DE2130308C3 - Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen von enzymatisch umsetzbaren Probensubstanzen - Google Patents

Description

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- ohne Anwendung besonderer Reinigung^- und Trennkennzeichnet, daß der die Probenlösung entbal- verfahren durchführbar sein. Dieses Ziel wurde instende Strom über ein Bett von teilchenförmigen! as besondere durch Entwicklung von Analysenautomaten trägergebundenem unlöslichem Enzym geleitet angestrebt, in denen die gewünschten Umsetzungen wird. weitgehend automatisiert ablaufen gelassen und ge-

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden messen werden.

Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Die bisher hierfür entwickelten Methoden und Vor-

blockartige Eingabe der Probenlösung so erfolgt, 30 richtungen besitzen jedoch noch wesentliche Nachdaß der Pufferlösungsstrom geteilt wird, die Teil- teile. Diese bestehen insbesondere darin, daß die ströme abwechselnd unterbrochen werden und die Analysenfrequenz noch zu gering ist, die Einbringung Probenlösung in den unterbrochenen Strom ein- der zu analysierenden Probe Arbeitsschritte umfaßt, gegeben wird. welche die Genauigkeit des Ergebnisses wesentlich

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge- 35 beeinflussen und der Reagenzienverbrauch, insbesonkennzeichnet, daß die Probenlösung an der Unter- dere der Verbrauch an Enzym, unerwünscht hoch ist. brechungsstelle im Überschuß zugegeben und Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diese durch öffnen des Teilstromts der Überschuß ab- Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren und eine getrennt wird. Vorrichtung zu schaffen, welche Fehlerquellen bei der

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfah- 40 Dosierung der zu bestimmenden Substanz, beispielsrens nach Anspruch 1 mit einem Enzym enthal- weise Pipettieren, Abmessen u. dg!., ausschließen, mit tenden Kreislaufsystem mit einem Pufferreservoir, einem Mindestaufwand an Reagenzien eine sehr hohe einer Vorrichtung zum Einführen einer Probe, Analysenfrequenz erreichen und gleichzeitig leicht einem Reaktionsraum und Detektor mit Re- auswertbare Meßsignale und sehr exakte Resultate gistriergerät und einer Pumpe mit konstanter For- 45 liefern. Insbesondere ist es auch Aufgabe der Erfinderleistung, dadurch gekennzeichnet, daß die Ein- dung, die Eigenschaft der Enzyme, sich als Katalysarichtung zum Einführen der Probe ein eine block- toren praktisch nicht zu verbrauchen, in einem Verartige Eingabe einer Probenlösung ohne Ände- fahren der obenerwähnten Art technisch nutzbar zu rung der Strömungsgeschwindigkeit erlaubender machen.

Applikator (A) ist, der zwischen Pufferreservoir 50 Gelöst wird diese Aufgabe bei einem Verfahren und Reaktionsraum angeordnet ist. der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch,

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch ge- daß zur quantitativen Bestimmung einzelner Proben kennzeichnet, daß der Applikator (A) wenigstens unterschiedlicher Konzentration eine bestimmte zwei durch einen Sperrschieber (11) mit wenig- Menge der Probenlösung blockartig, luftblasenfrei «tens zwei korrespondierenden Bohrungen (17, 55 und ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit 18) abwechselnd zu sperrende Durchlässe (13 α, der zirkulierenden Pufferlösung in den Pufferlösungs-15 a; 12 ο, 14 a) aufweist und eine der Bohrungen strom eingebracht und mit dem Enzym in Kontakt (18) mit einer Zuflußleitung (21) für die die zu gebracht wird.

bestimmende Substanz enthaltende Lösung in Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist.

Verbindung steht, wenn der korrespondierende 60 daß die Merkmale luftblasenfreie und blockartige Durchlaß (12 a, 14 a) gesperrt ist. Einführung der Probenlösungen in den Pufferlösungs-

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch ge strom ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit kennzeichnet, daß der Applikator (A) mit einer der Pufferlösung gleichzeitig erfüllt werden. Erst die Vakuumpumpe zum Evakuieren der Zuflußlei- Kombination dieser drei Bedingungen ermöglicht die tung (21) und der damit verbundenen Bohrung 65 Erzielung der weiter unten näher aufgeführten Vor-(18) in Verbindung steht. teile.

Aus der US-PS 3 512 517 sind bereite ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Überwachung des Blut-

, S -^ ^^ ^{Wobei der} «ockartig eingegebenen Probenlösung (Lösung

t· TV** ^DialySe- ^{der m} bestiminendei Substanz) mit dem kreisende]!

ri- ΐ¹ · I' ^Blui ?^{gea eine Strom bewirkt}- ^Die Vermischung kana beispielsweise

