DE2828658C3 - Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür - Google Patents
Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfürInfo
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Description
Im menschlichen Gewebe gibt es zwei verschiedene Untereinheiten dieses Enzyms, nämlich M und B. Die
aktive enzymatische Einheit besteht immer aus zwei Untereinheiten, die miteinander zu drei verschiedenen
Isoenzymen zusammentreten können, nämlich dem Muskeltyp (CK-MM), dem Gehirntyp (CK-BB) und dem
Hybridtyp (CK-MB), welcher praktisch nur im myokar-
10
1. Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatin-kinase (CK-B) in
gepufferter wäßriger Lösung durch Umsetzung mit Creatin-phosphat, ADP und dem System Luciferase/
D-Luciferin in Gegenwart eines spezifischen Antikörpers gegen die Untereinheit M der Creatin-kinase,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von L-Luciferin durchgeführt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Diadenosinpentaphosphat zugesetzt
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ADP in einer Menge von 10~5
bis 2 χ ΙΟ-4 Μ zugesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei pH 6,5 bis 7,8
gearbeitet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer Pufferkonzentration zwischen
10 und 25OmM bevorzugt bei 45 mM gearbeitet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Thiolschutzreagens,
insbesondere N-Acetylcystein, Glutathion, Dithiothreit oder Dithioerythrit, zugesetzt
wird.
7. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 6, enthaltend Creatin-phosphat, ADP,
Luciferase, D-Luciferin, L-Luciferin, Antikörper gegen CK-M, Diadenosinpentaphosphat, SH-Reagens,
Magnesiumsalz und Puffer sowie gegebenenfalls Stabilisatoren oder/und Komplexierungsmittel.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es
bis 200 μg/ml
bis 200 μg/ml
0,5 bis 20 μg/ml
bis 200 μg/ml
0,5 bis 20 μg/ml
χ ΙΟ-8 bis 5 χ 10-6M
bis 10OmM
bis 100 mM
bis 25OmM
bis 100 mM
bis 25OmM
und gegebenenfalls
0,1 bis 10 g/l
bis 5 mM
bis 5 mM
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatin-kinase
(CK-M), insbesondere im Serum, und ein hierfür geeignetes Reagens.
Das Enzym Creatin-kinase (EC 2.7.3.2) katalysiert die Umsetzung
Luciferase
D-Luciferin
L-Luciferin
CK-Antikörper Diadenosinpentaphosphat
Thiolreagens
Magnesiumacetat Imidazol-acetat-puffer
D-Luciferin
L-Luciferin
CK-Antikörper Diadenosinpentaphosphat
Thiolreagens
Magnesiumacetat Imidazol-acetat-puffer
Rinderserumalbumin EDTA
enthält.
9. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
bis 15 mM
lxl0-5bis5xl0"5M
10bis30μg/ml
bis 100μg/ml
lxl0-5bis5xl0"5M
10bis30μg/ml
bis 100μg/ml
bis 10 μg/ml
IxIO-7WsIxIO-6M
bis 50 mM
bis 2OmM
bis 12OmM
bis 2OmM
bis 12OmM
und gegebenenfalls
0,5 bis 2 g/l
0,5 bis 1OmM
0,5 bis 1OmM
enthalt.
Creatin-phosphat ADO
Luciferase
D-Luciferin
L-Luciferin
CK-Antikörper Diadenosinpentaphosphat
Thiolreagens
Magnesiumacetat Imidazol-acetat-puffer
Luciferase
D-Luciferin
L-Luciferin
CK-Antikörper Diadenosinpentaphosphat
Thiolreagens
Magnesiumacetat Imidazol-acetat-puffer
Rinderserumalbumin EDTA
Creatin + ATP dialen Gewebe vorkommt. Bei einem Herzinfarkt tritt das Hybridenzym CK-MB auch im Serum auf. Dieses
Isoenzym CK-MB ist daher für die Diflerentialdiagnose des akuten Herzinfarkts von großer Bedeutung.
