DE2929088A1 - Verfahren zur bestimmung einer substanz in einer biologischen fluessigkeit und dabei verwendbare reagenzienkombination - Google Patents
Verfahren zur bestimmung einer substanz in einer biologischen fluessigkeit und dabei verwendbare reagenzienkombinationInfo
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Description
(7 "/Snchen 40, C!isabeiti3traßa34
COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida
U.S.A.
U.S.A.
Verfahren zur Bestimmung einer Substanz in einer biologischen Flüssigkeit und dabei verwendbare
Reagenzienkombination
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung oder Auswertung einer in einer
biologischen Flüssigkeit, insbesondere in menschlichem Blutserum, vorhandenen Substanz. Mehr im einzelnen bezieht
sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei dem eine im Verlauf der Bestimmung entstehende Verbindung durch eine
Oxydations—Reduktionsreaktion unter gleichzeitiger Bildung
reduzierten ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotids in einer dem Gehalt der Substanz in der Flüssigkeit proportionalen Menge
oxydiert wird, und auf eine Verbesserung, um die Störung auszuschalten, die durch eine andere Substanz in der Flüssigkeit
verursacht wird, wobei letztere Substanz zwar mit der zu bestimmenden Substanz in keiner quantitativen Beziehung
steht, aber einer Oxydations—Reduktionsreaktion unter Bildung
reduzierten ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotids unterliegt und somit die Genauigkeit der Bestimmung verringert.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine bei dem Verfahren verwendbare Reagenzienkombination.
Eine Reihe von in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen StoffWechselprodukten lässt sich zweckmflssig nach Verfahren
bestimmen, bei denen ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in seiner oxydierten Form (NAD) in einer enzymatischen
Oxydations—Reduktionsreaktion proportional dem Gehalt der
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zu bestimmenden Substanz in seine reduzierte Form (NADH)
umgewandelt wird. K7ADH lässt sich durch Messung der
Intensität der Lichtabr.crption, vorzugsweise beim Absorptionsmaximum
bei 340 Manometer (nm) quantitativ bestimmen.
Ferner kann man auch das gebildete NADH in einer enzymatischen
Oxydations—Reduktionsreaktion mit 2-p-Jodphenyl-3-pnitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid
(JNT) umsetzen, um dar, JNT in seine reduzierte Form (JNTH) umzuwandeln.
JNTH kann dann durch Meinung der Lichtabsorption, vorzugsweise
beim Absorptionsraaximum bei 500 nm, quantitativ bestimmt
werden.
Substanzen, die sich nach der obigen Arbeitsweise bestimmen lassen, sind unter anderem das Enzym cc-Amylase, Transaminaseenzyme
einschliesslich Glutamat/Oxalacetat-transaminase (GOT) und Glutamat/Pyruvat-transaminase (GPT) sowie
Triglyceride. Besonders zweckir.ässig ist die Arbeitsweise für Bestimmungen in menschlichem Blutserum, einschliesslich
des Serumgehalts von Plasma, sowie in weiteren biologischen Flüssigkeiten einschliesslich z.B. Urin, Duodenal- und
Peritonealflüssigkeit.
Die obige Arbeitsweise bietet vielversprechende Möglichkeiten. Ausser den zu bestimmenden Substanzen enthalten die
biologischen Flüssigkeiten jedoch endogene Stoffe, welche selbst bzw. deren während der Bestimmung entstehende Derivate
an enzymatischen Oxydations—Reduktionsreaktionen unter
Bildung von NADH teilnehmen und somit die Bestimmungen stören. Beispielsweise wird nach bestehenden Methoden
oc-Amylase in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere
menschlichem Blutserum dadurch bestimmt, dass man das Enzym Stärke zu Maltose hydrolysieren lässt, wonach die Maltose
enzymatisch zu Glucose hydrolysiert, die Glucose in Glucose-6-phosphat umgewandelt und letztere Verbindung mit NAD in
einer Oxydations—Reduktionsreaktion zu NADH umgesetzt wird.
Ebenfalls in der Flüssigkeit vorhandene endogene Glucose nimmt an den letzteren Reaktionen unter Bildung nicht-spezifischen,
mit der a-Amylar.caktivität in keiner Beziehung
stehenden NADHs teil, was die Genauigkeit der Bestimmung im
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Ausmass von deren Gegenwart verringert.
Es wurden zwar Methoden zur Entfernung der endogenen Glucose vorgeschlagen, wie in Clin. Chem., 21, 69^ (1975) und Clin.
Chem., 21., Ski (1975) beschrieben, aber diese besitzen Nachteile
einschliesslich unter anderem mangelnde Einfachheit und Bequemlichkeit, wie für Laboratoriumsmethoden erwünscht,
und insbesondere bei der Verwendung als diagnostisches Hilfsmittel in Notfallkrankenhäusern.
Aus U.S. Patentschrift Nr. 4 000 0^2 ist eine Methode bekannt
geworden, bei der endogene Glucose zunächst unter Bildung von NADH verbraucht wird, wonach man ct-Glucosidase
zusetzt, um die Bestimmungsreaktionen einzuleiten. Bei Anwendung einer solchen Methode kann es vorkommen, dass
die dekadische Extinktion für die a-Amylaseaktivität gegenüber
der Extinktion für endogene Glucose vernachlässigbar klein ist, was zu ungenauen Ergebnissen führt. Eine Anzahl
handelsüblicher Geräte zur Extinktionsmessung sind auch nicht dazu fähig, so hohe Extinktionen zu messen, wie
bei hohen endogenen Glucosekonzentrationen auftreten können.
Als weiteres Beispiel kann die GOT- und GPT-Aktivität in Serum auf Grund einer Messung der Konzentration von bei
Transaminasereaktionen gebildetem Glutamat durch oxydative Entaminierung unter gleichzeitiger Reduktion von NAD zu
NADH und nachfolgende Reduktion von JNT zu JNTH bestimmt werden. Die Reaktionen werden durch Inkubation des
Serums mit einem einzigen Mischreagenz ausgeführt. Endogene Aminosäuren im Serum werden jedoch gleichfalls unter
Bildung nicht-spezifischen NADHs oxydativ entaminiert.
Es gibt zwar Arbeitsweisen zur Korrektur solcher unzuverlässiger Ergebnisse, aber diese führen zu Nachteilen wie Mehrarbeit,
fehlender Anpassungsfähigkeit zur Durchführung in automatischen Geräten und/oder unvollständiger Entfernung
störender endogener Stoffe.
