DE3886204T2

DE3886204T2 - Lyophilisat einer wässrigen Lösung von Triglyzeridsubstrat zur Bestimmung von Lipase.

Info

Publication number: DE3886204T2
Application number: DE88112272T
Authority: DE
Inventors: Iyoko Miki; Hisashi Ochi; Hiroyuki Tsubota; Toshio Tsuchiko
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2008-07-30
Also published as: AU611184B2; EP0337005A1; US5328832A; JP2711332B2; KR890016384A; JPH02243617A; DE3886204D1; KR960001502B1; AU2013988A; EP0337005B1; CA1338589C; US5082769A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Technischer Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lyophilisat einer transparenten und stabilen wäßrigen Lösung eines Triglyceridsubstrats zur Bestimmung der Lipase, ein Verfahren zur Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe unter Anwendung der wäßrigen Lösung und ein Verfahren zur Herstellung des Lyophilisats.

2. Beschreibung des einschlägigen Stands der Technik

Das Enzym Lipase ist in der Natur weit verbreitet, beispielsweise in Tieren oder Pflanzen, und seine Aktivität wird zu verschiedenartigen Zwecken bestimmt, d.h. aus klinischer Sicht ist es beispielsweise zur Früherkennung von Pankreas- Krankheiten, beispielsweise akuter Pankreatitis und Pankreaskrebs wichtig.
Verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Lipase sind bekannt, jedoch sind die beiden folgenden Verfahren, die im klinischen Bereich am meisten angewendetsten:

1. Nephelometrie

Dieses Verfahren umfaßt die Durchführung einer enzymatischen Reaktion in einer Suspension eines Triglycerids (typischerweise Olivenöl) oder eines Glycerolesters einer höheren Fettsäure als Substrat und anschließendes Messen der Verringerung der Trübung der Suspension auf der Grundlage ihrer Absorption.
Dieses Verfahren hat jedoch die folgenden Nachteile:
a) Die Lipaseaktivität stimmt nicht immer mit der Trübungsverringerung überein. In emulgierten Proben zeigen einige Proben beispielsweise eine erhöhte Absorption.
b) Die Lipaseaktivität wird aus der Messung der Trübungsverringerung berechnet. Dies ist eine indirekte Bestimmung der enzymatischen Aktivität.
c) Wenn die Lipase-Aktivität gering ist, sind Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit gering.

2. Verfahren unter Verwendung eines von Triglycerid verschiedenen, synthetisierten Substrats.

In diesem Verfahren werden Ester von Fettsäure-Derivaten oder Alkohol-Derivaten beispielweise Monoglycerid, 1,2-Diglycerid, p-Nitrophenollaurat, Dimethylcaproltributyrat, α-Naphthylpalmitat und ähnliche als Substrat verwendet. Wenn das synthetische Substrat in Wasser jedoch unlöslich ist, trifft dieses Verfahren nicht nur auf die oben unter 1. erwähnten Nachteile sondern auch auf das Problem der geringen Substratspezifität derart, daß das synthetische Substrat durch von Lipase verschiedene Esterasen hydrolisiert werden kann. Obwohl ein wasserlösliches Substrat diese unter 1. genannten Nachteile heilen kann, besitzt dieses Verfahren noch das Problem der Substratspezifität derart, daß das Substrat durch von Lipase verschiedene Esterasen hydrolisiert werden kann.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung verschiedene Forschungsprojekte durchgeführt, um ein Verfahren zur Bestimmung von Lipase zu entwickeln, welches die folgenden Punkte in Rechnung zieht:
a) Weil Lipase ein Enzym zur Hydrolyse eines Triglycerids mit einer langkettigen Fettsäure ist, wird Triglycerid als Substrat verwendet.
b) Anstelle der Messung der Verringerung der Trübung (Substrat) wird die bei der Hydrolyse des Triglycerids mit Lipase gebildete Feffsäure, Monoglycerid oder Glycerol direkt gemessen.
c) Das Verfahren ist einfach und kann für eine klinische Untersuchung angewendet werden.
Die japanische geprüfte Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 59-39168 (Japanisches Patent Nr. 1271605) offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer transparenten solubilisierten wäßrigen Lösung eines wasserunlöslichen Materials. Dieses Verfahren umfaßt die Stufen des Hinzufügens des wasserunlöslichen Materials zu einer ein nichtionisches Tensid enthaltenden wäßrigen Lösung, Erwärmen unter Rühren bis zu einer Temperatur, die über dem Trübungspunkt der Tensidlösung liegt und anschließend Abkühlen unter Rühren bis zu der Temperatur des Trübungspunkts oder darunter, um eine transparente Lösung zu erhalten. Gemäß dieser japanischen Veröffentlichung 59-39168 ist die so erhaltene wäßrige Lösung sehr stabil und Trübung ergibt sich weder aus dem pH- Wertwechsel oder einer Verringerung der Konzentration durch Verdünnung mit Wasser oder einem Puffer. Diese japanische Veröffentlichung 59-39168 lehrt auch, daß das Verfahren sehr nützlich zur Herstellung einer stabilen Standardlösung von Triolein ist und daß die transparente wäßrige Triolein-Lösung eine einfache und genaue photometrische Messung der Lipaseaktivität ermöglicht. Obwohl diese japanische Veröffentlichung 59-39168 eine relativ allgemeine Beschreibung enthält, beschreibt sie nicht die Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe.
Die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 63-91136 (Anmeldenr. 61-234520) offenbart ein anderes Verfahren zur Herstellung einer transparenten solubilisierten Lösung eines wasserunlöslichen Materials. Dieses Verfahren umfaßt die Stufen des Lösens des wasserunlöslichen Materials in einer trüben, ein nichtionisches Tensid enthaltenden Lösung, während die Lösung bei einer Temperatur über dem Trübungspunkt der Tensidlösung gehalten wird, obwohl der Trübungspunkt durch Zugabe eines Builders abfällt und anschliessendes Verdünnen der erhaltenen Flüssigkeit mit einer wäßrigen Flüssigkeit, um somit den Trübungspunkt zum Erhalt einer klaren Lösung anzuheben. Der Hauptvorteil des obigen Verfahrens ist, daß die transparente wäßrige Lösung des wasserunlöslichen Materials ohne Durchführung von Erwärmungs- und Abkühlungsstufen zum Anheben oder Abfallen der Temperatur der wäßrigen Lösung des nichtionischen Tensids erhalten werden kann. Nach dieser japanischen Veröffentlichung 63-91136 ist die so erhaltene wäßrige Lösung sehr stabil, es findet sich jedoch keine Offenbarung darin, daß die transparente wäßrige Lösung als Substrat zur Bestimmung der Lipaseaktivität verwendet werden kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Demzufolge ist es Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Lyophilisat einer transparenten wäßrigen Lösung eines Triglyceridsubstrats zur empfindlichen und wirksamen Bestimmung einer sehr geringen Menge von Lipase, insbesondere im Pankreassaft, Serum oder ähnlichem bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von Lipase unter Verwendung einer Substratlösung.
Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Erfindungsgemäß wird ein Lyophilisat einer transparenten und stabilen wäßrigen Lösung eines Substrats zur Bestimmung von Lipase bereitgestellt, enthaltend gleichförmig solubilisiertes Triglycerid, welches durch ein Verfahren erhältlich ist, daß die Stufen des Vermischens des Triglycerids und des nichtionischen Tensids in einer wäßrigen Flüssigkeit bei einer Temperatur des Trübungspunkts des in der Flüssigkeit enthaltenden Tensids oder darüber und des Abkühlens unter Rühren bis zu einer Temperatur, die geringer ist als der Trübungspunkt, zur Bildung einer transparenten Lösung, umfaßt oder durch ein Verfahren erhältlich ist, daß umfaßt die Stufen des Hinzufügens des Triglycerids unter Rühren in eine wäßrige, ein nichtionisches Tensid enthaltende Flüssigkeit, während die Flüssigkeit bei der Temperatur des Trübungspunkts der nichtionischen Flüssigkeit oder darüber gehalten wird, obwohl der Trübungspunkt durch Zugabe eines Builders gesenkt wird, Verdünnen der erhaltenen Lösung mit einer wäßrigen Flüssigkeit, um damit die Konzentration des Builders zu verringern und den Trübungspunkt der erhaltenen transparenten Lösung anzuheben, und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose, Oligozuckern Dextran, Carboxymethylcellulose, Lactose und einem synthetischen Polymer, hergestellt aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, einer inneren Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung (α) = 56,5ºC in einer Menge von 1 bis 10 Gew. %/Volumen, Albumin in einer Menge von 1 bis 5 Gew. %/Volumen und Kaliumchlorid und Glycin in einer Menge von 5 bis 10 Gew. %/Volumen.
Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe bereitgestellt, enthaltend die Stufen des Einbringens einer eine unbekannte Menge Lipase enthaltenden Probe in die wäßrige Lösung in Gegenwart des lipaseaktivitäterhöhenden Mittels und gegebenenfalls Monoglyceridlipase, um eine Fettsäure und Glycerol zu bilden, der Durchführung einer Bestimmung der erhaltenen Fettsäure oder des Glycerols, insbesondere nach einem Absorptionsverfahren, und anschließend beispielsweise der Berechnung der Lipaseaktivität in der Probe aus dem Ergebnis des Absorptionsverfahrens.

KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die Linearität zwischen einer Verdünnungsreihe aus menschlichem Pankreassaft und der in Beispiel 3 gemessenen Absorption und zeigt so, daß die Bestimmung der Lipase unter Verwendung des erfindungsgemäßen Substrats quantitativ ist.
Figur 2 ist eine grafische Darstellung, die eine Trioleinkonzentration und Absorption (Trübung) einer wäßrigen Substratlösung zeigt, erhalten aus dem erfindungsgemäßen lyophilisierten Produkt, und die unter Verwendung der wäßrigen Substratlösung gemessene Lipaseaktivität.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Das Triglycerid, das erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist ein Ester von Fettsäuren und ein trivalenter Alkohol, d.h. Glycerol, und ist ein Produkt einer Veresterung von drei Hydroxylgruppen des Glycerols mit drei Fettsäuren der allgemeinen Formel
worin RCOOH, R'COOH und R"COOH identisch oder voneinander verschieden sein können.
Die folgenden Fettsäuren können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden:

1. Gesättigte Fettsäuren

Laurinsäure C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub3;COOH
Myristinsäure C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub7;COOH
Palmitinsäure C&sub1;&sub5;H&sub3;&sub1;COOH
Stearinsäure C&sub1;&sub7;H&sub3;&sub5;COOH
Arachinsäure C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub9;COOH
Behensäure C&sub2;&sub1;H&sub4;&sub3;COOH

