DE2509156A1

DE2509156A1 - Verfahren zur bestimmung der cholesteringesamtmenge in einer serumprobe und einzelreagens zur durchfuehrung dieses verfahrens

Info

Publication number: DE2509156A1
Application number: DE19752509156
Authority: DE
Inventors: Charles Allain
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1974-03-04
Filing date: 1975-03-03
Publication date: 1975-09-25
Also published as: GB1479994A; SE7502372L; FR2263516A1; JPS50125796A

Description

Patentanwälte · ο t: η ο λ tz o

Dr. Ing, x::.:j-: αο<!ζ
Dr. DiGtDr Γ. U ο rf

Hr M--r*-~& Γ-,- -_ΊΟ 3. Mär25 1975

8 ii.urtciian 8υ, Pic,n*;3i-iCiiie;-3tr. 23

ABBOTT LABORATORIES

14th Street & Sheridan Road, North Chicago, Illinois 60064,

V.St.A.

Verfahren zur Bestimmung der Cholesteringesamtmejige in einer Seruiaprobe und Einzelreagens zur Durchführung dieses

Verfahrens

In der Literatur sind zahlreiche Verfahren zum Bestimmen des Serumcholesterins beschrieben und die Einflüsse und Schwankungsquellen angegeben, denen diese Verfahren unterliegen (vgl. Tonks, D. B., The Estimation of Cholesterol in Serum; A Classification and Critical Review of Methods, Clin. Biochem., Λ_ 12, 1967). Seit einiger Zeit ist ein Interesse an mikrobiologischen Enzymen sichtbar geworden, die in der Lage sind, Cholesterin abzubauen, und es wurde kürzlich nachgewiesen, dass bestimmte Enzyme für die Cholesterinprüfung verwendet werden können. H. M. Flegg verwendete Cholesterindehydrogenase, die aus Nocardia erythropolis isoliert worden

5 O 9 8 3 97 3 8~8 1

war, für die Prüfung der Cholesteringesamtmenge, indem er verseifte Serumauszüge mit den Enzymen über einen Zeitraum von bis zu 2 Stunden hin inkubierte und das gebildete Δ -Cholestenon vermittels seiner Absorption bei 240 Nanometer mass (vgl. An Investigation of the Determination of Serum Cholesterol by an Enzymatic Method, Ann. Clin. Biochem., 10, 79, 1973)· W. Richmond isolierte aus einer anderen Nocardia-Species eine Cholesterin-Sauerstof-Oxidoreductase und verwendete das gereinigte Enzym für die direkte Cholesterinprüfung in verseiftem Serum, indem er das gebildete Wasserstoffperoxid mass (vgl. The Development of an Enzymatic Technique for the Assay of Cholesterol in Biological Fluids, Scan. J. Clin. Lab. Invest., 22.,supp. 26, Abstract 3-25, 1972 und Clin. Chem., _19 1350, 1973). In der DT-PS 2 246 695 sind enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Hydroxysteroiden und insbesondere von Cholesterin beschrieben. Alle diese Arbeitsweisen beruhen auf der nicht-enzymatisehen Hydrolyse von Cholesterinestern vor der Messung des freien Cholesterins. Infolgedessen müssen sie für die enzymatische Bestimmung der Serumcholesteringesamtmenge in Verbindung mit gewissen Methoden, gemäss denen zunächst die Cholesterinester verseift werden, angewandt werden.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden Cholesterinester im Serum durch Cholesterinesterase zu freiem Cholesterin

4 hydrolysiert. Das freie Cholesterin wird dann zu Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid oxidiert, das bei der Umsetzung mit einem Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, in Gegenwart von Meerrettich-Peroxidase (HPOD) eine Farbe hervorruft, deren Intensität direkt proportional dem Cholesteringehalt der Probe ist. Das Verfahren kann folgendermassen kurz zusammengefasst werden:

Cholesterinester Cholesterinesterase;, Cholesterin +

RCOOH

Cholesterin + O₂ _Cholesten-(4)-on-(3)+H₂0₂

ΤΤΡΩΤ)