ung_] dialyaert wud. Hier wird durch WirbelbUdung durch mechanische Hindernisse

^-^Τ^ΤΑι,Αΐί³⁵⁰⁶^^^01111118· ⁵ '^m Lösungsstrom erfolgen. Die Vermischung soll SS?¹·. ,^h L? ΑΑΪ v™· ?^m ******** möolidist gering gehalten werden, um die Analy^n-Verfabren und der bekannten Von ,chtung quantita- frequenz und die Empfindlichkeit der Methode nicht tive Bestanmungen einzelner Probensubstanzen zu verringern. Sie muß lediglich in solchem Umfang durchzuführen. Auch w,rd man zwar bei dem bekann- stattfinden, daß ein Kontakt der zu bestimmeBden tea Verfahren im allgemeinen auch luftblaseofrei xo Substanz mit den für die Umsetzung benötigten Subarbeiten, eine vorhandene Luftblase wird jedoch im stanzen gewährleistet ist und der für die Aktivität des Gegensatz zur Erfindung die Gesamtmessung nicht Enzyms gewünschte pH-Wert sich einstellt s^¹®¹¹· _ . ..„ ., . . Bei Verwendung eines trägergebundenen unlös-Das erfindungsgemaße Verfahren eignet sich allge- liehen Enzyms, welches zwischen Applikator und Demein zur quantitativen Bestimmung von in wäßriger 15 tektor in den Lösungsstrom eingeschaltet v/ird, ergibt Losung enzymatisch umsetzbaren Probensubstanzen, sich der gewünschte Vermischungsgrad ohne weiteres vorausgesetzt, daß sich bei dieser Umsetzung eine Ver- durch die im Enzymbett stattfindende Vermischung änderung in der Lösung ergibt, die physikalisch ge- bzw. Verwirbelung. In diesem Fall kann auch die messen werden kann und proportional der Umset- Vermischung besonders gering gehalten werden, da zeug bzw. der Menge der zu bestimmenden Substanz *> ein zufriedenstellender Kontakt mit dem Enzym auf ist Unter quantitativer Bestimmung wird auch die jeden Fall gegeben ist.

Bestimmung von Enzym-Aktivitäten verstanden. Der- Soweit ein trägergebundenes Enzym verwendet

artige Substanzen und Umsetzungen sind in großer wird, sollte die spezifische Aktivität wenigstens

Zahl bekannt. Beispiele hierfür sind Umsetzungen, 10 U/g, vorzugsweise mehr als 50 U/g, betragen, um

welche sich so mit der Oxydation von reduzier- »5 ein großes Säulenvolumen und damit eine starke Ver-

tem Nicotinamid-Adenindinucleotid (NADH bzw. mischung des Probe-sBlocks« mit der Pufferlösung

NADPH) koppeln lassen, daß die Änderung der Ex- zu vermeiden.

tinktion von NADH der Umsetzung proportional ist. Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Auf diese Weise können beispielsweise bestimmt wer- Verfahrens besteht in der luftblasenfrei blockartigen den: Acetaldehyd, Pyruvat, Sorbose, Oxalacetat, 30 Einführung der Lösung, welche die zu bestimmende a-Ketoglutarat, Glutamat-Pyruvat-Transaminase Substanz enthält, in den Pufferlösungsstrom. Die Lö-(GPT), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) sung soll dabei unter möglichst geringer Vermischung u. v. a. mit dem Pufferlösungstrom so eingeführt werden, daß Andere derartige Reaktionen sind die Bestimmung sie nach Art eines Flüssigkeitspfropfens im fließenden von Harnstoff mittels Urease und Messung des ge- 35 Strom wandet. Eine derartige Einführung laß: sich bildeten Ammouiumcarbonats, beispielsweise durch beispielsweise mit Hilfe eines Schiebers erzielen, wel-Bestimmung der Ammoniumionenkonzentration; Um- eher in einer Bohrung die abgemessene Menge der Setzung von Saccharose mit Invertase und Messung Lösung enthält und so in den fließenden Pufferder optischen Drehung mittels Polarimeter; Spaltung lösungsstrom gebracht wird, daß die Probelösung von Lipiden mittels Lipase unter Bildung von Fett- 40 blockartig bzw. pfropfenartig in der Pufferlösung mitsäuren und Bestimmung der pH-Wert-Veränderung geführt wird.

mittels Glaselektrode; Bestimmung von Pyrophosphat Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsdurch Spaltung mittels Pyrophosphatase unter BiI- gemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein mit konlung von Orthophosphat oder Bestimmung von GIu- stanter Geschwindigkeit fließender Strom einer gecose durch mit Glucoseoxydase katal sierte Oxyda- 45 eigneten Pufferlösung als Träger und Reaktionsmittel tion und Messung der Wärmetönung in. Kalorimeter; für die Umsetzung verwendet wird. Unter konstanter Oxydation von Glucose oder Galactose, Harnsäure, Geschwindigkeit wird hierbei eine solche Konstanz Xanthin, Hypoxanthin, Cytochrom A, Aminosäuren, der Geschwindigkeit verstanden, bei der die unverpolyungesättigten Fettsäuren mit spezifischen Oxy- meidlich auftretenden Geschwindigkeitsschwankundasen und Messung der Verringerung der Sauerstoff- 50 gen so gering sind, daß sie von dem mit dem Detekkonzentration mittels Sauerstoff elektrode; Bestim- tor verbundenen Anzeigegerät praktisch nicht regimung von Wasserstoffperoxyd und anorganischen striert werden. Diese Bedingung ist ideal erfüllt, wenn Peroxyden mittels Katalase und Messung des gebil- konstante Bedingungen angezeigt werden, solange deten Sauerstoffs, ebenfalls mittels Sauertoffelektrode, kein Probelösungsblock den Detektor passiert. Wird Bestimmung von Aminosäuren mit Aminosäuredecarb- 55 diese konstante Geschwindigkeit nicht eingehalten, so oxylase und Messung des gebildeten CO₂ u.v.a. kann durch das ständig anzeigende Gerät in Verbin-Für die obigen Umsetzungen unter Sauerstoffver- dung mit dem Detektor eine Umsetzung vorgetäuscht brauch geeignete Enzyme sind beispielsweise GIu- werden. Fine solche Änderung kann auch vorgecoseoxydase, Galactoseoxydase, Uricase, Xanthin- täuscht werden, wenn bei der Einführung der Probeoxydase, Cytochromoxydase, Aminosäureoxydase 60 lösung Luftblasen in den Reagenzstrom gebracht und Lipoxygenase. werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Wesentlich ist weiter, daß die blockartige Einfüh-Enzyme können entweder im kontinuierlich zirkulie- rung der Probelösung keine Änderung der Strömungsrenden Lösungsstrom gelöst vorliegen oder als träger- geschwindigkeit des mit konstanter Geschwindigkeit gebundene unlösliche Enzyme teilchenförmig in Form 65 fließenden Stroms der Pufferlösung hervorruft, da eines Bettes, z. B. als Säule, im Lösungstrom ange- hierdurch die Gefahr einer Verfälschung des Meßordnet sein. Wird gelöstes Enzym verwendet, so wird ergebnisses entsteht, durch geeignete Mittel eine geringfügige Vermischung Für die Regenerierung der verbrauchten Kompo-

