% Gewicht/Volumen keine selektive Inaktivierung der Isoenzyme erfolgte.

Beispiel 11 Einfluß von N-jJ-Hydroxyäthyl-N.N-dimethyl- N-3-palmitamidopropyIammoniumchIorid auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Ungleich anderen untersuchten kationischen Amphiphilen, die üblicherweise zu einer vollständigen Inaktivierung von LDi — LD4 führen, wobei nur LDs-Aktivität übrig bleibt, führt das N-JJ-Hydroxyäthyl-N.N-di-

methyl-N-3-paImitamidopropyIamrnoniumchlorid hauptsächlich zu einer Inaktivierung von LDi-LD₃, wobei die LD₅-Aktivität in hohem Umfang erhalten bleibt (90%) und die LD₄-Aktivität ungefähr noch 60% ausmacht, wie dies in F i g. 11 dargestellt ist Somit ist eine Bestimmung von LDs oder LD₄ möglich, und in Verbindung mit einer LD5-Bestimmung läßt sich gleichzeitig das LD₄ bestimmen.

Beispiel 12

Einfluß von Heparin auf die Aktivität der LDH-Isoenzyme

Mit Heparin, einem sulfatierten Mucopolysaccharid erhält man ein unerwartetes Ergebnis. Heparin beeinflußt die LDH-Aktivität auf eine Weise, die der entgegengesetzt ist, welche auf der Grundlage der mit anderen Sulfat-Einheit-enthaltenden Polyanionen durchgeführten Untersuchung vorherzusagen ist LDi wird stärker inaktiviert als LD₅, wie dies der F i g. 12 zu entnehmen ist

Die nachfolgenden Beispiele 13 bis 17 erläutern die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf menschliche LDH-Isoenzyme. Für die Beispiele 13 bis 17 gilt das nachfolgend Gesagte:

2.	Aerosol -	American Cyanamid Company.
3.	Jgepon* -	OAF Corporation.
■·>.	Triton* -	Rohm & Haas Company.
5.	Monflor' -	Imperial Chemical Industries.
6.	Akypo' -	Chem-Y Corp. (Holland).
7.	ZonyF -	E. I. du Pont de Nemours * Co.
8.	Amine' -	Ciba-Oeigy Chemical Corporation

7. Herstellung von Humanenzym-enthaltendem Serum

Man erhöht den pH von vereinigtem Humanserum, das bis kurz vor der Anwendung in gefrorenem Zustand gehalten wird, auf einen Wert von 114. bis die gesamte LDH-Aktivität zerstört ist. Dann stellt man den pH auf 7,4 ein und bestimmt wiederum die LDH-Aktivität des Serums, um sicherzustellen, daß kein LDH reaktiviert worden ist. Anschließend gibt man ein spezifisches menschliches LDH-Isoenzym zu (erhalten aus Leberhomogenisat oder roten Blutzellen), um eine Enzymkonzentration von ungefähr 100 Einheiten/l zu erhalten. Die verschnittenen (spiked) Serumproben werden zwischen dem Gebrauch gekühlt und, falls erforderlich, wieder verschnitten (respiked). Man stellt jede Woche frisches Serum her.

8. Die angewendete Bestimmungsmethode ist die gleiche wie vorstehend für die Beispiele I bis 12

beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Testproben aus 25 bis 30 μΙ Serum anstelle von 100 μ! wäßriger Enzymlösung bestehen.

Beispiel 16

Einfluß der CTAB-Konzentration auf die Unterscheidung humaner LDH-Isoenzyme

Man verwendet eine optimierte Bestimmungsmethode, d. h. eine Amphiphil-Bestimmungslösung mit pH 7,8, die 14% Protein enthält, um den Einfluß variierender Konzentrationen an CTAB auf die Isoenzyme zu ermitteln. Es wird festgestellt, daß eine Lösung mit einem Gehalt an 24 mM CTAB die Isoenzyme LD4 und LDj vollständig aktiv läßt, während die Isoenzyme LDi und LD₂ vollständig inaktiviert werden.

Beispiel 17

Einfluß von DSS auf die Aktivtät von humanen LDH-Isoenzymen

Man verwendet das zuvor beschriebene, optimierte

10

15

2G

Beispiel 13

Einfluß von CTAB auf die Aktivität von humanen LDH-Isoenzymen

Man verwendet die zuvor beschriebene Bestimmungsmethode, wobei man wechselnde Konzentrationen von CTAB als Amphiphil und 25 μΐ Serumproben einsetzt, um die unterschiedliche Inaktivierung von Humanserum-LDH-Isoenzymen zu zeigen. Wie in F i g. 13 gezeigt, wird die Probe, weiche die Isoenzyme LDi, LD₂ und LD₃ enthält, vollständig inaktiviert, während die Probe, welche LD₅ enthält, mindestens 60% ihrer Aktivität in einem Bereich von oberflächenaktiven Mitteln von 0,002 bis 0,004 M beibehält (diese Proben enthalten kein LD₄).

