DE3220331C2

DE3220331C2 -

Info

Publication number: DE3220331C2
Application number: DE3220331A
Authority: DE
Inventors: Giorgio Ricci; Giorgio Rom/Roma It Federici
Original assignee: BIODATA SpA ROM/ROMA IT
Current assignee: BIODATA SpA ROM/ROMA IT
Priority date: 1981-05-28
Filing date: 1982-05-28
Publication date: 1990-08-09
Also published as: FR2512833A1; CH653135A5; CA1186604A; GB2099580B; NL186915C; IT1171257B; AT381326B; ES512600A0; ES8306184A1; NL8202062A; SE8203207L; JPH031960B2; IL65804A0; SE448884B; IL65804A; US4477566A; AU593762B2; NL186915B; ZA823398B; IT8148565A0

Description

Die Erfindung betrifft eine Bestimmungsmethode von Transaminasen zur Verwendung auf dem Gebiet der klinischen Diagnosen. Die Glutamat-Oxalacetat-Transaminasen (L-Aspartat-Ketoglutarat- Aminotransferase, EC 2.6.1.1.), die als GOT, AST oder AAT bezeichnet werden, liegen in zwei sich elektrophoretisch unterscheidenden Formen mit unterschiedlicher subcellularer Lokation vor, nämlich als:
1. ein kationisches Isoenzym, das mit den Mytochondrien vergesellschaftet ist (m-GOT); und
2. ein anionisches Isoenzym, das in dem Cytoplasma vorhanden ist (s-GOT).

Die Messung der Gesamtaktivität von GOT in Plasma wird in weitem Umfang zur Diagnose eines Myocard-Infarkts durchgeführt. Der Aktivitätsspiegel in physiologischen Flüssigkeiten ist auch zur Diagnose von anderen pathologischen Formen, insbesondere im Leber- oder Skelettmuskulaturspiegel, angewendet worden.

Die in der Klinik tatsächlich angewendeten Bestimmungsmethoden gestatten bei biologischen Proben die Messung der Gesamtaktivität des Enzyms, d. h. der Summe der zwei Isoenzyme.

Es ist wichtig, die relative Aktivität der zwei isoenzymatischen Formen von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase zu unterscheiden, um eine genauere Untersuchungsmöglichkeit des Zustands einer Gewebenekrose zu erhalten.

Bei anderen Enzymen, zum Beispiel Lactatdehydrogenase (LDH) und Kreatinkinase, wurde festgestellt, daß die richtige Bestimmung der Aktivität bezüglich der verschiedenen isoenzymatischen Formen bei der diagnostischen Anwendung eine höhere Auflösungskraft gestattet.

Die Bestimmungsmethoden, die tatsächlich für die zwei enzymatischen Formen, d. h. die cytoplasmatische und die mitochondriale Form, der Glutamat-Oxalacetat-Transaminasen vorliegen, bauen sich auf elektrophoretischen, chromatographischen oder immunologischen Techniken auf, bei denen die vorhergehende Abtrennung des einen Enzyms von dem andern notwendig ist.

So beschreibt Clinical Chemistry 27/4, 535-542 (1981) sechs Verfahren zur Bestimmung der Isoenzyme der Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1.) in Humanserum und Gewebshomogenaten. Ergebnisse der Verfahren auf der Basis immunchemischer Präzipitation mittels Antikörpern gegen entweder das mitochondriale oder (mit größerer Präzision) lösliche Isoenzym stimmten gut mit den Ergebnissen überein, die man durch differentielle kinetische Messung mittels verschiedener pH-Wertbedingungen und mittels Hemmung von Adipat erhielt. Ergebnisse mit DEAE-Sephadex Ionenaustauschchromatographie stimmten gut mit den Techniken für gereinigte Isoenzympräparate überein, aber zeigten nicht unwesentliche positive Abweichungen bei der Bestimmung des mitochondrialen Isoenzyms in Humanserum. Ein Verfahren nur auf der Basis verschiedener pH-Effekte unterschied zwischen den Isoenzymen mit weniger Abweichung als der chromatographische Ansatz. Die Präzision der zwei Ansätze mit verschiedenem pH-Wert wurde durch eine signifikante Eigenaktivität des Reagens infolge der Zerstörung von NADH bei pH 6,0 oder 6,2 eingeschränkt. Ein elektrophoretisches Verfahren mit einem Diazoniumsalz zum Sichtbarmachen von Oxalacetat war am wenigstens exakt, um Proben, deren Isoenzymzusammensetzung bekannt war, zu messen.