2. Ungesättigte Fettsäuren

Linderinsäure C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub2;O&sub2;
Lauroleinsäure C1&sub2;H&sub2;&sub2;O&sub2;
Tsuzuicsäure C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub6;O&sub2;
Physetericsäure C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub6;O&sub2;
Myristoleinsäure C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub6;O&sub2;
Palmitoleinsäure C&sub1;&sub6;H&sub3;&sub0;O&sub2;
Petroselinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O&sub2;
Oleinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O&sub2;
Ölsäure C&sub1;&sub8;H3&sub4;O&sub2;
Vaccensäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub4;O&sub2;
Linolsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub2;O&sub2;
Linolensäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub2;
α-Eläolstearinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub2;
β-Eläolstearinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub2;
Punicinsäure C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub2;
Parinarsäure C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;O&sub2;
Gadoleinsäure C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub8;O&sub2;
Letoleinsäure C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub2;O&sub2;
Erukasäure C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub2;O&sub2;
Arachidonsäure C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub2;O&sub2;
Triglyceride der allgemeinen Formel (I), worin RCOOH, R'COOH und/oder R"COOH die o.g. Fettsäuren sind, sind folgende:
Trilaurin (12,12,12: Anzahl der Kohlenstoffatome der gebundenen Fettsäuren), Tridecanoin (13,13,13), Trimyristin (14,14,14), Tripentadecanoin (15, 15,15), Tripalmitin (16,16, 16), Trimargarin (17,17,17), Tristearin (18,18,18), Trinonadecanoin (19,19,19), Triolein (18,18,18), Trilaiden (18,18,18), Trilinolein (18,18,18), Trilinolenin (18,18,18), Trierucin (22,22, 22), Tribrassidin (22, 22, 22), 1-Laruoyldimyristin (12,14,14), 1-Myristoyldipalmitin (14,16,16), 1-Palmitoyldistearin (16,18,18), 2-Stearoyldipalmitin (16,16,18), 2-Stearoyldipalmitin (16,18,16), 2-Palmitoyldistearin (18,16,18), 1-Oleoyldistearin (18,18,18), 1 Linoleoyldistearin (18,18,18), 2-Oleoyldistearin (18,18,18), 1 Stearoyldiolein (18,18,18), 1-Stearoyldilinolenin (18,18,18), 1 -Stearoyl-2-Myristoyl-3-Palmitin (18, 14,16), 1 -Stearoyl-2-Palmitoyl- 3-Myristin (18,16,14), 1-Lauroyl-2-Myristoyl-3-Palmitin (12,14,16).
Bei der Bestimmung der menschlichen Lipase wird es bevorzugt, daß das Substrat, die in menschlichen Körpern vorkommenden Fettsäuren aufweisenden Triglyceride, in einer großen Menge verwendet wird. Beispiele solcher Fettsäuren sind Myristin-, Palmitin-, Stearin-, Palmitolein-, Olein- und Linolsäure u.ä. Insbesondere umfaßt das bevorzugte Substrat Triglyceride, die eine oder mehrere (insbesondere drei) Ölsäure(n) enthalten, von der angenommen wird, daß sie in der Natur weit verbreitet und in großer Menge vorliegt und auch im menschlichen Körper in großer Menge vorkommt.
Das Tensid, welches erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist ein nichtionisches Tensid, beispielsweise ein Polyoxyethylenderivat wie Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylencetylether, Polyoxyethylenstearylether, Polyoxyetheylenoleylether, Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylennonylphenylether, Polyoxyethylen-Polyoxyprobylen-Blockcopolymer, oder höhere Polyoxyethlenalkohole. Der Hydrophilie-Lipophilie-Gleichgewichtswert (HLB) des nichtionischen Tensids liegt vorzugsweise im Bereich von 8 bis 20, in besonders bevorzugter Weise von 10 bis 16. Hinsichtlich der Lipase-Reaktion wird ein höherer Polyoxyethylenalkohol (HLB 10 - 16) am meisten bevorzugt.
Die erfindungsgemäße Substratlösung kann durch bekannte Verfahren oder durch die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung erarbeitenden Verfahren hergestellt werden.
Beispielsweise kann die wäßrige Substratlösung durch Vermischen des Triglycerids und des nichtionischen Tensids in einer wäßrigen Flüssigkeit (destilliertes Wasser oder Puffer) bei einer Temperatur des Trübungspunkts, der das Tensid enthaltenden Flüssigkeit oder darüber und anschließendem Abkühlen unter Rühren bis zu einer Temperatur, die geringer ist als der Trübungspunkt, hergestellt werden. In diesem Verfahren ist die Mischung aus Triglycerid und Tensid in der wäßrigen Flüssigkeit auch am Trübungspunkt oder darüber trübe.
Das Triglycerid wird in die trübe Flüssigkeit unter Rühren eingemischt. Anschließend unter Fortsetzung des Rührens wird die Flüssigkeit auf eine Temperatur unter dem Trübungspunkt abgekühlt, und es kann eine transparente und stabile Substratlösung erhalten werden. In vielen Fällen sollte die so erhaltene transparente Lösung mit der wäßrigen Flüssigkeit verdünnt werden, um eine stabile Substratlösung zu ergeben.
Wird ein kristallines, festes Triglycerid verwendet, ist dieses vorzugsweise in einer minimalen Menge des Alkohols vor der Vermischungsstufe zu lösen. Die obige Mischungsstufe schließt verschiedene Ausführungsformen ein durch Kombinieren der Zugabe des Triglycerids und des Tensids in die wäßrige Flüssigkeit und Erwärmen der wäßrigen Flüssigkeit, die das Triglycerid und/oder das Tensid enthalten kann. Beispielsweise kann die Vermischungsstufe das Hinzufügen des Triglycerids und des Tensids in die wäßrige Lösung und das anschließende Erwärmen der erhaltenen Lösung umfassen. Die Mischungsstufe kann weiterhin das Erwärmen der wäßrigen Flüssigkeit umfassen, die nichts oder nur das Triglycerid oder das Tensid enthält, und anschließendes Hinzufügen des Tensids und/oder der Lösung. Weiterhin kann der Trübungspunkt der wäßrigen, ein nichtionisches Tensid enthaltenden Flüssigkeit erhöht oder verringert werden durch Hinzufügen eines kationischen und/oder eines anionischen Tensids. Dazu kann die das kationische und/oder anionische Tensid zusätzlich zu dem nichtionischen Tensid enthaltende Flüssigkeit als wäßrige das nichtionische Tensid enthaltende Lösung in dieser Mischungsstufe eingesetzt werden.
Der Terminus "transparent", der in bezug auf die wäßrige Substratlösung verwendet wird, bedeutet, daß die Lösung eine Absorption von 0,2 oder weniger, vorzugsweise 0,1 oder weniger bei 340 nm zeigt.
Der Terminus "stabil", der in bezug auf die wäßrige Substratlösung ver-wendet wird, bedeutet, daß diese Lösung, die obeige Transparenz über eine Zeitdauer aufrecht erhält, die ausreichend ist, die Substratlösung zur Messung der Lipaseaktivität einzusetzen, beispielsweise einen Tag oder mehr, vorzugsweise eine Woche oder mehr.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die solubilisierte wäßrige Lösung der vorliegenden Erfindung auch hergestellt werden durch Zugabe des Triglycerids unter Rühren in eine ein nichtionisches Tensid enthaltende wäßrige Lösung, während die Flüssigkeit bei der Temperatur des Trübungspunkts der Tensidlösung oder höher gehalten wird, obwohl der Trübungspunkt durch das Hinzufügen eines Builders gesenkt wurde, und anschließendes Verdünnen der erhaltenen Flüssigkeit mit einer wäßrigen Flüssigkeit, um somit den Trübungspunkt zu erhöhen und eine transparente Lösung zu erhalten.
In obigem Verfahren bewirkt das Hinzufügen eines Builders eine Senkung des Trübungspunkts womit die Stufe des Erwärmens der trüben Lösung überflüssig werden kann. Weiterhin verursachte die Verdünnung der trüben Lösung eine Verringerung der Konzentration des Builders, womit die Temperatur der Lösung unter den Trübungspunkt ohne zu Kühlen abfällt, und dann ist die transparente Substratlösung gebildet.
Die Builder, die beispielsweise verwendet werden können, sind Natriumsalze anorganischer oder organischer Säuren wie Natriumhydrogenphosphat, Polyphosphat, Carbonat, Citrat oder Wolframat (Alkalisalz), Natriumsulfat oder - chlorid (Neutralsalz) oder Natriumhydrogensulfat (saures Salz). In einigen Fällen können, sofern erwünscht, Salze anderer Alkalimetalle oder Erdalkalimetalle verwendet werden.
Die Auswahl des Builders ist von dem pH-Wert der Triglycerid-Lösung abhängig. Die Konzentration oder die Menge des hinzugefügten Builders wird vorzugsweise derart bestimmt, daß der Trübungspunkt der wäßrigen Tensidlösung zum Abfallen unter die Umgebungstemperatur veranlaßt wird.
Als nichtionisches Tensid enthaltende wäßrige Flüssigkeit kann in der Zugabestufe die Flüssigkeit verwendet werden, die das kationische Tensid und/oder das anionische Tensid zusätzlich zu dem nichtionischen Tensid enthält.
Als Flüssigkeit zum Verdünnen der trüben Lösung wird gewöhnlich Wasser oder ein Puffer verwendet. Die Verdünnungsflüssigkeit wird vorzugsweise unter Berücksichtigung des pH-Werts der fertigen Lösung wie bei der Auswahl des Builders ausgewählt.
In obigem Verfahren ist es erforderlich, die (trübe) wäßrige Flüssigkeit kontinuierlich und kräftig zu schütteln, um das Triglycerid zu solubilisieren, und eine transparente Lösung zu erhalten. Zu diesem Zweck wird im allgemeinen ein Rührvorgang durchgeführt.
In der transparenten Triglyceridsubstrat-Lösung, die mit oder ohne Builder hergestellt wird, kann die Lipasereaktion insbesondere im Falle einer pankreatitischen Lipasereaktion gestört werden, wenn eine Überschuß des nichtionischen Tensids vorliegt. In der Zugabestufe des oben genannten Herstellungsverfahrens der transparenten Lösung werden 1 bis 40 Gew.% (vorzugsweise 5 bis 20 Gew.%) des nichtionischen Tensids bevorzugt verwendet und 0,0 bis 0,5 Gew.% Triglycerid wie Triolein vorzugsweise auf der Basis von 100 Gew.% destilliertem Wasser verwendet.
In der erfindungsgemäßen transparenten Triglyceridsubstrat-Lösung wird die Lipasereaktion vorzugsweise im pH-Bereich von 4 bis 11, in besonders bevorzugter Weise bei 6 bis 9, durchgeführt. Als Puffer kann beispielsweise verwendet werden Natriumcitrat-Phosphat-Puffer, Imidazol-Chlorwasserstoffsäure-Puffer, Triethanolamin-Chlorwasserstoffsäure-Natriumhydroxid-Puffer, Trispuffer, Glycylglycin-Natriumhydroxid-Puffer, Diethanolamin-Chlorwasserstoffsäure-Puffer, Boratpuffer, 2,4,6-Trimethylpyridin-Chlorwasserstoffsäure-Puffer, Phosphatpuffer und Good's Puffer oder ähnliches. Der Puffer wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 5 mM bis 300 mM verwendet.
Nach Verwendung der erfindungsgemäßen Substratlösung zur Bestimmung der Lipase (insbesondere Pankreaslipase)-Aktivität, ist es wichtig, ein Mittel zur Beschleunigung der Lipaseaktivität, wie ein Gallensalz oder Colipase zu verwenden. Vorzugsweise wird etwa 1 bis 100 mM Gallensalz, wie das Salz von Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Glycocholsäure oder Taurocholsäure und 50 U/Test oder mehr an Colipase zu der Substratlösung hinzugegeben. Das Mittel zur Beschleunigung der Lipaseaktivität kann in die Substratlösung in irgendeiner Stufe eingebracht werden, beispielsweise während der Herstellung der Lösung, während der Lagerung der Lösung oder unmittelbar vor deren Anwendung, solange das Mittel anwesend ist, wenn die Lipasereaktion durchgeführt wird.
Darüber hinaus wird eine größere Wirkung erhalten, wenn etwa 1 mM bis 80 mM Calciumchlorid und etwa 5 mM bis 500 mM Natriumchlorid gemeinsam mit der Substratlösung verwendet werden. Die bevorzugte erfindungsgemäße transparente Substratlösung umfaßt Triglycerid und Tensid, so daß etwa 0,0005 Gew. % oder mehr (vorzugsweise etwa 0,002 bis 0,5 Gew.%) des Triglycerids und etwa 0,005 Gew.% oder mehr (vorzugsweise etwa 0,02 bis 4 Gew. %) des nichtionischen Tensids in der fertigen Lösung vorhanden sind, worin die Bestimmung der Lipaseaktivität durchgeführt wird. Die Menge des hinzugefügten Builders ist so bemessen, daß die Absenkung des Trübungspunkts der verwendeten, das Tensid enthaltenden Lösung bewirkt wird. Die so erhaltene, erfindungsgemäße wäßrige Triglyceridsubstrat-Lösung ist eine zur Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe sehr nützliche und stabile Zubereitung.
