DE2162325C3 - Verfahren zur Bestimmung von Fettsäureglycerinestern und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Fettsäureglycerinestern und Reagens zur Durchführung des Verfahrens

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs I.
Die Bestimmung von Fettsnureglycerinestern ist in vielen Bereichen und insbesondere in der klinischen v. Biochemie von Wichtigkeit. Besondere Bedeutung kommt der Bestimmung von Fettsäureglycerinestern im menschlichen Serum zu. da erhöhte Werte von großer diagnostischer Bedeutung sind. Die Fettsäureglycerinester im Serum werden im allgemeinen vereinfacht als mi Triglyceride bezeichnet.
Bekannte Verfahren, die auf der Bestimmung des Fettsäureanteils beruhen, haben ebenso wie Verfahren, bei denen aus anderen Quellen freigesetztes Glycerin bei der Glycerinbestimmung mitbestimmt wird, ver- h> schiedene Nachteile.
Nach einem bekannten Verfahren werden die Fettsäureglycerinester alkalisch hydrolysiert, und das freigesetzte Glycerin wird anschließend enzymatisch bestimmt, vgl. R. Richterich, Klinische Chemie, 2. erweiterte Auflage, S. Karger, Basel 1968, Seiten 272 bis 278 mit weiteren Nachweisen. Auch diese Methode hat Nachteile, da die alkalische Hydrolyse bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden muß. Ein schnelles und genaues Verfahren zur ausschließlichen und vollständigen Bestimmung von Fettsäureglycerinestern ist im klinischen Bereich sehr erwünscht, da die bisher bekannten Verfahren im allgemeinen nicht völlig zufriedenstellend verlaufen.
Aus Comptes Rendus Acad. Sc. Paris, Bd. 259 (1964) Seiten 4394 bis 4396 ist bekannt, daß eine aus Rhizopus-Stämmen isolierte Lipase zur Spaltung von Triglyceriden geeignet ist Nachteilig ist hierbei jedoch die geringe Spaltungsgeschwindigkeit Zur Beschleunigung wird deshalb z. B. der Zusatz von Calciumionen empfohlen. Calciumionen bilden jedoci mit den freigesetzten Fettsäuren unlösliche Seifen, die zu Trübungen führen und damit die spektroskopische Messung erschweren und verfälschen. Die gleichen Nachteile weist der in der DE-PS 20 00 127 beschriebene Vorschlag auf, für die enzymatische Spaltung von lipoproteingebundenen Tri-, Di- und Monoglyceriden gegebenenfalls zusammen mit proteinfreien Neutralfetten eine aus Rhizopus arrhizus gewonnene Lipase einzusetzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und genaues Verfahren und ein Reagens zu schaffen, bei dem Glycerin aus Fettsäureester!!, z. B. in wäßrigen Medien, wie Serum oder Milch, freigesetzt wird, und das es erlaubt, das Glycerin nach einer Vielzahl von Methoden ohne vorherige Isolierung aus der zu untersuchenden Flüssigkeit enzymatisch zu bestimmen.
Diese Aufgabe wird gemäß dem kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 gelöst. Das Reagenz zur Durchführung des Verfahrens geht aus Anspruch 7 hervor. Ausgestaltungen des Verfahrens und des Reagenz sind in den Ansprüchen 2 bis 6 bzw. 8 bis 11 beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine den zu bestimmenden Fettsäureglycerinester enthaltende wäßrige Flüssigkeit mit einem Gemisch aus einer Lipase und einer Protease versetzt. Die erfindungsgemäß verwendete Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein. Vorzugsweise wird eine Lipase mikrobiellen Ursprungs, z. B. die rohe oder gereinigte Lipase aus Chromobacterium viscosum, variant paralipolyticum, oder die gereinigte Lipase aus Rhizopus delemar (vgl. Fukumoto et al., J. Gen. Appl. Microbiol., Band 10 [1964], Seiten 257 bis 265) eingesetzt. Als Protease kann erfindungsgeniaß eine allgemein übliche Protease verwendet werden. Spezielle Beispiele solcher Proteasen sind Chymotrypsin, Trypsin, Streptomyces griseus-Protease, Elastase, Papain und Bromelain. Eine besonders bevorzugte Protease ist A-Chymotrypsin. Es können auch Gemische von Proteasen verwendet werden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist im allgemeinen ein Gemisch aus einer Lipase und einer Protease ausreichend, obwohl die Hydrolyse im allgemeinen durch einen Zusatz eines Proteins, wie Serumalbumin, Eialbumin oder Globuline, etwas beschleunigtwird.
Das erfindungsgemäß freigesetzte Glycerin kann nach einer Vielzahl von bekannten Verfahren bestimmt werden. Einige Beispiele sind nachstehend beschrieben.
