DE3851025T2

DE3851025T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von zwei verschiedenen Substanzen in einer Probe unter Verwendung von Enzymelektroden.

Info

Publication number: DE3851025T2
Application number: DE19883851025
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hashizume; Ryuzo Hayashi; Akio Kariyone
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-09-12
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2008-09-13
Also published as: EP0310824A2; EP0310824A3; DE3851025D1; EP0310824B1; JPS6469944A; JPH0555816B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Flow-injection- Verfahren und eine Flow-injection-Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung, d. h., zur Messung der Konzentration, von zwei unterschiedlichen Substanzen in einer flüssigen Probe mit Hilfe von zwei Enzymelektroden, die letztlich das gleiche Material erfassen, wobei in einer dieser Enzymelektroden eine erste, zu messende Substanz aus einer zweiten Substanz durch enzymatische Reaktion erhalten wird.
In den letzten Jahren fanden immobilisierte Enzyme breite Anwendung, z. B. auf den Gebieten der klinischen Analytik, der Enzymherstellung, der Fermentationstechnologie und der analytischen Chemie. Insbesondere Elektroden mit immobilisiertem Enzym werden wegen ihrer hohen Selektivität, des schnellen Ansprechens und der leichten Messungen in breitem Umfang eingesetzt.
In jüngster Zeit wurden Vorrichtungen zur simultanen Messung von zwei unterschiedlichen Substanzen eingeführt, die zugleich beispielsweise folgende Substanzen bestimmen:
- Glucose und Harnsäure (JP-A1-24142/1987);
- Milchsäure und Brenztraubensäure (JP-A1-5172/1987);
- Glucose und Milchsäure oder Glucose und Cholin (GB 2063479);
- Saccharose und Glucose (Analytica Chimica Acta 171 (1985) 185-194).
Nach diesem Stand der Technik katalysiert allerdings jedes auf der Elektrode immobilisierte Enzym eine unterschiedliche Reaktion.
Im Gegensatz dazu kann im Fall gleicher Reaktionen, bei denen ein an der Elektrode aktives Material entsteht oder verbraucht wird (bei denen z. B. letztlich Wasserstoffperoxid gebildet und die Menge an Wasserstoffperoxid gemessen wird), die Konzentration einer ersten Substanz (z. B. Glucose) mit einer Elektrode gemessen werden, wobei jedoch die andere Elektrode nicht nur Wasserstoffperoxid, das von der zweiten Substanz (z. B. Saccharose) herrührt, sondern auch von der ersten Substanz (Glucose) herrührendes Wasserstoffperoxid erfaßt. Auf diese Weise kann die erste Substanz (Glucose) gemessen werden, jedoch entspricht das Ergebnis der Messung der anderen Substanz der Summe der beiden Werte für die betreffenden Substanzen.
Im Fall der Messung der Saccharosekonzentration in einer Probe, die sowohl Glucose als auch Saccharose enthält, unter Verwendung einer Enzymelektrode wird beispielsweise das Ergebnis durch die Glucosekonzentration beeinträchtigt: Saccharose + H&sub2;O Invertase α-D-Glucose + Fructose α-D-Glucose Mutarotase β-D-Glucose β-D-Glucose + O&sub2; Glucoseoxidase H&sub2;O&sub2; + Gluconsäure
Generell wird zur Messung der Saccharosekonzentration Saccharose durch Invertase (Gleichung (i)) zu Fructose und α-D-Glucose hydrolysiert. Danach wird die α-D-Glucose durch Mutarotase (Gleichung (ii)) in β-D-Glucose umgewandelt; als Ergebnis der durch Glucoseoxidase katalysierten Oxidation der β-D-Glucose (Gleichung (iii)) wird Wasserstoffperoxid, d. h., das elektrodenaktive Material, gebildet. Dieses Wasserstoffperoxid wird elektrochemisch durch die Enzymelektrode erfaßt (C. Bertrand, P.R. Coulet, D.C. Gautheron, Anal. Chim. Acta 126 (1981) 23-34). Nach diesem Verfahren mißt allerdings die Enzymelektrode nicht nur die durch Umwandlung aus Saccharose nach den Gleichungen (i) und (ii) entstandene β-D-Glucose, sondern auch die ursprünglich in der Probe enthaltene β-D-Glucose, da die ursprünglich in der Probe enthaltene β-D-Glucose nach Gleichung (iii) ebenso wie die nach den Gleichungen (i) und (ii) gebildete β-D-Glucose Wasserstoffperoxid liefert.