Als in der vorliegenden Erfindung zu analysierende Proben sind alle Lipase enthaltenden flüssigen Proben zu nennen, wie menschlicher Pankreassaft, menschliches Serum, Plasma, Urin, Zellextrakt und Lösungen von Kulturmedien.
Im Verfahren zur Bestimmung der Lipaseaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Basisreaktionen die Lipasereaktion des solubilisierten Triglycerid als Substrat zur Bildung von durch die Lipase hydrolisierten Fettsäuren und eine Reaktion zwischen der erhaltenen Fettsäure, Adenosintriphosphat (ATP) und Coenzym A (CoA) in Gegenwart von Acyl-CoA-Synthetase (ACS). Danach ist es möglich, entweder i) das gebildete Adenosinmonophosphat (AMP), ii) das gebildete Acetyl-CoA oder iii) verbleibendes CoA zu messen.
Beispiele der obigen Messverfahren i) bis iii) werden nachfolgend erläutert: i) Verfahren zur Messung von AMP Pyrophosphat Pyruvat Lactat Acetylphosphat
Das gebildete AMP wird mit ATP und Phosphoenolpyruvat (PEP) in Gegenwart von Myokinase (MK) und Pyruvatkinase (PK) zur Bildung von Pyruvat umgesetzt und das erhaltene Pyruvat anschließend mit Nicotinamidadenindinucleotid vom reduzierten Typ (NADH) in Gegenwart von Lactatdehydrogenase (LDH) umgesetzt. Die Reduktion von NADH wird gemessen. In alternativer Weise kann die Messung colorimetrisch unter Verwendung von Pyruvatoxidase (POP) durchgeführt werden.
Beispielhaft für das Messverfahren i) sind weitere Methoden zur Bestimmung von Ammoniak unter Verwendung von ADP-Deaminase zu nennen, ein Verfahren zur Messung von Ammoniak unter Verwendung von AMP-Deaminase, ein Verfahren zur Messung von Ammoniak unter Verwendung von AMP-Nucleotidase oder Adenindeaminase oder ein Verfahren zur Messung von Ammoniak unter Verwendung von AMP-Pyrophosphorylase oder Adenindeaminase. ii) Verfahren zur Bestimmung von Acyl-CoA Pyrophosphat trans-Enoyl-CoA
In diesem Verfahren wird Acyl-CoA der Einwirkung von Acyl-CoA-Oxidase (ACO) unterzogen und Wasserstoffperoxid gebildet. Die gebildete Wasserstoffperoxidase wird durch ein Peroxidase-Verfahren, Catalaseverfahren oder ähnliches gemessen. Wasserstoffperoxid wird gemessen durch oxidative Kondensation mit 4- Aminoantipyrin und verschiedenen Kupplern. Die Kuppler sind beispielsweise Phenole, Aniline, Toluidine oder ähnliche, wie N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin, N,N-Diethyl-m-toluidin, 3-Methyl-N-ethyl-N-(β-hydroxyethyl)anilin, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, 3,5-Dimethoxy-N-(3-sulfopropyl)anilin. Alternativ kann 3-Methyl-2- benzothiazolinonhydrazon anstelle von 4-Aminoantipyrin verwendet werden. Weiterhin können Kuppler wie 10-(3-Methoxycarboxylaminomethylbenzoylcarbamoyl)-3,7-bis(dimethyl-3-nk)-10H-phenothiazin, 3-Bis(4-chlor-phenyl)methyl-4- dimethylaminophenylamin in Abwesenheit von 4-Aminoantipyrin eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann Acyl-CoA direkt in einem β-Oxidationssystem eingesetzt werden, welches der metabolische Hauptstoffwechselweg einer Fettsäure ist. Insbesondere wird Acyl-CoA mit Acyl-CoA-Oxidase zu 2-3 trans-Enoyl-CoA umgewandelt. Durch die Wirkungen der Enoyl-CoA- Hydratase, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase wird ein Anstieg von NADH verursacht und dieser Anstieg gemessen. iii) Verfahren zur Bestimmung von restlichem CoA Pyrophosphat
Restliches CoA kann gemessen werden durch ein Mittel zur quantitativen Umsetzung der SH-Gruppen wie 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB).
Anstelle der Messung der Fettsäuren wie in den obigen Verfahren i) bis iii) kann auch das aus der Lipasereaktion erhaltene Glycerol bestimmt werden. In dem vorliegenden Bestimmungsverfahren wird typischerweise die Lipase aus dem menschlichen Körper (beispielsweise Pankreas-Lipase, Lipoprotein-Lipase, Leber- Lipase) eingesetzt. Die menschliche Lpase hydrolisiert Ester in den 1- und/oder 3- Stellungen des Triglycerids und folglich ist es erforderlich Monoglycerid-Lipase einzusetzen, um zu bestimmendes Glycerol zu erhalten. Die Lipase von Microorganismen kann im allgemeinen Ester in 1-, 2- und 3-Stellungen des Triglycerids hydrolisieren, und folglich ist es nicht erforderlich, dazu diese Monoglycerid-Lipase anzuwenden.
Im vorliegenden Verfahren zur Bestimmung der Lipase-Aktivität können dem einschlägigen Fachmann bekannte Absorptionsverfahren eingesetzt werden.
Wie zuvor kurz angedeutet, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Herstellung des lyophilisierten Produkts.
Verschiedene Verfahren wurden entwickelt und veröffentlicht, worin die solubilisierte wäßrige Lösung lyophilisiert, in Form eines lyophilisierten Pulvers gelagert und anschließend in die ursprüngliche Form durch Lösen in Wasser vor Verwendung umgewandelt wird. Es wird Bezug genommen, beispielsweise auf die ungeprüften japanischen Patentveröffentlichungen (Kokai) Nr. 60-224617 und Nr. 62-38. Die herkömmlichen Verfahren zur Lyophilisation von wasserunlöslichem Material umfassen das Solubilisieren oder Emulgieren des wasserunlöslichen Materials in einer wäßrigen Lösung mit einem nichtionischen Tensid und gegebenenfalls Hinzufügen eines Binde- oder Stabilisierungsmittels und anschließender herkömmlicher Lyophilisation.
Eine herkömmliche solubilisierte oder emulgierte wäßrige Lösung, die mit Wasser aus dem lyophilisierten Produkt umgewandelt worden ist, welches aus der ursprünglichen solubilisierten oder emulgierten wäßrigen Lösung durch Lyophilisation hergestellt worden ist, hat die folgenden Nachteile:
a) In herkömmlichen Verfahren kann ein Pulver nicht erhalten werden, ohne eine große Anzahl von Additiven wie Binde- oder Stabilisierugsmittel vor der Lyophilisation einzusetzen. In einigen Fällen werden solche Bestandteile in Wasser unlöslich, wenn das lyophilisierte Produkt in eine wäßrige Lösung umgewandelt wird. Insbesondere bei Anwendungen der wäßrigen Lösung, die aus lyophilisiertem Material hergestellt worden ist, dienen solche Additive als Inhibitor.
b) Wird die wäßrige Lösung lyophilisiert bevor das wasserunlösliche Material ausreichend darin solubilisiert worden ist, kann die Umwandlung mit Wasser aus dem erhaltenen lyophilisierten Produkt keine wäßrige Lösung ergeben, die das Material zufriedenstellend solubilisiert oder emulgiert. Deshalb mußten verschiedene beschwerliche Techniken verwendet werden, die ein hohes Ausmaß an Genauigkeit verlangten, um Art und Menge des verwendeten Tensids, das Solubilisierungsverfahren und ähnliches zu bestimmen. Bisher traten viele Fälle auf, worin eine ausreichend solubilisierte, zu lyophilisierende Lösung zusätzlich zu anderen Problemen, die auftreten können, nicht erhalten werden konnte.
c) In der mit Wasser aus dem herkömmlichen Lyophilisat umgewandelten solubilisierten oder emulgierten Lösung ist das wasserunlösliche Material bloß emulgiert, und die umgewandelte Lösung ist trübe und weiß oder opaque und kann somit bei verschiedenen Anwendungen nicht eingesetzt werden.
Unter den obigen Umständen führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Reihe von Versuchsprojekten durch, um ein Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Produkts zu entwickeln, aus dem eine hervorragend transparente wäßrige Lösung des wasserunlöslichen Materials erhalten werden kann und entdeckten ein solches Verfahren. Weiterhin wurde festgestellt, daß ein solches Lyophilisations-Verfahren bei der erfindungsgemäßen transparenten wäßrigen Triglyceridsubstrat-Lösung angewendet werden kann.
Demzufolge betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Produkts, das in der Lage ist, eine transparente und stabile wäßrige Lösung des Triglyceridsubstrats zur Bestimmung von Lipase, enthaltend die Stufen des Vermischens des Triglycerids und des nichtionischen Tensids in einer wäßrigen Flüssigkeit bei der Temperatur des Trübungspunkts der das Tensid enthaltenden Flüssigkeit oder darüber, des Abkühlens unter Rühren zu einer Temperatur unter dem Trübungspunkt, um eine transparente Lösung zu bilden, und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung eines Lyophilisats, das in der Lage ist, eine transparente und stabile wäßrige Lösung eines Triglyceridsubstrats zur Bestimmung der Lipase zu bilden, enthaltend die Stufen des Hinzufügens des Triglycerids unter Rühren zu einer ein nichtionisches Tensid enthaltenden wäßrigen Lösung, während die Lösung bei einer Temperatur eines Trübungspunkts der Lösung des nichtionischen Tensids oder darüber gehalten wird obwohl der Trübungspunkt durch Zugabe eines Builders gesenkt wurde, des Verdünnens der erhaltenen Flüssigkeit mit einer wäßrigen Flüssigkeit, um damit die Konzentration des Builders zu verringern und den Trübungspunkt zu erhöhen, um eine transparente Lösung zu erhalten und des anschließenden Lyophilisieres der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator. Das erfindungsgemäß verwendete Bindemittel wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose (1 - 10%), Kaliumchlorid (5 - 10%), Oligozuckern (1 - 10%), Dextran (1 - 10%), Albumin (1 - 5%), Carboxymethylcellulose (1 - 10%), Lactose (Milchzucker) (1 - 10%), Glycin (5 - 10%) und Ficoll 400 (1 - 10%). Von diesen Materialien können Saccharose, Kaliumchlorid, Oligozucker, Dextran, Albumin, Milchzucker (1 - 10 %), Glycin (5 - 10 %) auch als Stabilisator verwendet werden. Die oben in Klammern genannten Ziffern bezeichnen die Mengenbereiche der verwendeten Materialien.
Ficoll 400 ist ein synthetisches Polymer, das aus Saccharose und Epichlorhydrin hergestellt wird und ein mittleres Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, eine innere Viskosität von etwa 0,17 dl/g und eine spezifische Drehung (α)20D = + 56,5ºC aufweist.
Im obigen erfindungsgemäßen Lyophilisierungsverfahren können die o.g. Triglyceride, anionischen Tenside und Builder (sofern verwendet) eingesetzt werden.
Das Mittel zur Beschleunigung der Lipase (insbesondere Pankreaslipase) Aktivität, wie Colipase oder Gallensalz, kann vor der Lyophilisierungsstufe eingebracht werden. In alternativer Weise kann das Mittel zu der wäßrigen Lösung hinzugefügt werden, die mit Wasser aus dem lyophilisierten Produkt hergestellt worden ist.
Die transparente wäßrige Lösung des Triglyceridsubstrats gemäß der vorliegenden Erfindung kann lyophilisiert und in Form des lyophilisierten Pulvers gelagert und dann mit Wasser oder dem Puffer zu der transparenten Lösung zur Bestimmung der Lipaseaktivität umgewandelt werden.
Obwohl nur Triglycerid als zu solubilisierendes Material im Hinblick auf das vorliegende Lyophilisationsverfahren erwähnt worden ist, können auch andere Materialien verwendet werden. Beispielsweise können Cholesterole, Phospholipide, Glycolipide, Fettsäuren, Neutralfette, Glycerolether, Wachse, Cerebroside, höhere Alkohole, fettlösliche Vitamine, (beispielsweise Vitamin A, D, E, K etc.), Squalen, Carotenoide oder aliphatische Kohlenwasserstoffe, (beispielsweise Pentadecan, Isooctadecan, etc.) auch anstelle von Triglycerid verwendet werden.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele erläutert ist jedoch keinesfalls darauf beschränkt.

