DE2000127C3 - Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und Monoglyceriden - Google Patents
Verfahren zur quantitativen Spaltung und zum quantitativen Nachweis von Tri-, Di- und MonoglyceridenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen, enzymatischen Spaltung von lipoproteingebundenen
Tri-, Di- und Monoglyceriden gegebenenfalls zusammen mit proteinfreien Neutralfetten sowie ein Verfahren zum quantitativen Nachweis
von Triglyzeriden, die an Lipoproteine gebunden vorliegen und/oder proteinfreien Neutralfetten in
Lösungen, insbesondere in Körperflüssigkeiten, durch Spaltung der Fette und enzymatische Bestimmung des
als Spaltprodukt gewonnenen Glyzerins.
Sowohl bei der Erforschung der Arteriosklerose als auch bei klinischen und pharmakologischen Routineuntersuchungen
spielt die quantitative Bestimmung der Triglyceride, insbesondere derjenigen, welche an
I ipoproteine gebunden sind, eine immer bedeutendere
Rolle.
Die seit längerer Zeit bekannten Verfahren weisen arbeitstechnisch verschiedene Nachteile auf und besitzen
darüber hinaus oft nur eine geringe Spezifität und Analysengenauigkeit. Die enzymatische Bestimmung
der Triglyceride hat sich daher auf Grund ihrer ausgeprägten Spezifität und Treffsicherheit in
letzter Zeit ganz allgemein durchgesetzt; vgl. Klinische Wochenschrift40, S. 362(1962) und KlinischeChemie6,
S. 156 bis 159(1968).
Bei den bisher gebräuchlichen Verfahren werden die Fette zunächst mit einer starken Base, z. B. mit
alkoholischer Kalilauge in die Salze der Fettsäuren und in Glycerin gespalten, worauf das in der Flüssigkeit
enthaltene Glycerin nach Abtrennung der Fettsäurenanteile (beispielsweise durch Fällung und anschließendes
Zentrifugieren) in bekannter Weise enzymatisch in Pyruvat übergeführt wird. Die dem ursprünglichen
Glyceringehalt äquivalente Pyruvatmenge wird schließlich durch NADH (reduzierte Form des
Nicolinamid-adenindinucleotids oder Diphosphopyridin-nueteotids)
mittels Lactatdehydrogenase in Milchsäure übergeführt, wobei die photometrisch meßbare
Abnahme des NADH ein direktes Maß für den GIy* cerincehalt darstellt.
Die Verseifung der Fette stellt trotz des sonstigen wesentlichen Fortschritts in der Methodik immer noch
einen zeitraubenden und aufwendigen Arbeitsvorgang dar, da diese quantitativ nur durch eine halbstündige
Einwirkung von äthanolischer Kalilauge in der Wärme erreicht werden kann; außerdem ist es notwendig, die
entstandenen fettsäuren Kalisalze in einem zusätzlichen Schritt mittels Magnesiumsulfat als Magnesiumsalze
zu fällen und den entstandenen Niederschlag beispiclsweise durch Abzentrifugieren zu entfernen. Versuche,
auch den ersten Schritt der Fettspaltung enzymatisch durchzuführen, scheiterten bisher im wesentlichen
aus drei Gründen:
1. Lipoproteingebundene Triglyceride lassen sich zwar durch Lipoproteidlipasen spab^n. Diese
können jedoch nur aus menschlichem oder tierischem Gewebe gewonnen werden, sind wenig
stabil und besitzen einen so hohen Proteingehalt,
ao daß die photometrische NADH-Bestimmung gestört wird. Zudem erfolgt die Spaltung auch bei
langen Inkubationszeiten unvollständig.