Ein weiteres Beispiel ist die Bestimmung von Triglyceriden (Fettsäureestern des Glycerins) in Serum, wobei die Trigly-
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ceride enzymatisch mit Lipase zu Glycerin hydrolysiert
werden und das daraus gebildete Glycerin oder Glycerinphonphat mit NAD in einer Oxydations—Reduktionsreaktion zu
NADH umgesetzt wird. Die Ergebnisse werden durch die Gegenwart endogenen Glycerins beeinträchtigt, welches in
veränderlichen Mengen in Serum vorhanden ist. Obwohl der endogene Glyceringehalt mit einem Reagenz, das alle
Reaktionspartner ausser der Lipase enthält, bestimmt v/erden und der so erhaltene Wert von dem mit einem vollständigen
Reagenz einschliesslich Lipase erhaltenen Wert subtrahiert werden kann, ist die Arbeitsweise kompliziert und zeitraubend.
Gegenstand dieser Erfindung ist e^ne Verbesserung eines Verfahrens
zur Bestimmung oder Auswertung einer in einer biologischen Flüssigkeit vorliegenden Substanz, wobei die
Flüssigkeit ferner einen die Bestimmung störenden endogenen Stoff enthält. Insbesondere wird die in der Flüssigkeit
vorhandene Substanz dadurch bestimmt, dass man eine im Verlauf der Bestimmung entstehende Verbindung in Gegenwart
eines Dehydrogenase-enzyms unter gleichzeitiger Bildung
einer dem Substanzgehalt in der Flüssigkeit proportionalen Menge reduzierten ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotids oxydiert.
Der störende endogene Stoff bzw. dessen während der Bestimmung entstehendes Derivat unterliegt einer gleichartigen
Reaktion unter Bildung reduzierten ß-Nicotinamid-adenindinucleotids,
welches für die zu bestimmende Substanz nicht spezifisch ist und deshalb die Genauigkeit der Bestimmung
verringert. Die Verbesserung besteht darin, dass man den endogenen Stoff bzw. dessen Derivat in Gegenwart des
Dehydrogenase-enzyms unter gleichzeitiger Reduktion von ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid oxydiert, das so gebildete
reduzierte ß-Nicotiriamid-adenin-dinucleotid in Gegenwart
von Lactat-dehydrogenase unter gleichzeitiger Reduktion von Pyruvat zu Lactat oxydiert, dann die enzymatische Aktivität
der Lactat-dehydrogenase hemmt und schliesslich eine Menge jener im Verlauf der Bestimmung entstehenden Verbindung zu
deren Oxydation und zur gleichzeitigen Bildung von reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in einer dem Gehalt an
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zu bestimmender Substanz proportionalen Menge erzeugt.
Das verbesserte Verfahren ist auf verschiedene Bestimmungen anwendbar, bei denen es sich um enzymatir.chc Oxydation;—
Reduktionsreaktionen unter Bildung reduzierten ß-Nicotinamidadenin-dinucleotids handelt, wie oben beschrieben, einschliesslich
Bestimmungen von a-Amylase, GOT, GPT und Triglyceriden.
Das Verfahren lässt sich schnell und in einem einzigen Gefäss wie einem Laboratoriumskolben unter'Anwendung allgemein
verfügbarer Laboratoriumsgeräte durchführen. Das Verfahren ist empfindlich, da es nur einen sehr kleinen Anteil
der zu bestimmenden Flüssigkeit erfordert. Bei vielstufigen oder gekoppelten enzymatischen Reaktionen häufige Wartezeiten
werden durch Optimierung der Bestandteile und Bedingungen verringert.. Das Verfahren lässt sich leicht zur
Durchführung in automatischen Geräten anpassen. ·
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen
Verfahrens wird die in einer ferner endogene Glucose enthaltenden biologischen Flüssigkeit vorliegende a-Amylase dadurch
bestimmt, dass man (l) lösliche Stärke mit der in der Flüssigkeit vorliegenden a-Amylase enzymatisch zu Oligosacchariden
einschliesslich Maltose hydrolysiert, (2) gleichzeitig die vorhandene Glucose mit Adenosintriphosphat in
Gegenwart von Hexokinase zu Glucose-6-phosphat umsetzt, dieses
mit ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Gegenwart von
Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu 6-Phosphogluconat und
reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid und letzteres mit Pyruvat in Gegenwart von Lactat-dehydrogenase zu
ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in seiner oxydierten Form und Lactat umsetzt, (3) dann die enzymatische Aktivität der
Lactat-dehydrogenase hemmt und (4) schliesslich mit dieser Hydrolyse mit der vorliegenden a-Amylase fortfahrt, die
dabei gebildete Maltose in Gegenwart von a-Glucosidase enzymatisch zu Glucose hydrolysiert, die so gebildete GIu-cose
mit Adenosintriphosphat in Gegenwart von Hexokinase zu Glucose-6-phosphat umsetzt und das entstandene Glucose-
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- Ii
6-phosphat ir.it ß-Nicotinarnid-adenin-dinucleotid in Gegenwart
von Glucose-G-pbosphut-dehydrogenase zu reduziertem
fi-Nicotinamid-adenin-dinuclootid in einer der a-Amylaseaktivität
proportionalen Menge umsetzt. Gegebenenfalls kann Stufe (1) die enzymatisch^ Hydrolyse der dabei gebildeten
Maltose in Gegenwart von o-Glucosidase zu Glucose einschliessen.
Das in den Indikatorreaktionen der Stufe (4) gebildete, reduzierte ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid
(NADH), bzw.'durch dessen Umsetzung mit JNT erzeugtes JNTH,
kann wie oben beschrieben durch Messung der Lichtabsorption bestimmt werden.
Die vorstehende Ausbildungsform dient dazu, endogene Glucose, geringe Mengen in der Stärke vorhandene und durch a-Amylase
gebildete Glucose sowie gegebenenfalls durch oc-Glucosidase
erzeugte Glucose enzymatisch zu entfernen. Die Ausbildungsform ist besonders vorteilhaft, indem wegen der gleichzeitigen
Durchführung von Stufen (l) und (2) jegliche Wartezeit nach der Entfernung der Glucose in Stufe (2) entfällt.
Die zu einer Zunahme der Lichtextinktion führenden Indikatorreaktionen können unmittelbar danach beginnen. Da die
Geschwindigkeit dieser Extinktionszunähme (Extinktionszunahme
pro Minute) der in der Probe vorhandenen Amylaseaktivität direkt proportional ist, kann man die Amylaseaktivität
in der Probe mit hochgradiger Genauigkeit aus der Geschwindigkeit der Aenderung der Extinktion auf Grundlage des Extinktionskoeffizienten
der absorbierenden Gattung berechnen. Da das von der Oxydation endogener Glucose und sonstiger
vorhandener Glucose herrührende NADH in Stufe (2) oxydiert wird, ist dabei die Extinktion bei 340 nm, welche das in
Stufe (A) erzeugte NADH darstellt, anfänglich fast Null, so dass jegliche von der a-Amylaseaktivität herrührende
Extinktion, im Bereich 0-1500 Somogyi-Einheiten/dl, genau
messbar ist.