Gemäß diesem bevorzugten Verfahren wird die enzymatische Hydrolyse der Triglyceride mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Lipase-Protease-Gemisch in Gegenwart der Bestandteile von drei weiteren Enzymsystemen durchgeführt. Hierbei wird das freigesetzte Glycerin zunächst mit Adenosintriphosphat mittels des Enzyms Glycero —Kinase in Glycerin-1 -phosphat umgewandelt, wobei Adenosindiphosphat gebildet wird.
Das entstandene Adenosindiphosphat wird mit Phosphoenolpyruvat mit Hilfe des Enzyms Pyruvat-Kinase wieder in Adenosintriphosphat überführt, wobei
aus dem Phosphoenolpyruvat Pyruvat gebildet wird. Das entstandene Pyruvat wird mit reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid mit Hilfe des Enzyms Lactat-Dehydrogenase zu Lactat und oxydiertem Nicotinamidadenindinucleotid umgesetzt Da sämtliche zur Durchführung der genannten Reaktionen notwendigen Bestandteile in dem Gemisch enthalten sind, nimmt mit fortschreitender Hydrolyse des Triglycerids die optische Dichte der Testlösung bei 340 nm wegen der fortschreitenden Oxydation des Nicotinamidadenindinucleotids ab. Diese enzymatischen Reaktionen sind nachstehend schematisch zusammengestellt:
Enzymatische Hydrolyse (Lipase-Protease-Gemisch Triglyceride ► Glycerin + freie Fettsäuren
Glycero-Kinase Glycerin + Adenosintriphosphat > Glycerin-1-phosphat
-I- Adenosindiphosphat
Pyruvat-Kinasc Adenosindiphosphat + Phosphoenolpyruvat ► Adenosintriphosphat
+ Pyruvat
Lactat-Dchydrogenase Pyruvat + NADH — > Lactat + NAD
NAD = Oxydiertes Nicotinamickdenindinucleotid (absorbiert nicht bei 340 nm) NADH = Reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid (absorbiert stark bei 340nm; molarer Extinktionskoeffizient = 6,22 χ ΙΟ3).
Die zur Durchführung d::ses V< /fahrens erforderlichen Reagentien werden vorzugsweise in zwei getrennten Behältern, wie Glasfläschche? zur Verfügung gestellt. Ein Behälter A kann sämtliche zur Durchführung der Bestimmung benötigten Bestandteile mit der Ausnahme von Glycero-Kinase enthalten. Die Glycero-Kinase kann in dem Behälter B enthalten sein. Es sind auch andere Verteilungen der Bestandteile möglich, wobei die Bestandteile, die nur an der Glycerinumwandlung und den nachfolgenden Reaktionsstufen beteiligt sind, in dem Behälter B enthalten sein können.
Gemäß einer anderen Verfahrensweise kann das freigesetzte Glycerin auch dadurch bestimmt werden, daß man das reduzierte Nicotinamidadenindinucleotid und die Lactat-Dehydrogenase aus dem vorstehend beschriebenen Gemisch wegläßt, so daß nur die ersten drei Reaktionen des vorstehend aufgeführten Reaktionsschemas ablaufen. Das Gemisch wird hierbei mit einer zur Umsetzung des im dritten Reaktionsschritt entstandenen Pyruvats ausreichenden Menge Dinitrophenylhydrazin versetzt. Das so erhaltene Reaktionsprodukt ist im alkalischen Medium gefärbt und kann auf einfache Weise kolorimetrisch bestimmt werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, das Phosphoenolpyruvat, die Pyruvat-Kinase, die Lactat-Dehydrogenase und das reduzierte Nicotinamidadenindinucleotid aus dem vorstehend beschriebenen Gemisch weggelassen und dafür Glycerin-l-phosphat-Dehydrogenäse und oxydiertes Nieotinamidadenindinueleotid zuzusetzen, wobei Glycerin-!-phosphat und das oxydierte Nicotinamidadenindinucleotid in Dihydroxyacetonphosphat und reduziertes Nicotinamidadenindinucleotid umgewandelt werden. Die gebildete Menge an reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid, die proportional ist zur ursprünglich vorhandenen Menge an Triglycerid, kann in üblicher Weise durch die Zunahme der Fluoreszenz bestimmt werden. Gemäß einer Abänderung kann dem vorstehend beschriebenen
» System eine ausreichende Menge Dinitrophenylhydrazin zugesetzt werden, das mit dem gebildeten Dihydroxyacetonphosphat unter Bildung eines gefärbten Produktes reagiert. Die Menge dieses Produktes läßt sich leicht kolorimetrisch bestimmen und ist gleichfalls ein Maß für die ursprünglich vorhandene Menge an Triglycerid.
