DE2642232C3 - Verfahren und Vorrichtung zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrates - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines EnzymsubstratesInfo
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Description
Die Erfindung betriffl ein Verfahren zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrats
in einer wäßrigen Flüssigkeit mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und eine
Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die kontinuierliche Konzentrationsbestimmung maneher Substanzen wirft Probleme auf, die bei der Einzelanalyse von Proben des gleichen Untersuchungsgutes nicht oder in anderer Form auftreten. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn während der Probenvorbereitungen oder Probenvorbehar.dlung bei
Die kontinuierliche Konzentrationsbestimmung maneher Substanzen wirft Probleme auf, die bei der Einzelanalyse von Proben des gleichen Untersuchungsgutes nicht oder in anderer Form auftreten. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn während der Probenvorbereitungen oder Probenvorbehar.dlung bei
ίο der Einzelanalyse kinetische Vorgänge bis ui ein
endgültiges Gleichgewicht ablaufen können, die bei kontinuierlicher, direkter Probeneingabe dagegen nur
unvollständig oder gar nicht ablaufen oder zumindest das Meßergebnis verfälschen, auch wenn sie vollkommen
ablaufen können, bevor der Detektor erreicht wird. Dieses Problem tritt beispielsweise bei der Glucosebestimmung
aus Vollblut über die polarometrische Messung des Sauerstoffverbrauchs bei der enzymatischen
Oxidation der Glucose mittels Glucoseoxydase (GOD) durch die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins
auf. Bei der Bestimmung der Glucose nach diesem Verfahren im Serum tritt dieses Problem nicht auf, weil
dabei das Hämoglobin vor der analytischen Probenverarbeitung entfernt wird.
Im Falle einer Einzelbestimmung von Glucose aus Vollblut ist es auch noch leicht möglich, das Hämoglobin
mit Sauerstoff abzusättigen, bevor die Probe in das analytische System e'-ngebracht wird. Der dann noch
auftretende Sauerstoffverbrauch kann ebenso wie bei der Bestimmung im Serum nur noch durch die Glucose
bedingt sein. Wird hingegen der Vene kontinuierlich Vollblut zur Überwachung der Glucose entnommen, so
ist dies praktisch nicht mehr möglich. In einem solchen Fall wird man in der Regel das Vollblut durch einen
Dialysator führen, in welchem die Glucose in den Dosierkreis für die Analyse übertritt, während das
Hämoglobin zurückgehalten wird. Das aus der Vene kommende, an Sauerstoff verarmte Hämoglobin, nimmt
jedoch sofort Sauerstoff auf, sobald es dazu in der Lage ist. Dies tritt jedenfalls im Dialysator auf, da dort im
Meßkreislauf eine sauerstoffgesättigte Flüssigkeit vorliegt und eine O;-Diffusion innerhalb des Dialysators
von der Meßkreisseite zur Probenkreisseite hin auftritt. Infolge dessen verarmt die Flüssigkeit an Sauerstoff.
Eine Blockierung des Hämoglobins oder Sättigung mit Sauerstoff, ehe e«. m den Dialysator gelangt, ist mit
vertretbarem Aufwand kaum zu erzielen, zumal bei Eintritt in den Dialysator auch die Konzentration des
gelösten Sauerstoffs gleich sein müßte, wie diejenige im Dosierkreispuffer.
Ganz ähnliche Probleme wie in dem vorstehend beispielhaft erörterten Fall treten bei zahlreichen
anderen Bestimmungen ebenfalls auf, wenn sie kontinuierlich durchgeführt werden. Es besteht nun grundsälzhch
die Möglichkeit, diese Probleme durch Verwendung eines zweiten Detektors auszuschalten, welcher die zu
bestimmende Komponente des Systems vor der eigentlichen analytischen Reaktion mißt. In zahlreichen
Fällen scheitert dies jedoch an der Schwierigkeit, zwei vollständig gleiche Detektoren herzustellen. Schon in
der Spektralphotometrie bemüht man sich deshalb durch komplizierte Anordnungen die beiden Liehtwege
eines Doppeistrahlgerätes möglichst wieder auf einen Empfänger zu lenken, obwohl Photozellen noch leichter
zur Übereinstimmung gebracht werden können, als andere Meßgeräte. Dieses Problem tritt insbesondere
auf bei ionenempfindlichen Elektroden, Sauerstoffelektroden, Leitfähigkeitsmessungen sowie generell bei
allen solchen Detektoren, die sich praktisch nicht mit völliger Genauigkeit reproduzieren lassen, wo also ein
Detektor vom anderen auch bei größler Sorgfalt in der Herstellung immer gewisse Abweichungen in der
Anzeige ergibt Aber auch dann, wenn dies möglich ist, wäre es von Vorteil, den für diese Übereinstimmungsgenauigkeit
getriebenen Aufwand vermeiden zu können.