Beispiel 14

Einfluß hoher Proteinkonzentrationen auf die Bestimmung von humanen LDH-Isoenzymen

Gibt man große Mengen an Protein (8 bis 16%) zu der Amphiphil-Bestimmungslösung, bleibt die erforderliche Menge an Amphiphil normal (ungefähr 3,OmM). Darüber hinaus wird in Gegenwart einer hohen Proteinkonzentration die relative Aktivität des Isoenzyms (in diesem Fall LD₅) stark erhöht (>100%), während LDi-3 völlig desaktiviert bleiben. Vergleiche Fig. 14.

Beispiel 15

Einfluß des pH auf die Unterscheidung zwischen humanen LD₅ und LD₄-Isoenzymen

Wemi man die Lösungsbestimmung, die routinemäßig bei pH 7,4 durchgeführt wird, unter Verwendung von CTAB bei diesem pH durchführt, so ergibt sich eine nicht adäquate Unterscheidung zwischen LD₅ und LD₄ (vgl. (F i g. 15). Es wurde jedoch erfindungsgemäß festgestellt daß eine Amphiphil-Bestimmungslösung mit einem höheren pH zu einer ausgezeichneten Differenzierung zwischen den Isoenzymen führt

Man führt eine Versuchsreihe mit 30 μΙ Serumproben durch, die sowohl LD₅ und LD₄ enthalten, wobei man eine Amphiphil-Bestimmungslösung einsetzt die 3 mM CTAB in 14% Protein enthält Man variiert den pH des Reagens von 7,3 bis 8,3. Fi g. 15 zeigt daß der optimale pH zur Unterscheidung zwischen LD₅ und LD₄ 7,75 bis 735 beträgt. LD₅ wird auf über 100% aktiviert, während das LD₄ vollständig inaktiviert wird.

Bestimmungsverfahren unter Einsatz von 0,1 M Natriumdecylsulfat (DSS) als AmphiphüV Diese Lösung führt zu einer vollständigen Desaktivierung von LD_w und 5, wobei das LD₁ vollständig aktiv bleibt Diese, unter Verwendung von Humanseren erhaltenen Ergebnisse stehen in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen, in denen Ammoniumsulfatsuspensionen von tierischem LDH eingesetzt wurden.

Die Beispiele 18 bis 21 erläutern die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Isoenzyme von Malat-Dehydrogenase (MDH), Malat-Dehydrogenase (L-Malat: NAD+ Oxidoreductase, EC 1.1.137, MDH), ein Bestandteil des Zitronensäurezyklus, findet sich in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Obgleich es hinsichtlich der Anzahl an MDH-Isoenzymen beträchtliche Meinungsverschiedenheiten gibt, haben kürzliche Untersuchungen gezeigt, daß bei Säugern zwei unterschiedliche Isoenzyme vorliegen, von denen das eine in den Mitochondrien (mMDH) und das andere im Cytoplasma (cMDH) lokalisiert sind.

Falls nicht anders angegeben, gelten die nachfolgenden Ausführungen für die Beispiele 18 bis 21.

25

30

Man verwendet Schweine-cMDH und mMDH als Ammoniumsulfatsuspensionen. Normalerweise verdünnt man 5 μΐ der Enzymvorratslösungen mit 3OmM Phosphatpuffer von pH 7,4 vor der Verwendung auf 10 ml. Die erhaltenen Enzymlösungen werden in Eiswasser gelagert Falls nicht anders angegeben, werden ΙΟΟμΙ aliquote Anteile für die Bestimmung entnommen. Untersuchung auf MDH

Die Bestimmung beruht auf der Umwandlung der Oxalessigsäure in Gegenwart von NADH und MDH in Malat

H⁺ + OAA + NADH

MDH

Malat + NAD^H

45

50

55

60

65 Man führt die Bestimmung in 3OmM Phosphatpuffer bei Umgebungstemperatur mit und ohne entsprechende Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel durch. Der Gehalt beträgt 0,17 mM Oxalessigsäure (OAA) und 0,13 mM NADH. Man verfolgt die Reaktion, indem man die Absorptionsabnahme bei 340 nm unter Verwendung eines Beckman 25-Spektrophotometers oder eines Cary 118-Spektrophotometers beobachtet Die OAA-Lösungen werden über Eis gelagert, um eine Hydrolyse zu Brenztraubensäure zu vermeiden.