Die Erfindung verringert die Anzahl für eine genaue Bestiiimung
von a-Amylase notwendiger Reagenzien und Zugaben in einem verhältnismässig kurzen Zeitraum auf ein Minimum. Gegenstand
der Erfindung ist ferner eine neue und verbesserte
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Kombination aus zwei Reagenzien zur Verwendung bei der obigen Bestimmung. Ein erstes Reagenz wird zunächst zur
Durchführung der Stufen (1) und (2) mit der Flüssigkeit vermischt. Ein zweites Reagenz wird zur Durchführung der
Stufen (3) und (4) mit dem Produkt aus Stufen (l) und (2) vermischt. - Die Reagenzien sind weiter unten genauer beschrieben.
Die unten angegebene Reaktionsfolge lässt sich in herkömmlicher Weise zur Bestimmung oder Auswertung von in einer
biologischen Flüssigkeit wie menschlichem Blutserum vorhandener cc-Amylase anwenden:
1. Lösliche Stärke σ-Amylase ^. Maltose
in der Flüssigkeit'
2. Maltose cc-Glucosidase Glucose
3. Glucose + ATP Hexokinase ^ Glucose-6-pitosphat + ADP
4. Glucose-6-phosphat + NAD Glucose-6-phosphat- n.
dehydrogenase "^
, 6-Phosphogluconat + NADH Wahlweise Folgereaktion:
5. NADH + JNT Diaphorase^ NAD + JNTH '
wobei bestimmte Verbindungen wie folgt bezeichnet werden:
ATP = Adenosintriphosphat
ADP = Adenosindiphosphat
NAD = ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid NADH = Reduzierte Form von NAD
JNT = 2-p-Jodphenyl-3~p-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid
JNTH = Reduzierte Form von JNT
NADH bzw. JNTH, je nach Lage des Falls, wird photometrisch gemessen und die oc-Amylaseaktivität aus den Ergebnissen berechnet.
Liegt verbleibende endogene Glucose in der Flüssigkeit vor, so wird jene der Reaktion 3 unterliegen, und die Reaktionen
4 und 5 (falls angewandt) folgen dann unter Bildung von zusätzlichem
NADH oder JNTH, deren Entstehung nicht von der Q-Amylaseaktivität herrührt. Da die NADH- oder JNTH-Messung
keine Auskunft über die Herkunft der Verbindung gibt, wird die daraus berechnete a-Amylaseaktivitiit
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ungenau sein.
Bei der Erfindung wird die endogene Glucose unter Anwendung der Reaktionen 3 und 4 durch Umwandlung in 6-Phosphogluconat
entfernt. Anschliessend wird NADH durch folgende Umsetzung in seinen oxydierten Zustand zurückgeführt, um eine
Störung der danach zu Ende geführten Bestimmung zu verhindern :
6. NADH + Pyruvat ' LDH ^ Lactat + NAD
wobei LDH = Lactat-dehydrogenase.
Das Lactat-dehydrogenase-enzym -yird dann gehemmt oder inaktiviert,
um eine Störung des nachfolgenden Teils der Bestimmung zu verhindern. Unter den Bedingungen der Bestimmung,
insbesondere bei dem im Reaktionsgemisch eingestellten pH, kann man das Enzym durch Zugabe von Oxamidsäureanion hemmen.
Nach der Hemmung des Enzyms lässt sich die Bestimmung der a-Amylase ohne durch endogene Glucose verursachte Störung
durchführen, indem man die Reaktionen 1 bis k sowie gegebenenfalls
Reaktion 5 vornimmt.
Bei der oben beschriebenen, bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird in einer ersten Bestimmungsphase die Reaktion
1 gleichzeitig mit Reaktionen 3, 4 und 6, wie auf die endogene Glucose angewandt, durchgeführt. Diese Arbeitsweise
hat den Vorteil, dass die Wartezeit, die eintreten würde, wenn man erst nach der Hemmung des .Lactase-dehydrogenase-enzyms
mit der enzymatischen Hydrolyse der Stärke beginnen würde, entfällt. ' Ein weiterer Vorteil besteht
darin, dass in der Stärke vorhandene und/oder bei der Stärkehydrolyse gebildete Glucosemengen zusammen mit der
endogenen Glucose entfernt werden.
Gegebenenfalls kann man die auf die in Reaktion 1 aus Stärke gebildete Maltose angewandte Reaktion 2 gleichzeitig mit
Reaktionen 1, 3, h und 6 in der ersten Phase ablaufen lassen,
wobei die aus der Maltose entstandene Glucose zusammen mit der endogenen Glucose in 6-Phosphogluconat umgewandelt und
entstandenes NADH unter gleichzeitiger Reduktion von Pyruvat
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zu Lactat in Reaktion 6 zu NAD oxydiert wird. Es wird
jedoch weiterhin bevorzugt, in einer zweiten Bestimmungspbase
nach der Hemmung der Luctut-dehydrogenu;_;euk Livitflt mit
Reaktion 2 zu beginnen, wobei die Reaktionen 1 bis 4 bzw. 1 bis 5 durchgeführt werden.
Bei-der weiterhin bevorzugten Arbeitsweise wird Maltose in
der vorangehenden ersten Phase in kleineren Mengen gebildet, und höhere Oligosaccharide mit mehr als zwei Glucoseeinheiten
sammeln sich in grösseren Mengen an. Es liegen dann günstige Bedingungen zur Umwandlung der höheren Oligosaccharide
in Maltose durch a-Amylase vor, und die Indikatorreaktionen
beginnen deshalb ohne jegliche Wartezeit. Das Verfahren ist sehr empfindlich. Ein weiterer Vorteil
der bevorzugten Arbeitsvreise besteht darin, dass nur eine
sehr kleine Probe und kleinere Mengen .an Reagenzstoffen erforderlich
sind.
Bei der weiterhin bevorzugten Arbeitsweise wird die biologische Flüssigkeit mit oinem ersten Reagenz vermischt, welches
die zur Durchführung der Reaktionen 1, 3, 4 und 6 erforderlichen Stoffe, einschliesslich löslicher Stärke, ATP,
Hexokinase, NAD, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Pyruvat und LDH enthält. Das Gemisch wird zur Hydrolyse der
Stärke und zur Entfernung der endogenen und sonstigen vorhandenen Glucose inkubiert. Das Produkt wird mit einem
zweiten Reagenz vermischt, welches Oxamidsäureanion als Hemmstoff für die Lactat-dehydrogenase-enzymaktivität und
die zur Durchführung der Reaktion 2 erforderliche a-Glucosidase
enthält. Das zweite Gemisch wird inkubiert, um die Reaktionen 1 -bis 4 zur Bestimmung der a-Amylaseaktivität
zu bewirken. Will man zusätzlich die Reaktion 5 anwenden, so werden die dafür erforderlichen Stoffe, JNT undDiaphorase,
ebenfalls im zweiten Gemisch vorgesehen.