Dies soll am Beispiel der Sauerstoffelektrode näher erläutert werden. Die Eigenschaften derartiger Elektroden
ändern sich mit unterschiedlichen OrDiffusionswiderständen der Membran vor der Kathode. Sie sind
damit von Bespannung zu Bespannung verschieden und die Erfahrung zeigt, daß allein hierdurch bis zu 50%ige
Änderungen der Signalhöhe auftreten können. Weitere Veränderungen treten durch Verlegung der Mikroporen
der zumeist aus Polytetrafluoräthylen bestehenden Membran durch Verunreinigungen auf. Weiter spielen
anströmungsbedingte Unterschiede in den Grenzschichtver-hältnissen
vor der Kathode eine Rolle und damit Fertigungsdifferenzen der Durchflußkammern
von Exemplar zu Exemplar oder unterschiedliche Positionierungen der Elektrode in dei- Kammer von
einer Montage zur anderen. Schließlich treten auch Unterschiede in der Linearität der Signale, der
Nullströme, der Steilheit wie auch im dynamischen Sprungverhalten oder der Übergangscharakteristik zur
Sättigung auf. Hinzu kommt, daß bei Anordnung von zwei Detektoren mit getrennten Verstärkern auch
Unterschiede zwischen den Verstärkern die Fehlergröße erhöhen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben geschilderten Probleme zu beseitigen und ein einfaches
Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, weiche ohne großen apparativen oder herstellungsbedingten
Aufwand die kontinuierliche Überwachung einer Enzymsubstratkonzentration gestattet.
Gelöst wird diese Aufgabe bei einem Verfahren zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrates
in einer wäßrigen Flüssigkeit durch Einführung einer das zu bestimmende Substrat enthaltenden
Probe in ein^n Pufferlösungsstrom, Umsetzung des Substrates an einem immobilisierten Enzym und
physikalische Messung einer dadurch hervorgerufenen Änderung in der Lösung in einer Meßkammer,
erfindungsgemäß dadurch, daß der die zu bestimmende Probe enthaltende Pufferlösungsstrom abwechselnd
einmal direk· durch die Meßkammer "inter Erzeugung eines Referenzsignals und einmal zuerst über das
immobilisierte Enzym und danach durch die Meßkammer unter Erzeugung eines Meßsignals geleitet wird.
Eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung ist im Patentanspruch
3 und vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens bzw. der Vorrichtung sind in den Patentanspmchen
2 bzw. 4 u. 5 beschrieben.
Das Verfahren Jer Erfindung ist immer dann vorteilhaft anwendbar, wenn das erzeugte Meßsignal
ein Basissignal bzw. eine Basissignallinie benötigt und die Basissignallinie nicht konstant ist, sondern schwankt
oder triftet. Nach einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird lediglich die Reihenfolge, in der
die probehältige Lösung das immobilisierte Enzym und
die Meßkammer durchströmt, in regelmäßigen, möglichst kurzen, Abständen umgekehrt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren mißt man mit der gleichen Meßkammer, beispielsweise einer (VElektrode,
ionensensitiven Elektrode oder einer Leitfähigkeitsmessung,
nur zeitlich versetzt vor dem immobilisierten Enzym die tatsächliche, von welchen Einflüssen
auch immer bestimmte Konzentration der von der Messung erfaßten Substanz und nach Kontakt mit dem
Immobilisierten Enzym den durch die Umsetzung der zu bestimmenden Substanz geänderten Gehalt an der
Meßsubstanz, also beispielsweise den Sauerstoffgehalt vor und nach Oxydation des Blutzuckers.
Gegenüber bekannten Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Konzentration einer Substanz ist
es durch die Erfindung möglich, laufend eine Basismeßlinie zu erhalten und damit auch Einflüsse durch
Temperaturänderungen, Druckänderungen oder Strömungsgeschwindigkeitsänderungen auszuschalten.