2. Emulgierte Neutralfette werden durch Lipasen, welche aus dem Pankreas stammen, stufenweise
as über die Di- und Monoglyceride zu freien Fettsäuren
und Glycerin gespalten, wobei teilweise die Spaltung nur zu Monoglyceriden führt. Die
enzymatische Bestimmungsmethode läßt sich aber nur durchführen, wenn die Spaltung quantitativ
bis zur Stufe des freien Glycerins erfolgt. Mit sehr großen Enzymmengen und langen Inkubationszeiten,
welche die vollständige Spaltung bisweilen bewirken können, läßt sich eine quantitative
Bestimmung aus praktischen Gründen nicht durchführen.
3. Einfache proteinfreie Triglyceride werden durch eine Reihe von »körperfremden«, aus Pflanzen
oder Fungi gewonnenen Lipasen gespalten. Die Spaltung von Lipoproteiden, d. h. eiweißgebundenen
Fetten erfolgt, wenn überhaupt, nur unvollständig oder erfordert so große Enzymmengen
(mehr als 5 mg in etwa 2 ml Lösung), daß ein optischer Nachweis wegen der durch das Reagenz
hervorgerufenen Trübung nicht mehr durchgeführt werden kann.
Es wurde nun überraschenderweist gefunden, daß die in Comptes Rendus Acad. Sc. Paris 259 (1964),
S. 4394 bis 4396, beschriebene Lipase aus Rhizopus arrhizus imstande ist, lipoproteingebundene Triglyceride
neben den in Chylomikronen enthaltenen Triglyceriden mit außerordentlich hoher Umsatzzahl
quantitativ in freie Fettsäuren und Glycerin zu spalten, ohne daß die nachfolgende optische NADH-Bestimmung
im UV-Licht beeinträchtigt wird. Dieses Ergebnis ist um so erstaunlicher, als bisher von keiner
»körperfremden« Lipase eine ausreichende Aktivität gegenüber lipoproteingebundenen Triglyceriden bekannt
war; noch viel weniger lag naturgemäß der Einsatz für die quantitative Bestimmung von derartigen
Substanzen nahe.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen enzymatischen Spaltung von lipoproteingebundenen
Tri-, Di- und Monoglyceriden, gegebenenfalls zusammen mit proteinfreien Neutralfetten, ist demnach
dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine aus Rhizopus arrhizus gewonnene Lipase verwendet.
Dementsprechend ist das erfindungsgcmäße Vcr-
Dementsprechend ist das erfindungsgcmäße Vcr-
L·
fahren zum quantitativen Nachweis von Triglyceriden,
die an Lipoproteine gebunden vorliegen, und/oder proteinfreien Neutralfetten in Lösungen, insbesondere
Körperflüssigkeiten durch Spaltung der Fette und enzymatische Bestimmung des als Spaltprodukt gewonnenen
Glycerins dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipoproteide und proteinfreien Neutralfette mittels
einer aus Rhizopus arrhizus gewonnenen Lipase spaltet.
Erfindungsgemäß ist es nunmehr möglich, die Bestimmung von proteinfreien Neutralfetten und protein-
>o gebundenen Triglyceriden ohne vorhergehende Alkaliverseifung
in der Wärme und Aufarbeitung der Probe vollenzymatisch und ohne Einbuße an Genauigkeit
durchzuführen. Außer der Vermeidung der unangenehm zu handhabenden stark ätzenden Alkalien bedeutet
die erfindungsgemäße Durchführung vor allem einen beträchtlichen Zeitgewinn.
Die enzymatische Fettverseifung bietet außerdem den νοΠεϊζ die benötigte Serummenge gegenüber der
herkömmlichen Methode erheblich, nämlich auf V20 des Volumens, verringern zu können. Dies ist vor allem
bei Reihenuntersuchungen kleiner Labortiere, wie z. B. weißer Mäuse und Ratten, von Bedeutung.
Die erfindungsgemäß verwendete hochgereinigte Lipase aus Rhizopus arrhizui (Var. Delemar) weist
gegenüber Olivenöl bei den pH-Optima 3,5 und 7,0 Aktivitäten zwischen 3500 bis 8000 U/mg auf. Die
Reinheit der Rhizopus-Lipase wurde elektrophoretisch geprüft.
