DE3640349A1

DE3640349A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der verteilung von cholesterin in proteinfraktionen

Info

Publication number: DE3640349A1
Application number: DE19863640349
Authority: DE
Inventors: Johannes Dr Aufenanger
Original assignee: Individual
Current assignee: Technoclone Gesmbh Wien At
Priority date: 1986-11-26
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1988-06-09
Anticipated expiration: 2006-11-27
Also published as: DE3640349C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruches 1.

Ein solches Verfahren ist unter der Handelsbezeichnung IMMUNO LIPIDOPHOR ALL IN aus der Praxis bekannt. Bei dem bekannten Verfahren wird Blutserum auf ein albuminhaltiges Agarosegel einer Schichtdicke von etwa 1-1,5 mm aufgegeben, wonach die in dem Serum enthaltenen Proteine in einzelne Proteinbanden elektrophoretisch aufgetrennt werden. Es entstehen Banden aus Lipoproteinen und anderen Proteinen. Ausgehend von der Annahme, daß das Cholesterin nur in den Lipoproteinen und dort stets in jeweils konstanten Konzentrationen vorkommt, wird das Agarosegel nach erfolgter Elektrophorese mit einer Polyanionen-haltigen Entwicklerlösung präzipitiert. Dadurch werden die Lipoproteine in dem Gel vollständig ausgefällt und damit sichtbar gemacht. Zur Bestimmung der Cholesterinverteilung in den Lipoproteinfraktionen ist eine Umrechnung notwendig, die darauf basiert, daß in bestimmten Lipoproteinen eine bestimmte, und zwar konstante Menge Cholesterin vorkommt.

Obwohl dieses Verfahren bei Patienten, für die die getroffenen Annahmen zutreffen, relativ zuverlässige Ergebnisse hervorbringt, ist jedoch stets eine relativ komplizierte Umrechnung erforderlich, da selbst dann, wenn die Annahmen zutreffen, die Cholesterinkonzentration in verschiedenen Lipoproteinbanden unterschiedlich ist. So liegt z. B. nach der getroffenen Annahme der Anteil an Cholesterin beim beta-Lipoprotein bei 45%, dagegen beim präbeta-Lipoprotein bei nur 15%.

Ungeachtet dessen trifft diese Annahme auch nicht bei allen Patienten zu. Bei einigen Erkrankungen ist nämlich der Anteil an Cholesterin in bestimmten Lipoproteinen verändert. Hinzu kommt, daß Cholesterin auch in anderen Proteinen auftreten kann. Dieses Cholesterin wird beim bekannten Verfahren nicht erfaßt und führt demzufolge zu einer Verfälschung der Ergebnisse. Eine verläßliche quantitative Bestimmung der Cholesterinverteilung ist daher mit dem bekannten Verfahren nicht möglich.

Ein weiterer Nachteil des bekannten Verfahrens besteht darin, daß die Bestimmung nur unter Verwendung von Blutserum, nicht aber ungeronnenem Blutplasma durchgeführt werden kann. Das im Blutplasma enthaltene Fibrinogen schlägt sich bei der Elektrophorese als eigene Bande nieder und wird mit präzipitiert. Bei Heparinpatienten, also solchen Personen, denen gerinnungshemmende Wirkstoffe verabreicht wurden, findet keine Gerinnung, also auch keine Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin statt. Dadurch wird bei diesen Patienten häufig die Fibrinogenbande mit präzipitiert, was die Ergebnisse wiederum verfälscht. Bedenkt man, daß es sich gerade bei dieser Personengruppe um Risikopatienten, nämlich Herzinfarkt- oder auch Herzklappenpatienten handelt, so wäre hier eine genaue Bestimmung der Cholesterinverteilung in besonderem Maße wünschenswert.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte Verfahren derart zu verbessern, daß die Cholesterinverteilung in den Proteinfraktionen unmittelbar bestimmt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruches 1 gelöst.