Denn in regelmäßiger Zeitfolge steht immer wieder die Basismeßlinie zur meßtechnischen Bezugssetzung zur
Verfügung. Das Verfahren der Erfindung stellt keine im strengen Sinne des Wortes kontinuierliche Bestimmung
einer Enzymsubstratkonzentration dar, sondern eine laufende, aber intermittierende Bestimmung. Als Enzymsubstrat
werden alle durch enzymatische Analysenverfahren mcGbare Substanzen verstanden.
Der Begriff »immobilisiertes Εηζ>·.·.<
wird hier in seiner üblichen Bedeutung gebraucht hr umfaßt trägergebundene Enzyme, ob kovalent oder adsorptiv.
durch Einschluß, Verklebung oder Einpolymerisa »ion, durch Vernetzung immobilisierte Enzyme und dergleichen.
Da: immobilisierte Enzym kann in Form eines Pulvers, Granulats oder dergleichen vorliegen oder an
Membranen, Fasern oder Oberflächen von Formkörpern gebunden sein. Besonders gut geeignet sind eine
mit granuliertem, enzymatisch aktivem Material gefüllte Enzymsäule im Pufferiösungsstrom oder eine Enzymstrecke,
also eine Rohrleitung mit enzymatisch aktiver Oberfläche des Rohres. Im letzteren Fall können
beispielsweise Kunststoffschläuche oder Rohre verwendet werden, die z. B. aus Polyamiden bestehen und an
deren Oberfläche durch kovalente Bindung oder Verklebung das Enzym immobilisiert ist
Als Probe können beim Verfahren der Erfindung beispielsweise physiologische Flüssigkeiten wie VolJjlut
oder Harn oder Verfahrenslösungen verwendet werden. Das Verfahren eignet sich daher insbesondere zur
Übeiwachung von Körperfunktionen und der Zusammensetzung
von Prozeßströmen, beispielsweise Nährlösungen für Mikroorganismen u. ä.
Die das zu bestimmende Substrat enthaltende Probe kann kontinuierlich in die strömende Pufferlösung
eingebracht werden. Es ist jedoch auch möglich eine intermittierende Einführung vorzusehen, bei der das
Probevolumen blockartig im Pufferlösungsstrom wandert, wie es beispielsweise aus DE-OS 21 30 308 bekannt
ist Es kann auch sine zirkulierende Pufferlösung angewendet werden, wenn eine Regeneration derselben
möglich ist oder/und akkumulierende Substanzen tolane, bar sind.
Bei kontinuierlicher Einführung der Probe kann diese
über eine Dialysemeinbran mit dem Pufferiösungsstrom in Berührung gebracht werden, so daß die zu
überwachende Substanz in die Pufferlösung eindialysiert wird. Auf oiese Weise werden andere, nicht
dialysierbare Substanzen, welche Störungen beim Kontakt mit dem Enzym oder in der Meßkammer
hervorrufen könnten, ausgeschlossen. Wahlweise ist es
aber auch möglich, die zu bestimmende Proue direkt in den Pufferiösungsstrom einzuführen. Im letzteren Fall
wird man zweckmäßig die Probe vorher durch Zusatz von Pufferlösung, Heparinlösung oder dergleichen so
verdünnen, daß keine Störungen durch suspendierte
Feststoffe beim Kontakt mit dem immobilisierten Enzym oder in der Meßkammer auftreten können und
die Konzentration der zu bestimmenden Substanz sich dem Meßbereich des Detektors anpaßt. Störungen
durch Verstopfung des immobilisierten Enzyms lassen sich vermeiden, indem möglichst offene Querschnitte
gewählt werden, beispielsweise ein Schlauch mit einer enzymatisch aktiven Oberfläche als Ehzyrhstfecke.
Zweckmäßig erfolgt die Vorverdünnung, indem die Probe zuerst in einen Pufferlösungszweigstrom eingegeben
und dieser dann mit dem Hauptslrom des Puffers gemischt wird.