Zur Messung der korrekten Konzentration lediglich der Saccharose ist es daher erforderlich, eine Schicht, die Glucoseoxidase und Katalase enthält, vorzusehen, in der Glucose durch die Glucoseoxidase oxidiert wird und das Wasserstoffperoxid vor der Messung der Saccharose durch die Katalase enzymatisch entfernt wird (F. Scheller, R. Renneberg, Anal. Chim. Acta 152 (1983), 265-269), oder eine enzymatische Reaktion und eine elektrochemische Technik anzuwenden, um den Einfluß der ursprünglich in der Probe enthaltenen Glucose zu verhindern (JP-A1-216947/1983).
Die Vorrichtung, bei der das oben beschriebene Verfahren angewandt wird, hat jedoch einige Nachteile, da es extrem schwierig ist, bei der Herstellung der Enzymelektroden die Enzyme an den Membranen zu immobilisieren, und die Elektroden selbst sehr kompliziert aufgebaut sind. Darüber hinaus muß zur Messung von zwei unterschiedlichen Substanzen, d. h. z. B. Glucose und Saccharose, eine weitere Elektrode zur Messung der Glucosekonzentration durch diese Elektrode vorgesehen werden.
In jüngster Zeit wurde eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp angegeben, die einen Säulenreaktor aufweist, in dem eine Probenlösung zirkulieren gelassen wird (M. Massoom, A. Townshend, Anal. Chim. Acta 171 (1985) 185-194). Diese Vorrichtung ist allerdings kompliziert aufgebaut; ferner ist im Vergleich mit der Vorrichtung mit Enzymelektroden eine erheblich höhere Menge an Enzym erforderlich. Darüber hinaus liegt der weitere Nachteil vor, daß die Vorrichtung durch Verstopfen der Säule ungenaue Ergebnisse liefert.
Der Fall der Messung von Proben, die sowohl Saccharose als auch Glucose enthalten, wurde oben beschrieben; wenn allerdings durch die gleiche Enzymreaktion an den beiden Enzymelektroden bei der simultanen Messung von zwei unterschiedlichen Substanzen, beispielsweise bei der Messung von Maltose und Glucose oder der Bestimmung von verestertem Cholesterin und freiem Cholesterin, das gleiche elektrodenaktive Material gebildet wird, werden gleichartige Probleme hervorgerufen.
Es konnte daher in Betracht gezogen werden, die Konzentration von zwei unterschiedlichen Substanzen, beispielsweise von Glucose als erster zu messender Substanz und von Saccharose als zweiter zu messender Substanz, unter Verwendung von zwei Enzymelektroden mit einer Meßeinrichtung vom Strömungstyp zu messen, die eine erste Enzymelektrode mit immobilisierter Glucoseoxidase zur Messung von Glucose und eine zweite Enzymelektrode mit immobilisierter Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase zur Messung der Saccharose aufweist.
Die durch die erste Enzymelektrode erfaßte Glucosekonzentration wird berechnet, und die korrekte Konzentration lediglich der Saccharose wird durch Subtraktion des Berechnungsergebnisses vom Ausgangsstromwert der zweiten Enzymelektrode erhalten.
Nach diesem Verfahren wird allerdings, wenn die Glucosekonzentration der Probe vergleichsweise hoch ist, wegen der Umwandlung der Saccharose in Glucose an der zweiten Enzymelektrode eine große Menge anelektrodenaktivem Material gebildet. Daher überschreitet die Menge den Bereich, innerhalb dessen der Ausgangsstrom der Menge des elektrodenaktiven Materials proportional ist. Auf diese Weise können somit keine genauen Werte der Saccharosekonzentration erhalten werden.
In diesem Fall können Proben mit hohen Substanzkonzentrationen analysiert werden, indem eine zweite Enzymelektrode mit einer verringerten Menge an immobilisierten Enzymen und geringerer Empfindlichkeit verwendet wird. Bei diesem Verfahren müssen andererseits entsprechend den Konzentrationen der Substanzen in der Probenlösung Elektroden mit unterschiedlicher Empfindlichkeit hergestellt werden, daher ist eine Vorrichtung, bei der dieses Verfahren angewandt wird, für die Praxis überhaupt nicht geeignet.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung, d. h., zur quantitativen Bestimmung der Konzentration, mehrerer Substanzen in einer flüssigen Probe mit Hilfe von Enzymelektroden anzugeben, die in kurzen Zeiten genaue Konzentrationswerte liefern.