Durch die Cholesterinesterase werden zunächst die Cholesterinester in Cholesterin und freie Fettsäuren gespalten. Mit Hilfe der Cholesterindehydrogenase wird das Cholesterin zu Cholestenon oxidiert, wodurch Elektronen abgegeben werden, welche zur Farbanregung eines Farbindikators verwendet werden können. Da die Anzahl der frei werdenden Elektronen proportional zur Anzahl der Cholesterinmoleküle ist, gibt die Farbintensität des angeregten Farbindikators unmittelbar Aufschluß püber die Menge an Cholesterin in den einzelnen Proteinfraktionen, d. h. den Proteinbanden.

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen neben dem Verzicht auf eine umständliche Umrechnung der Lipoproteinverteilung in eine Cholesterinverteilung nicht zuletzt darin, daß keine - möglicherweise unzutreffenden - Annahmen über bestimmte Cholesterinanteile in bestimmten Proteinen getroffen werden zu brauchen. Damit eignet sich das Verfahren insbesondere auch für die Cholesterinbestimmung bei Heparinpatienten, da das Fibrinogen das Ergebnis nicht beeinflussen kann. Aber auch eine Lipolyse, wie sie z. B. durch eine Heparintherapie bedingt ist, stört nicht die Erfassung aller Cholesterin-haltigen Proteinfraktionen, da die quantitative Bestimmung beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur die Lipoproteinfraktionen, sondern alle Proteinfraktionen berücksichtigt.

Von besonderem Vorteil ist die Zusammensetzung der Enzymsubstratlösung gemäß den Merkmalen des Anspruches 2. Die freien Cholesterinmoleküle werden mit Hilfe der Cholesterindehydrogenase an der Hydroxylgruppe unter Beteiligung des Cosubstrates NAD+ zu Cholestenon oxidiert, wobei das NAD+ zu NAD + H+ reduziert wird. Die freien Elektronen von NAD + H+ werden über den Elektronenkoppler auf den Farbindikator übertragen, wodurch sich ein Farbkomplex bildet.

Als Elektronenkoppler kann in günstiger Weise Phenazinmethosulfat (PMS) verwendet werden.

Besonders vorteilhaft ist es, als Farbindikator 2-(p-Jodphenyl)- 3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT) zu verwenden, da sich hieraus durch Bildung eines schwer wasserlöslichen Formazankomplexes eine stabile, rotviolette Farbbildung ergibt.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren an einem Beispiel näher erläutert.

Zunächst wird, wie an sich bekannt, Blutserum auf eine Trägerschicht aus albuminhaltigem Agarosegel aufgegeben und anschließend einer Elektrophorese unterworfen, wodurch die einzelnen, im Blutserum enthaltenen Proteine in Proteinfraktionen aufgetrennt werden. Im Anschluß daran wird das Agarosegel mit den Proteinfraktionen in einer Enzymsubstratlösung 1-2 Stunden inkubiert.

Die hierzu verwendete Enzymsubstratlösung besteht bei dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel aus folgenden Mengen an Stammlösungen, die im einzelnen noch beschrieben werden:

TRIS-Puffer5 ml NAD1 ml EDTA0,25 ml INT2,5 ml PMS0,25 ml Cholesterindehydrogenase0,08 ml Cholesterinesterase0,20 ul Aqua bidest.17,3 ml

Die einzelnen Stammlösungen setzen sich wie folgt zusammen:

TRIS-Puffer

TRIS bedeutet TRIS-(hydroxymethyl-)aminomethan. Es werden 18,2 g TRIS in 400 ml Aqua bidest. aufgelöst und mit 1 N HCL auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. In diese Lösung wird 4 ml Triton X-100 (Handelsbezeichnung) und 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugegeben. Schließlich wird die Lösung mit Aqua bidest. auf 500 ml aufgefüllt. Man erhält so einen 0,3 M TRIS-Puffer mit einem pH-Wert von 8.