Die probehallige Pufferlösung kann man jeweils so lange durch die Meßkammer strömen lassen, bis ein
konstantes Referenzsignal bzw. Meßsignal erhalten wird, ehe man wieder umschaltet, notwendig ist dies
aber nicht. Auch muß die Enzymreaktion nicht vollständig ablaufen, es kann also noch Substrat nach
Passieren des immobilisierten Enzyms vorhanden sein. Bei einer zirkulierenden Pufferlösung kann nicht
umgesetztes Substrat in einer späteren Umsetzung mit weiterem immobilisierten Enzym vollständig entfernt
werden. Auch andere Substanzen in der Pufferlösung, die nach Passieren der Meßkammer bei erneuter
Messung stören würden, werden zweckmäßig in nichtstörende Substanzen umgewandelt oder daraus
entfernL Dies kann beispielsweise erfolgen durch eine weitere Kontaktierung mit geeignetem immobilisierten
Enzym. Eine besonders zweckmäßige Ausführungsform des Verfahrens ist hierbei die oben erwähnte Umkehrung
der Reihenfolge, in der Enzym und Meßkammer durchflossen werden, bei welcher solche Probelösung,
die ohne vorherigen Kontakt mit immobilisiertem Enzym direkt in die Meßkammer gerät und daher das
gesamte Enzymsubstrat noch enthält, anschließend mit dem immobilisierten Enzym in Kontakt gebracht und
dadurch entfernt wird. Falls jedoch Bedingungen gewählt werden, die nicht zur vollständigen Umsetzung
des Substrates, z. B. also der Glucose, führen, so wird in
diesem Fall noch eine weitere Kontaktierung mit immobilisiertem Enzym vorgenommen.
Falls bei der enzymatischen Reaktion Substanzen geDiidet werden, weiche die MeGreakiiun beeinflussen
oder durch diese erfaßt werden, können sie wieder aus der Pufferlösung entfernt werden, z. B. durch
Adsorptionsmittel oder/und Ionenaustauscher. Dies ist beispielsweise der Fall bei Leitfähigkeitsmessungen.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es aber auch ohne solche Entfernung der störenden Substanzen im
Kreislauf zu arbeiten, da ja bei jedem Kreislauf ein neues Basismeßsignal erzeugt wird, welches als
Bezugspunkt für das Substratmeßsignal dient und damit einen Einfluß der Anhäufung störender Substanzen auf
die Bestimmung selbst ausschaltet.
Die Dauer eines Verfahrenszyklus, also von einer Umschaltung zur nächsten, hängt ab von der Strömungsgeschwindigkeit
der Pufferlösung, der Länge der zu durchströmenden Strecken, der Ansprechzeit des
Detektors und der Geschwindigkeit der Enzymreaktion. In der Praxis wird die Zeitspanne von einer Umschaltung
zur nächsten zwischen einigen Minuten und einigen Sekunden liegen. Bei einer Umschaltzeit von
15 Sekunden würde man alle 30 Sekunden ein basisbezogenes Signal, d. h. ein Meßsignal, erhalten. Beispielsweise
bei einer Sauerstoffelektrode ist eine gewisse Zeit nötig, um das Diffusionsgleichgewicht einzustellen.
Zur näheren Erläuterung der Erfindung werden im Folgenden Ausführungsbeispiele einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung anhand der beigefügten Zeichnung beschrieben. In der Zeichnung stellt dar
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer beispielsweisen
effiridüngsgemäßcn Vorrichtung iiv einer ersten
Schaustellung,
Fig.2 die Vorrichtung von Fig. 1 in einer anderen
Schaltstellung,
Fig.3 ein anderes Ausführungsbeispiel einer erfin*
dungsgemäßeh Vorrichtung in einer ersten Schaltstellung,
Fig.4 eine andere Schaltstellung der Vorrichtung von F i g. 3 und
Fig. 5 eine typische Meßkurve, die mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aufgezeichnet wurde.
Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung weist ein Wechselventil (6) mit drei Kanälen (61,62,63) auf, wobei
in einer ersten Position des Wechselvenlils der erste Kanal (61) die Überbrückungsleitung (5) bildet, der
zweite Kanal (62) den Abstrom von der Meßkammer (4) zum immobilisierten Enzym (3) leitet und der dritte
Kanal (63) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der zum Behälter(l) führenden Leitung verbindet.