Die Reagenzien werden in wässrigen Lösungen wasserlöslicher Reagenzstoffe in destilliertem oder entionisiertem Wasser
eingesetzt. Die Reagenzlösung hat jeweils vorzugsweise einen pH im Bereich von ungefähr 6,3-7,1 und besonders be-
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vorzugt einen pH .von etwa 6,5.
Die eingesetzte lösliche Stärke ist in einer wässrigen Lösung des ersten Reagenzes vorzugsweise ohne Erhitzen unter
Entstehung einer klaren Lösung völlig löslich. Geeignete Materialien sind ohne weiteres erhältlich, einschliesslich
beispielsweise "Stärke löslich nach Zulkowsky zur Analyse"
(E. Merck Co.), "Paragon Indicator for Iodine Titration [Paragonindikator zur Jodtitration]" (Eastern Chemical Co.)
und "Superlose 500" (Stein-Hall und Co.), wobei letztere wie in U.S. Patentschrift Nr. 3 888 739 beschrieben aus der
Amylosefraktion von Kartoffelstärke hergestellt wird und
keinen nennenswerten Anteil der Amylopektinfraktion der Stärke enthält.
Um das erwünschte Brenztraubensäureanion in Lösung zu liefern, kann man Brenztraubensäure oder ein lösliches Salz
davon, vorzugsweise ein Alkalisalz der Brenztraubensäure, insbesondere das Natrium- oder Kaliumsalz, im ersten Reagenz einsetzen.
Im zweiten Reagenz verwendet man Oxamidsäure oder ein lösliches Salz davon, um das hemmende Oxamidsäureanion in Lösung
zu liefern. Vorzugsweise wird ein Alkalioxamat, insbesondere das Natrium- oder Kaliumsalz, als Reagenzstoff
eingesetzt.
Bei der bevorzugten Ausführungsform wird der pH mittels eines Puffers eingestellt und aufrechterhalten, wobei dies einer
der bekannten zweckmässigen Phosphat- und Nicht-phosphatpuffer
sein kann, wie ^ie aus U.S. Patentschrift Nr. 4 O36 697 (Kolonne 5) bekannt sind. Bevorzugt setzt man
einen Phosphatpuffer ein, vorzugsweise Alkaliphosphat und besonders bevorzugt Kalium- oder Natriumphosphat. Den
gewünschten pH erhält man durch Einsatz einbasischer und zweibasischer Phosphatsalze in einem geeigneten Verhältnis,
z.B. indem man eine Lösung von einbasischem Phosphat mit einer Lösung von zweibasischem Phosphat auf den gewünschten
pH titriert. Andernfalls kann man den Puffer zur Einstellung des gewünschten pH durch Zugabe von starkem Alkali
wie Kalium- oder Natriumhydröxyd zu Phosphorsäurelösung
9p ,9 8 8 6^1) 74 5 -16-
herstellen.
Vorzugsv/eise in den Reagenzien mitvorliegende Stoffe, die
jedoch nicht direkt an den Reaktionen teilnehmen, schliessen eine Chloridionenquelle, eine Magnesiumionenquelle und
Rinderserumalbumin ein. Das Chloridion wirkt als Kofaktor für a-Amylase und wird in Form eines löslichen Salzes,
vorzugsweise eines Alkalisalzes wie Natrium- oder Kaliumchlorid eingesetzt. Das Magnesiumion wirkt als Kofaktor für
Hexokinase und wird in Form eines löslichen Salzes, vorzugsweise eines Salzes einer schwachen Säure wie Asparaginsäure,
beigegeben. Das Rinderserumalbumin dient als Füllmittel.
· ' . ■ '
V/enn die Bestimmung die Reaktionen 1 bis 4 und 6 umfasst,
enthält das erste Reagenz vorzugsweise die in Tabelle 1 angeführten Stoffe und das zweite Reagenz vorzugsweise die in
Tabelle 2 angeführten Stoffe jeweils in Anteilen zwischen etwa 80% und 120% (+ 20%) der in der jeweiligen-Tabelle angegebenen
Werte.
Tabelle 1 Stoff
Lösliche Stärke Adenosintriphosphat ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid
Alkalipyruvat
Hexokinase .
Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase Lactat-dehydrogenase
Alkaliphosphatpuffer, pH 6,3-7,1
Alkalichlorid Magnesiumsalz Rinderserumalbumin
Meng | 25 | e | Gramm |
1, | 25 | Milliniol | |
1, | Millimol | ||
2 | 75 | Millimol | |
o, | I.U. | ||
1500 | I.U. | ||
2500 | I.U. | ||
250 | Millimol | ||
25 | Millimol | ||
50 | Millimol | ||
3 | Gramm | ||
4 |
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- 17
~17" 2329088
ft-Glucosidase 7000 I.U.
Alkalioxamat 180 Millimol
Alkaliphosphatpuffer, pH 6,3-7,1 25 Millimol
Rinderserumalbumin 4 Gramm
Umfasst die Bestimmung auch die Reaktion 5, so werden vorzugsweise
1 000 I.U. Diaphorase im ersten Reagenz zusammen mit den in Tabelle 1 angegebenen Stoffen sowie vorzugsweise
0,8 Millimol JNT im zweiten Reagenz zusammen mit den in Tabelle 2 angegebenen Stoffen miteingeschlossen. Die
obigen Anteile können im Bereich + 20% schwanken. Die
oben genannten Reagenzien v/erden in wässrigen Lösungen der Stoffe, die in den angegebenen Mengen pro Liter Lösung vorliegen,
eingesetzt.
Die Bestimmung von Triglyceriden in menschlichem Blutserum ist wegen ihres hohen diagnostischen Werts sehr wichtig.
Eine herkömmliche Reaktionsfolge, die zur Bestimmung der in einer biologischen Flüssigkeit wie menschlichem Blutserum
vorhandenen Triglyceride dienen kann, beruht auf der Freisetzung von Glycerin durch enzymatische Hydrolyse mit Lipase,
wie folgt: ,
Triglyceride Lipase -^ Glycerin + Freie Fettsäuren
Glycerin + NAD GDH ^ NADH + Dihydroxyaceton wobei GDH = Glycerin-dehydrogenase.
Ferner können die folgenden Reaktionen zur Messung des freigesetzten
Glycerins dienen:
Glycerin + ATP GK ->. Glycerinphosphat + ADP
Glycerinphosphat + NAD GPDH^ Dihydroxyaceton-
phosphat + NADH wobei: GK = Glycerokinase
GPDH = Glycerophosphat-dehydrogenase.
