DE2737288C2 - Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von AdenosintriphosphatInfo
- Publication number
- DE2737288C2 DE2737288C2 DE19772737288 DE2737288A DE2737288C2 DE 2737288 C2 DE2737288 C2 DE 2737288C2 DE 19772737288 DE19772737288 DE 19772737288 DE 2737288 A DE2737288 A DE 2737288A DE 2737288 C2 DE2737288 C2 DE 2737288C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- determination
- glycerophosphate
- glycerol
- oxidase
- triglycerides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(a) eine Lipase,
(b) eine Glycerin-Kinase und
(c) AdeEosintriphosphat,
dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch
(d) a-Glycerophosphat-Oxidase sowie gegebenenfalls
(e) einen Elektronenakzeptor
enthält.
5. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Anteil (e>
einen Indikator oder ein Indikatorsystem, das in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eine feststellbare Veränderung herbeiführt,
enthält.
6. Bestimißungs-Reagenz nach Ansprüchen 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-GIycerophosphat-Oxidase
von Stroptocoi-vus faecalis enthält.
7. Bestimmungs-Reaeenz für d:.e Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3 zur Bestimmung
von freiem Glycerin in wäßrit "·η Flüssigkeiten, enthaltend
(a) eine Glycerin-Kinase;
(b) Adenosintriphosphat;
(b) Adenosintriphosphat;
dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch
(c) ar-Glycerophosphat-Oxidase und
(d) einen Elektronenakzeptor
(d) einen Elektronenakzeptor
enthält.
8. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es als Anteil (d) ein Indikatorsystem
mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die in
Gegenwart eines Peroxides und der Substanz mit peroxidativer Aktivität eine feststellbare Veränderung herbeiführt,
enthält.
9. Bestimmungs-Reagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat in wäßriger Lösung, enthaltend
(a) Glycerin und
(b) eine Glycerin-Kinase,
(b) eine Glycerin-Kinase,
dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch
(c) a-Glycerophosphat-Oxidase und
(d) einen Elektronenakzeptor
(d) einen Elektronenakzeptor
enthält.
ifc 60
Die Erfindung betritTt ein Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden
gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem mar. in einer Probe der zu analysierenden
Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert, das freie und/
oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin in L-a-Glycerophosphat überführt und unter Erzeugung einer feslstellbaren
Veränderung weiter umsetzt. Des weiteren betrifft die Erfindung Bestimmungs-Reagenzien zur
Durchführung des Verfahrens.
Die üblichen bekannten Verfahren zur Bestimmung des Triglyceridgehaltes von Blutserum bestehen in einer
Hydrolyse der Triglyceride unter Freisetzung vo" jlycerin und Umsetzung des Glycerins mit verschiedenen
Reagenzien unter Erzeugung von Verbindungen, jie auf spektrophotometrischem Wege quantitativ bestimmt
werden können.
Die Hydrolyse der Triglycende erfolgt dabei unter Verwendung einer Base. Aus den US-PS 37 03 591 und
37 59 793 ist es jedoch auch bereits bekannt, die Hydrolyse auf enzymatischem Wege herbeizuführen, und zwar
nach dem Verfahren der US-PS 37 59 793 unter Verwendung einer Lipase allein und nach dem aus der US-PS
37 03 591 bekannten Verfahren unter Verwendung einer Lipase in Kombination mit einer Protease. Weitere
nicht-enzymatische Hydrolyseverfahren sind beispielsweise aus den DE-PS 22 29 849 und 23 23 609 bekannt.
Es ist des weiteren bekannt, Glycerin auf enzymatischem Wege zu bestimmen. Die Bestimmung kann dabei
nach drei verschiedenen enzymatischen Methoden erfolgen, nämlich:
(a) Methode von Garland und Rändle (vgl. P. B. Garland und P. J. Rändle in Nature, 196 [1962], Seiten 987-988).
Glycerin-Kinase
Glycerin + ATP ► L-tr-Glycerophosphat + ADP
Pyruvat-Kinase
ADF -t- Phiwphoenoipyruväi Pyruvat + ATP
ADF -t- Phiwphoenoipyruväi Pyruvat + ATP
Lactat
Pyruvat + NADH » Lactat + NAD+
Dehydrogenase
(b) Verfahren nach Weiland (vgl. O. Weiland in Biochem. Z., [1957], 329, Seite 313)
Glycerin-Kinase
Glycerin + ATP » L-ff-GIycerophosphat + ADP
Glycerin + ATP » L-ff-GIycerophosphat + ADP
«r-Glycerophospha:
L-ff-Glycerophosphat + NAD+ — * NADH + Dihydroxyacetonphosphat + H+
Dehydrogenase υ
(C) Glycerin-Dehydrogenase-Verfahren (vgl. J. H. Hagen und P. B. Hagen in Can. J. Biochem. und Physiology,
40 [1962], Seite 1129)
35 Glycerin
Glycerin + NAD+ ——
> Dihydroxyaceton + NADH + H+
Dehydrogenase
Aus der DE-PS 26 65 556, der GB-PS 13 22 462 sowie der US-PS 37 59 793 sind ferner Abwandlungen der
Methode (a) bekannt. In allen Fällen wird die Erzeugung von NADH oder das Verschwinden von NADH in
einem U.V.-Spektrophotometerbei 340 nm bestimmt. Die Methode (a), zu deren Durchführung Besti/nmungs-Rcagenzien
im Handel erhältlich sin 1, besteht aus einem 3-Enzymverfahren, wobei das Verschwinden von
NADH gemessen wird. Die Methode (b) ist ein 2-Enzymverfahren, bei dem die NADH-Erzeugung gemessen
wird. Auch bei der Methode (c), bei der es sich um eine ein Enzym verwendende Methode, und zwar eine Glycerin-Dehydrogenase-Reaktion
handelt, wird die NADH-Erzeugung gemessen. Nachteilig an den beiden zuletzt genannten Methoden ist ihre extreme pH-Wensempfindlichkeit und die hiermit verbundene Störanfälligkeit,
sofern keine genaue pH-Wertsüberwachung erfolgt. Nachteilig an allen drei Methoden, insbesondere der
Methode (a; ist ferner, daß die Stabilität, und zwar nicht nur der diagnostischen Enzyme, sondern auch des
Cofaktors, NADH, ein Problem ist. Fehler, die bei Durchführung der bekannten enzymatischen Methoden auftreten
können, werden ausführlich von H. P. Chen und S. S. El-Mequid in der Zeitschrift Biochemical Medicine,
7 (1973), Seite 460 oeschrieben.
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden ist aus der DE-PS 21 39 163 bekannt. Dieses Verfahren
in einer Hydrolyse der Triglyceride, Oxidation des erhaltenen Glycerins zu Formaldehyd und Umsetzung
des Formaldehyds mit Ammoniak und einem stabilen, wasser- und alkohollöslichen, farblosen Metallkomplex
des Acetylacetons unter Erzeugung einer farbigen Verbindung.
Es ist fernerauch bekannt, z. B. aus der DE-OS 22 13 721, Glucose in Flüssigkeiten durch enzymatische Oxidation
mit Glucoseoxidase und SauerstofTund anschließenden Nachweis der entstehenden Reaktionsprodukte
mittels einer Farbreaktion zu bestimmen.
Aus Chemical Abstracts 71, 19034 b (1969) ist es schließlich auch bekannt, daß sich e-Glycerophosphat mit
Sauerstoff in Gegenwart von cr-Glycerophosphat-Oxidase zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid
umsetzen läßt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren und ein Bestimmungs-Reagenz Tür die Bestimmung,
insbesondere quantitativ? Bestimmung von Glycerin und Triglyceriden, insbesondere Serum-Triglyceriden
anzugeben, bei dessen Durchführung die Einhaltung ganz bestimmter pH-Werte, wie bei den bekannten Verfahren
nicht erforderlich ist, und das des weiteren keine so hohen Anforderungen an die Reagenz-Stabilität stellt,
wie die bekannten Verfa>i.;::n.
Gelöst wird die gestellte Aufgabe mittels eines Verfahrens und Bestimmungsreagenzien, wie sie in den
Ansprüchen gekennzeichnet sind.