Die zweite Position des Wechselventils (6) von F i g. 1 ist in Fig.2 dargestellt Danach leitet der erste Kanal
(61) zum Enzym (3), der zweite Kanal verbindet den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der
Meß^ammer (4) und der dritte Kanal (63) den Abstrom von der Meßkammer (4) mit der zum Behälter (I)
führenden Leitung. Die in den F i g. 1 und 2 dargpstellte Vorrichtung enthält weiter zwei Pumpen (8 und Sa),
welche die Strömung im Meßkreislauf und im Probekreislauf aufrechterhalten, einen Reaktor (9) zur
Umwandlung von restlichem Substrat, eine Venenkanüle (10), mit der Vollblut über die Pumpe (Ha) in die als
Dialysator ausgebildete Probeeinführungsvorrichtung (2) und weiter zu einem Sammelgefäß (11) geleitet wird
und einen Behälter (12) für Heparinverdünnungslösung, die mit dem durch die Kanüle (10) abgenommenem
Vollblut vermischt dem Dialysator (2) zugeführt wird.
Die andere in den Fig. 3 und 4 dargestellte Vorrichtung ermöglicht eine Verkürzung der Umschaltzeilen.
Während die gesamte Vorrichtung im wesentli-
l #- 1 *<nr1 1
wird hier ein Wechselventil (6) mit zwei Kanälen (64,65)
vorgesehen, wobei der erste Kanal (64) das immobilisierte Enzym (3) enthält. In einer ersten Position des
Wechselventils verbindet der erste Kanal (64) den Abstrom von der Meßkammer (4) mit der zum Behälter
(I) führenden Leitung und der zweite Kanal (65) bildet
die Überbrückungsleitung (5).
In der in F i g. 4 dargestellten Position des Wechselventils verbindet der erste Kanal (64) den Abstrom von
der Probeeinführungsvorrichtung (2) mit der Meßkammer (4) und der zweite Kanal (65) den Abstrom von der
Meßkammer (4) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung.
Bei Betrieb der dargestellten Vorrichtungen wird durch die Venenkanüle (10) Blut entnommen und
gleichzeitig mit einer aus dem Vorratsbehälter (12) durch die Pumpe (Sa) geförderten Heparinlösung in
vorbestimmten Volumenverhältnissen verdünnt Die dabei erhaltene Mischung von Vollblut mit Heparinlösung
wird durch die Pumpe [Sa) angesaugt und der als Dialysator ausgebildeten Probeneinführungsvorrichtung
(2) zugeführt und von dort in den Sammelbehälter
(II) weitergeleitet. Im Dialysator steht die Mischung
von Vollblut mit Heparinlösung im Austausch mit durch die Pumpe (8) aus dem Vorratsbehälter (1) zugeführter
Pufferlösung. Hierbei treten die dialysierbaren niedermolekularen
Substanzen, wie z. B. Glucose, aus dem verdünnten Vollblut in den Meßkreislauf über und
gelangen in Kanal (61) bzw. (64) des Wechselvenlils (6).
In der in den Fig. I uhd 3 gezeigten Position des Wechselventils bildet dieser Kanal einen Teil der
Überbrückungsleitung (5) und die probehaltige Pufferlösung geengt daher direkt in die Meßkammer (4) unter
Erzeugung eines entsprechenden Meßsignals, welches in einer hier nicht gezeigten Vorrichtung angezeigt
wird. Danach gelangt der Pufferlösungsstrom wieder zurück in das Wechselventil in Kanal (62), kommt mit
dem immobilisierten Enzym (3) in Kontakt und strömt dann in das Wechselventil und durch Kanal (63) über
den Reaktor (9) in das Puffervorratsgefäß (I) zurück. Bei der Ausführungsform der Fig. 3 und 4 ist die
Enzymstrecke in den Kanal (64) verlegt, im übrigen ist die Betriebsweise jedoch genauso wie oben beschrieben.