Die obige Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen 1 und 5 gelöst. Die abhängigen Ansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen.
Das erfindungsgemäße Flow-injection-Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer in einer flüssigen Probe enthaltenen Substanz (zweite Substanz), die enzymatisch in eine andere Substanz (erste Substanz) umgewandelt werden kann, mit Hilfe von zwei Enzymelektroden, welche die erste Substanz erfassen, wobei die zweite Enzymelektrode die Umwandlung der zweiten Substanz in die erste Substanz vor ihrer Erfassung katalysiert, umfaßt folgende Schritte:
(I) Bestimmung des Ansprechverhältnisses k der beiden Enzymelektroden bezüglich der ersten Substanz
durch
(A) vorsehen eines konstanten Stroms einer Pufferlösung
(B) Einspritzen der ersten Substanz in den Strom der Pufferlösung,
(C) Hindurchleiten der in Schritt (B) erhaltenen Lösung durch eine erste Meßzelle, welche die erste Enzymelektrode (2) enthält, zur Erfassung der ersten Substanz und Messung des Ausgangsstroms (Ia),
(D) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (C) durch eine Verdünnungspipeline, und
(E) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (D) durch eine zweite Meßzelle, welche die zweite Enzymelektrode enthält, zur Erfassung der ersten Substanz und Messung des Ausgangsstroms (Ib),
(II) Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach der Gleichung α,
k = Ib/Ia (α),
(III) Wahl einer geeigneten Länge der Verdünnungspipeline in Abhängigkeit vom Konzentrationsverhältnis der ersten und der zweiten Substanz,
(IV) Bestimmung der zweiten Substanz
durch
(F) Einspritzen der zu analysierenden Probe, welche die erste und die zweite Substanz enthält, in den Strom der Pufferlösung,
(G) Hindurchleiten der in Schritt (F) erhaltenen Lösung durch die erste Meßzelle, welche die erste Enzymelektrode enthält, und Messung des Ausgangsstroms (I&sub1;),
(H) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (G) durch die Verdünnungspipeline und
(J) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (H) durch die zweite Meßzelle, welche die zweite Enzymelektrode enthält, welche die zweite, zu bestimmende Substanz in die erste Substanz umzuwandeln vermag, und Messung des Ausgangsstroms (I&sub2;), sowie
(V) Berechnung des der Menge der zweiten, zu bestimmenden Substanz entsprechenden Wertes des Stroms I&sub3; nach der Gleichung (β),
I&sub3; = I&sub2; - k·I&sub1; (β),
worin k das in Schritt (II) bestimmte Ansprechverhältnis bedeutet.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird auch die erste Substanz aus dem Ausgangsstrom (I&sub1;) der ersten Meßzelle quantitativ bestimmt, der in Schritt (G) gemessen wurde und der Menge der ersten Substanz entspricht.
Die Schritte (I) (B) bis (V) werden vorzugsweise intermittierend durchgeführt.
Die erfindungsgemäße Flow-injection-Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung einer in einer flüssigen Probe enthaltenen Substanz (zweite Substanz), die enzymatisch in eine andere Substanz (erste Substanz) umgewandelt werden kann, mit Hilfe von zwei Enzymelektroden, die sich besonders zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet, umfaßt:
- eine Fördereinrichtung zur kontinuierlichen Förderung einer Pufferlösung mit vorgegebenem Durchsatz,
- eine Einspritzeinrichtung zum Einspritzen der zu messenden Proben in den Strom der Pufferlösung,
- eine erste Meßzelle, die eine erste Enzymelektrode zur Erfassung der ersten Substanz aufweist und stromab von der Einspritzeinrichtung vorgesehen ist,
- eine Verdünnungspipeline, die stromab von der ersten Meßzelle vorgesehen ist und zur Verdünnung der Probe längs ihrer Strömungsrichtung dient,
- eine zweite Meßzelle, die am stromab liegendenden Ende der Verdünnungspipeline vorgesehen ist und eine zweite Enzymelektrode aufweist, die ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist, das die Umwandlung der zweiten Substanz in die erste Substanz katalysiert und zur Erfassung (a) der ursprünglich in der Probe enthaltenen ersten Substanz und (b) der aus der Umwandlung der zweiten Substanz resultierenden ersten Substanz dient,
- eine Einrichtung zur Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach der Gleichung α,
k = Ib/Ia (α);
worin
Ia den gemessenen Wert des Ausgangsstroms der ersten Meßzelle,
und
Ib den gemessenen Wert des Ausgangsstroms der zweiten Meßzelle (II) bedeuten,
und zur Berechnung des der Konzentration der zweiten, zu bestimmenden Substanz entsprechenden Wertes des Stroms I&sub3; nach der Gleichung β,
I&sub3; = I&sub2; - k·I&sub1; (β),
worin
I&sub1; den Ausgangsstrom der ersten Meßzelle und
I&sub2; den Ausgangsstrom der zweiten Meßzelle bedeuten, und
- eine Einrichtung zur Wahl einer geeigneten Länge der Verdünnungspipeline in Abhängigkeit vom Konzentrationsverhältnis der ersten und der zweiten Substanz,
wobei die Vorrichtung so ausgebildet ist, daß sie die oben definierten Verfahrensschritte (I) bis (V) durchführen kann.