In beiden Fällen kann die oben angegebene Reaktion 5 als
wahlweise zusätzliche Reaktion unter Bildung von JNTH angewandt werden. NADH bzw. JNTH, je nach La^e des Falls,
werden photometrisch gemessen, und die in beiden Fällen
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- 18
iakonzcntra-
- 18 -
der Extinktion direkt proportionale Triglyceri tion in der biologischen Flüssigkeit wird aus den Ergebnissen
berechnet.
Die obigen Bestimmungen sind ungenau, wenn endogenes Glycerin in der biologischen Flüssigkeit vorliegt, was bei
menschlichem Serum stets der Fall ist, da das endogene Glycerin ja nicht unterschieden werden kann. Die endogene
Glycerinkonzentration lässt sich durch Wiederholung der Bestimmung in Abwesenheit des Enzyms Lipase messen, jedoch
erfordert dies eine vollständige Wiederholung der Arbeitsweise.
Bei der Erfindung wird das endogene Glycerin in einer ersten Phase der Bestimmung auf einem von zwei Wegen entfernt,
jenachdem welche der obigen Arbeitsweisen zur Bestimmung
der Triglyceride benutzt wird, wobei man das erste Reagenz aus einer Kombination von zwei Reagenzien einsetzt und iri-'
kubiert. Im Zusammenhang mit der zuerst beschriebenen Arbeitsweise v/erden die,folgenden Reaktionen angewandt, wobei
das erste Reagenz in diesem Fall NAD, GDH, Pyruvat und LDH enthält:
Endogenes Glycerin + NAD GDH . NADH + Dahydraxyaceton
NADH + Pyruvat LDH ^ Lactat + NAD.
Bei der zweiten beschriebenen Arbeitsweise werden die folgenden Reaktionen angewandt, wobei das erste Reagenz in diesem
Fall ATP, GK, NAD, GPDH, Pyruvat und LDH enthält:
Endogenes Glycerin + ATP GK ADP + Glycerinphosphat
Mg++:>
Glycerinphosphat + NAD GPDH ^ Dihydroxyaceton-
phosphat + NADH
NADH + Pyruvat LDH ^ Lactat + NAD.
Die letzte Reaktion ist jeweils die gleiche wie die obige Reaktion 6.
In der zweiten Bestimmungsphase setzt man ein zweites Reagenz zu und inkubiert das Gemisch. Das zweite Reagenz
enthält Lipase und LDH-Enzymhemmstoffe, z.B. Alkälioxamat
und Alkalioxalat. LDH wird gehemmt, und die oben be-
909886/0745
schriebone Hydrolyse der Triglycerlde findet statt, vorauf
die Reaktion bzw. Reaktionen, je nach der jeweiligen Arbeitsweise, die zur Bildung von NADH führen, folgen.
Die (wahlweise) Einbeziehung von JK7T und Diaphorase im Reaktionsgemisch
führt zur Bildung von JNTH nach Reaktion 5. Zur genauen Bestimmung der Triglyceridkonzentration in der
biologischen Flüssigkeit wird die auf der Bildung von NADH bzw. JNTH beruhende Extinktion gemessen.
Die Bestimmung von Glutamat-oxalacetat-transeminase (GOT)
und die Bestimmung von Glutamat-pyruvat-transaminase (GPT) in menschlichem Blutserum sind diagnostisch höchst wichtig.
Eine zweckmässige Methode zur Bestimmung der Aktivität des jeweiligen Enzyms besteht darin, dieses zur Umwandlung von
a-Ketoglutarat (a-Qxoglutarat) in L-Glutamat nach einer der
entsprechenden nachfolgenden Transarninasereaktionen zu verwenden
und dann die Menge gebildeten Glutamats zu bestimmen; a-Ketoglutarat + L-Asparaginat GOT ^ L-Glutamat +
Oxalacetat
a-Ketoglutarat + L-Alanin GPT ^ · L-Glutamat +
Pyruvat.
Glutamat wird durch die folgenden Reaktionen bestimmt, wonach JNTH kolorimetrisch gemessen wird; der so erhaltene
Messwert ist der Aktivität des Enzyms im Serum direkt proportional :
L-Glutamat + NAD + H2O GLDII ^ NADH 4 o-Ketoglutarat
■ + NH3
NADH + JNT Diaphorase ^ JNTH + NAD wobei GLDH = Glutamat-dehydrogenase.
Gleichgev/ichtsbedingungen erfordern hohe GLDH-Konzentrationen,
was wiederum zu oxydativer Entaminierung gewisser sich im Serum findender L-Aminosäuren wie Glutamat, Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Methionin und a-Aminobutyrat führt. Die Reaktionen dieser endogenen Aminosäuren werden
typischerveise durch die obige Reaktion von L-Glutamat und NAD beschrieben und führen zur Bildung von unspezifischem
NADH und einer unrichtigen Bestimmung, d.h. sie täuschen eine Erhöhung der Enzymaktivität vor.
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Verführt man erfindungsgemäss, so werden die reaktionsfähigen
endogenen Aminosäuren in einer ersten Bestimmungsphüfc
durch Inkubation mit einem ersten Reagenz entfernt, wobei die folgenden Reaktionen stattfinden, wobei L-Glutamat als
Vertreter verschiedener Aminosäuren dient: L-Glutamat + NAD + Η£Ο GLDH > NADH + a-Ketoglutarat
+ NH3
NADH + Pyruvat LDH > NAD + Lactat.
Letztere Reaktion ist die gleiche wie die obige Reaktion 6.
Bei einer bevorzugten Arbeitsweise enthält das erste Reagenz ebenfalls L-Asparaginat zur GOT-BeStimmung bzw.
L-Alanin zur GPT-Bestimmung, NAD, GLDH, Diaphorase, Pyruvat
und LDH.
In einer zweiten Bestimmungsphase wird ein zweites Reagenz
zugesetzt und das Gemisch inkubiert. ' Das zweite Reagenz enthält vorzugsweise a-Ketoglutarat, JNT und LDH-Hemmstoffe,
z.B. Alkalioxamat und Alkalioxalat. LDH wird gehemmt, und die oben beschriebenen Transaminase- und Glutamatbestimmungsreaktionen
finden statt. Die Enzymaktivität wird zu vorbestimmter Zeit durch Ansäuern zu Ende gebracht,
und JNTH wird kolorimetrisch gemessen. Ebenfalls kann man die Enzymaktivität aufrechterhalten und die Geschwindigkeit
der Extinktionsönderung über einen Zeitraum bestimmen.