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nenten nach Durchlaufen des Detektors, nachdem Oxalacetat und Glutamat überführt werden. Das geder Pufferlösungsstrom konstant im Kreislauf umge- bildete Oxalacetat wird mit dem im Lösungsstrom pumpt wird, ist es zweckmäßig, wenn verbrauchte kreisenden oder trägergebunden vorliegenden Enzym Komponenten wieder ergänKt werden. Wird beispiels· Malatdehydrogenase in Malat überführt, wobei gleichweise das Verfahren unter Verwendung einer zu be- 5 zeitig in der Lösung vorhandenes NADH wieder in stimmenden Substanz durchgeführt, welche unter NAD umgewandelt wird.

Sauerstoffverbrauch oxydiert wird, so kann der Sauer- Die blockartige Eingabe der Probelösung ohne

stoffgehalt der Pufferlösung wieder ergänzt werden, Änderung der Strömungsgeschwindigkeit wird vorindem beispielsweise Luft durchgeleitet wird. Dies zugsweise so durchgeführt, daß der Pufferlösungserfolgt zweckmäßig in einem etwas größeren Be- io strom geteilt wird und die Teilströme abwechselnd hälter mit entsprechender Verweilzeit der Pufferlö- unterbrochen werden und die die zu bestimmende sung. Falls die zu bestimmende Substanz unter Er- Substanz enthaltende Lösung (Probelösung) in den höhung des Sauerstoffgehaltes der Lösung reduziert jeweils unterbrochenen Strom eingegeben wird. Bewird, wird der gebildete Sauerstoff wieder entfernt, sonders günstig ist es hierbei, die Probelösung an der indem in entsprechender Weise ein sauerstofffreies 15 Untetbrechungsstelle selbst zuzugeben. Hierbei wird Trägergas, beispielsweise Stickstoff oder «in Edelgas vorzugsweise ein Überschuß an Probelösung, beidurchgeleitet wird. spielsweise an Serum, zugegeben und durch öffnen

Wird z. B. NADP zu NADPH reduziert (wie im des Teilstromes der Überschuß abgetrennt. Dies kann Beispiel der Glucosebestimmung mit der gekoppelten beispielsweise wie oben bereits angedeutet erfolgen, Hexokinase-Glucose-6-phosphat-Reaktion), so läßt s» indem in einen Teilstrom des Pufferiösungsstromes sich gebildetes NADPH durch einen Redoxaus- eine schieberartige Vorrichtung eingeschaltet wird, tauscher, der als Säule nach dem Detektor in den deren Schieber eine zur Aufnahme einer bestimmten Strom eingeschaltet wird, laufend zu NADP reoxy- Menge Probelösung geeichte Bohrung enthält. Durch dieren: Eintauchen dieser Schieberöfmung in überschüssige

Hydrierte Pyridincoenzyme (NADH und NADPH) »5 Probelösung, z. B. überschüssiges Probeserum, oder können auch mit trägergebundener Glutamat-Dehy- öffnen der Bohrung zu einem größeren Behälter, der drogenase reoxydiert werden (Säule in Strom), wenn derartige Probelosung enthält, und Einfließenlassen man dem kreisenden Reagenz NH_t ⁺-Ionen und der Probe wird eine abgemessene Menge Probea-Ketoglutarat zusetzt Diese Substanzen stören die lösung bei Verschieben des Schiebers abgetrennt und zu messende Reaktion im allgemeinen nicht. so blockartig in den Pufferlösungsstrom eingegeben,

Das Verfahren der Erfindung kann jedoch auch wenn die Bohrung des Schiebers in den unterohne laufende Regenerierung durchgeführt werden, mochenen Teilstrom der Pufferlösung so gebracht bis die umgesetzten Komponenten verbraucht sind wird, daß durch diese Bohrung die öffnung des unter- oder Reaktionsprodukte sich derart anhäufen, daß brochenen Stromes erfolgt Vorzugsweise wird hierdie zur Bestimmung herangezogene Reaktion gestört 35 bei gleichzeitig der andere, bis zu diesem Zeitpunkt wird. Es wird dann entweder diskontinuierlich rege- eicht unterbrochene Teilstrom unterbrochen, was neriert oder die Pufferlösung ausgetauscht. durch den gleichen Schieber erfolgen kann.