Nach bevorzugten Ausführungsformen ist die erfindungsgemäße Vorrichtung durch ein oder mehrere der folgenden Merkmale gekennzeichnet:
- Die Einspritzeinrichtung ist eine HPLC-Einspritzeinrichtung;
- die Verdünnungspipeline weist einen Strömungskanal mit einem Innendurchmesser von 0,1 bis 2,0 mm und einer axialen Länge von 0,2 bis 100 m auf;
- die Verdünnungspipeline besteht aus einem Kunstharz;
- die Verdünnungspipeline besteht aus rostfreiem Stahl;
- die Verdünnungspipeline liegt in einer gewickelten Form vor;
- es sind mehrere Verdünnungspipelines, die jeweils unterschiedliche Innendurchmesser und/oder unterschiedliche axiale Länge aufweisen, sowie Schaltventile vorgesehen, mit denen eine der Verdünnungspipelines zwischen die erste Meßzelle und die zweite Meßzelle eingeschaltet werden kann.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Einrichtung zur Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach Gleichung (a) und des Stromwertes I&sub3; nach Gleichung (β) so ausgebildet, daß sie auch die Bestimmung der Menge der ersten Substanz aus dem Ausgangsstrom (I&sub1;) der ersten Meßzelle erlaubt, der in Schritt (G) gemessen wurde. Darüber hinaus ist diese Einrichtung vorzugsweise so ausgebildet, daß sie die Einspritzeinrichtung zur intermittierenden, aufeinanderfolgenden oder unabhängigen Durchführung der oben beschriebenen Schritte (I) (B) bis (V) steuern kann.
Die nachstehenden Kombinationen entsprechen bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung:
- Verwendung einer ersten Enzymelektroden die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase aufweist,
wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Saccharose sind,
- Verwendung einer ersten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und α-Glucosidase aufweist,
wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Maltose sind,
- Verwendung einer ersten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und β-Glucosidase aufweist,
wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz ein β-Glucosid sind,
- Verwendung einer ersten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Glucoamylase aufweist,
wenn die erste Substanz Glucose und die zweiten Substanzen Oligomaltosen sind,
- Verwendung einer ersten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist und einer zweiten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Lactase aufweist,
wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Lactose sind, und
- Verwendung einer ersten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode, die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase aufweist,
wenn die erste Substanz freies Cholesterin und die zweite Substanz ein Cholesterinester sind.
Nach dem Konzept der vorliegenden Erfindung wird die Probe in der Vorrichtung vom Strömungstyp in einen konstanten Strom einer Pufferlösung eingespritzt, wobei die Enzymelektroden der beiden Meßzellen mit dem Flüssigkeitsstrom in Kontakt stehen, der durch die Verdünnungspipeline fließt, die sich stromabwärts von der ersten Enzymelektrode befindet; die zweite Enzymelektrode befindet sich stromabwärts von der Verdünnungspipeline; mit dieser Einrichtung können beispielsweise Saccharose als zweite Substanz sowie Glucose erfaßt werden. Dementsprechend wird die Probe durch die Verdünnungspipeline automatisch verdünnt, und die zweite Enzymelektrode kann auf höhere Konzentrationen der Substanzen innerhalb ihres Proportionalbereichs ansprechen. Auf diese Weise können die Konzentrationen mehrerer Arten von Substanzen genau gemessen werden.