Das obige verbesserte Verfahren zur Bestimmung von GOT und GPT in einer biologischen Flüssigkeit wird in
unserer gleichzeitigen, am
eingereichten Anmeldung Lfde. Nr.
beansprucht.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen Zusammensetzungen
und Arbeitsweisen zur Durchführung von Bestimmungen gemäss den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.
Es versteht sich, dass die Erfindung nicht auf die' in den Beispielen, die lediglich erläuternder Natur sind, dargelegten
Stoffe, Mengenverhältnisse, Bedingungen und Arbeitsweisen beschränkt ist.
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' £Vi 'T Λ J0
Dir <ι-Λ:ΐ!_ν"ί ■ : '·:Λ-:Ιϊν±Uli ir; menschlichem Blutserum wird unter
Vc.-rv:«.'.1 ichiu;1 von ersten υικί zwei ten Reagenzlösungen bestimmt.
Die ( r.Ttc· Irrung weist rinen pH von etwa 6,5 auf und enthalt
die- in Tabelle '5 angeführten, in destilliertem oder
entioni;.-,i( r t em Wasser gelösten Stoffe in den angegebenen
Verhältnissen:
Stoff , ' Menge pro Liter
Lösliche Sti'rke 1,25 Gramm
Adenorintripho-phut (ATP) 1,25 Millimol
ß-Nicotinamid-adenin-dirmcleotid
(NAD)
Natriumpyruvat
Hexokinase
Glucose-S-phospliat-dehydrogenase
Lactat-dehydrogenase (LDH) Kaliu^phosphatpuffer, pH 6,5
Natriumchlorid
Magnesiumasparaginat
Rinderserumalbumin
Als lösliche Sxärke v.'ird "Stärke löslich nach Zulkov.-sky zur
Analyse" (E. Kcrck Co. Katalognr. 1257) verwendet. Der
Kaliumphosphatpuffer ist ein Gemisch aus ein- und zweibasischem Kaliumphosphat.
Die Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase stammt aus
L. mesenteroides. Hexokinase kommt aus Hefe. Lactatdehydrogenase
wird aus Schweineherz oder Kaninchenmuskel erhart en. Handelsübliches Rinderserumalbumin, Fraktion
V (J.A.C.S. 6S, A59 (1956)), frei von Verunreinigung durch
Kohlehydrate, wie das Produkt der U.S. Biochemical Corporation, wird dabei eingesetzt.
Die zweite Rcagcnzlösung. weist einen pH von etwa 6,5 auf
und enthält die in Tabelle 4 angeführten, in destilliertem oder entionisiertem Wasser gelösten Stoffe, einschliesslich
Natriumoxamat als Hemmstoff für LDH, in den angegebenen
2 | Millimol |
o, | 75 Millimol |
1500 | I.U. |
2500 | I.U. |
250 | I.U. |
25 | Millimol |
50 | Millimol |
3 | Millimol |
4 | Gramm |
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- 22 -
Stoff
Tabelle- Λ
α-Glucosidase Natriuinoxamat
Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5 Rinderserumalbumin
Menge pro Liter 7000 I.U. IBO MU1 iniol
25 Millimol 4 Gramm
Der Kaliumphosphatpuffer und das Rinderserumalbumin sind
wie für die erste Reagenzlösung angegeben. Die o-Glucosidnsc stammt aus Hofe. Die einzelnen, in den
beiden Lösungen verwendeten Enzyme sind von verschiedenen Handelslieferanten erhältlich.
Bei der Durchführung einer Bestimmung pipettiert man zwei
ml der ersten Reagenzlösung in eine Küvette und gibt 50 μΐ
(0,05 ml) der Blutserumprobe dazu. Der Inhalt wird gemischt
und 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird das so erhaltene Reaktionsgemisch mit ejnemii.
der zweiten Reagenzlösung vermischt. Während des Ablaufs der Indikatorreaktionen wird die Inkubation bei 37°C
fortgesetzt. Die Intensität der Lichtabsorption wird bei 3^0 nm gegenüber einem Blindversuch mit den Reagenzien 5
Minuten lang laufend gemessen, um die Geschwindigkeit der vom gebildeten NADH herrührenden Extinktionsänderung zu bestimmen.
Der Blindversuch mit den Reagenzien wird in der gleichen V/eise wie das Probegemisch zubereitet und inkubiert,
ausser dass man 50 μΐ destilliertes V/asser anstelle
der verwendeten Blutserumprobe einsetzt.
Die o-Amylaseaktivität der Serumprobe wird auf Grund des
Extinktionskoeffizienten des NADH nach folgender Gleichung berechnet:
Amylaseaktivität der _ Δ A/Min. G esamt volumen
Serumprobe in I.U./l ~ b,22 χ Probenvolumen χ 1000
wobei das Gesamtvolumen die vereinigten Volumina der ersten und zweiten Reagenzien und der Probe darstellt, in dieoem
Fall 3,05 ml. Das Probenvolurnen betrügt 0,05 ml.
909886/0 745 _?
χ ·■-
" 23 ~ 2929Ü88
ΛΛ/Min. In deutet tile E:-: r i: ·■!: ti- orisändcrung pro I-ü nute.
Auch kann man die Festin-Uiurg so durchführen, dass man die
Lichtabsorption bei r)00 nrr· nissi, wobei man die folgenden
Aendei'ungen vornimmt: JNT wird zu ·. ir.om Anteil von 0,8
Mikromol pro Auswertung in die zweite Reagenzlosung und
Diaphorase (aus C1 οs τidium kluyνeri ) zu einen; Anteil von
etwa 1 I.U. pro Auswertung in die erste Reagenzlösung eingebracht.
Die Geschwindigkeit der Aenderung der Extinktion, die von de;:, durch die in der Serumprobe vorhandene
Amylaseaktivital g. l· :.l<.k ten JIITH herrührt, lässt sich dabei
mit derjenigen vergleichen, welche au.Γ das durch die in einer
oc-Amylasekontrolle vorliegende bekannte Amylaseaktivität
gebildete JKTK zurückzufünrer; ist, wobei diese bei der Arbeitsweise
auf die gleiche Art, jedoch unter Ersatz der Probe durch die Kontrolle bestirnt wird. Die Aktivität der
Serumprobe wird nach folgender Gleichung berechnet:
cr-Amylase- Geschwindigkeit der
aktivität Extinktionsänderung
a-AmylasesktivitSt _ der Kontrolle χ bei der Probe
der Seru'rprobe ~ Geschwindigkeit der Exxinkxions-
ändcrung bei der Kontrolle
Anstatt die JI;TH bildenden Indikatorrcaktionen zu verfolgen,
besteht, noch die weitere Myglichkeit, sowohl dem Serumprobencals»
aucli den: Kontrollger.isch zu einer vorbestinuriten
Inkubationszeit nach der Zugabe der zweiten Reagenzlösung,
vorzugsweise nach etwa 5-10 Minuten Inkubation, 1 rcl 0,An-Salzsäure
zuzusetzen. Zu dieser Zeit wird die Intensität der Lichtabsorption bei 300 nr. in jeder der Lösungen gemessen.