NAD

Hierzu werden 1000 mg Nicotin-adenin-dinucleotid (NAD) in 10 ml TRIS-Puffer (1 : 4 mit Aqua bidest. verdünnt) gelöst. Man erhält eine 13-mM-NAD-Stammlösung.

EDTA

Zur Herstellung einer 10-mM-EDTA-Stammlösung werden 372 mg Ethylendinitrilotetraacetat-dihydrat in 100 ml Aqua bidest. gelöst.

INT

Hierzu werden 100 mg 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)- 5-phenyltetrazolium-chlorid (INT) auf 100 ml Aqua bidest. gelöst. Man erhält eine 1,79-mM-INT-Stammlösung.

PMS

Zur Herstellung einer 3,27-mM-PMS-Stammlösung werden 100 mg Phenazinmethosulfat in 100 ml Aqua bidest. gelöst.

Cholesterin-Dehydrogenase wird in einer Lösung von 45,2 U/ml und Cholesterin-Esterase in einer Lösung von 52 U/ml verwendet.

Nachdem die Trägerschicht in einer Enzymsubstratlösung der o. g. Stammlösungen inkubiert wurde, werden die nunmehr rotviolett eingefärbten Banden bei Licht mit einer Wellenlänge von 570 nm densitometrisch ausgewertet. Die quantitative Erfassung der einzelnen Proteinfraktionen erfolgt relativ zur Summe aller Cholesterin-haltigen Fraktionen, d. h. jede einzelne Cholesterin-haltige Fraktion wird prozentual zur Gesamtcholesterinmenge im Gel angegeben. Will man den absoluten Cholesteringehalt der einzelnen Proteinfraktionen im Blutserum bestimmen, so brauchen die relativen Anteile der Fraktionen nur - wie bei dem bekannten Verfahren auch - mit dem Gesamtcholesteringehalt im Blutserum multipliziert zu werden. Der Gesamtcholesteringehalt im Blutserum kann ebenfalls enzymatisch bestimmt werden.

Als Elektronenkoppler kann anstatt PMS auch Diaphorase verwendet werden. Es ist auch möglich, Nitroblautetrazoliumsalz an Stelle von INT als Farbindikator zu verwenden. Die Banden werden dann blau eingefärbt und müssen bei einer entsprechend anderen Wellenlänge densitometrisch ausgewertet werden.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Verteilung von Cholesterin in Proteinfraktionen nach deren elektrophoretischen Auftrennung in einem Gel, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine in einer Enzymlösung als Einfärbelösung inkubiert wird, wobei die Enzymlösung neben anderen Substraten Cholesterinesterase und Cholesterindehydrogenase enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung weiterhin enthält einen TRIS-Puffer, Nikotin-adenin-dinucleotid (NAD), Ethylen- dinitrilotetraacetat-dihydrat (EDTA), einen Elektronenkoppler und einen Farbindikator.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenkoppler Phenazinmethosulfat (PMS) verwendet wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Farbindikator 2-(-p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5- phenyltetrazoliumchlorid (INT) verwendet wird.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymsubstratlösung etwa folgende Anteile aufweist: TRIS-Puffer57 mM NAD0,5 mM EDTA0,1 mM INT0,16 mM PMS0,03 mM Cholesterindehydrogenase0,14 U/ml Cholesterinesterase0,4 U/ml

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationszeit etwa 1 bis 2 Stunden beträgt.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung des eingefärbten Cholesterins densitometrisch erfolgt.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die densitometrische Auswertung mit Licht der Wellenlänge 570 nm erfolgt.

9. Enzymsubstratlösung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch etwa folgende Zusammensetzung: TRIS-Puffer57 mM NAD0,5 mM EDTA0,1 mM INT0,16 mM PMS0,03 mM Cholesterin-Dehydrogenase0,14 U/ml Cholesterin-Esterase0,4 U/ml