Beispiel 1

A. Herstellung der Reagenzien 1 bis 4

1) Reagenz 1

Nachdem 10g Emulgen 707 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurden 5 g Natriumchlorid (Builder) hinzugefügt und bei Raumtemperatur (25º C) gerührt. Die Flüssigkeit wurde trüb und in die trübe Flüssigkeit wurden 2 g Triolein gegeben und kräftig etwa 2 Stunden geschüttelt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde mit 10 mM Tris-Puffer (pH 7,9) auf das hundertfache Volumen verdünnt, um eine transparente Lösung zu erhalten. Anschließend wurde Natriumdesoxycholat (10 mM), Natriumchlorid (70 mM), Calciumchlorid (5 mM) und Colipase (30.000 U/dl) zu der transparenten Lösung gegeben, um Reagenz 1 zu erhalten.

2) Reagenz 2

Reagenz 2 wurde hergestellt durch Lösen von Acyl-CoA- Synthetase (5.0 U/5 ml), Adenosine-5'-triphosphat (33,0 umol) und dem Lithiumsalz von CoA (7,8 umol) in einer wäßrigen Trishydroxymethylaminomethan (0,05 M, pH 7,85) und Magnesiumchloridhexahydrat (5 mM) enthaltenden Lösung.

3) Reagenz 3

Reagenz 3 wurde hergestellt durch Lösen von Acyl-CoA-Oxidase (10,0 U/20 ml), Peroxidase (20.000 U/20 ml) und 4-Aminoantipyrin (24 umol) in wäßriger Lösung (pH 7,30), die N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-aminosulfat (20 mM) und N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin (0,75 mM) enthält.

4) Reagenz 4

Reagenz 4 wurde hergestellt durch Lösen von N-Ethylmaleinimid (10 mM) in einer wäßrigen Chlorwassersäure-Lösung und auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt.

B. Messungen und Ergebnisse

Sowohl 20 ul gereinigtes Wasser (Kontrolle) und 20 ul Pankreassaft (Probe) wurden in ein 1,1 ml Reagenz 1 enthaltendes Teströhrchen gegeben und 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde 1 ml des Reagenz 2 hinzugefügt. Nachdem die Reaktion 10 Minuten lang durchgeführt worden war, wurde 1 ml Reagenz 4 hinzugefügt. Nach 2 Minuten wurde Reagenz 3 hinzugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur belassen. Nach 10 Minuten wurde die Absorption bei 550 nm gemessen, um für den Pankreassaft, bezogen auf die Kontrolle des gereinigten Wassers, 0,420 zu erhalten.
Eine wäßrige Lösung von Ölsäure (1.000 ueq/l) wurden hergestellt und als Lipase-Standardlösung (100 U/l) verwendet. Das obige Analyseverfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 20 ul der Standardlösung eingesetzt wurden, die Absorption betrug 0,104 und somit betrug die Lipaseaktivität des Pankreassaftes 403,8 U/l.

Beispiel 2

A. Herstellung der Reagenzien 1 bis 4

1) Reagenz 1

Nachdem 10g Emulgen 709 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols, Trübungspunkt 56ºC) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 56ºC oder mehr erwärmt. Wegen des Erreichens des Trübungspunkts wurde die Lösung trübe und zu der trüben Flüssigkeit wurden 2 g Trilinolein hinzugefügt und das Ganze etwa 30 Minuten lang gerührt, während die Temperatur bei 56ºC oder mehr gehalten wurde. Das Erwärmen wurde unterbrochen und die Flüssigkeit unter Rühren belassen. Als die Temperatur auf Raumtemperatur abgefallen war, wurde die Flüssigkeit transparent und mit destilliertem Wasser verdünnt, um das zehnfache Volumen der solubilisierten Substratlösung für die Lipase zu erhalten. Diese Lösung wurde mit Reagenz 1 bezeichnet.

2) Reagenz 2

Reagenz 2 wurde hergestellt durch Lösen von Natriumdesoxycholat (4,16 mg), Natriumchlorid (4,16 mg), Kalziumchlorid (0,06 mg) und Colipase (230 U) in 1,0 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxymethylaminomethan (10 mM, pH 7,9).

3) Reagenz 3

Reagenz 3 wurde hergestellt durch Lösen von ATP (0,79 mg), Phosphoenolbrenztraubensäure (0,15 mg), Myokinase (7 U), Pyruvatkinase (30 U) und Lactatdehydrogenase (8 U) in 0,5 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxyethylaminomethan (10 mM, pH 7,9).

4) Reagenz 4

Reagenz 4 wurde hergestellt durch Lösen des Lithiumsalzes von CoA (1,8 mg), Acyl-CoA-Synthetase (4 U) und Magnesiumchlorid (0,6 mg) in 1,0 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxyethylaminomethan (10 mM, pH 7,9).