HpO₂ + Wasserstoff-Donator 2HpO + oxidierter Wasserstoff-

609 83?/08 8 1- Donator

5099 α

Sämtliche Bestandteile, welche für die Prüfung des Cholesteringesamtgehaltes benötigt werden, werden in einem trockenen Einzelreagens vereinigt, das lange haltbar ist und durch Wiederansetzen mit Wasser gebrauchsfertig gemacht wird. Das Reagens wird mit 3 ml destilliertem Wasser angesetzt und auf 37° C erwärmt. 30 Mikroliter Serum werden hinzugegeben, und das Gemisch wird 5 bis 10 Minuten lang zur vollständigen Farbentwicklung, die in einem Spektrophotometer im sichtbaren Spektrum abgelesen wird, inkubiert. Die Nettoabsorption wird aus einer Standardkurve abgelesen, oder man vergleicht mit einer in ähnlicher Weise behandelten Standardprobe, um die Konzentration des Cholesterins zu erhalten. Das Verfahren ist schnell, genau, verlangt keine Vorbehandlung der Probe, verlangt keine ätzenden Mittel und ist vollständig enzymatisch. Es gewährleistet eine bessere Spezifität als bekannte Verfahren und ausgezeichnete Präzision.

Im folgenden wird eine Arbeitsweise zur Bestimmung der Serumcholesteringesamtmenge beschrieben, bei der ein gekoppeltes Drei-Enzymsystem verwendet wird und das erzeugte Wasserstoffperoxid durch oxidative Kupplung eines Wasserstoffdonators, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, gemessen wird. Bei Verwendung von 4—Aminoantipyrin in Gegenwart von überschüssigem Phenol als Wasserstoffdonator lässt sich die Reaktionsfolge, wie nachstehend beschrieben, veranschaulichen:

Cholesterin-Chol esterinest er + H₂O > Cholesterin + RCOOH

Cholesterin-Cholesterin + O₂ > Cholesten-(4)-on-(3) + H₂O₂

HPOD 2HoO₅ + 4-Aminoantipyrin + Phenol ^chinonimin-Farbstoff +

^ ^ ■ 4-H₂O

Die verwendete Cholesterinesterase (auch als Cholesterinesterhydrolase bezeichnet) wird von der Enzym-Kommission als EC3.I.I.13 identifiziert.

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3099 _u

Die bessere Spezifität, der Umfang, in dem dieses Verfahren anwendbar ist und die Einfachheit machen die Vorzüge dieses Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren aus.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Verwendung von O-Dianisidin oder 4-Aminoantipyrin plus Phenol als Chromogen oder Wasserstoffdonator beispielhaft veranschaulicht.

Cholesterinstandard-Vorratsmaterial, das 10 g Cholesterin je Liter gleichwertig ist

1000 mg aschefreies Cholesterin werden in Isopropanol aufgelöst und mit Isopropanol auf 100 ml verdünnt. Es werden solche Verdünnungen des Cholesterinstandard-Vorratsmaterials in Isopropanol bereitet_{ dass sich Arbeitsstandardlösungen ergeben, die 100, 200, 300, 400, 500 und 600 mg Cholesterin je 100 ml entsprechen.