10 μΐ menschlichen Serumf werden nacheinander
mit den folgenden Reagenzien versetzt:
1,5 ml Triäthanolamin-Puffer (O.lmolar) eingestellt auf pH 7,6, enthaltend NADH
(0,12 mMol) und Magnesiumsulfat (0,74 mMol),
0,1 ml Phosphoenolpyruvat-Na (4,8 mMol) und
Adenosintriphosphat (1,3 mMol) gelöst in Triäthanolamin-Puffer (0,lmolar) einge- *"
stellt auf pH 7,6,
0,02 ml Lipase aus Rhizopus arrhizus (4 mg/ml) (3500 E/mg = 14 000 E/ml),
0,005 ml Lactatdehydrogenase (900 E/ml)/Pyruvatkinase (150 E/ml).
Die so hergestellte Lösung wird nach 5 Minuten in eine Küvette gegeben und die Extinktion bei 366 nm bestimmt
(E1). Durch die Zugabe von 0,005 ml Glycerokinase
(85 E/ml) wird die Enzymreaktion, welche so letztlich über Pyruvat unter NADH-Abnahme zum
NAD führt, in Gang gesetzt. Nach weiteren 10 Minuten wird der zweite Extinktionswert abgelesen (E2). Aus'
der Extinktionsdifferenz /IE — E1 — E2 ergibt sich
der Triglyceridgehalt nach folgender Formel:
JE '^224 - mg% Triglyceride.
Nach dem in Beispiel 1 aufgeführten Verfahren wurden 37 Einzelbestimmungen menschlichen Serums
einmal nach der konventionellen Methode (Verseifung der Feite mit alkoholischer Kalilauge) und dann erfindungsgemäß
mit dem aus Rhizopus arrhizus gewonnenen Enzym durchgeführt.
Aus den Ergebnissen ergab sich ein Korrelationskoeffizient von
r = 0,998.
Die Einzelergebnisse sind in der Tabelle wiedergegeben.
Triglyceridgehalt menschlicher Serumrireben in mg%
45
| A. Nach Verseifung mit alkoholischer Kalilauge |
B. Nach Fettspaltung mil Lipase aus Rhizopus arrhizus |
| 417 | 416 |
| 160 | 145 |
| 445 | 430 |
| 472 | 460 |
| 135 | 110 |
| 60» | 621 |
| 1798 | 1925 |
| 1843 | 1710 |
| 108 | 105 |
| 124 | 133 |
| 350 | 305 |
| 492 | 445 |
| 1063 | 1020 |
| 126 | 149 |
| 160 | 154 |
| 400 | 372 |
| 129 | 132 |
| 72 | 74 |
| 268 | 250 |
| 72 | 74 |
| 177 | 167 |
| 375 | 355 |
| 167 | 149 |
| 65 | 57 |
| 154 | 145 |
| 189 | 189 |
| 232 | 215 |
| 63 | 65 |
| 165 | 159 |
| 110 | 116 |
| 365 | 362 |
| 214 | 198 |
| 462 | 456 |
| 90 | 89 |
| 438 | 410 |
| 194 | 188 |
| 70 | 72 |
Claims (2)
- Patentansprüche:X, Verfahren zur quantitativen, enzymatischen Spaltung von lipoproteingebundenen Tri-, Di- und Monoglyceriden gegebenenfalls zusammen mit proteinfreien Neutralfetten, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym eine aus Rhizopus arrhizus gewonnene Lipase verwendet.
- 2. Verfahren zum quantitativen Nachweis von Triglyceriden, die an Lipoproteine gebunden vorliegen und/oder proteinfreien Neutralfetten in Lösungen, insbesondere in Körperflüssigkeiten, durch Spaltung der Fette und enzymatische Bestimmung des als Spaltprodukt gewonnenen Glycerins, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipoproteide und proteinfreien Neutralfette mittels einer aus Rhizopus arrhizus gewonnenen Lipase spaltet.
Priority Applications (15)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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