DE-OS 26 27 353 beschreibt ein Verfahren zur Differentialbestimmung von Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase- isoenzym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die m-GOT dadurch bestimmt, daß man ein Immunokonjugat herstellt, indem man eine Anti-s-GOT, erhalten durch Immunisierung eines Säugetiers mit gereinigter s-GOT als Antigen, extrahiert aus dem Blut oder Gewebe des Säugetiers, zu dem Humanserum zufügt, daß man sensibilisierte Teilchen zusetzt, die man mit dem Anti-s-GOT-Antikörper zu unlöslichen Teilchen kuppeln läßt, und daß man die s-GOT in dem Humanserum vollständig absorbiert.

Die Erfindung betrifft eine neue Methode der Bestimmung bzw. Dosierung, die die individuelle Bestimmung der Aktivität der zwei Isoenzyme in Serum- oder Plasmaproben ohne die Notwendigkeit einer Trennung der zwei Isoenzyme gestattet.

Die Methode baut sich im wesentlichen auf der bekannten Reaktion von L-Serin-O-sulfat mit cytoplasmatischer Schweine- Glutamat-Oxalacetat-Transaminase auf. Nach unterschiedlichen Inkubationsperioden erfolgt eine Entaktivierung durch die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen einem Derivat des Substrats und einer reaktiven Gruppe für die aktive Stelle des Enzyms (R. A. John, P. Fasella: "The reaction of L-serine- O-sulphate with Aspartate Aminotransferase", Biochemistry, Band 8, Nr. 11, Nov. 1969).

Im Verlauf von entsprechenden Versuchen wurde im Gegensatz zu den Erwartungen gefunden, daß die Bedingungen der Inkubierung für die Entaktivierung des menschlichen cytoplasmatischen Isoenzyms in Gegenwart des mitochondrialen zu keinem Aktivitätsverlust des letzteren führen.

Es ist daher möglich, durch eine Bestimmung der in dem Plasma oder Serum vor und nach der Inkubierung mit L-Serin-O-sulfat vorhandenen GOT-Aktivität im ersten Falle die gesamte Aktivitätssumme der zwei Isoenzyme und im zweiten Falle (nach Inkubierung mit L-Serin-O-Sulfat) die Aktivität nur des mitochondrialen Isoenzyms zu bestimmen. Mittels einer einfachen Differenz wird der Wert der Aktivität des cytoplasmatischen Isoenzyms erhalten.

Die experimentellen Bedingungen der Analyse zur Bestimmung der Aktivität der zwei Isoenzyme, d. h. des mitochondrialen und des cytoplasmatischen Isoenzyms von GOT, werden nachstehend wie folgt beschrieben.

Zur Bestimmung im Serum oder Plasma wird es bevorzugt, unter Verwendung von zwei identischen aliquoten Teilen der gleichen Probe vorzugehen. Ein aliquoter Teil wird zur Bestimmung der gesamten Aktivität (Summe der zwei Isoenzyme) verwendet, während aus dem anderen nach der Inkubierung mit L-Serin-O-sulfat, die zuvor durchgeführt worden ist, der Wert von nur dem mitochondrialen Isoenzym erhalten wird.

Aus der gleichen Serum- oder Plasmaprobe werden je 0,5 ml entnommen und in zwei verschiedene Reagenzgläser eingegeben. In das erste Reagenzglas (A) werden 25 µl einer 2M-Lösung von L-Serin-O-sulfat in H₂O eingegeben, so daß eine ungefähre Endkonzentration von L-Serin-O-sulfat von etwa 50 mM ohne zu starke Verdünnung der Probe erhalten wird. In das zweite Reagenzglas (B) werden 25 µl H₂O zugegeben, um die gleiche Verdünnung zu erhalten, wie sie durch die Zugabe des L-Serin-O-sulfats zu dem Reagenzglas (A) erhalten wurde.

Zur Inkubierung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur oder 20 Minuten lang bei 30°C stehen gelassen. Am Ende dieses Zeitraums ist die Reaktion vollständig, d. h. im Reagenzglas (A) hat eine von L-Serin-O-sulfat abgeleitete Verbindung (Aminoacrylsäure) vollständig und irreversibel eine kovalente Bindung mit einer Gruppe in der aktiven Stelle des cytoplasmatischen Isoenzyms gebildet, wodurch dieses inaktiviert wird, wobei während dieser Inkubierungsperiode eine analoge Inhibierung des mitochondrialen Isoenzyms nicht gestattet wird.