Demzufolge verfährt man erfindungsgemäß in der Weise, daß man das Glycerin in L-ar-Glycerophosphat überführt
und das erzeugte L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von a-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung
einer feststellbaren Veränderung oxidiert.
In der zu analysierenden Flüssigkeit vorhandene Fettsäureester des Glycerins werden zunächst nach üblichen
bekannten Methoden, vorzugsweise auf enzymatischem Wege, in besonders vorteilhafter Weise mit einer
Lipase zu Glycerin hydrolysiert.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verfährt man in der Weise, daß man das L-ar-Glycerophosphat
in Gegenwart von «-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert, das
mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagiert.
In vorteilhafter Weise führt man das Verfahren der Erfindung in Gegenwart von Sauerstoffals Elektronenakzeptor
sowie eines Indikators oder eines Indikatorsystems, der bzw. das bei Kontakt mit Wasserstoffperoxid ein
bestimmbares Reaktionsprodukt liefert, durch. Das bestimmbare Reaktionsprodukt besteht dabei in vorteilhafter
Weise aus einer farbigen Verbindung, die gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung
quantitativ meßbar ist.
In vorteilhafter Weise erfolgt des weiteren die Überführung des Glycerins in L-o-Glycerophosphat unter Verwendung
einer Glycerin-Kinase.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verfährt man somit derart, daß man eine Probe der zu
analysierenden Flüssigkeit mit einem Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt, das
(a) eine Lipase;
(b) eine Glycerin-Kinase und
(c) Adenosintriphosphat enthält und außerdem
(d) ύ'-Glycerophosphat-Oxidase sowie gegebenenfalls
is (e) einen Elektronenakzeptor.
is (e) einen Elektronenakzeptor.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung führt man das Verfahren in Gegenwart eines
Indikatorsystems mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung durch,
wobei die FarbstolTvorläuferverbindung entweder (1) eine Verbindung sein kann, die in Gegenwart von Wasser-Stoffperoxid
und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität einen Farbstoff erzeugt oder (2) aus einer Verbindung
oder mehreren Verbindungen bestehen kann, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz
mit peroxidativer Aktivität keine feststellbare Veränderung im sichtbaren Bereich des Spektrums herbeiführen,
jedoch mit einer anderen Verbindung oder einer Reihe von Verbindungen unter Erzeugung eines quantitativ
erfaßbaren Reaktionsproduktes zu reagieren vermögen, wobei dieses Reaktionsprodukt proportional zum
Glycerin- und/oder Triglyceridgehalt der zu analysierenden Probe erzeugt wird.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht somit die quantitative Bestimmung des freien und/oder in Form von
Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten nach folgendem Reaktionsschema:
Lipase
1. Trigycerid + HOH ► Glycerin + Fettsäuren
1. Trigycerid + HOH ► Glycerin + Fettsäuren
Glycerin-Kinase
2. Glycerin + ATP * L-a-Glycerophosphat + ADP
2. Glycerin + ATP * L-a-Glycerophosphat + ADP
a-GP-Oxidase
3. L-tr-Glycerophosphat + Elektronenakzeptor ► Dihydroxyacetonphosphat + Verbindungen
zur analytischen Bestimmung.
Bei Verwendung von Sauerstoffals Elektronenakzeptor wird H2O2 als analytische bestimmbare Verbindung in
der Reaktion (3) erzeugt. In vorteilhafter Weise kann die H2O2-Bestimmung nach folgendem Reaktionsschema
erfolgen:
Peroxidase
4. H,O, + HjA (red.) ► A (ox) + H2O (bestimmbare Verbindung)
4. H,O, + HjA (red.) ► A (ox) + H2O (bestimmbare Verbindung)
wobei bedeuten:
H^A (red.) eine Farbstoffvorläuferverbindung, bei der es sich um die reduzierte Form des Farbstoffes handelt;
A(ox) einen Farbstoff, der durch Oxidation von H2A erhalten wird.
A(ox) einen Farbstoff, der durch Oxidation von H2A erhalten wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik insbesondere
deshalb technisch fortschrittlich, weil es nicht auf der Erzeugung oder Beseitigung von NADH beruht. Es
weist gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik insbesondere folgende Vorteile auf: Es lassen
sich alle Leucofarbstoffe, die Peroxidase als Elektronendonor benutzen können, in dem Indikatorsystem
verwenden, weshalb man je nach dem ausgewählten Farbstoff die Umsetzung bei einer von mehreren verschiedenen
Wellenlängen des sichtbaren Spektrums messen kann. Die im sichtbaren Spektrum durchführbaren Messungen
sind weniger störanfällig als Messungen, die bei einer Wellenlänge von 340 nm durchgeführt werden
müssen. Außer Farbstoffen lassen sich praktisch alle Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid einsetzen.
Es braucht keine Sorge für die Stabilität von NAD* oder NADH getragen zu werden, da O2 der Cofaktor der j
flr-Glycerophosphat-Oxidasereaktion ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht durch Serumkomponen- !
ten, die NAD* oder NADH alsCofaktoren verwenden (beispielsweise Lactat + Lactat-Dehydrogenase), gestört, ;j
welche die Reaktionsfolge bekannter Verfahren stören können. Es können alle Mittel, die einen O2-Verbrauch ;
messen, als Bestimmungsmittel eingesetzt werden, wenn O2 als Elektronenakzeptor verwendet wird. Schließ- 5 :4
lieh siiiu die verwendeten Enzyme innerhalb eines vergleichsweise breiten pH-Wert-Bereiches aktiv, so daß eine
sorgfältige pH-Wertsteuerung nicht erforderlich ist. ;j
Die erfindungsgemäß verwendbaren Bestimmungs-Reagenzien können in Form von Lösungen vorliegen oder !'ij
in Form von Trockenansätzen oder in lyophilisierter Form, in welchem Falle sie durch Zusatz von Wasser unmittelbar
vor ihrer Verwendung in gebrauchsfertige Lösungen überführt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat besondere Bedeutung für klinische Untersuchungen, insbesondere die
Bestimmung von Serum-Triglyceriden.
In vorteilhafter Weise erfolgt die Hydrolyse vorhandener Fettsäureester des Glycerins der Serumprobe mit
einer Lipase oder einer Kombination aus einer Lipase und einem Effektor, beispielsweise einer Protease oder
einer oberflächenaktiven Verbindung, je nach der Natur der vorliegenden Triglyceride. Dabei kann beispielsweise
nach Methoden verfahren werden, wie sie aus den US-PS 37 03 591 und 37 59 793 bekannt sind.
Ein weiteres bekanntes Verlahren besteht in der Hydrolyse von Serum-Trigiyceriden unter Verwendung einer
verträglichen Mischung aus einer Lipase, die normalerweise selbst nicht dazu befähigt ist, proteingebundene
Triglyceride zu hydrolysieren, wie sie im Serum vorliegen, und einem Effektor, d. h. einer verträglichen oberflächenaktiven
Verbindung. Eine geeignete verträgliche oberflächenaktive Verbindung ist dabei eine Verbindung,
die die Triglycerid-Hydrolyse durch die Lipase stimuliert, wie es in dem folgenden Test beschrieben wird. Dies
bedeutet also, daß eine verträgliche oberflächenaktive Verbindung eine solche ist, die die Aktivität der Lipase
nicht inhibiert, sondern erhöht.
Vorteilhafte Lipasen sind solche von Candida cylindracea (Candida rugosa).
Ganz allgemein jedoch lassen sich die verschiedensten Lipasen für die Triglycerid-Hydrolyse verwenden, und
zwar solche pflanzlichen wie auch tierischen Ursprungs. Geeignete Lipasen sind im Handel erhältlich.
Lipase-Präparate, die selbst nicht in der Lage sind, Serum-Triglyceride zu hydrolysieren, können in Kombination
rnjt nicht-ionogenen und/oder anionischen oberflächenaktiven Verbindungen verwendet werden. Als
besonders vorteilhafte oberflächenaktive Verbindungen haben sich beispielsweise Octyl- und Nonylphenoxypolyäthoxyäthanole
erwiesen.