Gegebenenfalls kann zwischen Probeeinlührungsvorrichtung
(2) und Wechselventil (6) noch ein Strömungsumkehrventil angeordnet werden, damit notfalls Gasblasen
oder ähnliche Störungen kurzzeitig aus dem Kreislauf entfernt werden können. Zweckmäßig wird
dieses Strömungsumkehrventil dann so angeordnet, daß vor Erreichen des Behälters (1) noch der Reaktor (9)
durchströmt wird.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Vorrichtung besteht
in der Steuerung des Zusatzes von Substanzen in Abhängigkeit von den ermittelten Meßwerten. Beispielsweise
kann die Blutzuckerkonzentration gemessen werden und in Abhängigkeit vom erhaltenen Meßwert
ein blutzuckersenkendes Mittel, wie Insulin oder eine blutzuckererhöhende Substanz zudosiert werden. In
analoger Weise ist es aufgrund des Meßwertes möglich, wenn diese zur Überwachung ablaufender Reaktionen
eingesetzt werden, die Zugabe von Ausgangsstoffen für diese Reaktionen zu steuern u. ä. m.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung noch weiter erläutern.
R ρ i ς η i ρ I I
Es wird die in den Fig. 1 und 2 dargestellte Vorrichtung verwendet. Eine handelsübliche Venenkanüle
(10), die eine Heparinisierung des Blutes direkt an ihrer Spitze erlaubt, entnimmt das Blut. Die Schlauchpumpe
(8a) fördert hierzu aus dem Heparinlösungsvorratsgefäß (12) 5 ml/Stunde Heparinlösung (50 000 U/
100 ml) zur Kanüle. Der zweite, in die Pumpe (8a) eingelegte Schlauch saugt aus der Kanüle eine
Mischung von 5 ml/Stunde Heparinlösung und 5 ml/ Stunde Blut an. Diese Mischung gelangt nun zur
Primärseite des als Dialysator ausgebildeten Probeeinführungsgerätes (4) und von dort zu einem Abfallgefäß
(11). Während der Verweilzeit im Dialysator tritt das heparinisierte Blut mit dem die Sekundärseite des
Dialysators durchströmenden Puffer in Austausch. Die Laufstrecke im Dialysator beträgt 15 cm. Der Puffer
(0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0, enthaltend 0,02% Alkaliacid) wird von der Schlauchpumpe (8) einem 51
fassenden Vorratsbehälter (I) entnommen, welcher von Luft durchperlt wird, um den Puffer dauernd mit
Sauerstoff zu sättigen. Die gesamte Anordnung ist thermostatisiertauf3Ö°C.
Von der Förderseite der Schlauchpumpe (8) gelangt
der Puffer zürSekurtdärseite des Diatysalors. Dort wird
er auf ca. 1% der Glucosekonzcntration des heparihisierten
Blutes gebracht. Wie in Zusammenhang mit den Fig. I und 2 beschrieben, strömt der glucosehaltige
ίο Puffer abwechselnd zuerst über die Meßkammer (4) und
dann über das immobilisierte Enzym (3) (Fig. 1) und
zuerst über das immobilisierte Enzym (3) und dann über die Meßkammer (4) (F i g. 2). Sowohl im Enzymreaktor
(3) als auch im Enzymreaktor (9) befindet sich jeweils immobilisierte Glucoseoxydase (GOD).
Die in der Meßkammer (4) erzeugten Meßströme werden über einen Verstärker auf eine Anzeigevorrichtung
übertragen. Fig. 5 zeigt eine typische Aufzeichnung der erhaltenen Ergebnisse. Der untere Wende-
>o punkt der Kurve entspricht dem Basismeßsignai, der
obere Wendepunkt dem Substratmeßsignal. Mit A wird die Eichung angegeben, bei der ein Blutz-uckersiandard
von 320 mg/100 ml verwendet wurde. Bei D wurde auf die aus der Vene entnommene Probe umgeschaltet. Der
erkennbare Basislinienanstieg ist auf das Hämoglobin zurückzuführen und würde das Glucosesignal um ca.
40 mg/100 ml verfälschen, wenn er nicht durch die erfindungsgemäße Inversionsanordnung korrigiert würde.
!0 Beispiel 2
Es wurüe die in den Fig. 3 und 4 dargestellte Vorrichtung verwendet. Die beiden Enzymstrecken (3)
und (9) enthielten immobilisierte Urease. Die Meßkammer
(4) war zur Messung der Leitfähigkeit eingerichtet. Bei Überleitung einer harnstoffhaltigen Pufferlösung
wird der Harnstoff durch die Urease unter Bildung von Ammoniak und Kohlensäure gespalten. Diese Produkte
verändern die Leitfähigkeit des Puffers und können daher auf diese Weise direkt bestimmt werden. Die
Pufferlösung besteht aus 7 χ 10-1M Hepes (2-[4-(2-Hydroxyäthyl)-piperazinyl-(
1 )-]-äthansulfonsäure), mit
p g
dieses Puffers beträgt ca. 150 Mikro-Siemens. Bei der Dialyse in der Probeeinführungsvorrichtung (2) steigt
die Leitfähigkeit des Puffers durch übertretende Elektrolyten um etwa 200 Mikro-Siemens an. Je nach
Höhe des Harnstoffgehaltes liefert der Harnstoffabbau im Enzym (3) weitere 50 bis 200 Mikro-Siemens.