Die Pufferlösung selbst stellt eine wäßrige Lösung Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchfüh-

eines für das jeweils verwendete Enzym geeigneten rung des oben beschriebenen Verfahrens mit einem Puffers in üblicher Konzentration dar. Die geeigneten 40 Enzym enthaltenden Kreislaufsystem mit einem Puf-Puffer und Pufferkonzentrationen sowie die günstigen ferreservoir, einer Vorrichtung zum Einführen einer pH-Werte für die jeweils verwendeten Enzyme sind Probe, einem Reaktionsraum und Detektor mit Reim allgemeinen bekannt. gistriergerät und einer Pumpe mit konstanter Förder-Die Pufferlösung kann gegebenenfalls noch andere leistung ist dadurch gekennzeichnet, daß die EinSubstanzen außer den puffernden Verbindungen ent- 45 richtung zum Einführen der Probe ein eine blockhalten, welche für die enzymatische Umsetzung not- artige Eingabe einer Probenlösung ohne Änderung der wendig oder erforderlich sind. Beispiele hierfür sind Strömungsgeschwindigkeit erlaubender Applikator Salze, welche etwa erforderliche Ionen, wie z. B, (A) ist, der zwischen Pufferreservoir und Reaktions-Magneshanionen, Sulfationen o. dgl. eatfealten oder raum angeordnet ist.

stabilisierend wirkende Verbindungen, oberflächen- so Der ProbeappHkator besitzt vorzugsweise wetrigaktive Substanzen u. dgL Wetter enthält die Puffer- stens rwei durch enten Sperrschieber nut wenigstens lösung afle diejenigen Substanzen gelöst, die asch für zwei korrespondierenden Bohraagen abwechselnd eventuelle gekoppelte Reaktionen, die gleichzeitig ab- za sperrende Durchlässe and esse der Bohrungen laufen, erforderlich sind. Insndere enthält sie steht mit einer Zofhifileitang für die die za bestiav-Eazyme und Substrate für derartige Reaktionen. Wird 55 mecde Probensubstanz enthaltende Lösung in VerbeispielsweiseGlutamat-PyrBvat-TransaEnnase (GPT) bindung, wenn der korrespondierende Durchlaß gegemessen, so werden L-AIanra ued o-Ketogtutarat sperrt ist

in der Pufferlösung gelöst and durch das mit der Gemäß einer besonders n Ausführungs-

Probe zugefügte Enzym za Gratamat and Pyruvat form steht der Applikator oat ewer Vakuumpumpe iß umgewandelt. Das Pyruvat wiederum wird in Gegen- 60 Verbindung, mit der die Zaäaßlertang für die Probenwart des Hilfs- bzw. Indikatorenzyms Lactatdehydro- lösung and die damit verbundene Probeabohnmg im genäse (LDH) und von NADH zu L-Lactat umge- Schieber evakuiert werden können, wandelt unter Bildung von NAD⁺, wobei die beim Zweckmä&gerweise besteht der Applikator au·

Verschwinden von NADH rende Änderung der eiser Hülse not verschiebbarem Kern, wobei Hülst Extinktin im UltravioJetteD gesessen wird. Falls die 65 and Kern je drei Durchlässe aufweisen, die durch Ver Glutaraat-Oxalacetat-Traasaminase (GOT) bestimmt schieben des Kerns zur Deckung gebracht werdet werden sou, so wird der Pufferlösung u-Aspartat können. Besonders zweckmäßig ist ein derartige and a-Ketoglutarat zugesetzt, die von der GOT in Applikator gekennzeichnet durch eine Hälse mit erne

7 ^ψ 8

ersten unid zweiten Einlaßbohrung, einer ersten und faß bestehen, welches eine Ablauföffnung und eine zweiten Auslaßbohrung, einer Lufteinlaßbohrung, Zulauföffnung für Pufferlösung sowie zweckmäßig einer Vakuumbohrung und einer Probelösungsboh- eine öffnung zur Einführung von zu ergänzenden rung, sowie einem in der Hülse verschiebbar ange- Substanzen, Gasen u. dgl. aufweist. Das Reservoir ist ordneten Kern mit drei Bohrungen, die so angeordnet 5 zweckmäßigerweise thermostatisiert. Die Pumpe P, sind, daß durch Verschieben des Kerns die erste Ein- die zur Förderung des Pufferstromes und zur Auflaß- mit der ersten Auslaßbohrung, die zweite Ein- rechterhaltung des Kreislaufs dient, kann wie bereits laß- mit der zweiten Auslaßbohrung, die Lufteinlaß- erwähnt als Schlauchpumpe oder auch als Kolbenmit der Vakuumbohrung und die Probelösungsboh- oder Kreiselpumpe gestaltet sein. Zweckmäßigerweise rung mit der Vakuumbohrung verbunden werden kön- io ist ihre Förderleistung regelbar, nen, wobei nicht gleichzeitig die erste Einlaßbohrung Der in Fi g. 2 schematisch im Schnitt gezeigte Demit der ersten Auslaßbohrung und die zweite Einlaß- tektor besteht aus einer Durchflußzelle 1, die zweckbohrung mit der zweiten Auslaßbohrung verbunden mäßigerweise thermostatisierbar gebaut ist Sie entwerden. hält die eigentliche Meßvorrichtung 2 sowie einen

Ferner enthält die Vorrichtung eine Pumpe mit 15 Lösungskanal 3, in den die Meßvorrichtung, beispielskonstanter Förderleistung, vorzugsweise in der Lei- weise eine Meßelektrode, eine Glasfaseroptik oder ein tung vor oder hinter dem Applikator. Hierbei kann Temperaturfühler hineinragen kann, beispielsweise eine Schlauchpumpe Verwendung fin- Unter der Bezeichnung »Verstärker V* sind alle den. Eine für diesen Zweck bevorzugte Schlauch- funktionalen Teile zu verstehen, die die Meßelekpumpe wird in der deutschen Patentschrift (Patent- » trode zur Arbeit benötigt, also Stromquelle, Ananmeldung P 20 25 056.0) beschrieben. Schlußleitungen zur Stromquelle, elektronische Ver-

Ferner enthält die Vorrichtung zweckmäßig in der Stärkung usw.