Wird Tür die Hydrolyse eine Protease-Lipase-Kombination des Standes der Technik verwendet, so können
hierzu die verschiedensten üblichen bekannten Proteasen verwendet werden. Hierzu gehören beispielsweise
Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease, Proteasen von Aspergillus oryzae und Bacillus subtilis, Elastase,
Papain und Bromelain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.
Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen sn Lipasc und anderen Effektoren, beispielsweise oberflächenaktiven
Verbindungen und Protease, können sehr verschieden sein, je nach den zeitlichen Begrenzungen des
Bestimmungsverfahrens. Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermitteln. Typische
geeignete Konzentrationen ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.
Die Hydrolyse der Triglyceride kann auch nach den üblichen bekannten »nicht-enzymatischen« Methoden
durchgeführt werden, beispielsweise auch durch Behandlung mit einer starken Base. Es ist lediglich darauf zu
achten, daß das durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin dem enzymatischen Glycerin-Bestimmungsreagenz in
einem Medium zugeführt wird, das keine Stoffe enthält, die die Enzyme des Glycerin-Bestimmungssystems
inhibieren oder die in anderer Weise den Ablauf der Reaktionen, die zur Erzielung eines exakten Glycerin-Bestimmungsergebnisses
erforderlich sind, beeinträchtigen könnten.
Sobald die Triglycerid-Hydrolyse erfolgt ist, kann die enzymatische Glycerin-Bestimmung durchgeführt werden.
Das erste Enzym der Glycerinbestimmung besteht aus Glycerin-Kinase, die die Umwandlung von Glycerin in
L-<7-Glycerophosphat in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert. Zur Durchführung des Verfahrens
eignen sich die bekannten Glycerin-Kinasen. Als besonders vorteilhafte Glycerin-Kinasen haben sich
solche erwiesen, die sich von E. coli und Candida mycoderma erhalten lassen. Eine Übersicht über verwendbare
Glycerin-Kinasen, ihre Herstellung und ihre Reaktionsfähigkeit findet sich beispielsweise in dem »Enzyme
Handbook« von T. E. Barman, Band I, Springer-Verlag, N. Y. (1969), Seiten 401 bis 402. Im übrigen sind
geeignete Glycerin-Kinasen im Handel erhältlieh.
Die nächste Stufe des Bestimmungsverfahrens besteht in der Oxidation von L-tr-Glycerophosphat in Gegenwart
von L-a-Glycerophosphat-Oxidase und einem Elektronenakzeptor unter Hervorrufung einer feststellbaren
Änderung, vorzugsweise einer Farbveränderung oder Farbbildung, die vorzugsweise quantitativ von dem GIyceringehalt
der untersuchten Probe abhängig ist. Die feststellbare Veränderung braucht jedoch nicht unbedingt
in einer Farbveränderung oder Farbbildung zu bestehen. Vielmehr ist es beispielsweise auch möglich, andere
feststellbare Veränderungen zu bestimmen, beispielsweise den Sauerstofiverbrauch.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbar sind die verschiedensten Elektronenakzeptoren,
die eine Oxidation des a-Glycerophosphates in Gegenwart des Oxidase-Enzymes unter gleichzeitiger Hervorrufung
einer feststellbaren Veränderung ermöglichen. Besonders vorteilhafte Elektronenakzeptoren sind solche,
die auf direktem oder indirektem Wege ein radiometrisch feststellbares, vorzugsweise farbiges Produkt liefern.
Die Verwendbarkeit eines speziellen Elektronenakzeptors läßt sich auf experimentellem Wege leicht feststellen.
Als besonders vorteilhafter Elektronenakzeptor hat sich Sauerstoff erwiesen, der das L-ar-Glycerophosphat in
Gegenwart von Oxidase zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid oxidiert. Verfahren zur Bestimmung
von Wasserstoffperoxid und Messung des Verbrauches von Sauerstoff in Reaktionen dieses Typs sind
bekannt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung wird als Elektronenakzeptor eine farbige oder nicht-farbige
Verbindung verwendet, die einer Farbveränderung unterliegt oder die ein farbiges Reaktionsprodukt liefert,
und zwar als Folge einer Reduktion in Gegenwart des Enzymes und des Substrates. Derartige Verbindungen
lassen sich leicht durch einen Test ermitteln, wie er beispielsweise in dem später folgenden Beispiel 5 beschricben
wird. Nach diesem Test-Verfahren sind beispielsweise Indophenole, Kaliumferricyanid und Tetrazoliumsalze
geeignete Elektronenakzeptoren. Insbesondere hat sich gezeigt, daß 2,6-Dichlorphenolindolphenol allein
oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat und 2-(p-Indophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-nheny!-2H-tetrazoliumchlorid
entweder allein oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat vorteilhafte Elektronenakzeptoren
darstellen.
Die feststellbare Veränderung läßt sich gegebenenfalls auch durch Durchführung von potentiometrischen
Meßmethoden ermitteln, beispielsweise durch Messung des Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung einer
Sauerstoffelektrode.
Das Enzym L-a-Glycerophosphat-Oxidase kann verschiedenen Ursprungs sein. Als besonders vorteilhafte
Oxidasen haben sich solche erwiesen, die von Streptococcaceae, Lactobacillaceae und Pediococcus erhalten
werden. Eine vorteilhafte Oxidase ist weiterhin eine Oxidase von Kulturen von Streptococcus faecalis. Besonders
vorteilhafte Oxidasen sind erhältlich von den Stämmen ATCC 11 700, ATCC 19 634 sowie ATCC 12 755
dci American Type Culture Collection.
Wie später noch näher beschrieben werden wird, weist beispielsweise das Enzym von ATCC 12 755 eine Aktivität
innerhalb eines etwas breiteren pH-Bereiches auf als Enzyme von den anderen beiden Stämmen, weshalb
sich ein Enzym von ATCC 12 755 als besonders vorteilhaft erwiesen hat.
Nähere Angaben bezüglich des Enzymes sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Extraktion finden sich beispielsweise
in den folgenden Literaturstellen:
L. K, Koditschek und W. W. Umbreit »ar-Glyccrophosphate Oxidase in Streptococcus faecium, F 24«, Journal
of Bacteriology, Band 98, Nr. 3 (1969), Seiten 1063 bis 1068 und N. J. Jacobs und P. J. Van Demark, »The Purification
and Properties of the α-Glycerophosphate Oxidizing Enzyme of Streptococcus faecalis, 10 Cl.«, in Archives
of Biochemistry and Biophysics, Bd. 88, (1960), Seiten 250-255.
Werden Enzympräparate unbekannter Herkunft verwendet, so ist zu überprüfen, ob nicht Verunreinigungen
extrahiert werden müssen, welche die Bestimmungsergebnisse beeinträchtigen könnten. So kann es beispielsweise
möglich sein, daß bestimmte L-a-Glycerophosphat-Oxidase-Präparate derart hohe Konzentrationen an
Verunreinigungen enthalten, daß das rohe Präparat gereinigt werden muß, wozu übliche bekannte Fraktionierungs-
und Kolonnen-Trennmethoden angewandt werden können.
Erfolgt die Bestimmung des Glycerins in wäßrigen Lösungen, beispielsweise in Blutserum, unter Verwendung
eines Indikatorsystems, durch das die Wasserstoffperoxidkonzentration festgestellt wird, die bei der Oxidation
von L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird, so können hierzu bekannte Indikator-
ic ci/ctArnA uArurAnHpt wgrHgn
Geeignete Wasserstoffperoxid-Indikatorsysteme bestehen im allgemeinen aus einer Substanz mit peroxidativer
Aktivität, vorzugsweise einer Peroxidase und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die einer Farbbildungsreaktion
oder Farbveränderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität
unterliegt. Typische verwendbare Indikatorsysteme sind beispielsweise aus der US-PS 29 81 606 gekannt.
Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Indikatorsystemen mit Farbstoffvorläuferverbindungen
erwiesen, d. h. Verbindungen, die ein farbiges Reaktionsprodukt durch eine Kupplungsreaktion liefern.