Aus Clinica Chimica Acta 73 (1976), 445 bis 451 ist bereits ein Verfahren zur Bestimmung des Isoenzyms
CK-MB bekannt, welches letztlich auf der Bestimmung der Untereinheit CK-B beruht. Dies ist möglich, weil das
Gehirnenzym CK-BB, welches ebenfalls die Untereinheit CK-B enthält, normalerweise im Serum überhaupt
nicht auftritt und daher sämtliche dort vorgefundene CK-B-Aktivität dem Isoenzym CK-MB zukommt. Nach
dem bekannten Verfahren erfolgt die Bestimmung, indem das in der oben angegebenen Reaktion der
Creatin-kinase gebildete ATP gemäß folgender Glei- ■
chung bestimmt wird:
ATP + D-Glucose ^ ADP + D-Glucose-6-phosphat
D-Glucose-6-phosphat + NADP ^L^ Q.Gluconolaclon-ö-phosphat + NADPH
Die Bestimmung wird spezifisch für CK-MB, indem man in Gegenwart eines die Untereinheit M der
Creatin-kinase (CK-M) spezifisch hemmenden Antikörpers arbeitet.
Wesentlicher Nachteil dieser bekannten Methode ist einerseits eine Empfindlichkeit, die zu wünschen übrig
läßt, und außerdem das Auftreten einer Lag-phase, die zwar etwas temperaturabhängig ist, sich in der Regel
aber nicht unter 90 Sekunden herabdrücken läßt. Diese Lag-phase hat zur Folge, daß bei Anwendung des
Verfahren" auf Analysenautomaten deren Frequenz nicht ausgenützt werden kann und die Durchführung auf
bestimmten schnellen Automaten überhaupt nicht möglich ist. Außerdem ist der CK-B-Spiegel beim
Herzinfarkt im Serum nur sehr niedrig und aufgrund der nicht besonders hohen Empfindlichkeit des bekannten
Verfahrens lassen sich die dabei auftretenden Aktivitäten nicht mehr mit der angestrebten Sicherheit
bestimmen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung der Untereinheit B der
Creatin-kinase zu schaffen, welches die oben erwähnten Nachteile des bekannten Verfahrens nicht aufweist,
insbesondere ein Verfahren zu schaffen, bei dem keine Lag-phase auftritt, die Empfindlichkeit wesentlich
gesteigert ist gegenüber dem bekannten Verfahren und durch Linearisierung der Reaktion auch eine kinetische
Messung möglich wird.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur photometrischen Bestimmung der
Untereinheit B der Creatin-kinase (CK-B) in gepufferter wäßriger Lösung durch Umsetzung mit Creatinphcsphat,
ADP und dem System Luciferase/D-Luciferin in Gegenwart eines spezifischen Antikörpers gegen die
Untereinheit M der Creatin-kinase, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Bestimmung in Gegenwart
von L-Luciferin durchgeführt wird.
Bekannt war bereits ein Verfahren zur Bestimmung der Creatin-kinase (nicht der Untereinheit B) unter
Anwendung des Luciferase-D-Luciferin-systems (Analytical Biochemistry 80 [1977] 496 bis 501). Bei diesem
Verfahren wird gereinigte Luciferase zusammen mit D-Luciferin, ADP, Creatin-phosphat, Magnesiumsulfat
und Puffer eingesetzt Die Lichtemission tritt hier jedoch als Blitz auf, was die praktische Anwendung
erschwert und eine kinetische Bestimmung unmöglich macht Erst durch die Kombination dieses Verfahrens
mit der Antikörperhemmung der Untereinheit M und dem L-Luciferin-zusatz wurde es möglich, die Untereinheit
B zu bestimmen und gleichzeitig eine kontinuierliche, der Enzymaktivität der Untereinheit B der CK
proportionale Lichtemission zu schaffen, welche die kinetische Verfolgung der Lichtemission ermöglicht Es
war weder vorhersehbar, daß auch in Gegenwart des Antikörpers gegen die Untereinheit M die Luciferasereaktion
quantita*iv ablaufen würde noch war vorhersehbar, daß es möglich sein würde, die Emission eines
Lichtblitzes in eine kontinuierliche, längerdauernde Emission über mehrere Minuten umzuwandeln und
dabei gleichzeitig auch die Lag-phase zu eliminieren.