Leitung zwischen Applikator und Detektor eine Das Registriergerät G dient zur Registrierung der Mischvorrichtung, welche beispielsweise aus einer Meßergebnisse. Es können beliebige Geräte verwen-Säule, die auf teilchenförmigen! Träger gebundenes as det werden, bevorzugt wird jedoch ein Schreiber, der Enzym enthält, bestehen kann. Bei Anwendung von an den Verstärker V angeschlossen werden kann, gelöstem Enzym besteht die Mischvorrichtung zweck- An Stelle des Schreibers können auch andere Analogmäßig in einem einfachen Einsatz in der Rohrleitung, oder Digitalgeräte verwendet werden. Für die Mesder eine gewisse Verwirbelung der durchströmenden sung erforderlich ist nur die Anzeige des Meßsignals Lösung verursacht. 30 in Relation zum Zeitablauf.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfin- Die in F i g. 3 im Schnitt gezeigte Mischvorrich-

dungsgemäße Vorrichtung werden nachstehend an tung 5 besteht aus einer Säulenwand 4, die zweck-

Hand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellt mäßigerweise zylindrische Form aufweist und an den

dar Enden geschlossen ist und an einem Ende eine Ein-

F i g. 1 eine schematische Darstellung der erfin- 35 Strömöffnung 5 und am anderen Ende eine Ausdungsgemäßen Vorrichtung, Strömöffnung 6 für Pufferlösung aufweist Sie ist gc-

F i g. 2 eine schematische Darstellung der Führung füllt mit Körnern 7, die aus inertem Material oder aus

des Puffer-Lösungsstromes am Detektor, Enzym auf festem unlöslichem Träger gebunden be-

F i e. 3 eine Ansicht der Mischeinrichtung im stehen. Die Größe der Säule hängt vom gewünschten Schnitt, 4» Vermischungsgrad von Probelösung und Pufferlösung

F i g. 4 eine Darstellung eines erfindungsgemäßen sowie im Falle eines trägergebundenen Enzyms von Applikators mit Verbindungsleitungen im Längs- der gewünschten Meßempfindlichkeit, der Meßprobeschnitt und Querschnitt, menge und der Aktivität des Enzyms ab. Wird eine

F i g. 5 eine mit dem Verfahren der Erfindung er- Säule mit trägergebundenem Enzym verwendet, so

haltene Meßkurve, 45 liegt diese zweckmäßigerweise in thermostatisierter

F i g. 6 die sich aus der Meßkurve von F i g 5 er- Ausführung vor. Zweckmäßig ist die Säule dann so

gebende Eichkurve, gestaltet daß sie durch einfaches Auf- oder Zu-

F i g. 7 eine Eichkurve für eine andere Ausfüh- schrauben ausgewechselt werden kann, falls die Akti-

runesform der Erfindung, vität des trägergebundenen Enzyms nachgelassen hat

F i g. 8 eine Meßkurve für eine weitere Ausfüh- 5° oder aus einem anderen Grund ein Austausch erfor-

runesform der Erfindung, derltch ist. Em soldier Austausch kann beispielsweise

F i g. 9 die Eichkurve zu der in Fi g. 8 dargestellten erforderlich sein, um die Vorrichtung für die Besnm- Meßkurve, mang einer anderen Substanz einzurichteii and damit Fig. 10 eine weitere MeßkuTve und ein anderes trägergebundenes Enzym einzuführen Fi g. 11 eine weitere Eichkurve. 55 oder um den Vermischungsgrad von Probelösung aod Wie in Fig. 1 gezeigt enthält ein Reservoir/? einen PaSeriösinig bei Übergang auf ehre andere Bestim- Vorrat an Pufferlösung. Eine Pumpe P fördert die nnragsmethode τα ändern.

Pufferlösung aus dem Reservoir R in einen Proben- Der Probeapplikator A dient wie weiter oben beapplikator A und von dort über einen Mischeinsatz 5 bereits beschrieben zum te, Hodcartigeo weiter in einen Detektor D sowie anschließend wieder 60 Einbringen der Probelösang in den Pafferstrom. Er in das Reservoir R zurück. In der gezeigten Ausfüh- bewirkt die Abmessung der Probdösung and die stännragsfonnsnKlamDetektoTDeindeklronischerVer- dige AufiechtCTbatong des Pufferaiouies ohne stärker V, der die Meßsigaate des Detektors D ver- größere GescuwiiHfigkeifssdiwaiikuiigen. stäkt, and ein Registriergerät G, an welches die ver- In der in Fig.4 gezeigten Ausranrungsforni bestärkten Meßsignale citciyn werden aad wel- «5 steht der Applikator ans einer Heise 1« rod einem dies beispielsweise em Schreiber sein kanu, ange- darin verschiebbaren Ken 11. Eine Emlaßteituag 12 schlossen. for den Psn fönt zur Bobrang 12« in der

Das Reservoir Λ kann aus einem beliebigen Ge- Hase 19 Eine Zweigtettung 13 zweigt von der Lei-

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tung 12 ab und führt zur Bohrung 13 a der Hülse 10. keit der Pufferlösung und gegebenenfalls der Größe

Desgleichen führt eine Auslaßbohrung 14, die mit der der Säule S ab. Falls für die Bohrung 18 ein kapillarer Bohrung 14 a verbunden ist und zum Auslaß der Durchmesser gewünscht wird, kann zur Erleichterung Pufferlösung dient, an der anderen Seite der Hülse 10 des Füllvorgangs eine entsprechende öffnung in der

weiter. Eine Zweigleitung 15 verbindet die Auslaß- S Hülse 10 gegenüber der Trichterbohfung 21 angebracht

bohrung 15 a in der Hülse 10 mit der Auslaßleitung werden. Die Probe wird nicht auslaufen können, da