Verwendbar sind pflanzliche Peroxidasen, Lacto-Peroxidasen, Verdo-Peroxidasen sowie auch synthetische
Peroxidasen, wie sie beispielsweise von Theorell und Maehly in der Zeitschrift Acta Chem. Scand., Band 4
(1950), Seiten 422 bis 434 beschrieben werden. Verwendbar, wenn auch nicht vorzugsweise verwendet, sind ferner
Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches
Hämatin, Hämin-Derivate und andere Substanzen mit peroxidativer Aktivität.
Farbstoffvorläuferverbindungen, die gegebenfalls unter Verwendung einer Farbkupplerverbindung zu einer
farbbildenden Reaktion in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität
geeignet sind, sind beispielsweise:
1. Monoamine, z. B. Anilin und Anilinderivate, o-Toluidin und p-Toluidin;
2. Diamine, z. B. o-Phenylendiamin, Ν,Ν'-Dimethyl-p-phenylendiamin, Ν,Ν'-Diäthylphenylendiamin, Benzidin
und Dianisidin;
3. Phenole, z. B. Phenol selbst, Thymol, ο-, m- und p-Kresole, »-Naphthol undjff-Naphthol;
4. Polyphenole, z. B. Brenzcatechin, Guaiacol, Orcin, Pyrogallol, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;
5. aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure, Pyrocatechuic-Säure sowie Gallensäuren;
6. Leucofarbstoffe, z. B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein;
7. Farbstoffe, wie beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindolphenol;
8. verschiedene biologische Substanzen, z. B. Epinphrin, Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie
Tryptophan;
9. andere Substanzen wie beispielsweise Gum guaiac, Guaiaconsäure, Kalium, Natrium- und andere wasserlösliche
Iodide sowie Bilirubin und
10. spezielle Farbstoffe, z. B. 2,2'-Azin-di(3-äthy!benzoüüazoIin-(6)-su!fonsäure) sowie 3,3'-Diamsnobenzidin.
Weitere Indikatoren oder Indikatorsysteme, die durch Peroxide in Gegenwart von Peroxidase oxidierbar sind
und die radiometrisch bestimmbare Reaktionsprodukte liefern, sind bestimmte Farbstoffe liefernde Substanzen.
So können geeignete Indikatorsysteme beispielsweise Verbindungen aufweisen, die, wenn sie in Gegenwart
von Peroxidase oxidiert werden, mit sich selbst oder mit ihrer reduzierten Form unter Bildung eines Farbstoffes
-eagieren. Derartige auto-kuppelnden Verbindungen können beispielsweise aus den verschiedensten Hydroxyverbindungen
bestehen, beispielsweise aus o-Aminophenolen, 4-Alkoxynaphtholen, 4-Amino-5-pyrazolonen,
Kresolen, Pyrogallol, Guaiacol, Orcin, Phloroglycin, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl, Gallensäuren, Pyrocate.huic-Säure,
Salicylsäure und dergleichen. Verbindungen dieses Typs sind bekannt und werden in der Literatur beispielsweise
in dem Buch von Mees und James, »The Theory of the Photographic Process«, 1969, insbesondere in
Kapitel 17, beschrieben.
Die feststellbare oder bestimmbare Veränderung kann des weiteren beispielsweise durch Oxidation eines
Leucofarbstoffes in Gegenwart von Peroxidase unter Erzeugung des entsprechenden Farbstoffes erfolgen.
Typische Leucofarbstoffe, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind beispielsweise Leucomalachitgrün und
Leucophenolphthalein. Weitere Leucofarbstoffe, die auch unter der Bezeichnung »oxichromogene Verbindungen«
bekannt sind, werden beispielsweise in der US-PS 38 80 658 beschrieben, woraus auch bekannt ist, daß
derartige Verbindungen mit entsprechenden Substituenten cfiffusionsfähig sind. Die aus der US-PS 38 80 658
bekannten nicht-stabilisierten oxichromogenen Verbindungen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise verwenden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann eine feststellbare oder bestimmbare
Veränderung durch ein Indikatorsystem herbeigeführt werden, das eine Verbindung enthält, die in Gegenwart
von Peroxidase oxidierbar ist und die zu einer oxidativen Kondensationsreaktion mit Kupplerverbindungen
befähigt ist, 7. B. solchen Farbkupplerverbindungen mit phenolischen Gruppen oder aktivierten Methylengruppen.
Typische derartige oxidierbare Verbindungen sind beispielsweise Benzidm und Benzidinhomologe, p-Phenylendiamine,
p-Aminophenole, 4-Aminoaiitipyrine und dergleichen. Derartige Kuppler sowie auto-kuppelnde
Verbindungen sind aus der Literatur bekannt und werden beispielsweise in dem bereits zitierten Buch von Mees
und James sowie in dem Buch von Kosar, »Light-Sensitive Systems«, 1965, Seiten 215 bis 248, beschrieben.
Als besonders vorteilhafter Indikator für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich 4-Methoxy-
1-naphthol erwiesen, das in oxidiertem Zustand einer Selbstkupplung unterliegt oder eine Kombination
aus 1,7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin (HCI). Im letzteren Falle kuppelt die oxidierte Pyrinverbindung
mit dem Dihydroxyi;aphthalin.
Die optimale Konzentration der Bestandteile der verschiedenen Indikatorsysteme, die sich zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden lassen, hängt zu einem großen Teil von der Konzentration des
Glycerins in der zu untersuchenden Probe ab, der Bestimmungsvorrichtung und dem erzeugten Farbstoff. Die
im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermitteln. Typische Konzentrationswerte ergeben
sich aus den später folgenden Beispielen.
Die Bestimmung des Wasserstoffperoxides kann jedoch auch auf andere Weise erfolgen. So können beispielsweise
die Enzyme und anderen Reagenzien, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich
sind, in Membranen von Sauerstoff-sensitiven poiarographischen Elektroden untergebracht werden, wie sie
beispielsweise von Rebecca L. Rawls unter der Überschrift »Electrodes Hold Promise in Biomedical Uses« in
der Zeitschrift Chemical and Engineering News, Januar 1976, Seite 19 beschrieben werden.
Anstatt das erzeugte Wasserstoffperoxid zu bestimmen, ist es des weiteren auch möglich, den Sauerstoffverbrauch
zu ermitteln, und zwar unter Verwendung einer Sauerstoff-sensitiven Elektrode, in welchem Falle die
Menge an Sauerstoff bestimmt wird, die bei der Umsetzung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor mit L-a>Glycerophosphat
verbraucht wird.
Die optimalen Konzentrationen der anderen Komponenten eines erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenz
können ebenfalls sehr verschieden sein, je nach der zu analysierenden Lösung (z. B. Blutserum, verdünnt oder
unverdünnt oder der Zusammensetzung anderer komplexer wäßriger Lösungen von Glycerin und/oder Triglyceriden.
In der folgenden Tabelle I sind allgemein verwendbare und bevorzugt verwendbare Konzentrationsbereiche
der einzelnen Komponenten erfindungsgemäß verwendbarer Bestimmungsreagenzien angegeben.
Enzym
Allgemein
anwendbarer Bereich
anwendbarer Bereich
(E/ml)
Vorzugsweise
angewandte Menge
angewandte Menge
(E/ml)
Lipase (falls verwendet) Giycerin-Kinase Glycerophosphat-Oxidase
Protease (falls verwendet) Peroxidase
Oberflächenaktive Substanz (falls verwendet)
Gegebenenfalls können jedoch auch vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten werden, wenn Enzym-Konzentratio
>v;n außerhalb der angegebenen Bereiche angewendet werden.
20-160 | 80 |
0,05-1 | 0,2 |
1-10 | 4 |
300-2400 | 1200,0 |
0,2-1,4 | 0,7 |
g/ml | g/ml |
0,01-0,05 | 0,02 |
In der Tabelle I ist eine internationale Einheit eines Enzymes definiert als die Enzymmenge, die die Umwandlung
eines Mikromoles eines Substrates in einer Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7 bewirkt.