Die. ii-Amylasc ak iivitäx dei- Serumprcbe wii'd
nach de2" lctztei^en Gleichung bestimrr.t, wobei man in der
Gleichung jeweils die Geschwindigkeiten der Extinktionsänderung durch die Gesa:..textinktionen ersetzt.
Triglycerido in menschlichem Blutserum werden unter Verwendung
von ersten und zweiten Rcagenzlösungen bestimmt.
Die erste Lösung weist einen pH von etwa 7,4-7,6 auf und
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" 2h "
enthält die in Tabelle 5 angeführten, in destilliertem odc-ientionisiertem
Wasser geirrten Stoffe in den angegebenen
Verhältnissen.
TüIk lic ',
Stoff
Glycerin-dehydrogenase (GDH) Diaphorase
Lactat-dehydrogenase (LDH) f'-Nicotinamid-adenin-dihuc] cotid
Desoxycholsfiure
Kaliumphosphatpuffer, pH 7,^-7,6 Natriumpyruvat
Trypsinhemmstoff
Trypsinhemmstoff
Menge pro Liter 3 000 I.U. 3 000 I.U.
500 I.U.
(NAD) k Millirnol
0,12 Millimol
_ 100 Millimol
. 0,5 Millimol
0,2 Gramm
Die Glycerin-dehydrogenase stammt aus E. aerogenes und ist
im Handel erhältlich. Der Trypsinhcmmstoff wird zugesetzt, um gegebenenfalls in dem später zugegebenen Lipasepräparat
vorhandene Proteasen zu hemmen. Dieser wird aus Sojabohnen gewonnen und ist von der U.S. Biochemical
Corporation erhältlich., Diaphorase und LDH stammen aus den in Beispiel 1 angegebenen Quollen.
Die zweite Reagenzlösung weist einen pH von etwa 7,4-7,6 auf und enthält die in Tabelle 6 angeführten, in destilliertem
oder entionisiertem 1,'asser gelösten Stoffe in den angegebenen
Verhältnissen.
Tabelle 6 Stoff
Natriumoxamat
Kaliumoxalat
JNT
Lipase
Kaliumoxalat
JNT
Lipase
Kai j umpho:·.])}).'! tpu Π'νν, pH 7, A-7, (>
Manganchlorid
Menge pro Liter 20 Millimol 53 Millimol 1,0 Millimol • 106 I.U.
100 Millimol 0,2 Millimol
Die Lipase stammt aus Rhizopur. arrhizus oder Scbv.'cinepankreas.
Manganchlorid wird als Aktivator für Glycerindehydrogenase verwendet. Die Anteile der· Stoffe in den
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-25-
2323Ü88
ersten und zweiten ]·;< -.-.^-■ nrJ ösungen können innerhalb eines
bcvi>r;-.u[;t. ·. Bereich.': vor. + 20',' der in den Tabelle]) 5 und 6
f"in/'-f rt ben· :, Verhältnisse schwanken.
Boi diesel"- Bestimmung, die bei schv/ach alkalischem pH durchgeführt
wird, werden sowohl Oxamat- als auch OxalathemmstofiY.
für die LE)H-Ak tivitflt der zweiten Reagenzlösung mitzugegeben,
υπ; die LDIl-Aktivitat in der folgenden Reaktion
(Reaktion 6) in beiden Richtungen zu hemmen: Pyruvat λ NADH LDH ^ Lactat + NAD.
Die Reduktion von Pyruvat zu Lactat in Gegenwart von LDH
findet bei neutralem pH statt, und das vorhandene Oxamat soll diese Reaktion hemmen. Die Oxydation von Lactat zu
Pyruvat in Gegenwart von LDH läuft bei einem pH-Optimum von ( iv.'ä f: ob. Oxalat hemmt diese Reaktion, die sonst nach
dc'i· Liι ί.fernung endogenen Glycerins sowie wegen der Gegenwert.
von endogenem Lactat und LDH im Serum stattfinden könnte " und die zur Eildung von NADH führen würde, das für die zu
bestimmende] Trig! yer-ridi nicht spc "!fisch ist.
Zur Bestimmung verfährt man so, dass man ein Gemisch aus
0,5 ml der erster. Reagenzlösung und 25 μΐ einer Serumprobe
10 Minuten bei 37 C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkx versetzt
man mit 0,Γ· ml der zweiten Reagenzlösung und inkubiert
noch weit«, re PO Minuten. Dann wird eine. Menge von
''J ml 0, ln-Scil: .<^;;ri d^rurf gi bon, um die Reaktion anzuhalten.
Parallel mit der Serumprobe lässt man eine Triglyceridkontrolle und einen Blindversuch mit den Reagenzien laufen.
PiIr die Kontrolle verwendet man 25 μΐ einer Standard-Triglyceridlösung
anstelle der Probe. Für den Blindversueh setzt man ?\i μΐ destillierter; V.'asser anstelle der Probe
ein. Die Extinktionen der Probe und Kontrolle werden gegenüber dem Blindversuch mit den Reagenzien gemessen, und
die Triglyceridkonzentration in der Probe wird wie folgt berechnet:
Triglyceridkonzentration in der Serumprobe -
Triglyceridkonzentration in der Serumprobe -
Triglycerldkonzentraticn in der Kontrolle Extink t ion
Ex"Linktion der Kontrolle χ der Probe.
Claims (16)
- Patentansprüche(Verbessertes Verfahren zur Bestimmung einer in einer \_/ biologischen Flüssigkeit vorliegenden Substanz durch Oxydation einer im Verlauf der Bestimmung in Gegenwart eines Dehydrogenase-enzyms unter gleichzeitiger Bildung einer dem Substanzgehalt in der Flüssigkeit proportionalen Menge reduzierten ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotids entstehenden Verbindung, wobei diese Flüssigkeit ferner einen endogenen Stoff enthält, welcher bzw. ein während der Bestimmung entstehendes Derivat davon ebenfalls in Gegenwart dieses Enzyms unter gleichzeitiger Bildung reduzierten ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotids oxydiert wird, so dass eine Störung der Bestimmung auftritt, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbesserung zur Beseitigung der Störung durch den endogenen Stoff darin besteht, dass man: diesen endogenen Stoff bzw. dessen Derivat in Gegenwart dieses Enzyms unter gleichzeitiger Reduktion von ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid oxydiert, das so gebildete reduzierte ß-Nicotinamid-adenindinucleotid in Gegenwart von Lactat-dehydrogenase unter gleichzeitiger Reduktion von Pyruvat zu Lactat oxydiert,909886/0745dann die enzymatischem Aktivität der Lactat-dehydrogenase hemmt undschliesslich eine Menge jener im Verlauf der Bestimmung entstehenden Verbindung zu deren Oxydation und zur gleichzeitigen Reduktion von ß-Nicotinamid-adenindinucleotid proportional dem Gehalt an jener Substanz erzeugt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum ist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lactat-dehydrogenaseaktivität durch Oxamidsäureanion gehemmt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von a-Amylase, dadurch gekennzeichnet, dass jene im Verlauf der Bestimmung entstehende Verbindung Glucose-6-phosphat ist.