Demgemäß erlaubt das Konzept der Erfindung schnelle, leichte und genaue Messungen-mehrerer Arten von Substanzen.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1: Ein System einer Meßvorrichtung, die einer Ausführungsform der Erfindung entspricht;
Fig. 2: ein Diagramm, das die Ansprechkurve der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 3: ein Diagramm, das die Ansprechkurve der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose ohne Verwendung der Verdünnungspipeline zeigt;
Fig. 4: eine Systemdarstellung, die eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt;
Fig. 5: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose und Saccharose gemäß Beispiel 1 zeigt;
Fig. 6: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf eine Probe von 300 mM Glucose in Abhängigkeit von der Saccharosekonzentration zeigt;
Fig. 7: ein Diagramm, das eine Eichkurve für Saccharose gemäß Beispiel 1 zeigt;
Fig. 8: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration ohne Verwendung der Verdünnungspipeline gemäß Vergleichsbeispiel 1 zeigt;
Fig. 9: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose und Maltose gemäß Beispiel 2 zeigt;
Fig. 10: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf eine Probe mit 30 mM Glucose in Abhängigkeit von der Konzentration an Maltose gemäß Beispiel 2 zeigt;
Fig. 11: ein Diagramm, das eine Eichkurve für Maltose gemäß Beispiel 2 zeigt;
Fig. 12: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten und der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose ohne Verwendung der Verdünnungspipeline gemäß Vergleichsbeispiel 2 zeigt;
Fig. 13: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der ersten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose gemäß Beispiel 3 zeigt;
Fig. 14: ein Diagrau, das die Ausgangsstromwerte der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose gemäß Beispiel 3 zeigt;
Fig. 15: ein Diagramm, das eine Eichkurve für Lactose gemäß Beispiel 3 zeigt, und
Fig. 16: ein Diagramm, das die Ausgangsstromwerte der zweiten Enzymelektrode beim Ansprechen auf Glucose ohne Verwendung der Verdünnungspipeline gemäß Vergleichsbeispiel 3 zeigt.
Im folgenden wird das allgemeine Konzept der Erfindung unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen näher beschrieben.
Fig. 1 zeigt eine Meßvorrichtung gemäß der Erfindung. Eine in einem Behälter 7 vorgelegte Pufferlösung 8 wird durch eine Pumpe 6 mit einem vorgegebenen Durchsatz gefördert. Die Pufferlösung fließt von der Pumpe 6 durch die Einspritzeinrichtung 1 in die erste Meßzelle 3. Als Einspritzeinrichtung 1 wird vorzugsweise z. B. ein Injektor verwendet, wie er allgemein bei der Hochdruckflüssigkeitschromatographie eingesetzt wird. Die durch die Einspritzeinrichtung 1 einzuführenden Proben enthalten zwei Substanzen, d. h., eine erste zu messende Substanz (beispielsweise Glucose) und eine zweite zu messende Substanz (beispielsweise Saccharose). Eine erste Enzymelektrode 2 und eine Bezugselektrode 10 sind so angeordnet, daß sie sich an dem in der ersten Meßzelle 3 vorgesehenen Strömungskanal 9 gegenüberliegen. An der stromabwärts gelegenen Seite der ersten Meßzelle 3 ist eine Verdünnungspipeline 5 angeschlossen. Die Verdünnungspipeline 5 besitzt vorzugsweise einen Strömungskanal mit einem Innendurchmesser von größenordnungsmäßig 0,1 bis 2,0 mm und einer axialen Länge von größenordnungsmäßig 0,2 bis 10 m, so daß verhindert wird, daß die erste und die zweite Substanz, die gemessen werden sollen, über einen zu weiten Bereich in der Axialrichtung der Verdünnungspipeline 5 verteilt und in der Pufferlösung verdünnt werden. Auf diese Weise ist es möglich, eine wirksame Verdünnung bei hoher Strömungsgeschwindigkeit vorzunehmen. Die axiale Länge der Verdünnungspipeline 5 wird entsprechend dem Verhältnis der Konzentrationen der ersten und der zweiten zu messenden Substanz in geeigneter Weise eingestellt. Wenn die Länge zu kurz ist, kann kein ausreichender Verdünnungseffekt erzielt werden; wenn die Länge zu groß ist, ist eine beträchtliche Zeit für die Messung erforderlich. Die axiale Länge der Verdünnungspipeline 5 sollte daher, wie oben angegeben, vorzugsweise in der Größenordnung von 0,2 bis 10 m und noch bevorzugter in der Größenordnung von 0,5 bis 3 in liegen. Die Verdünnungspipeline 5 kann aus einem Fluorharz, wie etwa Poly(tetrafluorethylen) (PTFE, Teflon®) oder anderen Kunstharzen, wie Polyvinylchlorid, bestehen oder aus einem metallischen Material, wie etwa rostfreiem Stahl, gefertigt sein. Zur Erzielung einer wirksamen Mischung der ersten und zweiten Substanz mit der Pufferlösung besitzt die Verdünnungspipeline die Form einer Spule.