Es ist bekannt, daß ein jedes Enzym ein pH-Aktivitäts-Profil aufweist, d. h. daß die Aktivität eines jeden Enzymes
pH-Wert-abhängig ist. Beispielsweise ergibt sich aus dem pH-Aktivitäts-Profil von L-c-Glycerophosphat-5
Oxidase eine Spitze zwischen einem pH-Wert von etwa 5 und 8.5. Aus der folgenden Tabelle II ergeben sich die
pH-Bereiche, in denen die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Enzyme besonders
aktiv sind.
pH-Wertbereich
Lipase 5-9
Glycerin-Kinase 7-9
L-e-Glycerophosphat-Oxidase 6,3-8,0
Peroxidase 6-8
Aus aer Tabelle ergibt sich, daß es vorteilhaft ist, die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien auf einen
pH-Wert zwiscbec etwa 6,0 und etwa 8,0, insbesondere zwischen etwa 7,0 und etwa 8,0 abzupuffern. Dabei können
übliche bekannte Methoden angewandt werden. Beispielsweise können entsprechende Konzentrationen an
Puffersubstanzen in den erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien gelöst, dispergiert oder in anderer
Weise verteilt werden. Andererseits können jedoch auch Puffersubstanzen in trockener Form verwendet
werden, beispielsweise dann, wenn die Bestimmungs-Reagenzien in trockener Form in Form von Mischungen
hergestellt werden.
Zur Herstellung der Bestimmungs-Reagenzien geeignete Puffersubstansen sind bekannt und werden im
Detail beispielsweise von Good in der Zeitschrift Biochemistry, 5, (1966), Seite 467 beschrieben. Besonders vorteilhafte
Puffersubstanzen sind Phosphate, beispielsweise Kaliumphosphat.
Die Konzentrationen der erzeugten Verbindungen, die zu bestimmen sind, können nach üblichen bekannten
Methoden ermittelt werden, beispielsweise durch Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte, auf spektrophotometrischem
Wege und dergleichen.
In den später folgenden Beispielen wurden die folgenden Enzympräparate und standardisierten Verfahren
angewandt:
Standard-Lösungen
Die genauen Konzentrationen von Glycerin-Standard-Lösungen wurden nach der Methode von Garland und
Rändle (Nature, 196 [1962], Seite 987 bis 988) bestimmt.
Wasserstoffperoxid-Lösungen wurden standardisiert durch Messung der optischen Absorption bei 240 nm
*°~ (A24o) und unter Verwendung von E240 = 43,6 für entsprechende Berechnungen. Die Serumproben wurden auf
ihren Triglyceridgehalt nach der halb-automatisierten fluorometrischen Methode von Kessler und Lederer
untersucht (vergl. »Fluorometric Measurement of Triglycerides, Automation in Analytical Chemistry«, Technican
Symposia, L. T. Sheggs, Jr., Ed. Medical Inc., N. Y., N. Y. 341 [1966]).
Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimmung nach der ar-GP-Oxidase-Methode
Inkubationsmischungen für die Glycerinbestimmung enthielten in einem Gesamtvolumen von 1.0 ml:
200 μ Mole Kaliumphosphat-Puffersubstanz, pH-Wert = e.O^^-Purpurogallin-EinheitenMeerrettich-Peroxidase,
2,5 μ Mole MgSO4,2,4 μ Mole ATP, 10 mg Triton X-100,96 μ^-ΑηιίηοΒη^Γβη-Ι-^ΓοοΓίΙοΓΪα,
32 μ g 1,7-Dihydroxynaphthalin (zugesetzt in Form einer 0,8%igen Lösung in Äthanol) und 4 Einheiten
a-GP-Oxidase (überschüssige Glycerin-Kinase war in dem e-GP-Oxidase-Präparat vorhanden).
Für die quantitativen Triglyceridbestimmungen enthielten die Inkubierungs-Mischungen 10 mg (8 Einheiten/mg)
Lipase von Candida rugosa zusätzlich zu den oben angegebenen Komponenten.
Sämtliche Komponenten wurden durch 5 Minuten langes Stehenlassen bei 37°C ins Gleichgewicht gebracht,
worauf die Absorption bei 490 nm (A490) ermittelt wurde.
Die Reaktionen wurden dann dadurch eingeleitet, daß entweder eine Glycerin-Standardlösung (5-100 η
Mole) oder eine Serum-Standardlösung (20 ul) zugegeben wurde, worauf die Mischung 20 bis 30 Minuten lang
stehengelassen wurde. Daraufhin wurde von neuem die Absorption bei 490 nm gemessen, und zwar diesmal der
(A490) Endwert. Abweichungen von diesem Standardsystem werden, falls notwendig, angegeben.
Berechnung der Triglycerid-Konzentrationen
Triglycerid-Glycerin-Konzentrationen von unbekannten Proben wurden in der folgenden Weise bestimmt:
Der Δ Ac0-WeM (A490-WeH [Endwert] minus A»90-Wert [Anfangswert]) der Proben, die in Gegenwart des Stan-
dard-G!ycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden, wurde abgezogen von dem Δ A490-Wert der gleichen
Proben, die in Gegenwart von Lipase M und des Standard-Glycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden.
Die Triglycerid-Konzentrationen wurden von dieser Lipase M abhängigen Absorptionsveränderung unter
Verwendung einer Eichkurve mit entweder Glycerin oder vor-analysierten Serumproben als Standardlösungen
bestimmt.
Züchtung von S. faecal is
S. faecal is-Stäm me (vergl. die Angaben in der später folgenden Tabelle III) wurden auf Schrägen mit 0,1% Glucose,
1% Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,65% K2HPO4 und 1,5% Agar gezüchtet. Wäßrige Suspensionen der Schrägen-Kolonien
(0,2 ml einer 1,0-ml-Suspension pro Kolben) wurden zur Inokulierung von Kolben verwendet, die
mit jeweils 25 ml Medium gefüllt waren. Die Kolben wurden dann 22 Stunden lang bei 300C in einem Inkubierungs-Schüttelgerät
bei 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Herstellung der zellfreien Extrakte
Geerntet wurden die Zellen von 100 ml Medium durch Zentrifugieren (4°C, 10 000 Xg, 10 Minuten). Sie *>
vden mit 40 ml eine kalten 0,05 molaren Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen,
nochmals zentrifugiert und dann in 10 ml Pufferlösung suspendiert. Die Zellen wurden dann durch Ultraschallbehandlung
in einer Rosett-Kühlzelle aufgebrochen. Die Behandlung dauerte 7 Minuten.
Die Temperatur wurde unterhalb 8°C gehalten. Die nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 Xg erhaltene
überstehende Flüssigkeit wurde als Enzymlieferant verwendet. In allen Fällen erreichte die Menge an löslichem
Protein während der angegebenen Beschallungsperiode ein Maximum. Bei Verwendung von Bovin-Serum-Albumin
als Standard wurde die Proteinkonzentration nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern bestimmt
(vergl. D. H. Lowry, N. S. Roseborough, A. L. Farr und R. J. Randall in J. Biol. Chem. 193 [1951], Seite 265).
Isolierung von a-Giycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecal is
In der folgenden Tabelle IH sind die Ergebnisse zusammengestellt, die im Falle von drei Stämmen von Streptococcus
faecalis erhalten wurden.
In jedem Faile wurden die Organismen aerob 22 Stunden lang bei 300C in einem Glucosemedium kultiviert.
Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und durch Beschallung zerstört.
Die Verstehende Flüssigkeit von einer Zentrifugierung bei 10 000 X g wurde dann als Enzymlieferant (roher
Extrakt) verwendet. Jedoch blieb die Oxidase in Lösung auch nach einer einstündigen Zentrifugierung bei
100 000 X g. In allen Fällen war die Abnahme an gelöstem Sauerstoff proportional zur Menge an rohem Extrakt
und hing ab von sowohl D,L-a-Glycerophosphat und dem Extrakt.
Wie sich aus der folgenden Tabelle III ergibt, zeigen alle drei Stämme eine Sauerstoff-gebundene Aktivität.