14. Eine Leitung 16, die mit einer Bohrung 16 a in die Oberflächenspannung des unten hängenden

der Hülse 10 in Verbindung steht, ist an ein Vakuum Tropfens ein Abreißen verhindert,

angeschlossen. Der verschiebbare Kern 11 weist Boh- Der Applikator A kann aus beliebigem Material

rangen 17,18 und 19 auf, welche bei entsprechender io sein, soweit dieses Material gegenüber den verwen-

Schieberstellung jeweils die Bohrungen 12 a und 14 a, deten Lösungen inert ist und einen dichten Sitz von

13a und 15a sowie 16 α mit Lufteinlaßbohrung 20 und Kern 11 und Hülse 10 ermöglicht. Geeignete Ma-

Trichterbohrung 21 in der Hülse 10 verbinden terialien sind z. B. Glas, Kunststoff oder Metall. Der

können. Applikator A kann auch aus verschiedenen Ma-

Bei der in Fig. 4a gezeigten Normalstellung des is terialien bestehen, beispielsweise aus Metall mit Kerns 11 wird in die Trichterbohrung 21 die zu Oberflächen aus einem gleitfähigen Kunststoff, wie

untersuchende Probelösung, beispielsweise Serum, z. B. Polytetrafluoräthylen.

eingegossen und von dort in die Bohrung 18 des Der Applikator A läßt sich im Rahmen des oben Kerns 11. Die Füllhöhe in der Trichterbohrung 21 der angegebenen Prinzips auch anders gestalten, z. B. zy-Hülse 10 spielt hierbei keine Rolle, soweit nur Boh- »o lindrisch entsprechend einem Mehrwegehahn. Der rung 18 im Kern 11 vollständig gefüllt wird. Während Parallelstrom wird in diesem Fall zweckmäßig in die Probe eingefüllt wird, fließt der Pufferstrom von einem zweiten Hahn gesteuert, dessen Kern auf der 13a nach 15a. Nach Abschluß des Füllens wird der gleichen Achse sitzt wie der Kern, in den die Probe-Kern 11 in Pfeilrichtung geschoben, bis sich die Boh- lösung appliziert wird.

rung 18 mit den Bohrungen 12 a und 14 a deckt Die as Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfin-Probelösung, deren Volumen dem Volumen der Boh- dungsgemäße Vorrichtung weisen eine Reihe besonrung 18 im Kern 11 genau entspricht, wird vom Puf- derer Vorteile auf. Sie gestatten, außerordentlich ferstrom zur Säule S hin blockartig mitgeführt. Bei rasche Analysen durchzuführen, da das Meßergebnis dieser Stellung des Kerns 11 ist der Strom von 13 a im allgemeinen schon nach sehr kurzer Zeit vorliegt nach 15 a unterbrochen, gleichzeitig wird die in der 30 Durch den konstanten flüssigkeitsstrom wird eine Trichterbohrung 21 verbliebene Lösungsmenge durch sehr stabile Einstellung des Systems gewährleistet, die Bohrung 19, Bohrung 16a und Leitung 16 abge- welche langwieriges Nacheichen überflüssig macht saugt Sobald die Probelösung im Pufferstrom abge- und ständige Betriebsbereitschaft garantiert. Die Verleitet ist, wird der Kern 11 entgegen der Pfeilrichtung wendung geeichter Meßpipetten wird überflüssig, so verschoben, bis sich die Bohrung 18 mit der Luftein- 35 daß hieraus resultierende Fehlermöglichkeiten elimilaßbohrung 20 und der Auslaßbohrung 16a deckt niert werden. Durch die ständige Wiederverwendung Die Bohrung IS wird dabei vom Puffer entleert und der eingesetzten Enzyme wird eine erhebliche Köder Pufferstrom von Bohrung 13 a zu Bohrung 15 a steneinsparung bzw. Materialeinsparung erzielt wieder freigegeben. Schließlich wird der Kern 11 wie- Durch einfaches Auswechseln der Pufferlösung sowie der in Pfeilrichtung bis zur Ausgangsstellung bewegt 40 gegebenenfalls des trägergebundenen Enzyms und/odei und der Vorgang kann wiederholt werden. des Detektors läßt sich das Verfahren und die Vor-

Die Größe des Applikator» A, insbesondere das richtung rasch für eine andere Bestimmung einrichten. Volumen der Bohrung 18, hängt von der Empfind- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung

lichkeit des Verfahrens, der Strömungsgeschwindig- weiter.

Beispiel 1

Bestimmung von D-Glucose im Serum Prinzip:

D-Glucose + ATP Gtacose-6-pbosphat + ADP

_. c. _·. t » . «Arm* . im λ Gtacose-5-phosphat-Dehydrogenase - _. . ,

GhKOse-6-phosphat + NADP⁺ + H₈O - 2 =► 6-Phospho-gluconat

+ NADPH + H⁺ . Die Bildung von NADPH wird im Photometer gemessen.