Die zweite Meßzelle 11 ist am stromabwärts gelegenen Ende der Verdünnungspipeline 5 angeschlossen. In der zweiten Meßzelle 11 sind eine zweite Enzymelektrode 4 und eine Bezugselektrode 12 so angeordnet, daß sie sich am Strömungskanal 13 gegenüberliegen. Zur Verhinderung einer breiten Verschiebung der gemessenen Peakwerte an den Enzymelektroden 2, 4 beträgt die Kapazität der Strömungskanäle 9, 13 der Meßzellen 3, 11 vorzugsweise größenordnungsmäßig 5 bis 100 [ul].
Die erste Enzymelektrode 2 erfaßt die erste Substanz.
An der zweiten Enzymelektrode 4 finden Enzymreaktionen statt, bei denen die erste Substanz aus der zweiten Substanz erzeugt wird, wobei ebenfalls die erste Substanz erfaßt wird.
Wenn die erste Substanz Glucose ist und die zweite Substanz Saccharose darstellt, ist die erste Enzymelektrode 2 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase ist.
Wenn die erste Substanz Glucose ist und die zweite Substanz Maltose darstellt, ist die erste Enzymelektrode 2 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, Mutarotase und α- Glucosidase ist.
Wenn die erste Substanz Glucose ist und die zweite Substanz ein β-Glucosid darstellt, ist die erste Enzymelektrode eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und β-Glucosidase ist.
Wenn die erste Substanz Glucose ist und die zweiten Substanzen Oligomaltosen sind, ist die erste Enzymelektrode 2 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und Glucoamylase ist.
Wenn die erste Substanz Glucose ist und die zweite Substanz Lactose darstellt, ist die erste Enzymelektrode 2 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und Lactase ist.
Zur Erfassung von freiem Cholesterin und verestertem Cholesterin ist die erste Enzymelektrode 2 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Cholesterinoxidase, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Elektrode mit darauf immobilisierter Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase ist.
Ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß nach der Messung der ersten Substanz durch die erste Enzymelektrode die Probe, welche die erste Meßzelle 3 verläßt, d. h., eine Lösung der ersten und/oder der zweiten Substanz in der Pufferlösung, in die Verdünnungspipeline 5 geführt wird, so daß die erste und die zweite Substanz innerhalb der Verdünnungspipeline 5 verteilt und verdünnt werden. Wenn beispielsweise Glucose als erste zu messende Substanz durch die Einspritzeinrichtung 1 eingespritzt und von der zweiten Enzymelektrode erfaßt wird, kann eine Ansprechkurve wie in Fig. 2 gezeigt erhalten werden, bei welcher der maximale Ausgangsstromwert der zweiten Enzymelektrode 4 vergleichsweise klein ist, so daß die erste und die zweite Substanz bei hoher Konzentration in wirksamer Weise gemessen werden können. Wenn im Gegensatz dazu eine Pufferlösung, welche die zu messende erste und/oder zweite Substanz enthält, direkt in die zweite Meßzelle 11 geleitet wird, ohne daß eine Verdünnungspipeline 5 verwendet wird, ist der maximale Ausgangsstromwert von der zweiten Enzymelektrode 4 von beträchtlicher Höhe, wie aus Fig. 3 hervorgeht. Als Konsequenz liegt die Konzentration der von der zweiten Enzymelektrode 4 erfaßten ersten Substanz außerhalb der Obergrenze ihres Proportionalbereichs, weshalb es praktisch unmöglich ist, eine genaue Messung der zweiten Substanz durchzuführen. Die Verdünnungspipeline 5 vermeidet dieses Problem.