Analyse von Cholestarinoxidase

Die Analyse von Cholesterinoxidase(C.O.) beruht auf der Umwandlung von Cholesterin in Cholesten-(4)-on-(3)> das auf Grund seiner konjugierten Carbonylgruppe ein Absorptionsmaximum bei 240 nm aufweist. 3,0 ml eines 0,10 Mol/Liter-Phosphatpuffers (pH 7,0), der 0,05 ml Triton Z-100-Fetzmittel je 100 ml enthält, werden in einer I₅O cm-Küvette mit 50 Mikroliter (ul) einer JOO mg (mg)/100 nl-Cholesterinlösung (wässrige Cholesterin-Standardlösung, wie Tekit, das von der Firma Searle Diagnostics, Inc. erhältlich ist) versetzt und durch Umdrehen durchmischt. Das Spektrophotometer wird gegen eine Blindprobe von gepuffertem Triton X-100-Netzmittel auf Null geeicht. 10 ul einer 1-10-verdünnten Lösung von Cholesterinoxidase in Wasser werden zugegeben, und es wird die Geschwindigkeit der Absorptionsänderung bei 240 nm je Minute bei 37° C gemessen. Die Enzymeinheit, auf die Bezug genommen wird, wird als derjenige Aktivitätsgrad von Cholesterinoxidase bestimmt, der die Umwandlung von 1 Mikromol Cholesterin in Cholesten-

_ 4 509839/0881

(4)-on-(3) je Hinute unter den vorgeschriebenen Testbedingungen fördert. Der millimolare Extinktionkoeffizient für Cholesten-(4-)-on-(3) ist 18,0.

Analyse von Cholesterinesterase

Die Analyse von Cholesterinesterase (Gholesterinesterhydrolase) beruht auf der Bildung eines Chinoniminfarbstoffs in der nachstehenden Eeaktionsfolge:

Cholesterin-Cholesterinester ^ Cholesterin + RCOOH

Cholesterin-Cholesterin + O₂ ^ Cholesten-(4)-on-(3) + H₂O₂

ΤΤΡΩΤ) 2H₀O₀ + 4—Aminoantipyrin + Phenol ^ Chinonimin-Farbstoff +

^d * 4 O

Mit Substrat, Cholesterinoxidase und Meerrettich-Peroxidase (HPOD) im Überschuss wird die Geschwindigkeit der Zersetzung von Cholesterinestern dadurch bestimmt, dass die Geschwindigkeit der Färbentwicklung bei 500 nm gemessen wird.

3,0 ml eines 0,10 Mol/Liter-Phosphatpuffers (pH 6,7), der 3,0 Millimol (mMol)/Liter Natriumcholat, 0,8 inMol/Liter 4—Aminoantipyrin, 14 mMol/Liter Phenol, 67 ooo Einheiten/ Liter HPOD, 120 Einheiten/Liter Cholesterinoxidase und 0,17 mMol/Liter eines Polyglykols, wie Carbowax-6000, enthält, werden mit 50 ill eines Kontrollserums, das eine bekannte Menge an Cholesterinestern aufweist, wie Serachol, das von der Firma General Diagnostics Division of Warner-Lambert Co. erhältlich ist, versetzt.

Für die Hydrolyse von Cholesterinestern durch ChoIesterinester hydrolase ist unbedingt eine Gallensäure oder ein Salz davon erforderlich. Unter den Gallensäuren können nur Cholinsäure und ihre konjugierten Derivate (Taurocholinsäure und Glyco-

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cholinsäure) oder Salze davon die Cholesterinesteraseaktivitat unterstützen (vgl. Hyun, J. et al., J. Biol.Chem. 244, 1937; 1969).

Die Lösung wird durchmischt und 5 Hinuten lang bei 37° C inkubiert. 0,10 ml einer Lösung von Cholesterinesterase in 0,10 mMol/Liter Phosphatpuffer, &r 0,05 bis 0,10 Einheit/ml enthält, werden zugegeben, und die Geschwindigkeit der Absorptionsänderung je Minute bei 500 nm wird aufgezeichnet.

1 Einheit Cholesterinesteraseaktivitat ist diejenige Enzymmenge, die 1 Mikromol Cholesterinester je Minute bei 37° C zersetzt. Der millimolare Extinktionskoeffizient für den unter diesen Bedingungen gebildeten Farbstoff wurde zu 5»33 gefunden.

Ein Perkin-Elmer-Modell 46-Spektrophotometer, das bei 37° ^c arbeitete, wurde für die Prüfung sämtlicher Enzyme verwendet.

Die einzelnen Reagenzien können vereinigt werden, um ein Einzelreagens für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin bereitzustellen.