Ferner kann die Glycerinbv-stimmung mit einem Gemisch durchgeführt werden, das nur die in der ersten Reaktionsstufe des vorstehenden Schemas beschriebene enzymatische Hydrolyse der Fettsäureglycerinester erlaubt. Das Gemisch enthält jedoch noch oxydiertes Nicotinamidadenindinucleotid und Glycerin-Dehydrogenase. Das freigesetzte Glycerin wird hierbei in Dihydroxyaceton ur.ter gleichzeitiger Bildung von
w reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid überführt. Der Anstieg der optischen Dichte bei 340 nm ist, wie vorstehend beschrieben, ein Maß für die ursprünglich vorhandene Menge an Triglycerid. Eine geeignete Glycerin-Dehydrogenase ist aus Enterobacter aeroge-
>i nes herstellbar; dieses Enzym ist im Handel erhältlich. Gemäß einer Abänderung kann das Reaktionsgemisch mit Dinitrophenylhydrazin versetzt werden, wobei ein gefärbtes Reaktionsprodukt mit Dihydroxyaceton entsteht, das kolorimetrisch bestimmt werden kann.
In den beiden letztgenannten Verfahrensweisen, die unter Verwendung von Glycerin= l=Phosphat=Dehydro= genäse bzw. Glycerin-Dehydrogenase durchgeführt werden, wird, wie bereits erwähnt, eine äquivalente Menge an reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid
hi gebildet. Gemäß einer weiteren Abänderung, die auf beide dieser Verfahren angewendet werden kann, wird das bekannte Verhalten verschiedener Tetrazoliumsalze ausgenutzt, die bei der Reduktion der ursprünglich
farblosen, wasserlöslichen Verbindungen in Farbstoffe umgewandelt werden. Das reduzierte Nicotinamidadenindinucleotid, dessen Menge proportional zu der Menge des ursprünglich vorhandenen Triglycerids ist, kann seinen Wasserstoff auf das Tetrazoliumsalz übertragen. Diese Reaktion läuft unter Bildung von oxydiertem Nicotinamidadenindinucleotid durch Vermittlung verschiedener bekannter Substanzen, vorzugsweise Diaphorase oder Phenazinmethosulfcjt, quantitativ ab. Die so gebildete Farbstoff menge kann auf ι ο einfache Weise kolorimetrisch, d. h., durch Bestimmung der Änderung der optischen Dichte im sichtbaren Bereich, bestimmt werden.
Die erwähnten Glycerinbestimmungsverfahren sind aus der Literatur bekannt.
Hierzu wird auf die nachfolgenden Literaturstellen verwiesen, in denen weitere Nachweise enthalten sind:
R. O. Briere, J. A. Preston und J. G. Ba tsakis,
American Journal of Clinical Pathalogy, Bd. 45, No. 5, Mai 1966, »Rapid Colorimetric (Tetrazolium Salt) " Essay for Lactate Dehydrogenase«, und
H. U. Bergmeyer, »Methods of Enzymatic Analysis«, Academic Press, New York 1965, J. 953 bis 955.
Die Mengenverhältnisse der Lipase oder des -'5 Lipasegemischesunddei Protease oder des Proteasegemisches betragen in dem Bestimmungsansatz vorzugsweise etwa 5 bis etwa 500 IU (Internationale Einheiten) Protease pro 1000 Lipase-Einheiten und insbesondere etwa 20 bis etwa 100 IU Protease pro 1000 Lipase-Ein- jo heiten.
1 Lipase-Einheit ist diejenige Enzymmenge, die aus Triolein nach 30minütiger Inkubation bei 37°C so viel Fettsäure freisetzt, daß zu deren Neutralisation 1 ml 0,05 π Kalilauge erforderlich ist. Die Internationale Einheit für die proteolytische Aktivität ist die Proteasemenge, die pro Minute einen Umsatz von 1 Mikromol eines für die betreffende Protease spezifischen Substrats unter annäherungsweise optimalen Bedingungen bewirkt. DuS Substrat für Chymotrypsin ist der Äthylester -to des Tyrosins. Der Umsatz kann in diesem Fall auf verschiedene Weise, z. B. durch Messung der Änderung der optischen Dichte bei 237 nm oder durch Bestimmung des freigesetzten Tyrosins als Phenolreagenz-Tyrosin-Äquivalente oder durch Titration mit Formaldehyd bestimmt werden. Die ><>F-Einheit (National Formulary-Einheit) wird gelegentlich für Proteasen verwendet und erscheint auch im nachstehenden Beispiel. 1 NF-Einheit von «-Chymotrypsin ist diejenige Enzymmenge, die bei Jer Inkubation mit N-Acetyl-L-tyrosinäthylester unter den Testbedingungen pro Minute bei 23Γ nm eine Absorptionsänderung von 0,0075 hervorruft.
Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung.
55
Beispiel
(1) Testkombination
Behälter A
Kaliumphosphat-Puffer. 0,1 m,pn7
Magnesiumasparaginat 1,6 mg
Adenosintriphosphat, Dinatriumsalz Phosphoenolpyruvat
Rinderserumalbumin
Nicotinamidadenindinucleotid bis zu einer Endabsorption von 0,8
(optische Dichte bei 340 nm)
•Lactat-Dehydrogenase
Pyruvat-Kinase
a-Chymotrypsin
Lipase aus Rhizopus delemar
Gesamtvolumen
Behälter B
Glycero-Kinase
0,9 μΜοΙ 0,9 μΜο! 5,0 mg
2IU 6IU
1100 NF-Einheiten
1200 Lipase-Einheiten
3 ml
2IU
Da 1 IU gleich 28 NF-Einheitr··. ist, entsprechen 1100 NF-Einheiten «-Chymotrypsin 39 ϊU. Da in der Testkombination 1200 Lipase-Einheiten enthalten sind, entfallen auf 1000 Lipase-Einheiten etwa 32 IU-Protea-
(2) Durchführung des Verfahrens
Ein aliquoter Teil der das Triglycerid enthaltenden, zu untersuchenden Flüssigkeit, z. B. 50 μΐ Serum, wird zu dem Inhalt des Behälters A (3 ml) gegeben. Dieses Gemisch wird anschließend annähernd 10 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 370C inkubiert. Sodann wird die optische Dichte bei 340 nm bestimmt. Anschließend wird das Gemisch mit dem Inhalt des Behälters B (2IU Glycero-Kinase) versetzt und 10 Minuten bei derselben Temperatur stehen gelassen. Darauf wird wiederum die optische Dichte bei 340 nm bestimmt. Die Differenz der erhaltenen Werte ist propotional zu dem Gehalt an Triglycerid in der Probe.
Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß die bevorzugte Testkornbination im Behälter A mindestens eine Lipase und eine Protease und im Behälter B mindestens Glycero-Kinase enthalten sollte. Die übrigen Bestandteile können in den beiden Behältern wahlweise verteilt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird festgestellt, daß die Fettsäureglycerinester vollständig hydrolysiert werden, so daß eine stöchiometrische Glycerinmenge freigesetzt wird. Der dieser Reaktion zugrunde liegende Mechanismus ist nicht bekannt; es ist jedoch sicher, daß der Grund für den erfindungsgemäßen Ablauf der Reaktion auf der gemeinsamen Anwesenheit der Lipase und der Protease beruht. Wenn z. B. in menschlichem Serum das aus Triglyceriden freigesetzte Glycerin gemäß dem vorstehenden Beispiel bestimmt wird, wird festgestellt, daß der erhaltene Glycerinwert dem bei vollständiger Hydrolyse der Triglycjride zu erwartenden Wert entspricht, wobei die letzteren nach bekannten Methoden bestimmt werden.

Claims (11)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Fettsäureglycerinestern in wäßrigen Flüssigkeiten durch Hydrolyse der Fettsäureglycerinester und enzymatische Bestimmung des Glycerins, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Flüssigkeit mit einer Lipase und einer Protease versetzt und den bzw. die Fettsäureglycerinester vollständig hydrolysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase mikrowellen Ursprungs einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase aus Rhizopus delemar oder Chromobacterium viscosum oder ein Gemisch dieser Lipasen einsetzt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease Chymotrypsin. Trypsin. Streptomyces griseus-Protease. Elastase, Papain oder Bromelain oder ein Gemisch dieser Proteasen einsetzt
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 5 bis etwa :i 500 IU Protease je 1000I ipase-Einheiten einsetzt
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Triglyceride im Serum bestimmt.
7. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch ein Gemisch aus einer Lipase und einer Protease.
8. Reagenz nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch ein Verhältnis der Protease zu der Lipase von etwa 5 bis etwa 500 IU je 1000 Lipase-Einheiten. ji
9. Reagenz nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase mikrobiellen Ursprungs ist.
10. Reagens nach einem der Ansprüche 7 bis 9, gekennzeichnet durch den Gehalt an Lipase aus -in Rhizopus delemar. Λ-Chymotrypsin, Magnesiumasparaginat und Kaliumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7.
11. Reagenz nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch ein Verhältnis der Protease zu der Lipase von r> etwa 5 bis etwa 500 IU je !000 Lipase-Einheiten.
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