Luciferase wird aus der amerikanischen Firefly (Photinus pyralis) gewonnen und läßt sich nach
bekannten Verfahren reinigen. Im Rahmen der Erfindung wird vorzugsweise ein möglichst reines Luciferase-präparat
eingesetzt, weil rohe Luciferase-präparate Störstoffe enthalten Luciferase katalysiert die Reaktion
D-Luciferin + ATP + O2 >
Oxyiuciferin + CO2 +AMP + PPi (Pyrophosphat) Licht.
Die Menge des emittierten Lichts ist der ATP-Konzentration direkt proportional.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird zweckmäßig die Luciferase in einer Menge zwischen etwa 5 und etwa
lOO^g/ml, vorzugsweise von 10 bis 30 μg/ml, bezogen
auf reine Luciferase, eingesetzt. Für das D-Luciferin beträgt die Menge in der Testlösung zweckmäßig
zwischen 25 und 200 μg/ml, vorzugsweise zwischen 50 und 100|ig/ml.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird außerdem Diadenosinpentaphosphat
zugesetzt. Zweckmäßig werden etwa 5xlO~8 bis
5 χ 10"6M zugesetzt. Etwa auftretende Reststörungen
durch Myokinase lassen sich vorteilhafterweise ausschalten, indem mit einer möglichst niedrigen Konzentration
von ADP gearbeitet wird. Diese Konzentration liegt im allgemeinen zwischen 1 χ 10~5 und 2 χ ΙΟ-4 M,
vorzugsweise zwischen 1 χ 10 -5 und 5 χ 10 -5 M.
L-Luciferin wird zweckmäßig in einer Menge zugesetzt, die eine mindestens 25%ige Inhibierung der
Luciferase-reaktion ergibt. Die Hemmung soll jedoch 95% nicht überschreiten. Bevorzugt wird der Zusatz
einer Menge, die eine Hemmung von 50 bis 90% bewirkt. Bei den oben angegebenen, bevorzugten
Bereichen für den Zusatz von Luciferase und D-Luciferin beträgt der Zusatz an L-Luciferin vorzugsweise 1 bis
l
Außerdem wird üblicherweise ein geeignetes Magnesiumsalz, wie Magnesiumacetat, zugesetzt. Ein Zusatz
üblicher Stabilisierungsmittel für Enzyme, wie Rinderserumalbumin und dergleichen, öder/und von Komplexierungsmitteln,
wie EDTA, ist möglich.
Die Art des verwendeten Puffers ist unkritisch.
Die Art des verwendeten Puffers ist unkritisch.
Geeignet sind beispielsweise Imidazol-acetat-puffer, Tris-acetat-puffer, Tri-äthanolamin-acetat-puffer oder
Phosphat-puffer. Bevorzugt wird Imidazol-acetat-puffer. Der durch den Puffer eingestellte pH-Wert soll im
Bereich von 6,5 bis 7,8, vorzugsweise von 6,7 bis 7,0 liegen. Die Pnfferkonzentration kann in weiten Grenzen
variiert werden. So erwiesen sich sowohl Konzentrationen von 10 als auch von 250 mM als geeignet. Bevorzugt
werden 60 bis 120 mM.
Zweckmäßig wird der Reaktionslösung außerdem ein Thiolschutzreagens zugesetzt, wie N-Acetylcystein (NAC), Glutathion, Dithiothreit oder Dithioerythrit. Bevorzugt wird NAC. Der bevorzugte Konzentrationsbereich für dieses Reagens liegt zwischen 2 und 50 mM. Creatin-phosphat wird üblicherweise im Überschuß zugesetzt. Ein bevorzugter Bereich sind 5 bis 30 mM, besonders bevorzugt werden 8 bis 15 mM.
Zweckmäßig wird der Reaktionslösung außerdem ein Thiolschutzreagens zugesetzt, wie N-Acetylcystein (NAC), Glutathion, Dithiothreit oder Dithioerythrit. Bevorzugt wird NAC. Der bevorzugte Konzentrationsbereich für dieses Reagens liegt zwischen 2 und 50 mM. Creatin-phosphat wird üblicherweise im Überschuß zugesetzt. Ein bevorzugter Bereich sind 5 bis 30 mM, besonders bevorzugt werden 8 bis 15 mM.