Wirkung von reduzierenden Verbindungen

Ein normales Kontrollserum wurde bis zur Hälfte seines vorgeschriebenen Volumens angesetzt, und aliquote Anteile wurden mit gleichen Teilen einer Lösung, welche das zu prüfende Material enthielt, derart abgemischt, dass sich die in der folgenden Tabelle gezeigte Serumendkonzentration ergab. Die Ergebnisse zeigen geringe Störungen bei Verwendung der untersuchten Verbindungen.

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3099 ,

Wirkung von reduzierenden Verbindungen

Reduzierende Verbindung	Konzentration im Serum mg/100 ml	Cholesterin mg/100 ml	Differenz %
Keine	• · ·	188	• · *
Harnstoff	60	189	+0,5
Ascorbin säure	5	184	-2,1
Creatinin	11	189	+0,5
Glucose	500	190	+1,0
Bilirubin	15	186	-1,0
Harnsäure	50	191	+1,6
Hämoglobin	.200	192	+2,1
Natriumbromid	10	187	-0,5
Genaugkeit des	Verfahrens

Unter Verwendung von nativem Humanserum wurde unter routinemässigen Krankenhausbedingungen für die Cholesterinkonzentration mit einem mittleren Wert von 384,4 mg/100 ml und einer Standardabweichung von 1,91 eine Genauigkeit für den einzelnen Tag (CV) von 0,50 % und für eine Konzentration mit einem mittleren Wert von 46,9 mg/100 ml und eine Standardabweichung von 0,48 eine solche von 1,0 % (CV) gefunden. Von Tag zu Tag durchgeführte Analysen von nativem Humanserum zeigten über einen Zeitraum von 5 Tagen einen CV-Wert von 0,99 % (mittlerer Wert: 386,5; SD: 3,84) und einen CV-Wert von 3,0 % (mittlerer Wert: 48,2; SD: 1,45).

Das beschriebene Cholesterinverfahren stellt den ersten Versuch dar, die Spezifität einer vollkommen enzymatisch durchgeführten Arbeitsweise, bei der ein wässriges Einzelreagens verwendet wird, in eine einfache colorimetische Analyse für die Routineanwendung einzuführen. Das Verfahren weist gute Empfindlichkeit auf, verlangt keine Extraktion oder Probenverdünnung und vermeidet die Verwendung von scharfen Mineral-

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säuren. Das Reagens ist in Lösung 8 Stunden lang bei Raumtemperatur und 24· Stunden lang, wenn es bei 4·° C gehalten wird, stabil. Das Verfahren kanu manuell ausgeführt oder auch leicht einer automatisierten Anwendung angepasst werden.

Es wurden mehrere Indikatorreaktionen für die Messung des gebildeten Wasserstoffperoxids bewertet, beispielsweise die von Gochman und Schmitz beschriebenen (Automated Determination of Uric Acid, With the Use of a Uricase-Peroxidase System, Clin.Chem., 1£, 1154·, 1971, wie O-Dianisidin, 4' ,4' i*"-Methylidin-tris-(N,N-dimethylanilin), 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon/O-Toluidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydra-ζοη/Ν,Ν-Dimethylanilin wie auch ABTS Z2,2'-Azino-di-(3-äthylbenzthiazolinsulfonat-6)-diammonium-Salz7). Von den bewerteten Chromogenen erwiesen sich O-Dianisidin und 4—Aminoantipyrin plus Phenol als am besten hinsichtlich Löslichkeit, Empfindlichkeit, niedrigem Leerwert und Nicht-Inhibierung.

Ein Einzelreagens, das sämtliche der für die enzymatische Bestimmung des Serumcholesteringesamtgehaltes notwendigen Bestandteile enthält und 4-Aminoantipyrin plus Phenol als Chromogen verwendet, wird durch den folgenden Ansatz dargestellt:

Bestandteil Konzentration mMol/Liter

Natriumcholat 2-5

4—Aminoantipyrin 0,5 - 1»3

Phenol 12-16

Cholesterinesterase 20 - 50 Einheiten/Liter

Cholesterinoxidase 80 - I50 Einheiten/Liter

Meerrettichperoxidase (HPOD) 40 - 160 000 Einheiten/Liter.