B. Messungen und Ergebnisse

Eine Reaktionszelle wurde mit 100 ul Reagenz 1, 0,5 ml Reagenz 3,1 ml Reagenz 4 und 20 ul menschlichen Pankreassafts (Probe) nacheinander beladen gerührt und vorinkubiert. Reagenz 2 (1,0 ml) wurde als Reaktionsinitiator hinzugegeben und die Reaktion bei 37ºC durchgeführt. Zum Erhalt eines Blindwerts wurde die Reaktion ohne Zugabe der Probe durchgeführt. Die Lipase im Pankreassaft wurde mit dem solubilisierten Substrat umgesetzt, um Fettsäure zu ergeben, und die erhaltene Fettsäure wurde mit CoA und ATP in Gegenwart von Acyl-CoA-Synthetase umgesetzt. Das gebildete AMP wurde in Gegenwart von ATP und Myokinase zu ADP umgewandelt, welches mit Phosphoenolpyruvat in Gegenwart der Pyruvatkinase unter Erhalt von Pyruvat umgesetzt wurde. Das gebildete Pyruvat wurde der Wirkung der Lactatdehydrogenase unterworfen und die Reduktion von NADH bei 340 nm gemessen. Die Absorption nahm in Abhängigkeit von der Reaktionsdauer ab. Die Verringerung der Absorption je Minute betrug 0,061, woraus die Lipaseaktivität mit 128,5 U/l berechnet wurde.

Beispiel 3

A. Herstellung der Reagenzien 1 bis 3

1) Reagenz 1

Nachdem 10g Emulgen 709 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols, Trübungspunkt 56ºC) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 56ºC oder mehr erwärmt. Durch Erreichen des Trübungspunkts wurde die Lösung trüb und zu der trüben Lösung wurden 2 g Triolein hinzugefügt und das ganze etwa 30 Minuten gerührt, während die Temperatur auf 56ºC oder mehr gehalten wurde. Das Erwärmen wurde dann unterbrochen und die Flüssigkeit unter Rühren belassen. Nach Abfallen der Temperatur der Flüssigkeit auf Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit transparent. Nach dem Transparentwerden wurde sie mit Tris-Puffer (10 mM), pH 7,9) auf das zweihundertfache Volumen verdünnt. Anschließend wurden Natriumdesoxycholat (2,5 mM), Natriumchlorid (35 mM), Calciumchlorid (3,5 mM) und Colipase (30.000 U/dl) zu der transparenten Lösung hinzugefügt, um das Reagenz 1 zu erhalten.

2) Reagenz 2

Reagenz 2 wurde hergestellt durch Lösen von Acyl-CoA- Synthetase (66 U/dl), Acyl-CoA-Oxidase (90 U/dl), Peroxidase (16.000 U/dl), ATP (140 umol), CoA (16 umol) und 10-(3-Methoxycarboxylaminomethylbenzoylcarbamoyl)-3,7-bis(dimethylamino-10H-phenothiazin (2,2 umol) in Good's Puffer (25 mM, pH 6,75).

3) Reagenz 3

Als Kontrollreagenz wurde Reagenz 3 ohne Zugabe von Triolein, Colipase und Calciumchlorid aus Reagenz 1 hergestellt.

B. Messungen und Ergebnisse

In zwei Teströhrchen wurde jeweils ein ml des Reagenz 1 oder des Reagenz 3 und dann jeweils 20 ul menschlichen Serums hineingegeben. Nachdem die Reaktion bei 37ºC fünf Minuten lang abgelaufen war, wurden 1 ,5 ml Reagenz 2 in jedes Röhrchen gegeben. Die Temperatur wurde bei 37ºC fünf Minuten lang gehalten und dann die Absorption bei 666 nm gemessen.
Als Standard wurde eine wäßrige Oleinsäure-Lösung (1000 ueq/l) hergestellt und als Lipase-Standardlösung (200 U/l eingesetzt.
In der folgenden Tabelle 1 ist der Absorptionswert (berechnet durch Substraktion des Kontrollwerts von dem Wert der Probe) und die Lipase-Aktivität (berechnet unter Verwendung der Standardlösung) für 10 Proben menschlichen Serums und einer Standardlösung aufgelistet. Tabelle 1 Absorption Lipaseaktivität U/l Standardlösung 200U/l Humanserum
Weiterhin wurden eine Reihe von verdünnten Lösungen menschlichen Pankreassaftes hergestellt und deren Lipaseaktivität in Übereinstimmung mit Beispiel 3B bestimmt. Die Ergebnisse, die eine sehr hohe Linearität aufweisen, sind in Figur 1 gezeigt.

Beispiel 4

A. Herstellung der Reagenzien 1 bis 4

1) Reagenz 1

Die folgenden Bestandteile wurden in 25 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxymethylaminomethan (0,1 p, pH 7,5) gelöst, die Magnesiumchlorid (0,6 g/l) und Calciumchlorid (0,6 g/l) enthält, um das Reagenz 1 zu ergeben.
Adenosine 5'-Triphosphat 97 mg
Phosphoenolbrenztraubensäure 14,6 mg
Lactatdehydrogenase 840 U
Pyruvatkinase 700 U
Nicotinamidadenosin dinucleotid-reduziert 25,5 mg
Acyl-CoA-Synthetase 196 U
Solubilisiertes Substrat (Reagenz 1 in Beispiel 2) 1,4 ml
Colipase 35.000 U

2) Reagenz 2

Reagenz 2 wurde hergestellt durch Lösen von 2 g Natriumdesoxycholat in 100 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxyethylaminomethan (0,1 M, pH 8,3).

3) Reagenz 3

Als eine herkömmliche Substratsuspension von Triolein wurde Reagenz 3 hergestellt durch Zgabe der folgenden Bestandteile zu Tris-Puffer (0,1 M, pH 9,2).
Triolein 0,3 mM
Natriumdesoxycholat 17 mM
Natriumchlorid 35 mM
Calciumchlorid 1 mM
Colipase 210.000 U/l

B. Messungen und Ergebnisse

In einem Autoanalyzer (Hitachi 705 Autoanalyzer) wurden 350 ul des Reagenz 1 gemäß der vorliegenden Erfindung und 10 ul menschliches Serum als Probe gegeben. Nachdem eine fünfminütige Reaktion zur Eliminierung der freien Fettsäuren des menschlichen Serums durchgeführt worden war, wurden 50 ul des Reagenz 2 hinzugegeben. Es wurde die Verringerung der Absorption, gemessen 3 Minuten später, gegenüber der, gemessen 5 Minuten später, bestimmt.
In demselben Autoanalyzer wurden 500 ul des Reagenz 3 als herkömmliche Suspension und 20 ul menschlichen Serums eingefüllt und die Verringerung der Absorption vier Minuten später gegenüber der fünf Minuten später bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. Tabelle II Analyse 1 Analyse 2 Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Substrats Herkömmliches Verfahren
In der Tabelle II bedeutet n die Anzahl der vorgenommenen Messungen, x den Mittelwert, SA bedeutet die Standardabweichung und VK den Variationskoeffizient.
Es ist ersichtlich aus Tabelle II, daß die das solubilisierte Substrat verwendende Lösung der vorliegenden Erfindung eine hervorragende Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zeigt.

Beispiel 5

A. Herstellung der Reagenzien 1 und 2

1) Reagenz 1

Die folgenden Bestandteile wurden in 15 ml einer wäßrigen Lösung von Trishydroxymethylaminomethan (0,1 M, pH 8,3) gelöst, um Reagenz 1 zu ergeben.
Solubilisiertes Triolein-Substrat 1,7 ml
(Reagenz 1 von Beispiel 2)
Calciumchlorid 100 mg
Magnesiumchlorid 8 mg
Colipase 14.000 U

2) Reagenz 2

Reagenz 2(a)

Glycerokinase 5,38 U
Peroxidase 13,5x10&sup4; U
Adenosintriphosphat 42,4 mg
L-α-Glycerophosphatoxidase 161 U
4-Aminoantipyrin 5,7 mg
Ascorbatoxidase 53,8 U

Reagenz 2(b)

N,N-Bis (2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure 4,27 g
N-Ethyl-N-Sulfopropyl-m-toluidin 0,14 g
Magnesiumchloridhexahydrat 3,05 g
Triton X-100 0,1 g
Wasser q.s.bis 1.000 ml
pH-Einstellung auf 6,65
Reagenz 2 wurde hergestellt durch Lösen von Reagenz 2(a) in 36 ml des Reagenz 2(b).