Das Enzym von dem Stamm ATCC 11 700 hatte ein pH-Optimum bei 5,8 und die Oxidase von dem Stamm
ATCC 19 634 zeigte ein Maximum bei einem pH-Wert von 7,0. Dieser Trend ergibt sich ebenfalls aus Tabelle III.
In analoger Weise war die Aktivität des Enzymes von dem Stamm 12 755 ähnlich zu dem Enzym von dem
Stamm ATCC 19 634.
Isolation von α-Glycerophosphat-Oxidase von drei Stämmen von Streptococcus
faecalis
Die Reaktionen wurden bei 21°C in einer 0,05molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung
bei dem angegebenen pH-Wert durchgeführt, unter Verwendung von 0.13 M
D.L-ff-Glycerophosphat als Substrat.
S. faecalis Kultur pH-Wert der Abnahme an
Fnkubations-Mischung gelöstem O2 in % ,.
ATCC 11 700 6,0 4,52
7,3 1,49
ATCC 19 634 6,1 3,94 "
7,5 6,90
ATCC 12 755 5,9 4,93
6,8 7,10
Bestimmung von ir-Glycerophosphat-Oxidase mit einer Sauerstoff-Elektrode
Die L-ar-Glycerophosphat-Oxidase wurde bestimmt durch Messung der Verminderung vom
gelösten Sauerstoff in einem Analysegerät.
Die Sauerstoff-Elektrode wurde sowohl gegenüber N2 als auch gegenüber mit Wasser gesättigter
Luft geeicht, und zwar bei konstantem Rühren mit einem N'agnetrührer. Die Inkubierungsmischungen
enthielten Puffersub:;tanz sowie D.L-a-Glycerophosphat bei einem Gesamtvolu-
men von 7,5 ml. Eine Gleichgewichtseinstellung wurde bei 21°C herbeigeführt. Die Reaktionen wurden dann
eingeleitet durch Enzymzusatz, worauf die Abnahme an gelöstem Sauerstoff aus dem linearen Teil der Kurve
ermittelt wurde.
Spektrophotometrische Bestimmung von o-Glycerophosphat-Oxidase
a-GP-Oxidase wurde mittels eines Reagenzes bestimmt, das in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml enthielt:
100 μ Mole Kaliumphosphat-Pußer, pH-Wert = 7,0,66 ^g o-Dianisidin,25 μg Meerrettich-Peroxidase (4,6 PurpurogaUin-Einheiten)
und 200 μ Mole D,L-e-Glycerophosphat (bei einem pH-Wert von 7,0).
ίο Eine Gleichgewichtseinstellung des Reagenzes erfolgte bei 37°C. Die Reaktionen wurden durch Zusatz gleicher Enzymmengen eingeleitet. Die Aktivität wurde aus der anfangs linearen Neigung der Reaktionsspur bei 430 cm mit ε = 1,08 x 104 berechnet
ίο Eine Gleichgewichtseinstellung des Reagenzes erfolgte bei 37°C. Die Reaktionen wurden durch Zusatz gleicher Enzymmengen eingeleitet. Die Aktivität wurde aus der anfangs linearen Neigung der Reaktionsspur bei 430 cm mit ε = 1,08 x 104 berechnet
Eigenschaften der o-Glycerophosphat-Oxidase in rohen Extrakten
Ein pH-Aktivitäts-Profil von a-Glycerophosphat-Oxidase des Stammes 12 755 ist in Fig. 1 dargestellt. Eine
optimale Aktivität wurde innerhalb des breiten pH-Wertsbereiches von 63 bis 74 beobachtet. Unterhalb eines
pH-Wertes voaS.O und oberhalb eines pH-Wertes von 8.0 nahm die Aktivität rasch ab. Aus F i g. 1 ergibt sich des
weiteren die offensichtliche Inhibierung des Enzyms durch entweder Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid)
(A-A) oderGlycin-KOH (X) Puffer. Bei einem pH-Wert von 7,7 war die Aktivität in einerO.lmolaren
Kaliumphosphatpufferlösung 4mal so groß als die Aktivität, die im Falle einer 0,1 molaren Glycin-KOH-Lösung
beobachtet wurde. Erfolgte die Inkubation jedoch in Gegenwart von sowohl einer 0,lmolaren
Glycin-KOH-Lösung wie auch in Gegenwart einer 0,07molaren Kaliumphosphatpufferlösung bei einem pH-Wert
von 7,7, so ergaben sich 82'A der ursprünglichen Aktivität (in Gegenwar» einer O.lmolaren Kaliumphosphatpufferlösung).
Hieraus ergibt sich, daß Tris-HCl und Glycin-KOH keine Inhibitoren sind, sondern daß vielmehr
eine Kaliumphosp'uatpufferlösung das Enzym aktiviert. Auch muß eine Natriumacetatpufferlösung das
Enzym stimulieren (F i g. 1), da bei einem pH-Wert von 6,5 die Aktivität in der Natriumacetatpufferlösung mindestens
90% der Aktivität betrug, die im Falle einer Kaliumphosphatpufferiösung zu beobachten war.
L-ff-Glycerophosphat-Oxidase-Reinigung
Untersuchungen des ff-Glycerc^hosphat-Oxidase-Glycerin-Bestimmungssystems zeigten, daß das rohe a-Glycerophosphat
(o-GP)-Oxidase-Präparat Verunreinigungen enthielt. Einige dieser Verunreinigungen verhinderten
die Verwendung des rohen Enzymes bei Serumuntersuchungen, da im Serum ganz offensichtlich Substrate
für diese Enzyme in Konzentrationen vorhanden waren, die vergleichbar waren mit den normalen Triglycerid-Konzentrationen.
Bestimmte dieser Verunreinigungen wirkten des weiteren auf im Semm vorhandene
Substrate unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid, wodurch das bevorzugte Bestimmungsverfahren gestört
wurde.
Die Ergebnisse der Reinigung unter Anwendung von Protein-Fraktionierungsverfahren sind in der folgenden
Tabelle IV zusammengestellt.
Reinigung von e-Glycerophosphat-Oxidase von S. Faecalis ATCC 12 755
*) 1 Einheit entspricht der Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 uMol Substrat in I uMol Produkt in I Minute
bei 37°C zu überführen.
60
Stabilität von a-Glycerophosphat-Oxidase
Die Enzym-Lösung erwies sich mindestens 4 Monate lang als stabil, wenn sie bei -200C aufbewahrt wurde.
Wiederholtes Einfrieren und Auftauen denaturierte das Enzym nicht. Auch wurde das Enzym nicht durch
Octylphenoxypolyethoxyethanol inhibiert, und zwar selbst nicht bei Konzentrationen der oberflächenaktiven
Substanz von 2%.
Verfahren | Gesamt- | Gesamt- | Einheiten | Reinigung | Aus |
Einheiten*) | Protein | ff-GP OX | beute | ||
ar-GP OX | mg | mg Protein | |||
Roher Zeil-freier Extrakt | 6300 | 9850 | 0,64 | 1 | 100 |
Protamin · SO4-Fraktionierung (0,05%) | 6280 | 9540 | 0,66 | 1,03 | 100 |
Ammonium · SO4-Fraktionierung | 5590 | 4700 | 1,2 | 1,9 | 89 |
(50 bis 80%) | |||||
DEAE-Cellulose-Fraktionierung | 3600 | 1007 | 3,6 | 5,6 | 57 |
Dialyse und Konzentration | 4250 | 1007 | 4,22 | 6,6 | 68 |
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindun· iäher veranschaulichen,
Beispiel 1
Eich-Kurve fur Glycerin und Wasserstoffperoxid
Eich-Kurve fur Glycerin und Wasserstoffperoxid
Eine Glycerin-Ansprech-Kurve ist in Fig. 2 dargestellt.
Zunächst wurden Mischungen, wie oben unter der Überschrift »Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimmung
nach der α-GP-Oxidase-Methode« beschrieben hergestellt.
Dann wurden Reaktionen durch Substratzusatz eingeleitet, die nach 15 Minuten bei 37°C im wesentlichen
beendet waren. Es wurde eine gute Beziehung zwischen den Glycerin-Konzentrationen (·) und der Farbstoffbildung
(X) für die gekoppelten Reaktionen ?, 3 und 4 festgestellt.