Ein Puffer, der in der Lage ist, einen pH-Wert von 6,4- bis 7,0 aufrechtzuerhalten, wie Natriumphosphat (etwa 100 mMol/ Liter); ein !Füllstoff, wie Kaliumchlorid (etwa 50 mllo l/Liter); und ein Polyglykol, wie Carbowax-6000 (etwa 0,20 mMol/Liter)

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zur Unterstützung der Solubilisierung, können zugesetzt werden.

Die angegebenen Bestandteile können vermischt werden, und es kann so ein trockenes, stabiles Einzelreagens für die enzymatische Analyse des gesamten Serumcholesterins bereitgestellt werden.

Das Ansetzen des Reagenses kann erfolgen, indem eine Portion destillierten Wassers zugesetzt und zum Auflösen der Bestandteile sacht gemischt wird. Das Reagens ist bei Raumtemperatur 6 Monate lang und in Lösung 8 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 24 Stunden bei 4° C stabil.

Das angesetzte Reagens wird in aliquote 3»O ml-Anteile getrennt; zu jedem der Anteile werden 30 ia.1 Serumprobe gegeben. Das Gemisch wird mindestens 10 Minuten lang bei 37° C inkubiert, und die Absorption bei 500 Nanometer wird gegen eine Reagensblindprobe aufgezeichnet.

Aus der erhaltenen ITettoabsorption kann die Cholesterinkonzentration in mg/100 ml direkt aus einer Eichkurve, die unter Verwendung bekannter Cholesterinproben konstruiert werden kann, bestimmt werden. Andererseits kann die Cholesterinkonzentration auch wie folgt berechnet werden:

. Konzentration der

Konzentration einer _ ( unbekannt) χ (Btandardprobe)

^Aunbekannt ⁼ Absorption der = 0,400 ^A500 unbekannt unbekannten Probe

Konzentration der
Standardprobe = 200 mg%

^AStsndard ⁼ Absorption der
t>ranaara standardprobe = 0,200

_ 9 _
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Aus den beispielhaft angegebenen Werten kann die Konzentration berechnet werden.

Konzentration der _ (0,400) χ (200) _ unbekannten Probe ~ CO,200j "

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Claims

Pat entansprüche

Enzymatisch.es Verfahren zum Bestimmen der Cholesteringesamtmenge in einer Serumprobe, dadurch, gekennzeichnet, dass man die Cholesterinester in der genannten Probe in Gegenwart einer Gallensäure oder eines Salzes einer Gallensäure durch. Umsetzung mit Cholesterinesterase zu freiem Cholesterin hydrolysiert; das freie Cholesterin in Gegenwart von Cholesterinoxidase zu Δ -Cholestenon und Wasserstoffperoxid oxidiert; das gebildete Wasserstoffperoxid mit einem Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, in Gegenwart von Meerrettichperoxidase unter Färberzeugung umsetzt, wobei die Farbe dem Cholesteringehalt der Probe direkt proportional ist; und die gebildete Farbe misst, um den Cholesteringehalt der Probe zu bestimmen.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, aus der folgenden Klasse auswählt: O-Dianisidin, M-¹ ,4·' ,4ⁿ-Methyliäin-r-tris-(N,N-dimethylanilin), J-Methyl-S-benzothiazolinon-hydrazon/O-Toluidin, 3-Methyl~2-benzothiazolinon-hydrazon/lT,N-Dimethylanilin, 2,2'-Azino-di-(3-äthylbenzothiazolinsulfonat~6)-diammoniumsalz und 4—Aminoantipyrin plus Phenol·

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, unter der folgenden Klasse auswählt: O-Dianisidin und 4-Aminoantipyrin plus Phenol.