Es wurde die in Fig. 1 der Zeichnung dargestellte optischen Dichte erfolgte bei 366 mn. Zur Registrie Vorrichtung verwendet Die Saide S wies einen 60 rung war ein Kompensationssreiber angeschtes Durchmesser von 1 era and eine Föflhöhe von 1 cm sen.

mn raid war mä einer 2:1-Mischung von ia Wasser Der verwendete Applikator A wies ha Prinzip dn

gequollener Gfmxjse-6-pbospfaat-Deoydrogeiiase auf in F i g. 4 der Zeicbmmg gezeigte Konstruktion auf

Träger der spez. Aktivität von 27 U/g und Hexo- Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte ein Volumen να Kasse aaf Träger der spez. Aktivität von 80 U/g be- Ss 10 μΐ. Der Applikator bestand aas V4A-StaM/Te&on

schickt Die einzelnen Vorrichta&gsteüe waren wSt Sffikon

Ak Detektor D wurde ein handetsubtiebes Photo- schlauch von 1 mm lichter Weite verbanden. Ah Pdf

meter mit DuTchflußzeHe verwendet Die Messung der fer wurde 03 M Triäthanolamm-Puffer pH 7,5 ver

11 12

wendet, enthaltend 4 mM Magnesiumsulfat; 0,44 mM stieg der Nullinie beruht darauf, daß gebildetes

NADP und 0,59 mM ATP. NADPH sich im Puffer anreichert.

In den Applikator wurden im Abstand von etwa Beisüiel 2 1 Minute Serumproben mit bestimmtem Glucose-

gehalt eingegeben. Proben 1 und 4 enthielten 200 mg 5 Bestimmung von D-Glucose im Serum Glucose/100 ml, Proben 2 und 3 100 mg/100 ml, Das Beispiel ist analog Beispiel 1, mit dem Unter-Probe 5 300 mg/100 ml und Proben 6 und 7 schied, daß die die Reaktion katalysierenden Enzyme 50 mg/100 ml. Die auf dem Registriergerät auf ge- in Lösung vorliegen. Als Mischeinrichtung S (vgl. zeichneten Meßkurven zeigt Fig. 5. Die erhaltenen Fig. 1 der Zeichnung) wurde eine einfache Glas-Werte sind in F i g. 6 als Eichkurve dargestellt und io spirale verwendet, die einen Innendurchmesser von zeigen, daß die Höhe der Gipfel über der Nullinie des 2,5 mm und eine Weglänge von 70 cm aufwies. Der Meßschreibers direkt proportional dem Glucosege- Puffer enthielt als zusätzliche Komponenten 0,12 mg halt der Lösung ist, wobei unter den beschriebenen Hexokinase/ml (16,5 U/ml) und 0,12 mg Glucose-Versuchsbedingungen der Proportionalitätsbereich bis 6-phosphat- Dehydrogenase (17 U/ml), zur Konzentration von 200 mg/100 ml reicht. Der An- 15 Das Versuchsergebnis entsprach dem aus Beispiel 1.

Beispiel 3

Bestimmung von Hexokinase in wäßriger Lösung Prinzip:

D-Glucose + ATP Glucose-6-phosphat + ADP

,_i , , ,.t.t^j. . *■. ~ Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase >.«.., Glucose-6-phosphat + NADP⁺ + H₂O — > 6-Phosphogluconat

+ NADPH + H⁺ . Die Bildung von NADPH wird im Photometer gemessen.

Da die Reaktionszeit zwischen Beginn der Re- Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die

aktion und Messung im Detektor konstant ist, kann in Fig.4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf.

von der Menge des gebildeten NADPH auf die Akti- 35 Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte ein Volumen

vität der Hexokinase geschlossen werden. von 10 μΐ. Der Applikator bestand aus V4A-Stahl/

Es wurde die in F i g. 1 der Zeichnung dargestellte Teflon.

Vorrichtung verwendet. Die Säule 5 wies einen Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikon-Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 2 cm schlauch von 1 mm lichter Weite verbunden. Als Pufauf und war mit in Wasser gequollener Glucose-6- 40 fer wurde 0,3 mM Triäthanolamin-Pufier pH 7,5 verphosphat-Dehydrogenase auf Träger der spez. Akti- wendet, enthaltend 4 mM Magnesiumsulfat, 0,4 mM vität 27 U/g beschickt. Zwischen Detektor D und Re- NADP, 0,59 mM ATP und 2O«/o Glucose, servoir R war eine Glasspirale geschaltet, die einen In den Applikator wurden im Abstand von etwa innendurchmesser von 2,5 mm und eine Weglänge 1 Minute Proben von wäßriger Hexokinase-Lösung von 70 cm aufwies. Diese Glasspirale war in einem 45 eingegeben. Es wurden 1 :2 und 1 :4 verdünnte Wasserbad auf 95° erwärmt Sie diente dazu, die zu- Hexokinase-Lösung eingesetzt, sowie unverdünnte vor gemessene Hexokinase zu inaktivieren. Hexokinase-Lösung (0,1mg Protein/ml). Die Eich-

AIs DetektorD wurde wiederum ein handelsübliches kurve Fig. 7 gibt die Abhängigkeit der Höhe der Photometer mit Durchflußzelle verwendet. Die Mes- Gipfel auf der Registrierkurve von der eingesetzten

sung der optischen Dichte erfolgte bei 366 am. Zur 50 Hexokinase-Konzentration wieder. Es ist erkennbar,

Registrierung war derselbe Kompensationsschreiber daß eine lineare Abhängigkeit besteht, angeschlossen.