Ein Reagenz zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält Creatin-phosphat, ADP, Luciferase,
D-Luciferin, L-Luciferin, Antikörper gegen CK-M, Diadenosinpentaphosphat, SH-Reagens, Magnesiumsalz
und Puffer sowie gegebenenfalls Stabilisatoren oder/und Komplexierungsmittel.
Im Rahmen der Erfindung verwendbare Komplexierungsmittel
sind beispielsweise Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Nitrilotriessigsäure.
Bevorzugt enthält das Reagens in lyophilisierter oder mit Wasser rekonstituierter Form die genannten
Bestandteile in nachstehend aufgeführten Mengen:
Creatin-phosphat
ADP
Luciferase
D-Luciferih
L-Luciferin
CK-M-Antikörper*)
Diadenosinpenlaphosphat
Thiolreagens
Mngnesiumacetat
ImidazolacetatpufTer
und gegebenenfalls
Rinderserumalbumin
EDTA
Bevorzugt
8-15 mM 1X1O"5-5X1O"5M
10-30 ug/ml 50-100 ug/ml
1-10 ug/ml
1X10 "-1X10"6 2-50 mM 5-20 mM
60-120 niM
0,5-2 g/l 0,5-10 mM
Allgemein
Ausreichend, um eine CK-MM-Aktiviiät von 1000 U/l Probelösung
inhibieren.
5-50 mM
IX 10^-2XlO"1 M
5-200 ug/ml
25-200 ug/ml
0,5-20 ug/ml
IX 10^-2XlO"1 M
5-200 ug/ml
25-200 ug/ml
0,5-20 ug/ml
5X1O"S-5X1O"'' M
1-100 mM
1-100 mM
10-250 mM
1-100 mM
1-100 mM
10-250 mM
0,1-10 g/I
1-5 mM
bei 25 C vollständig zu
Das Reagens kann in vorgemischter Form oder in Form mehrerer, wiederum aus einigen Bestandteilen
zusammengesetzter Vormischungen als Testkit vorliegen. Falls es aus einer Vormischung sämtlicher jo
Bestandteile besteht, erfolgt der Start der Reaktion durch Zusatz der zu bestimmenden Probelösung,
vorzugsweise einer Serumprobe. Falls eine Vorinkubation mit der Serumprobe gewünscht wird, fügt man
wenigstens einen der für die Reaktion notwendigen Bestandteile, beispielsweise ADP oder/und Creatinphosphat,
erst am Ende der Inkubationsperiode zu.
Durch das Verfahren und Reagens der Erfindung wird es möglich, die Bestimmung der Untereinheit B der
Creatin-kinase mit wesentlich höherer Empfindlichkeit durchzuführen als dies bisher möglich war. Gleichzeitig
läßt sich das Verfahren infolge Wegfall der Lag-phase besser auf Analysenautomaten durchführen.
Ein Antikörper gegen Creatin-kinase-untereinheit M ist bekannt er läßt sich erhalten durch Immunisierung
von Versuchstieren, vorzugsweise Ziegen, mit Isoenzym CK-MM und Gewinnung der antikörperhaltigen Fraktion
aus dem Serum. Ein geeignetes Gewinnungsverfahren ist beispielsweise beschrieben in Clinica Chimica
Acta73(1976)S.446.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
| B eis | ungen | piel 1 | Endkonzen |
| Konzentra | tration im | ||
| tion in der | Test | ||
| Luciferase-reagens | Lösung | ||
| reine Luciferase | 2 ug/ml | ||
| D-Luriferin | 10 -/g/ml | 50 ug/ml | |
| L-Luciferin | 250 ug/ml | 4 ug/ml | |
| Rindcrserumalbumin | 20 ug/ml | 1 mg/ml | |
| (RSA) | 5 ug/ml | ||
| Mimnesiumacetat | 1OmM | ||
| 50 mM | |||
| Lösungen | Konzentra | Lndkonzen- |
| tion in der | !ration im | |
| Lösung | Test | |
| b) Puffer | ||
| Imidazolacetat | 143 mM | 100 mM |
| EDTA | 2,9 mM | 2 mM |
| N-Acetylcystein | 14,3 mM | 10 mM |
| (NAC) | ||
| c) ADP-Reagens | ||
| ADP | 5X10 4 M | 10 5 M |
| Ap5A | 5X10 "M | 10"7M |
| Imidazolacetat | 100 mM | 100 mM |
| d) Creatin-phosphat | 0,5 M | 1OmM |
| e) ATP-Standard- | 10 5 M | 2X10"7 M |
| lösung | ||
| Testvorschrift |
Es werden zusammengegeben:
0,2 ml Luciferase-reagens
0,7 ml Puffer
bis 50 μΐ Serum-probe
μΐ CK-M-Antikörperlösung
Nach 15 Minuten Inkubation bei 25°C werden zugegeben:
" 20 μΐ ADP-Reagens und
μΐ Creatin-phosphat-lösung.