15 Quantitative Bestimmung eines Triglycerid-Substrates
Eine Triglycerid-Emulsion wurde dadurch hergestellt, daß eine Mischung von Olivenöl (3,ιί ,iMole/ml) in
0,4%igem Octylphenoxypolyethoxyethanol r.\ einem Eisbade 10 Minuten lang einer Behandlung mit Ultraschallwellen
ausgesetzt wurde.
Eine quantitative Bestimmung des Triglycerid-Substrates durch die gekoppelten Reaktionen 1, 2, 3 und 4
wurde mit der quantitativen Bestimmungsmethode von Garland und Rändle verglichen. Es wurden ausreichende
Mengen an Lipase von Candida rugosa zugesetzt, um die Hydrolyse des Triglycerides rasch (weniger als
1 Minute) und vollständig zu katalysieren. Das Triglycerid-Glycerin wurde bestimmt durch einen Vergleich des
A A4J0-WeHeS nach einer 30mitiütigen Inkubation mit der Glycerin-Konzentration-Ansprechkurve, ähnlich is
F i g. 2. Die in Tabelle V dargestellten Werte zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden.
Die Triglyceridwerte. die nach der ar-Glycerophosphat-Oxidase-Methode ermittelt wurden, lagen in allen Fällen
etwa höher, jedoch war der Unterschied lediglich im Falle der Probe 2 größer als 10%.
Quantitative Bestimmung von Serum-Triglyceriden nach der a-Glycerophosphat-Oxidase-Methode
Unter Verwendung des bevorzugt verwendeten Puffersystems, d. h. eines 0,2molaren Kaliumphosphatpuffers
bei einem yH-Wert von 8,0 wurden 10 Serum-Proben auf ihren Triglycerid-Glyceringehalt bei Konzentrationen
von 0,50 bis 6,50 mM untersucht.
Die Vergleichsmischungen enthielten lediglich die Standard-Komponenten für die Glycerin-Bestimmung;
die Probenmischungen enthielten Lipase von Candida rugosa sowie die Standa'rikomponenten für die Glycerin-Bestimmung.
Die Gleichgewichtseinstellung sämtlicher Mischungen erfolgte durch 5 M'nuten langes Erwärmen auf 37°C,
worauf die Ausgangs-A49o-Werte ermittelt wurden. 5;
Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 20 μΐ einer jeden Serumprobe eingeleitet, wonach nach einer Inkubationsdauer
von 20 Minuten die endgültigen A490-WeHe ermittelt wurden.
Die Triglycerid-Glycerinkonzentrationen wurden unter Verwendung einer wäßrigen Glycerin-Ekhkurve, wie
in F i g. 2 dargestellt, ermittelt, nachdem die Δ A490-WeHe der Vergleichsproben von den Δ A490-Werten der Proben
abgezogen worden waren. In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen unter
Einbeziehung der Methode von Kessler und Lederer (vergl. »Fluorometric Measurement of Triglycerides«,
Automation in Analytical Chemistry, Technicon Symposia, L. T. Skeggs, Jr. Editor, Mediad, Inc., New York,
New York, 341 [ 1966]) angegeben. Wie sich aus den Date, ι ergibt, besteht eine gute Übereinstimmung zwischen
den beiden Methoden.
Tabelle V Triglycerid-Konzentration |
Methode nach
Garland und Rändle |
a-G Iy cerophosp hat-
Oxidase-Methode |
Probe | 18,4 36,8 73,6 110,0 |
19,0 42,0 78,0 114,0 |
1 2 3 4 |
||
Vergleich der quantitativen Serum-Triglyceridbestimmung unter Verwendung des σ-Glycerophosphat-Oxidascsystems
mit einer halbautomatischen chemischen Methode
Proben-Nr.
Triglycerid-Konzentration Vergleichs-Methode
mM
mg/dl
<r-Glycerophosphat-Oxidase- | mg/dl |
Methode | 550,80 |
mM | 416,50 |
6,48 | 337,45 |
4,90 | 314,50 |
3,97 | 161,50 |
3,70 | 93,50 |
1,90 | 42,50 |
1,10 | 53.55 |
0,50 | 114,75 |
0,63 | 80,75 |
1,35 | |
0,95 | |
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2
3
4
5
6
7
8
9
10
6,59
4,82
3,76
3,30
2,00
1,71
1,06
0,59
1,25
1,00
4,82
3,76
3,30
2,00
1,71
1,06
0,59
1,25
1,00
560,15
409,70
319,60
280,50
170,00
145,35
90,10
50,15
106,25
85,00
Die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch wiederholte Bestimmung von zwei verschiedenen
Serumproben getestet. Eine Serumprobe enthielt eine normale Triglycerin-Konzentration und die
andere Serumprobe eine hohe Triglycerid-Konzentration. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle VlI zusammengestellt. Im Falle der normalen Probe wurde ein Abweichungs-Koeffizient von 5,1%
bestimmt und im Falle der abnormalen Probe ein entsprechender Koeffizient von 2,6%.
Reproduzierbarkeit des ar-GP-Oxidase-Systems für die
quantitative Triglyceridbestimmung
Triglycerid-Konzentration (mM)
quantitative Triglyceridbestimmung
Triglycerid-Konzentration (mM)
Normaler Serumspiegel | Hoher Serumspiegel |
1,60 | 4,90 |
1,66 | 4,82 |
1.61 | 4,80 |
1,42 | 5,25 |
1,62 | 4,72 |
1,55 | 5,00 |
1.54 | 4,78 |
1,70 | 4,92 |
1,66 | 4,96 |
1,54 | 4,83 |
4,91 | |
4,79 | |
4,90 | |
4,80 | |
Mittelwert = 1,59 | 4,89 |
S.D. =±0,081 | 0,13 |
COV = 5,10 | 2,60 |
Beispiel 5
Verwendung anderer Elektronenakzeptoren
Verwendung anderer Elektronenakzeptoren
Dies Beispiel veranschaulicht, daß außer Sauerstoff auch andere Elektronenakzeptoren verwendet werden
können. Zu diesem Zweck wurden Reaktionsmischungen mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:
12
0,1 M Kaliumphosphat-PufTer für die Einstellung eines pH-Wertes von 7; ί
0,2 M D.L-a-Glycerophosphat; j
Elcktronenakzeptor, wie in der folgenden Tabelle VIII angegeben. ■'"!
In jedem Falle erfolgte eine Gleichgewichtseinstellung der Mischung bei 37°C, worauf die Reaktion durch 5 ;i
Enzyinzusatz eingeleitet wurde. Die Aktivität des verwendeten Enzymes wurde in der beschriebenen Weise i
berechnet, unter Verwendung von E60J-, = 16 x 103 Tür 2,6-Dichlorphenolindolphenol, E400 = 1 x 10'1 für -i
K,Fe(CN6) und E50, = 18,5 x \Q3 für '.-(p-IndophenylKMp-nitrophenyD-S-phenyl^M-tetrazoliumchlorid j
(INT). (j
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengestellt. ic if
Tabelle VIII Ί
Verwendung anderer Elektronenakzeptoren für die a-GP-Oxidase-Reaktion '
uMüic üxiüicrics Relative
a-GP/Min./mg Geschwindigkeit*)
80 | 1 |
4 | 0,05 |
70 | 0,88 |
21 | 0,26 |
35 | 0,44 |
0,8 | 0,01 |
12 | 0,15 |
Sauerstoff ου ι 2α>
2,6-Dichlorphenolindolphenol (70 um) 2,6-Dichlorphenolindolphenol (70 um)
Phenazinmethosulfat (60 um) K3Fe(CN)6 (1 mM)
K1Fe(CN)6 (1 mM) Phenazinmethosulfat (60 um)
INT**)(0,16mM) w,o u,w. 30
INT (0,16 mM)
Phenazinmethosulfat (60 ,um)
Phenazinmethosulfat (60 ,um)
*) Verglichen mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
*·) INT = 2-(p-Indophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid. 35
*·) INT = 2-(p-Indophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid. 35
Die Erfindung ermöglicht die quantitative Bestimmung eines jeden Reagenzes und Enzymes, das in dem
erfindungsgemäßen Reagenz-System verwendet wird. So läßt sich beispielsweise ATP mit einem Bestimmungs-Reagenz
bestimmen, das sämtliche Reagenzien außer ATP enthält, das mit der zu analysierenden Probe züge- -to
führt wird. In entsprechender Weise lassen sich Glycerin-Kinase, Lipase und e-Glycerophosphat bestimmen,
indem entsprechende Bestimmungsreagenzien verwendet werden, die alle Komponenten enthalten, außer den
zu bestimmenden Komponenten.