B. Messungen und Ergebnisse

Reagenz 1(1,5 ml) und Reagenz 2 (1,5 ml) wurden mit 20 ul Lipase (30 U/ml), erhalten aus Hefe, vermischt und bei 37ºC 5 Minuten gerührt. Für den Blindwert wurde das gleiche Verfahren ohne Lipase wiederholt. Die Absorption bei 550 nm (minus Absorption der Kontrolle) betrug 0,140, aus der die Lipaseaktivität mit 257 U/l unter Verwendung der Glycerolstandardlösung berechnet wurde.

Beispiel 6

A. Herstellung des Reagenz

1) Reagenz 1

Reagenz 1 wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:
Solubilisiertes Substrat 50 ul/ml
(Reagenz 1 von Beispiel 2)
Colipase 1200 U/ml
Calciumchlorid 3,5 mM
Natriumdesoxycholat 6,0mM
Monoglyceridlipase 3,0 U/ml
Glyceroldehydrogenase 15 U/ml
Nicotinamidadenosin dinucleotid, oxydiert 6,0 mM
Dihydroxyacetonkinase 2,0 U/ml
Adenosin 5'-Triphosphat 4,0 mM
Magnesiumchlorid 2,0 mM
Trishydroxymethylamino-methan-Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 8,5) 100 mM

B. Messungen und Ergebnis

Reagenz 1(500 ul) wurde mit menschlichem Serum (20 ul) vermischt. Nach 2 Minuten wurde die Zunahme der Absorption bei 340 nm 3 Minuten lang gemessen und über 3 Minuten mit 0,036 ermittelt. Die Lipaseaktivität wurde daraus mit 50,2 U/l berechnet.
Es wird angenommen, daß die Reaktionen in diesem Beispiel wie folgt auftreten: Triolein Pankreaslipase Ca²&spplus; Colipase 2,3-Diolein 2-Monoolein Ölsäure Glycerol 1) ... Monoglyceridlipase, 2) ... Dehydroxyaceton, 3) ... Dihydroxyacetonkinase und 4) ... Dihydroxyacetonphosphat.

Beispiel 7

Nachdem 7 g Emulgen 709 (höherer Alkohol eines Polyoxyethylens, Trübungspunkt 56ºC) als nichtionisches Tensid in 63 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 56ºC oder mehr erwärmt. Beim Erreichen des Trübungspunkts wurde die Lösung trüb und zur trüben Flüssigkeit wurden 1,4 g Triolein hinzugefügt und das Ganze etwa 30 Minuten lang gerührt, während die Temperatur 56ºC oder mehr betrug. Das Erwärmen wurde unterbrochen und die Flüssigkeit unter Rühren belassen. Nach Abfallen der Temperatur auf Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit transparent und nach Transparentwerden der Flüssigkeit wurde sie mit 630 ml einer wäßrigen, 3% Ficoll enthaltenden Lösung (in Wasser leicht lösliche Polymerverbindung aus Saccharose und Epichlorhydrin hergestellt wird, Molekular-gewicht etwa 400.000, Pharmacia) als Bindemittel und 2 % Saccharose als Stabilisator enthaltenden Lösung verdünnt.
Die erhaltene wäßrige Lösung wurde in Gefäße (25 ml-Gefäß zur Lyophilisation) in einer Menge von 5 ml/Gefäß eingefüllt.
Die Lösungen wurden durch Abkühlen auf -50ºC gefroren und unter Vakuum getrocknet, um 140 Gefäße zu erhalten, die 0,352 bis 0,367 g/Gefäß (Feuchtigkeitsgehalt 2 % oder weniger) des lyophilisierten Triolein als wasserunlösliches Material enthaltenden Pulvers enthielten.

Beispiel 8

Nachdem 10 g Emulgen 707 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden war, wurden 5 g Natriumchlorid (Builder) hinzugefügt und bei Raumtemperatur (25ºC) gerührt. Die Flüssigkeit wurde trüb und in die trübe Flüssigkeit wurden 2 g Triolein gegeben und kräftig etwa 2 Stunden gerührt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde mit 10 mM Tris-Puffer (pH 7,9) auf das zehnfache Volumen verdünnt, um eine transparente Lösung zu erhalten. Anschließend wurden Natriumdesoxycholat (10 mM), Natriumchlorid (70 mM) und Colipase (30 U/dl) zu der transparenten Lösung gegeben. Der erhaltenen transparenten Lösung wurden Ficoll 400 (3 %) als Bindemittel und Saccharose (2 %) als Stabilisator hinzugefügt.
Die erhaltene wäßrige Lösung wurde in Gefäße in Mengen von 5 ml/Gefäß gegeben, durch Abkühlen auf -50ºC gefroren und unter Vakuum getrocknet, um 200 Gefäße zu erhalten, die 0,543 - 0,560 g/Gefäß (Feuchtigkeitsgehalt 2 % oder weniger) des lyophilisierten, Triolein als wasserunlösliches Material enthaltenden Pulvers zu enthielten.

Beispiel 9

Nachdem 10 g Emulgen 709 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols, Trübungspunkt 56ºC) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurden 10 g Natriumchlorid (Builder) hinzugefügt und bei Raumtemperatur (25ºC) gerührt. Die Flüssigkeit wurde trübe und in die trübe Flüssigkeit wurde 1 g Lecithin gegeben und kräftig etwa 3 Stunden lang gerührt. Die erhaltene Flüssigkeit (noch trüb) wurde mit 900 ml einer wäßrigen 5 % Lactat enthaltenden Lösung verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde in Gefäße in einer Menge von 5 ml/Gefäß gefüllt, durch Abkühlen auf -50ºC gefroren und unter Vakuum getrocknet, um 200 Gefäße zu erhalten, die 0,405 - 0,422 g/Gefäß (Feuchtigkeitsgehalt 2 % oder weniger) eines lyophilisierten, Lecithin als wasserunlösliches Material enthaltenden Pulvers enthielten.

Beispiel 10

Nachdem 10 g Emulgen 810 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols Trübungspunkt 60ºC) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 60ºC oder mehr erwärmt. Mit Erreichen des Trübungspunkts wurde die Lösung trübe und zu der trüben Flüssigkeit wurden 2 g Vitamin E hinzugefügt und das Ganze etwa 30 Minuten lang gerührt und währenddessen die Temperatur bei 60ºC oder mehr gehalten. Das Erwärmen wurde unterbrochen und die Flüssigkeit unter Rühren belassen. Mit Abfallen der Temperatur auf Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit transparent und nach Transparentwerden der Flüssigkeit wurde diese mit 900 ml einer wäßrigen 5 % Polyethylenglycol 6000 als Bindemittel enthaltenden Lösung verdünnt.
Die erhaltene wäßrige Lösung wurde in Gefäße in Mengen von 5 ml/Gefäß gefüllt, durch Abkühlen auf -50ºC gefroren und unter Vakuum getrocknet, um 200 Gefäße zu erhalten, die 0,385 - 0,400 g/Gefäß (Feuchtigkeitsgehalt 2 % oder weniger) des lyophilisierten, Vitamin E als wasserunlösliches Material enthaltendem Pulver enthalten.

Beispiel 11

Nachdem 10 g Emulgen 709 (Polyoxyethylen eines höheren Alkohols, Trübungspunkt 56ºC) als nichtionisches Tensid in 90 ml destilliertem Wasser gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 56ºC oder mehr erwärmt. Mit Erreichen des Trübungspunkts wurde die Lösung trüb und zu der trüben Flüssigkeit wurden 2 g Trilinolein hinzugefügt und das Ganze etwa 30 Minuten lang gerührt, während die Temperatur auf 56ºC oder mehr gehalten wurde. Das Erwärmen wurde unterbrochen und die Flüssigkeit unter Rühren belassen. Nach Abfallen der Temperatur unter Raumtemperatur wurde die Lösung transparent und nach Transparentwerden wurde sie mit 1900 ml TAPS-Puffer (10 mM, pH 8,6) der 1,5% Ficoll 400 (Bindemittel) und 1 % Saccharose (Stabilisator) verdünnt.
Die erhaltene wäßrige Lösung wurde in Gefäße in einer Menge von 5 ml/Gefäß gegeben, durch Abkühlen auf -50ºC gefroren und unter Vakuum getrocknet, um 400 Gefäße zu erhalten, die 0,298 - 0,316 g/Gefäß eines lyophilisierten, Trili nolein als wasserunlösliches Material enthaltenden Pulvers (Feuchtigkeitsgehalt 2 % oder weniger) enthielten.