- 5. Verfahren nach Ansprach 1 zur Bestimmung einer Transaminase, dadurch gekennzeichnet, dass jene im Verlauf der Bestimmung entstehende Verbindung L-Glutamat ist.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Triglyceriden, dadurch gekennzeichnet, dass jene im Verlauf der Bestimmung entstehende Verbindung Glycerin ist.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Triglyceriden, dadurch gekennzeichnet, dasr. jene im Vorlauf der Bestimmung entstehende Verbindung Glycerinphosphat ist.
- 8. Verfahren zur Bestimmung von in einer ferner endogene Glucose enthaltenden biologischen Flüssigkeit vorliegender a-Amylase, dadurch gekennzeichnet, dass man stufenweise:(1) lösliche Stärke mit der in dieser Flüssigkeit vorliegenden a-Amylase enzymatisch zu Oligosacchariden einschliesslich Maltose hydrolysiert,(2) gleichzeitig die in dieser Flüssigkeit vorhandene909888/0745Glucose mit Adenosintriphosphat in Gegenwart von Hexokinase zu Glucose-6-phosphat umsetzt, dieses mit ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Gegenwart von GIucose-6-phosphat-dehydrogenase zu 6-Phosphogluconat und reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid umsetzt und letzteres mit Pyruvat in Gegenwart von Lactat-dehydrogenase zu ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in seiner oxydierten Form und Lactat umsetzt,(3) dann die enzymatische Aktivität der Lactat-dehydrogenase hemmt und(A) schliesslich mit dieser Hydrolyse mit der in jener Flüssigkeit vorliegenden a-Amylase fortfährt, die dabei gebildete Maltose in Gegenwart von a-Glucosidase enzymatisch zu Glucose hydrolysiert, die so gebildete Glucose mit Adenosintriphosphat in Gegenwart von Hexokinase zu Glucose-6-phosphat umsetzt und das entstandene GIucose-6-phosphat mit ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in einer der cc-Amylaseaktivität proportionalen Menge umsetzt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Hemmung jener Aktivität in Stufe (3) Oxamidsäureanion zusetzt.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum ist.
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man Stufen (1) und (2) miteinander ungefähr 10 Minuten lang bei etwa 370C ablaufen lässt.
- 12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Durchführung der Stufen (1) und (2) jene Flüssigkeit mit löslicher Stärke, Adenosintriphosphat, Hexokinase, ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, einem löslichen Brenztraubensäuresalz und Lactat-dehydrogenase vermischt und zur Durchführung der Stufen (3) und (A) das Produkt aus Stu-909886/0745 - *fen (1) und (2) mit einem löslichen Oxamidsfiuresalz und oc-Glucosidase versetzt.
- 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese biologische Flüssigkeit menschliches Blutserum ist.
- 14. Kombination aus zwei Reagenzien zur Bestimmung von in einer femer endogene Glucose enthaltenden biologische! Flüssigkeit vorliegender cc-Amylase, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem ersten Reagenz, welches lösliche Stärke, Adenosintriphosphat, Hexokinase, ß-Nicotinamid-adenindinucleotid, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, ein lösliches Brenztraubensäuresalz \m.d Lactat-dehydrogenase enthält, wobei dieses erste Reagenz zunächst zwecks Hydrolyse der Stärke und Umwandlung der vorhandenen Glucose zu 6-Phosphogluconat in einem ß-Nicotinamidadenin-dinucleotid in seiner oxydierten Form enthaltenden Produkt mit jener Flüssigkeit zu vermischen ist, und einem zweiten Reagenz, welches ein lösliches Oxamidsäuresalz und a-Glucosidase enthält, wobei dieses zweite Reagenz zwecks Hemmung der enzymatischen Aktivität dieser Lactat-dehydrogenase und anschliessender Bildung von reduziertem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in einer der a-Amylaseaktivität proportionalen Menge mit jenem Produkt zu vermischen ist, besteht.
- 15. Kombination aus zwei Reagenzien zur Bestimmung von in einer ferner aidogene Glucose enthaltenden biologischen Flüssigkeit vorliegender α-Amyläse, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem ersten Reagenz, welches die folgenden Stoffe jeweils in Anteilen zwischen etwa 80% und 120% der angegebenen Werte enthält:Stoffe MengcLösliche Stärke 1,25 Gran,:.iAdenosintriphosphat 1,25 Millimolß-Nicotinamid-adenin- 2 Millimoldinucleotid
Alkalipyruvat 0,75 Millimol909886/0745 ~ 5 ^BADMen/ I.U. 1500 I.U. 2500 I.U. 250 Millimol 25 Millimol 50 Millimol 3 Stoffe HexokinaseGlucose-6-phosphat-dehydrogenase
Lactat-dehydrogenaseAlkaliphosphatpuffer, pH 6,3-7,1Alkalichlorid Magnesiumsalzwobei dieses erste Reagenz zunächst mit jener Flüssigkeit zu vermischen ist, um die Stärke zu hydrolysieren und die vorhandene Glucose zu 6-Phosphogluconat in einem ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in seiner oxydierten Form enthaltenden Produkt umzuwandeln, und einem zweiten Reagenz, welches die folgenden Stoffe jeweils in Anteilen zwischen etwa 80% und 120% der angegebenen Werte enthält:Stoffe · Mengea-Glucosidase ' 7000 I.U.Alkalioxamat 180 .MillimolAlkaliphosphatpufferpH 6,3-7,1 25 Millimolwobei dieses zweite Reagenz mit jenem Produkt zu vermischen ist, um die enzymatische Aktivität dieser Lactat-dehydrogenase zu hemmen und anschliessend reduziertes ß-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in einer der a-Amylaseaktivität proportionalen Menge zu bilden, besteht. - 16. Kombination nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese Reagenzien jeweils aus einer wässrigen Lösung ihrer Stoffe mit einem pH von etwa 6,5, bestehen und diese Stoffe in den angegebenen Mengen pro Liter Lösung vorliegen.■h'M '■·. ■"·/.»■■*-■' '- 6-909886/07A5
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