Verfahren nach Anspruch 3> dadurch gekennzeichnet, dass man die Mischung aus Serumprobe und Enzymen bei einem pH-Wert zwischen 6,4 und 7 hält.

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5- Einzelreagens zum Ausführen einer enzymatisehen Analyse auf den Cholesteringesamtgehalt einer Serumprobe, enthaltend eine wasserlösliche, feste, praktisch wasserfreie, lagerungsstabile Mischung von den Enzymen Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase; dem Enzym Meerrettichperoxidase; einem Wasserstoffdonator, der sich durch Was- ■ serstoffperoxid oxidieren lässt; und einer Gallensäure oder einem Salz einer Gallensäure.

6. Einzelreagens nach Anspruch 5* dadurch gekennzeichnet, dass man den Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, aus der folgenden Klasse auswählt: O-Dianisidin, V,4',4-"-Methylidin-tris-(N,N-dimethylanilin), 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon/0-Toluidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon/lⁱr,N-Dimethylanilin, 2,2'-Azino-di-(j-äthylbenzothiazolinsulfonat-6)-diammoniumsalz und 4—Aminoantipyrin plus Phenol.

7. Einzelreagens nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, dass man den Wasserstoffdonator, der sich durch Wasserstoffperoxid oxidieren lässt, aus der folgenden Klasse auswählt: O-Dianisidin und 4-Aminoantipyrin plus Phenol.

8. Einzelreagens nach Anspruch 7₅ enthaltend eine Gallensäure oder ein Salz einer Gallensäure aus der Klasse Cholinsäure, Taurocholinsäure, Glycocholinsäure und deren Salze. . .

9. Einzelreagens nach Anspruch 8, enthaltend einenPuffer, der in der Lage ist, den pH-V/ert zwischen 6,4- und 7 zu halten.

10. Einzelreagens nach Anspruch 5 zum Ausführen einer enzymatischen Analyse auf den Cholesteringesamtgehalt einer Serumprobe, enthaltend eine wasserlösliche, feste, praktisch wasserfreie, lagerungsstabile Mischung aus: 4-Amino-

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antipyrin in einer Konzentration von 0,5 bis 1,3 mMol je Liter; Phenol in einer Konzentration von 12 bis 16 mMol ge Liter; Cholesterinesterase in einer Konzentration von 20 bis 50 Einheiten je Liter; Cholesterinesterase in einer Konzentration von 80 bis 150 Einheiten ge Liter; Meerretti^chperoxidase in einer Konzentration von 40 000 bis 160 000 Einheiten je Liter; und Natriumcholat in einer Konzentration von 2 bis 5 mMol je Liter.

11. Einzelreagens nach -Anspruch 10, enthaltend einen Puffer, der in der Lage ist, den pH-Wert bei 6,4 bis 7 zu halten.

12. Verwendung des Einzelreagenses nach Anspruch 5» zum Bestimmen des Cholesteringesamtgehaltes in einer Serumprobe, wobei man ein Einzelreagens, das eine wasserlösliche, feste, praktisch wasserfreie, lagerungsstabile Mischung aus den Enzymen Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase; dem Enzym Meerrettichperoxidase; einer Gallensäure oder einem Salz einer Gallensäure; und einem Wasserstoffdonator, der in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu oxidieren und aus der folgenden Klasse ausgewählt ist: 0-Dianisidin und 4-Aminoantipyrin plus Phenol, enthält, mit Wasser versetzt, um das genannte Reagens anzusetzen; die zu prüfende Serumprobe dem angesetzten Reagens zusetzt; in der Mischung aus Serumprobe und Reagens sich eine Farbe entwickeln lässt, wobei die gebildete Farbe direkt proportional dem Cholesteringehalt der Probe ist; und die gebildete Farbe misst, um den Cholesteringehalt der Serumprobe zu bestimmen.

13· Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Einzelreagens Natriumcholat und einen Puffer enthält, der in der Lage ist, den pH-Wert bei 6,4 bis 7 zu halten.

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