Die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien können des weiteren in vorteilhafter Weise in eine Matrix
aus einem absorbierenden Material bekannten Aufbaues eingearbeitet werden, beispielsweise durch Imprä- 45
gnieren der Matrix.
Auf diese Weise lassen sich Testmaterialien und Testelemente hersteilen, die sich für die qualitative oder halbquantitative Bestimmung von Glycerin und/oder Trigiyceriden eignen. Die Bestimmungs-Reagenzien können
des weiteren zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden, die beispielsweise aus einem Schichtträger
und verschiedenen hierauf aufgebrachten Schichten, beispielsweise einer Ausbreitschicht, und einer Rea- 50
genzschicht bestehen können. Dies bedeutet, daß die Bestimmungs-Reagenzien der Erfindung beispielsweise
zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden können, wie sie im Aufbau beispielsweise aus den folgenden
US-PS bekannt sind:
30 92 465,34 18 099,34 18 083,28 93 843,28 93 844,29 12 309,30 08 879,38 02 842,37 98 064,32 98 739, 55
39 15 647, 39 17 453, 39 33 596 und 39 36 357.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
1 60
1 60
13
Claims (4)
1. Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen
Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls
vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert, das freie und/oder durch
Hydrolyse freigesetzte Glycerin in L-a^Glycerophosphat überführt und unter Erzeugung einer feststellbaren
Veränderung weiter umsetzt, dadurch gekennzeichnet, daß mandasL-a-^jlycerophosphat in Gegenwart
von ff-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung oxidiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das L-c-GIycerophosphat in Gegenwart
von a^Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert, das mit einer Substanz
mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagiert.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man L-a-Glycerophosphat-Oxidase
von Streptococcus faecalis verwendet.
4. Bestimmungs-Reagenz für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3, enthaltend
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71579776A | 1976-08-19 | 1976-08-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2737288A1 DE2737288A1 (de) | 1978-02-23 |
DE2737288C2 true DE2737288C2 (de) | 1985-05-02 |
Family
ID=24875522
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19772737288 Expired DE2737288C2 (de) | 1976-08-19 | 1977-08-18 | Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
JP (3) | JPS6012040B2 (de) |
CA (1) | CA1100023A (de) |
DE (1) | DE2737288C2 (de) |
FR (1) | FR2362395A1 (de) |
GB (1) | GB1590736A (de) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5545616B2 (de) * | 1973-05-26 | 1980-11-19 | ||
US4338395A (en) * | 1980-07-21 | 1982-07-06 | Technicon Instruments Corporation | Method for the analysis of triglycerides |
JPS5783287A (en) * | 1980-11-14 | 1982-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Elimination of hydrogen peroxide |
JPS5794656A (en) * | 1980-12-04 | 1982-06-12 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | Element for analysis |
JPS5794653A (en) * | 1980-12-04 | 1982-06-12 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | Element for analysis |
JPS60126084A (ja) * | 1983-12-13 | 1985-07-05 | Toyo Jozo Co Ltd | グリセロリン酸オキシダーゼの安定化法 |
JP2562882B2 (ja) * | 1986-12-02 | 1996-12-11 | 株式会社シノテスト | 生体成分測定用試薬の安定化法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2000127C3 (de) * | 1970-01-02 | 1974-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und Monoglyceriden |
US3703591A (en) * | 1970-12-16 | 1972-11-21 | Calbiochem | Triglyceride hydrolysis and assay |
CH548029A (de) * | 1971-03-30 | 1974-04-11 | Hoffmann La Roche | Mittel zum glucosenachweis. |
JPS4950990A (de) * | 1972-09-13 | 1974-05-17 | ||
DE2315501C3 (de) * | 1973-03-28 | 1980-02-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin |
DK678474A (de) * | 1974-02-15 | 1975-10-13 | Hoffmann La Roche | |
US3884764A (en) * | 1974-03-25 | 1975-05-20 | Eastman Kodak Co | Method and composition for blood serum cholesterol analysis |
-
1977
- 1977-07-08 CA CA282,354A patent/CA1100023A/en not_active Expired
- 1977-08-18 DE DE19772737288 patent/DE2737288C2/de not_active Expired
- 1977-08-19 GB GB3497477A patent/GB1590736A/en not_active Expired
- 1977-08-19 FR FR7725353A patent/FR2362395A1/fr active Granted
- 1977-08-19 JP JP9941877A patent/JPS6012040B2/ja not_active Expired
-
1981
- 1981-05-13 JP JP7213081A patent/JPS5726600A/ja active Granted
-
1986
- 1986-01-24 JP JP1227086A patent/JPH0246200B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2362395B1 (de) | 1984-02-24 |
JPS5324892A (en) | 1978-03-08 |
JPH0131880B2 (de) | 1989-06-28 |
JPS5726600A (en) | 1982-02-12 |
CA1100023A (en) | 1981-04-28 |
JPS61293397A (ja) | 1986-12-24 |
GB1590736A (en) | 1981-06-10 |
JPH0246200B2 (ja) | 1990-10-15 |
FR2362395A1 (fr) | 1978-03-17 |
JPS6012040B2 (ja) | 1985-03-29 |
DE2737288A1 (de) | 1978-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2512585C3 (de) | Verfahren, Testlösung und analytisches Element für die Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen | |
DE2409696C2 (de) | Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Cholesterin | |
DE69603472T2 (de) | Bestimmung von glykierten proteinen | |
EP0354441B1 (de) | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation | |
US4241178A (en) | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides | |
DE3239236A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von physiologischen komponenten in biologischen fluessigkeiten oder gasen | |
DE2954385C2 (de) | ||
DE3436005C2 (de) | Neue Bilirubinoxidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Reagenszubereitung | |
DE2737288C2 (de) | Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat | |
DE2633728C3 (de) | NADH-Peroxidase, ihre Gewinnung und Verwendung | |
DE2512586C3 (de) | Mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten | |
DE2237940A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von harnsaeure | |
DE3125667C2 (de) | Verfahren und Mittel zum Nachweis von Wasserstoffperoxid | |
DE1498901C3 (de) | Diagnostisches Mittel und Ver fahren zum Nachweis bzw zur Be Stimmung von Harnsaure im Blut | |
DE69026611T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Fruktosaminen | |
EP0117550A2 (de) | Pyruvatoxidase | |
EP0048347B1 (de) | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin | |
DE2737286C2 (de) | Mehrschichtige analytische Elemente für die Bestimmung von Triglyceriden und Glycerin in Flüssigkeiten | |
DE69433003T2 (de) | Assayverfahren für biologische Komponenten | |
DE3781008T2 (de) | Verfahren zur messung von wasserstoffperoxid oder zur messung eines peroxidfreimachenden enzyms oder biochemischen substrats. | |
DE2804356C2 (de) | Verfahren zur Hydrolyse von proteingebundenen Cholesterinestern | |
EP0089606B1 (de) | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Glycerin | |
DE3246090C2 (de) | ||
DE3301655A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von ungesaettigten fettsaeuren | |
DE3242652A1 (de) | Verfahren zur quantitativen bestimmung von phosphatidyl-glycerin |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification | ||
8126 | Change of the secondary classification | ||
8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: BRANDES, J., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT., PAT.-ANW., 8 |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: JOHNSON & JOHNSON CLINICAL DIAGNOSTICS, INC., ROCH |
|
8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: STREHL, SCHUEBEL-HOPF, GROENING & PARTNER, 80538 MUENCHEN |