Die Leitfähigkeitszelle mißt von 5 bis ca. 15 000 Mikro-Siemens linear. Der Puffer kann daher so oft
wi"derverwendet werden, bis die Grundleitfähigkeit sich 15 000 Mikro-Siemens nähert und wird dann durch
frischen Puffer ersetzt.
Alternativ kann im Reaktor (9) ein lorienaüstäuscherbett
angeordnet werden, welches die gebildeten Ionen wieder entfernt. Statt dessen kann der Reaktor auch
eine Elektrodialyseeinheit, Ionenaustauschmembran oder ein anderes geeignetes Mittel zur Entfernung der
die Leitfähigkeit erhöhenden Ionen enthalten.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungea
Claims (5)
1. Verfahren zur laufenden Bestimmung der
Konzentration eines Enzymsubstrates in einer wäßrigen Flüssigkeit durch Einführung einer das zu
bestimmende Substrat enthaltenden Probe in einen Pufferlösungsstrom, Umsetzung des Substrates an
einem immobilisierten Enzym und physikalische Messung einer dadurch hervorgerufenen Änderung
in der Lösung in einer Meßkammer, dadurch
gekennzeichnet, daß der die zu bestimmende Probe enthaltende Pufferlösungsstrom abwechselnd
einmal direkt durch die Meßkammer unter Erzeugung eines Referenzsignales und einmal zuerst über
das immobilisierte Enzym und danach durch die Meßkammer unter Erzeugung eines Meßsignales
geleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die probehaltige Pufferlösung jeweils
so lange durch die Meßkammer strömen gelassen wird, bis ein 'konstantes Basissignal bzw. Meßsignal
erhalten wird ehe wieder umgeschaltet wirci.
3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend einen Puffervorratsbehälter
(1), eine Probeeinführungsvorrichtung (2), immobilisiertes Enzym (3) und eine Meßkammer (4),
die miteinander in dieser Reihenfolge durch Leitungen zu einem Kreislaufsystem verbunden sind,
gekennzeichnet durch eine Überbrückungsleitung (5) zwischen Probeeinführungsvorrichtung (2) und
Meßkammer (4) und ein Wechselventil (6), welches die Überbrückungsleitung (5) abwechselnd sperrt.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Wechselvent.. (6) drei Kanäle (61,
62, 63) aufweist, wobei in e;ner ersten Position des
Wechselventils der erste Kanal ,bl) die Überbrükkungsleitung
(5) bildet, der zweite Kanal (62) den Abstrom von der Meßkammer (4) zum immobilisierten
Enzym (3) leitet und der dritte Kanal (63) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der
zum Puffervorratsbehälter (1) führenden Leitung verbindet und in einer zweiten Position der erste
Kanal (61) die Leitung zum immobilisierten Enzym
(3) bildet, der zweite Kanal (62) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der Meßkammer (4)
und der dritte Kanal (63) den Abstrom von der Meßkammer (4) mit der zum Behälter (1) führenden
Leitung verbindet.
5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Wechselventil (6) zwei Kanäle (64,
65) aufweist, wobei der erste Kanal (64) das immobilisierte Enzym (3) enthält, und in einer ersten
Position des Ventils der erste Kanal (64) den Abstrom von der Meßkammer (4) mit der zum
Puffervorratsbehälter (1) führenden Leitung verbindet und der zweite Kanal (65) die Überbrückungsleitung
(5) bildet und in einer zweiten Position der erste Kanal (64) den Abstrom von der Probeeinführungsvorrichtung
(2) mit der Meßkammer (4) und der zweite Kanal (65) den Abstrom von der Meßkammer
(4) mit der /um Puffervorratsbehälter (1) führenden Leitung verbindet.
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