Beispiel 12

1) Das im Gefäß in Beispiel 6 erhaltene lyophilisierte Pulver wurde durch Hinzufügen von 5 ml destilliertem Wasser gelöst und die Absorption (Trübung) bei 340 nm gemessen, um die fortlaufende Reproduzierbarkeit zu bestimmen. Die Ergebnisse für 50 Gefäße sind in Tabelle III gezeigt. Es ist aus Tabelle III ersichtlich, daß die wäßrige Flüssigkeit, die aus dem lyophilisierten Pulver erhalten wurde, eine hohe Transparenz und nur eine kleine Variation zwischen den Gefäßen aufwieß. Tabelle III Probe Nr. Absorption
n = 50
Mittel = 0,03632
SA = 0,001038
VK = 2,860
Max = 0,038
Min = 0,034
Bereich = 0,004
2) 50 aus Beispiel 6 erhaltene Gefäße wurden bei 4ºC 0 bis 550 Tage gelagert. Das lyophilisierte Pulver wurde nacheinander mit 5 ml destilliertem Wasser zu einer wäßrigen Lösung umgewandelt. Der Gehalt an Triolein, der umgewandelten Lösung wurde mittels eines herkömmlichen Verfahrens zur Bestimmung von Triglycerid nach Eliminierung freien Glycerols gemessen und die Absorption (Trübung) bei 340 nm ebenfalls bestimmt sowie die Lipaseaktivität in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Beispiel 4 gemessen. Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt.
Aus Figur 2 wird deutlich, daß das lyophilisierte, erfindungsgemäß hergestellte Produkt eine stabile, ein solubilisiertes Triolein mit einem konstanten Gehalt enthaltende wäßrige Lösung zu bilden vermag, wobei eine konstante Trübung und Aufrechterhaltung der Lipaseaktivität über einen langen Lagerungszeitraum gezeigt wird.

Claims

1. Lyophilisat einer transparenten und stabilen, wäßrigen Lösung einesSubstrats zur Bestimmung von Lipase, enthaltend gleichförmig solubilisiertes Triglycerid, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die Stufen des Vermischens des Triglycerids und des nichtionischen Tensids in einer wäßrigen Flüssigkeit bei einer Temperatur eines Trübungspunkts der das Tensid enthaltenden Flüssigkeit oder darüber, des Abkühlens unter Rühren zu einer Temperatur unter dem Trübungspunkt zur Bildung einer transparenten Lösung und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisierungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose, Oligozuckern, Dextran, Carboxymethylcellulose, Lactose und einem synthetischen Polymer, hergestellt aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, einer inneren Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung (α)20D = ± 56,50 in einer Menge von 1 bis 10 Gew.%/Volumen, Albumin in einer Menge von 1 bis 5 Gew. %/Volumen und Kaliumchlorid und Glycin in einer Menge von 5 bis 10 Gew.%/Volumen.

2. Lyophilisat einer transparenten und stabilen wäßrigen Lösung eines Substrats zur Bestimmung von Lipase, enthaltend gleichförmig solubiliesiertes Triglycerid, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend die Stufen des Hinzufügens des Triglycerids unter Rühren zu einer wäßrigen, ein nichtionisches Tensid enthaltenden Flüssigkeit, während die Flüssigkeit auf einer Temperatur eines Trübungspunkts der Flüssigkeit des nichtionischen Tensids oder darüber gehalten wird, obwohl der Trübungspunkt durch Hinzufügen eines Builders gesenkt worden ist, des Verdünnens der erhaltenen Lösung mit einer wäßrigen Flüssigkeit, um dadurch die Konzentration des Builders zu verringern und den Trübungspunkt zu erhöhen,um eine transparente Lösung zu erhalten, und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose, Oligozuckern, Dextran, Carboxymethylcellulose, Lactose und einem synthetischen Polymer, hergestellt aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, einer inneren Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung von (α)20D = 56.5º in einer Menge von 1 bis 10 Gew.%/Volumen, Albumin in einer Menge von 1 bis 5 Gew.%/Volumen und Kaliumchlorid und Glycin in einer Menge von 5 bis 10 Gew.%/Volumen.

3. Lyophilisat nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend Triglycerid in einer Menge von etwa 0,0005 Gew.% oder mehr und ein nichtionisches Tensid in einer Menge von 0,005 Gew.% oder mehr.

4. Ein Lyophilisat nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend zusätzlich ein Mittel zur Beschleunigung der Lipaseaktivität, welches während der Herstellung der Lösung oder nach der Herstellung, aber vor der Benutzung eingebracht wird.

5. Transparente wäßrige Lösung, erhältlich durch Lösen des Lyophilisats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Wasser oder in einer Pufferlösung.

6. Verfahren zur Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe, enthaltend die Stüfen des in Berührung bringen der die unbekannte Menge Lipase enthaltenden Probe mit der wäßrigen Lösung nach Anspruch 5 in Gegenwart eines Mittels zur Beschleunigung der Lipaseaktivität und gegebenenfalls Monoglyceridlipase, zur Bildung einer Fettsäure und Glycerol und des Ausführens der Bestimmung der erhaltenen Feftsäure oder des Glycerols.

7. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Produkts, das zur Bildung einer transparenten und stabilen wäßrigen Lösung eines Triglyceridsubtrats zur Bestimmung von Lipase geeignet ist, enthaltend die Stufen des Vermischens des Triglycerids und des nichtionischen Tensids in einer wäßrigen Flüssigkeit bei einer Temperatur eines Trübungspunkts, der das Tensid enthaltenden Flüssigkeit oder darüber, des Abkühlens unter Rühren auf eine Temperatur unter dem Trübungspunkt zur Bildung einer transparenten Lösung und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose, Oligozuckern, Dextran, Carboxymethylcellulose, Lactose und einem synthetischem Polymer, hergestellt aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, einer inneren Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung (α)20D = + 56.5º in einer Menge von 1 bis 10 Gew.%/Volumen, Albumin in einer Menge von 1 bis 5 Gew.%/Volumen und Kaliumchlorid und Glycin in einer Menge von 5 bis 10 Gew.%/Volumen.

8. Verfahren zur Herstellung eines lyophilisierten Produkts, das zur Bildung einer transparenten und stabilen wäßrigen Lösung eines Triglyceridsubstrats zur Bestimmung der Lipase geeignet ist, enthaltend die Stufen des Hinzufügens des Triglycerids unter Rühren zu einer wäßrigen, ein nichtionisches Tensid enthaltenden Flüssigkeit, während die Flüssigkeit bei einer Temperatur eines Trübungspunkts der Flüssigkeit des nichtionischen Tensids oder darüber gehalten wird, obwohl der Trübungspunkt durch Hinzufügen eines Builders gesenkt worden ist, des Verdünnens der erhaltenen Lösung mit einer wäßrigen Flüssigkeit zur Verringerung der Konzentration des Builders und zur Erhöhung des Trübungspunkts der erhaltenen transparenten Lösung, und des anschließenden Lyophilisierens der so erhaltenen Lösung mit einem Bindemittel oder Stabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Saccharose, Oligozuckern, Dextran, Carboxymethylcellulose, Lactose und einem synthetischen Polymer, hergestellt aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren Molekulargewicht von 400.000 ± 100.000, einer inneren Viskosität von etwa 0,17 dl/g und einer spezifischen Drehung (α)20D = + 56.5º in einer Menge von 1 bis 10 Gew.%/Volumen, Albumin in einer Menge von 1 bis 5 Gew.%/Volumen und Kaliumchlorid und Glycin in einer Menge von 5 bis 10 Gew.%/Volumen.

9. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, worin ein Mittel zur Beschleunigung der Lipaseaktivität in die Lösung vor der Lyophilisierungsstufe eingebracht worden ist.

10. Verfahren zur Herstellung einer transparenten wäßrigen Lösung eines Substrats nach Anspruch 5 zur Bestimmung der Lipaseaktivität in einer Probe, gekennzeichnet durch Lösen eines Lyophilisats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Wasser oder einer Pufferlösung.