Der Anstieg der Lichtemission wird mit einem
kommerziellen Gerät und Schreiber verfolgt. Die
t>o Steigung wird ermittelt. Dann werden 20 μΐ ATP-Lö-
sung als interner Standard zugegeben. Die Erhöhung
der Signalamplitude wird als Eichung verwendet
Die Figur der Zeichnung zeigt den typischen Zeitverlauf des dabei erhaltenen Lichtsignals.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Reagens werden 2 mg Luciferase, 5 mg D-Luciferin, 400 μg
L-Luciferin, 100 mg Rinderserumalbumin, 1 mMol
Magnesiumacetat, 10 mMol Imidazol-acetat, pH 6,7, 0,2 mMol EDTA, 1 mMol N-Acetylcystein, 10~6 MoI ADP,
10~8 Mol Diadenosinpentaphosphat und 1 mMol Creatin-phosphat in 94 ml Wasser gelöst und lyophilisiert.
Zur Rekonstitution vor Gebrauch wird wieder in 94 ml Wasser aufgenommen. Die Reagensmenge reicht
für die Durchführung von 100 Tests. Das Reagens ist zum Start durch Zugabe der Creatin-kinase-haltigen
Serumprobe bestimmt.
Beispiel 3
Testkit: für 100 Tests
Testkit: für 100 Tests
I. Luciferase-reagens
Lyophilisat mit 20 ml Wasser aufnehmen
enthält:
2 mg Luciferase
5 mg D-Luciferin
400 μg L-Luciferin
100 mg Rinderserumalbumin
1 mMol Magnesiumacetat
II. Puffer
Lyophilisat in 70 ml Wasser aufnehmen enthält:
10 mMol Imidazol-acetat, pH 6,7 0,2 mMol EDTA
1 mMol N-Acetylcystein
2 ml CK-M-Antikörperlösung
III. ADP-Reagens
Lyophilisat in 2 ml Wasser aufnehmen enthält:
10-6MoIADP
10-8MoIAp5A
200 mMol Imidazol-acetat, pH 6,7.
10-8MoIAp5A
200 mMol Imidazol-acetat, pH 6,7.
IY. Creätin-phosphat
Lyophilisat in 2 ml Wasser lösen
enthält:
Lyophilisat in 2 ml Wasser lösen
enthält:
1 mMol Creatin-phosphat
Dieser Testkit ermöglicht die Vorinkubation mit der zu bestimmenden Probe. Der Start erfolgt wie in
Beispiel 1 beschrieben durch Zugabe der entsprechenden Menge der Lösungen III. und IV.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
130 243/282
Claims (1)
- Patentansprüche:5 bis 50 mMIx ΙΟ-5 bis 2 χ 10-4MCreatin-phosphat
ADPCreatin-phosphat + ADP
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2828658A DE2828658C3 (de) | 1978-06-29 | 1978-06-29 | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
| US06/050,518 US4235961A (en) | 1978-06-29 | 1979-06-21 | Method for photometric determination of the subunit B of creatine kinase and a reagent for carrying out the method |
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| GB7922474A GB2026156B (en) | 1978-06-29 | 1979-06-28 | Determination of creatine kinase sub-unit |
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|---|---|---|---|
| DE2828658A DE2828658C3 (de) | 1978-06-29 | 1978-06-29 | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| DE2828658B2 DE2828658B2 (de) | 1980-08-21 |
| DE2828658C3 true DE2828658C3 (de) | 1981-10-22 |
Family
ID=6043140
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE2828658A Expired DE2828658C3 (de) | 1978-06-29 | 1978-06-29 | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
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- 1979-06-28 GB GB7922474A patent/GB2026156B/en not_active Expired
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