Beispiel 18

Einfluß von CTAB auf die Aktivität der MDH-Isoenzyme

Unter Anwendung der zuvor beschriebenen Bestimmungsmethode werden verschiedene Konzentrationen an CTAB (in Fig. 16 dargestellt) als kationisches Amphiphil zugesetzt und die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten gemessen. Wie in Fig. 16 dargestellt, erhält man eine gute Auftrennung der zwei Isoenzyme. cMDH wird bei 0,3 mM CTAB im wesentlichen vollständig inaktiviert, während das mMDH bezogen auf eine Pufferkontrolle zu 100% aktiv bleibt.

Mit zunehmender Konzentration an Amphiphil (> 3,5 mM) sinkt die Auflösung, da die Inaktivierung des mMDH einsetzt und cMDH offensichtlich gegenüber einer weiteren Inaktivierung resistent ist.

Beispiel 19

Einfluß von DSS auf die Aktivität von MDH-Isoenzymen

Man befolgt dieselbe Arbeitsweise wie in Beispiel 18 mit der Ausnahme, daß man das anionische Amphiphil Natriumdeeylsulfat (DSS) einsetzt Es erfolgt eine deutlich bevorzugte Inaktivierung von mMDH, bezogen auf cMDH, wie dies in F i g. 17 dargestellt ist

Beispiel 20

Verbesserte Unterscheidung zwischen MDH-Isoenzymen

Man befolgt dieselbe Arbeitsweise wie in Beispiel 18 beschrieben mit der Ausnahme, daß die Geschwindigkeitsmessungen nicht am Anfang, sondern nach 2 Minuten durchgeführt werden. Wie in F i g. 18 erläutert, erhält man eine bessere Auftrennung der beiden MDH-Isoenzyme. Man stellt fest daß durch Erhöhung der Einwirkungszeii von CTAB auf das Enzym eine wirksamere Inaktivierung von cMDH erfolgt ohne daß ein Einfluß auf das mMDH augeübt wird.

Beispiel 21

Einfluß von Amphiphilen auf MDH-Isoenzyme, die zu vereinigtem Humanserum zugesetzt wurden

Zur Bestimmung des Einflusses von Serumproteinen auf die Wechselwirkung von Amphiphilen mit MDH-Isoenzymen, gibt man vereinigtes Humanserum durch eine 1,5 Meter-AMP -Sepharose*-Säule, um verbliebenes MDH zu entfernen. Das erhaltene Serum wird mit Schweine-cMDH oder mMDH verschnitten. Die Bestimmungsmethode ist mit der zuvor unter Verwendung von CTAB als Amphiphil beschriebenen Methode identisch mit der Ausnahme, daß die Größe der Enzymprobe auf 20 μΐ verringert wurde, um eine gegenseitige Beeinflussung zwischen Protein und oberflächenaktivem Mittel zu mindern. Fig. 19 zeigt das nach 2 Minuten erhaltene Aktivitätsprofil. Nach 3 Minuten erhält man eine verbesserte Auflösung, wie dies in F i g. 20 dargestellt ist.

Die Beispiele 22 bis 24 erläutern die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase, der Aspartat-Arninotransferase (SGOT) und der Lactat-Dehydrogonase.

Beispiel 22

Einfluß von Amphiphilen auf Isoenzyme der alkalischen Phosphatase

Man untersucht den Einfluß von Amphiphilen auf die Isoenzyme der alkalischen Phosphatase unter Verwendung von alkalischer Phosphatase des Darms (Quelle: Hühner) und von alkalischer Phosphatase aus der Leber (Quelle: Rinder). Man führt die Bestimmung der alkalischen Phosphataseaktivität durch, indem man 30 mM Glycinpuffer bei pH 8,5 mit 1 mM p-Nitrophenylphosphat als Substrat einsetzt. Fig.21 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat. Fig.22 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase in Gegenwart von Cetylpyridiniumbromid mit und ohne Natriumchlorid. Es ist zu bemerken, daß die Anwesen-

heit von 0,2M Natriumchlorid die Unterscheidung zwischen den Isoenzymen signifikant akzentuiert

Beispiel 23

Einfluß von Amphiphilen auf Isoenzyme der
Aspartat-Aminotransferase

Es wurde gezeigt daß Aspartat-Aminotransferase (L-Aspartat; 2-Oxoglutarat-Aminotransferase EC 2.6.1.1) mindestens zwei verschiedene Isoenzymformen aufweist Ein Enzym wird aus dem Cytoplasma, das andere aus den Mitochondrien isoliert Die in diesem Beispiel eingesetzten Isoenzyme von SGOT sind in einer lyophilisierten Humanserum-Matrix enthalten und

!5 wt.-den bei 4° C gelagert und zur Verwendung mit entionisiertem Wasser rekonstituiert

Bei der Bestimmungsmethode des SGOT handelt es sich um die von Henry et aL, American Journal of Clinical Pathology, Band 34, Seite 381 (1960) und von

Rodgerson et aL, Clinical Chemistry, Band 20, Seite 43 (1974) beschriebene Methode. Die Bestimmungslösung enthält 9OmM Phosphatpuffer mit pH 7,4, 0,18 mM NADH, 6 mM 2-Oxoglutarat 125 mM Aspartat und 4 Einheiten MDH. Die Bestimmung wird bei 30⁰C an einem Beckman-25-Spektrophotometer durchgeführt Man überwacht die Absorptionsabnahme bei 340 nm. Man stellt Lösungen von oberflächenaktivem Mittel in 90 mM Phosphatpuffer her und verwendet sie anstelle des Bestimmungspuffers, um die Wirkung auf die Isoenzyme zu bestimmen.