Beispiel 4

Bestimmung von η-Glucose im Sentm mittels Ghicoseoxydase nach der Gleichung: Glucose -i O₈ + H₁O Qj_000n^_{1115 +}

Es wurde die in F i g. 1 der Zeichnung dargestellte sauerstoff sensitive Elektrode mit einem Sauerstoffmeß- Vorrichtung verwendet. Dk Säule S wies einen gerät und angeschlossenem Potentiometerschreibei Durchmesser von 1 can und eine Füllhöhe von 1 cm verwendet.

auf und war mit in Wasser gequollener Ghicoseoxy- 65 Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betrug

dase auf Träger mit einer spezifischen Aktivhat von 7,5 cm/Sek., der Durchmesser der Eintrittsbohrunj

200 U/g beschickt in die Durchflußzelle wie in Fig. 2 dargestellt 1 mm

Als Detektor D wurde eine im Handel erhältliche Der verwendete Applikator A wies im Prinzip di<

in Fig. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion aiii. Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte 2 mm Durchmesser und 10 mm Länge. Der Applikator bestand aus Glas.

Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauen von 1 mm Durchmesser verbunden. Ais Puffer wurde 0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH 6,0 verwendet, enthaltend 18 mM Kaliumiodid, 7,5 mM Ammoniumheptamolybdat und 80OmM Natriumchlciäd.

In den Applikator A wurden im Abstand von etwa

einer Minute Serumproben mit bestimmten Glucosegehalt eingegeben. Die Proben 1 bis 3 enthielten je f 00 mg Glucose/100 ml Serum. Probe 4 enthielt 200, ProbeS 300, PnAe 6 400 und Probe 7 500 mg/ s 100 mL Die auf dem Registriergerät 61 aufgezeichneten Meßloirvea zeigt Fig.8. Die erhaltenen Werte sind in Fig. 9 als Eichkurve wiedergegeben und zeigen, daB die Höhe der Gipfel über der Null-Linie des Meßschreibers direkt proportional dem Glucosegehalt der Probe ist

Beispiel S Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase nach der Gleichung:

Hamsäare + 2H₁O +O₂ Allantoin + H₁O₂ + CO₂.

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung der gleichen Vorrichtung zur Bestimmung von Harnsäure verwendet Die Säule 5 war mit Uricase auf Träger gefüllt Die Säule 5 wies einen Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 5 cm auf. Die spezifische Aktivität der trägergebundenen Uricase betrug 3 U/g.

Es wurde die im Beispiel 1 beschriebene Vorrichtung verwendet Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betrug 3,5 cm/Sek., der Durchmesser der Eintrittsbohrung in die Durchflußzelle, wie in Fi g. 2 dargestellt, betrug 1 mm.

Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die in Fig. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte einen Durchmesser von 2,5 mm und eine Länge von 13 mm. Der Applikator Λ bestand aus Glas.

Die einzelnen VonichtungsteUe waren mit Silikonschlauch von I mm Durchmesser verbunden. Als Pufao fer wurde 0,2 M Boratpuffer pH 6,5 verwendet, in dem 600 U/ml Katalase gelöst waren.

In den Applikator A wurden im Abstand von etwa 6 Minuten Proben von Harnsäurelösungen bestimmten Gehaltes eingegeben. Probe 1 enthielt 5 mg Hamas säure/100 ml, Probe 2 10 mg, Probe 3 15 mg, Probe 4 30 mg, Probe 5 45 mg und Probe 6 60 mg/ 100 mi.

Die auf dem Registriergerät G aufgezeichnete Meßkurve zeigt Fig. 10 der Zeichnung. Die erhaltenen Werte sind in Fig. 11 als Eichkurve wiedergegeben. Man erkennt daraus, daß die Höhe der Gipfel über der Null-Linie des Meßschreibers direkt proportional dem Harasäuregehalt der Probe ist

Hierzu 9 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

v3 Die Erfindung betrifft em Verfahren zum Bestun- Patentansprüche: men von enzymatisch umsetzbaren Probensubstanzen in wäßriger Lösung in einem Enzym enthaltenden, im

1. Verfahren zum Bestimmen von enzymatisch Kreislauf geführten Pufferiösungsstrora und Messung umsetzbaren Probensubstanzen in wäßriger 5 einer Veränderung in der Lösung mittels Detektor, Lösung in einem Enzym enthaltenden, im Kreis- wobei verbrauchte Komponenten gegebenenfalls regelauf geführten Pufferlösungsstrom und Messung neriert werden, sowie eine Vorrichtung zur Durcheiner Veränderung in der Lösung mittels Detek- führung dieses Verfahrens.

tor, wobei verbrauchte Komponenten gegebenen- Enzymatisch umsetzbare Probensubstanzen wer-

falls regeneriert werden, dadurch gekenn- » den sowohl in der Technik als auch im klinischen zeichnet, daß zur quantitativen Bestimmung Labor in großem Umfang laufend quantitativ beeinzelner Proben unterschiedlicher Konzentration stimmt unter Ausnutzung ihrer Eigenschaft, durch beeine bestimmte Menge der Probenlösung block- stimmte Enzyme selektiv so umgesetzt zu werden, daß artig, luftblasenfrei und ohne Änderung der Strö- sich in der wäßrigen Lösung eine der Menge des gemungsgeschwindigkeit der zirkulierenden Puffer- 15 suchten Produktes proportionale Änderung, die leicht lösung in den Pufferlösungsstrom eingebracht und meßbar ist, ergibt Diese Änderung kann beispielsmU dem Enzym in Kontakt gebracht wird, weise im Auftretet, oder Verschwinden bestimmter

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- Verbindungen oder in der Änderung spezieller Eigenkeunzeichnet, daß das Enzym in der Pufferlösung schäften, wie des pH-Wertes u. dgl. bestehen. Bei dergelöst ist und die Pufferlösung mit der Proben- ao artigen Bestimmungen besteht ganz allgemein das lösung vor Erreichen des Detektors gemischt Problem einer möglichst raschen und einfachen wird. Durchführung. Insbesondere sollte die Bestimmung