Der Proportionalbereich der Konzentration einer zu messenden Substanz in Bezug auf den Wert des Ausgangsstroms einer Enzymelektrode wird allgemein durch kinetische Konstanten und den Diffusionskoeffizienten der zu messenden Substanz in der immobilisierten Enzymschicht bestimmt; wenn Sauerstoff erforderlich ist, wie dies bei immobilisierten Oxidasen der Fall ist, hängt der Proportionalbereich auch von der Menge an gelöstem Sauerstoff ab.
Dementsprechend kann, wenn die Konzentration der durch die zweite Enzymelektrode 4 gemessenen ersten Substanz zu hoch ist, eine Abweichung von dem genannten Proportionalbereich eintreten, wobei dann die Durchführung einer genauen Messung der Konzentration der ersten Substanz nicht möglich ist.
Fig. 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, die für Fälle anwendbar ist, in denen die erste und die zweite Substanz, die gemessen werden sollen, beträchtlich unterschiedliche Konzentrationen aufweisen; die Vorrichtung umfaßt mehrere Verdünnungspipelines 5, 5a (zwei Stück in Fig. 4), so daß mit Hilfe von Umschaltventilen 14, 15 eine Umschaltung von einer Verdünnungspipeline auf die andere möglich ist. Die Verdünnungspipelines 5, 5a weisen unterschiedliche Abmessungen, z. B. unterschiedlichen Innendurchmesser des Strömungskanals und unterschiedliche axiale Länge, auf. Die Verdünnungspipelines 5, 5a können anstelle der Ausrüstung mit den Umschaltventilen 14, 15 auch so ausgebildet sein, daß sie gegenseitig austauschbar über Rohrverbindungen mit den Meßzellen 3, 10 verbunden werden können.
Bei der erfindungsgemäßen Meßvorrichtung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist, wird die erste zu messende Substanz, während die Pufferlösung 8 durch die Pumpe 6 mit konstantem Durchsatz gefördert wird, durch die Einspritzeinrichtung 1 intermittierend in die Pufferlösung eingespritzt. In diesem Fall zeigt die erste Enzymelektrode 2 eine Ansprechcharakteristik, die in Fig. 5 durch die Linie 11 angegeben ist; die zweite Enzymelektrode 4 ergibt eine Ansprechcharakteristik entsprechend der Linie 12 in Fig. 5. Wenn die Konzentration bei der ersten Substanz an der ersten Enzymelektrode 2 und der zweiten Enzymelektrode 4 in Bezug auf den Ausgangsstromwert dieser Elektroden innerhalb des Proportionalbereichs liegt und die Molarität der ersten Substanz durch Ma, der Ausgangsstromwert der ersten Enzymelektrode 2 durch Ia und der Ausgangsstromwert der zweiten Enzymelektrode 4 durch Ib bezeichnet werden, berechnet sich das Ansprechverhältnis k nach der Gleichung α
k = Ib/Ia (α).
Anschließend werden Proben der ersten Substanz mit vorgegebener Konzentration im Gemisch mit der zweiten Substanz mit variierten Konzentrationen mit der Einspritzeinrichtung 1 intermittierend eingeführt. Im Ergebnis zeigt die erste Enzymelektrode 2 die in Fig. 6 durch die Linie 14 angegebene Ansprechcharakteristik, während die zweite Enzymelektrode 4 eine Ansprechcharakteristik ergibt, die in Fig. 6 durch die Linie 15 angegeben ist. In Fig. 6 ist der Ausgangsstrom I&sub1; der ersten Enzymelektrode 2 durch 14 dargestellt, den Ausgangsstrom I&sub2; der zweiten Enzymelektrode 4 veranschaulicht die Linie 15. Der Ausgangsstrom I&sub3; der zweiten Enzymelektrode 4, der durch lediglich die zweite Substanz bedingt ist, ist in Fig. 7 durch die Linie 16 dargestellt, die durch die Formel β ausgedrückt wird. Der Ausgangsstrom I&sub3; ist der Konzentration der zweiten Substanz proportional:
I&sub3; = I&sub2; · k · I&sub1; (β).
Wie oben beschrieben, erfolgt erfindungsgemäß eine automatische Verdünnung der Proben in der Verdünnungspipeline 5 zwischen den beiden Enzymelektroden 2 und 4, so daß der Proportionalbereich an der zweiten Enzymelektrode erweitert werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, Proben variabler Konzentration mit guter Genauigkeit und innerhalb kurzer Zeiten zu messen. Anders als bei Vorrichtungen auf der Basis des Flow-injection-Prinzips, bei denen Säulen verwendet werden, erfordert die erfindungsgemäße Meßvorrichtung keinerlei Veränderung des Strömungsweges, was den Vorteil mit sich bringt, daß Änderungen im individuellen Durchsatz durch Veränderungen im Gegendruck oder aufgrund von Totvolumina in Flanschbereichen nicht berücksichtigt werden müssen.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Beispiele erläutert.