Daher wird die Aktivität in den zwei Reagenzgläsern nach der Karmen-Methode bestimmt, d. h. man verfolgt den Verbrauch der reduzierten Form von Nikotinamidadenindinucleotid (NADH) bei der gekuppelten Reaktion von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase mit Malatdehydrogenase.

Aus dem Unterschied der optischen Dichten bei 340 nm pro Minute werden die Werte der enzymatischen Einheiten pro Liter Serum oder Plasma wie folgt erhalten:
Reagenzglas (B) = Gesamteinheiten/Liter (cytoplasmatisches Isoenzym + mitochondriales Isoenzym)
Reagenzglas (A) = Einheiten/Liter nur des mitochondrialen Enzyms.

Aus dem Unterschied: Einheiten/Liter (B) - Einheiten/Liter (A) wird der Wert von Einheiten/Liter des cytoplasmatischen Isoenzyms, das in dem Reagenzglas (A) vollständig inaktiviert worden ist, erhalten.

Beispiel

Um die Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Methode zu zeigen, wurden fünf Pools von Humanserum hergestellt, die verschiedene Mengen der zwei Isoenzmye enthielten. Die Matrix der fünf Pools bestand aus Humanserum mit der niedrigsten endogenen Aktivität (<5 E/l). Zu diesem Serum wurden verschiedene Mengen der zweit Isoenzyme gegeben, die nach der Methode von E. J. Sampson u. a. (Clin. Chem. 24, 1805, 1978) gereinigt worden waren.

Am Ende hatten die fünf Pools die folgenden Zusammensetzungen:

Pool Nr. 1
120 E/l nur cytoplasmatisches Enzym
Pool Nr. 2	112,5 E/l, wovon 90 E/l cytoplasmatisches Isoenzym und 22,5 E/l mitochondriales Isoenzym waren
Pool Nr. 3	105 E/l, wovon 60 E/l cytoplasmatisches Isoenzym und 45 E/l mitochondriales Isoenzym waren
Pool Nr. 4	97,5 E/l, wovon 30 E/l cytoplasmatisches Isoenzym und 67,5 E/l mitochondriales Isoenzym waren
Pool Nr. 4	90 E/l mitochondriales Isoenzym

Bei der Bestimmung der isoenzymatischen Aktivitäten nach der beschriebenen Methode wurden die in der Tabelle angegebenen Werte erhalten. Die Werte stellen Mittelwerte von sechs verschiedenen Bestimmungen dar (in der Tabelle wird das cytoplasmatische Isoenzym als s-GOT und das mitochondriale Enzym als m-GOT angegeben).

Tabelle

Aus dem Vergleich der so erhaltenen Versuchswerte im Verhältnis zu den theoretischen Werten bezüglich der isoenzymatischen Zusammensetzung wird die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens und seine Präzision ersichtlich.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der einzelnen enzymatischen Aktivitäten von cytoplasmatischem und mitochondrialem Isoenzym von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) in Serum- oder Plasmaproben, dadurch gekennzeichnet,
daß man die im Serum oder Plasma vorhandene GOT-Aktivität vor und nach der Inkubierung mit L-Serin-O-sulfat bestimmt, um im ersten Falle einen Wert der enzymatischen Aktivität zu erhalten, der der Gesamtsumme der Aktivität der zwei Isoenzyme entspricht, und im zweiten Falle einen Wert der enzymatischen Aktivität zu erhalten, der der Aktivität lediglich des mitochondrialen Enzyms entspricht, und
daß man die Aktivität des cytoplasmatischen Isoenzyms aus der Differenz der zwei genannten Werte erhält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung mit zwei identischen aliquoten Teilen der gleichen Serum- oder Plasmaprobe durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten in der Weise durchführt, daß man den Verbrauch der reduzierten Form von Nikotinamidadenindinucleotid (NADH) in der gekuppelten Reaktion von GOT mit Malatdehydrogenase verfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inaktivierung des cytoplasmatischen Isoenzyms mit L-Serin-O-sulfat durch 30minütige Inkubierung bei Raumtemperatur erhält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inaktivierung des cytoplasmatischen Isoenzyms mit L-Serin-O-sulfat durch 20minütige Inkubierung bei 30°C erhält.

6. Diagnostischer Satz zur Bestimmung der einzelnen enzymatischen Aktivitäten von cytoplasmatischem und mitochondrialem Isoenzym von GOT zur Verwendung bei dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er als eine seiner Komponenten L-Serin-O-sulfat enthält.