Fig.23 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung auf SGOT-Isoenzyme in Gegenwart von Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB).
Fig.24 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von SGOT-Isoenzymen in Gegenwart von Natriumdeeylsulfat (DSS). Es wurde auch Cetylpyridiniumbromid verwendet, diese Verbindung ergibt jedoch offensichtlich keine Unterscheidung zwischen diesen Isoenzymen.

Beispiel 24

Verwendung von Amphiphilen zur Beeinflussung

der Aktivität von Isoenzymen bei einer

Bestimmung unter Verwendung eines

Mehrschichtenelements

Man stellt nach dem nachfolgenden Schema analytische Elemente her, die sämtliche erforderlichen Reagenzien zur mengemäßigen Erfassung spezifischer Isoenzyme enthalten:

Schicht 2 Ausbreit-Reagensschicht

Schicht 1 Reagensschicht

Träger

Avicel*-Ausbreitschicht, enthaltend Pyruvat und oberflächenaktives Mittel

Agarose-Schicht,

enthaltend

Tris-Pufler+NADH

Lexan'-Träger

Man verwendet Natriumdeeylsulfat, um bei einer Bestimmung unter Verwendung eines Mehrschichtenelements zwischen LDi und LDs-Isoenzymen zu unterscheiden. Die Teststreifen werden wie folgt beschichtet:

Man beschichtet einen Lexan®-Träger, der mit einer Polycarbonat-Unterschicht versehen ist, mit einer

Reagensschiebt, Die Reagensschicht enthält Agarose (2,7 g/m²) und NADH (0,12 g/m?) in 0,1 M Tris-Puffer von pH 7,4. Dann beschichtet man mit einer Ausbreit-Reagensschicbt, die Avicel® (43 g/m²), Natriumpyruvat (0,5 g/m²), Polyvinylpyrrolidon (PVP) (2,15 g/m²) in Isopropylalkohol und Natriumdecylsulfat (DSS) (044 g/m^J) enthält

Es verden Vergleichsstreifen wie zuvor beschrieben überzogen mit der Ausnahme, daß der Ausbreit-Regensschicht kein Natriumdecylsulfat zugesetzt wird.

Die Streifen werden nach der folgenden Arbeitsweise bewertet:

Man stellt zwei wäßrige Lösungen von gereinigten Schweine-LDH-Isoenzymen her, von denen die eine LDi und die andere LD₅ enthält Diese Lösungen werden in 0,01 M Tris-Puffer von pH 7,4 zu angenähert 90 mU/ml hergestellt Von jeder Lösung tüpfelt man Probenanteile (10 μΐ) und eine Pufferkontrolle (0,01 M Tris) auf die Streifen, die dann in einer POS-Einheit auf abnehmende Fluoreszenz des NADH in Abhängigkeit von der Zeit bei 340 nm gemessen werden.

Die Vergleichsstreifen ohne oberflächen?.'<tives Mittel zeigen die in Tabelle 4 dargestellten Aktivitäten für

und LDs, Dagegen ergibt der Untersuchungsstreifen, der das oberflächenaktive Mittel DSS enthält, eine Aktivitäe für LD_)t jedoch keine Aktivität für LD₅. Mit anderen Worten erfolgt in Gegenwart eines anionischen Amphiphils eine vollständige Inhibierung der Aktivität von LDs.

Tabelle 4

Streifen

Isoenzifmaktivität LD₁

Kontrolle
DSS

11
15

Für den Fachmann liegt es auf dar Hand, daß bei der erfindungsgemäßen Bestimmung di;r Isoenzyme man jederzeit gewünschtcnfalls anstelle der Verwendung eines zweiten Amphiphils auch da^vjlbe Amphiphil bei einer zweiten, vorgegebenen Konzentration einsetzen kann, um ein äquivalentes Ergebnis zu erhalten.

Hierzu 25 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms in einer Probe, wobei man

a) in einer ersten Bestimmung Gesamtenzymaktivität in der Probe ermittelt und

b) in Gegenwart eines die Isoenzymaktivität verändernden Effektors eine zweite Bestimmung durchführt und

c) aus der Differenz der beiden Bestimmungen die Aktivität des in der Probe vorliegenden Isoenzyms ermittelt,