Beispiel 1

In einer Vorrichtung gemäß Fig. 1 werden als erste Enzymelektrode 2 eine glucoseerfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und als zweite Enzymelektrode 4 eine Glucose und Saccharose erfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase, Invertase und Mutarotase verwendet.

Herstellung der Enzymelektroden 2, 4

Auf die Oberfläche einer gründlich gereinigten Platindrahtelektrode mit einem Durchmesser von 2 mm wurden tropfenweise 5 ul einer wäßrigen Lösung aufgebracht, die Glucoseoxidase (Typ II, Sigma) in einer Konzentration von 3 mg/ml, Rinderserumalbumin ("Fraktion V", Sigma) in einer Konzentration von 7 mg/ml und Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,5 Masse-% enthielt. Durch 30 min Behandlung bei 40ºC wurde Glucoseoxidase auf der Oberfläche immobilisiert. Diese Elektrode wurde als erste Enzymelektrode 2 verwendet.
Auf die Oberfläche einer Platinelektrode wurden tropfenweise 5 ul einer wäßrigen Lösung aufgebracht, die Glucoseoxidase in einer Konzentration von 3 mg/ml, Invertase (grade X, Candida utilis, Sigma) in einer Konzentration von 1,5 mg/ml, Mutarotase (Sigma) in einer Konzentration von 0,1 mg/ml, Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 5,4 mg/ml und Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,5 Masse-% enthielt. Durch 30 min Behandlung bei 40ºC wurden die Enzyme auf der Oberfläche immobilisiert. Diese Elektrode wurde all zweite Enzymelektrode 4 herangezogen.
Die verwendete Meßvorrichtung (Fig. 1) war so aufgebaut, daß ein Injektor, wie er allgemein für Hochdruckflüssigkeitschromatographie verwendet wird und mit dem Mikroliterproben eingespritzt werden konnten, als Einspritzeinrichtung 1 verwendet wurde. Die erste Meßzelle 3 mit der darin angeordneten ersten Enzymelektrode 2 wurde über einen PTFE- Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm und einer Länge von 1,5 m mit der Einspritzeinrichtung 1 verbunden. Die Meßzelle 3 wurde über eine aus PTFE hergestellte, spiralige Verdünnungspipeline 5 mit einem Außendurchmesser von 2,8 cm, einer Länge in gestrecktem Zustand von 2,0 in und einem Innendurchmesser von 0,5 mm mit der die zweite Enzymelektrode 4 enthaltenden Meßzelle 11 verbunden. Die Meßzellen 3, 11 besaßen jeweils ein Innenvolumen von 40 ul; in ihrem Inneren waren Ag/AgCl-Bezugselektroden 10, 12 so angeordnet, daß sie den Enzymelektroden 2 bzw. 4 gegenüberlagen. An jede der Enzymelektroden 2, 4 wurde eine Spannung von +0,45 V, bezogen auf die entsprechende Ag/AgCl-Bezugselektrode, angelegt. Zur Förderung der Pufferlösung wurde eine HPLC-Pumpe als Pumpe 6 verwendet, mit der eine Pufferlösung von 0,1 M Natriumphosphat und pH 7,0 bei einem Durchsatz von 1,0 ml/min eingespeist wurde.
In dieses System wurden zunächst eine wäßrige Lösung von lediglich Glucose (innerhalb des Konzentrationsbereichs von 5 bis 50 mM) sowie eine wäßrige Lösung von lediglich Saccharose (innerhalb des Konzentrationsbereichs von 5 bis 50 mM) in einer Menge von jeweils 5 ul eingespritzt; auf diese Weise wurden die einzelnen Eichkurven 11 bis 13 erhalten, wie oben unter Bezug auf Fig. 5 erläutert wurde. Mit der ersten Enzymelektrode 2 erstreckte sich der Linearbereich für Glucose bis zu 30 mM. Anschließend wurden Saccharoseproben mit verschiedenen Konzentrationen (innerhalb des Konzentrationsbereichs von 5 bis 50 mM) hergestellt, die jeweils 30 mM Glucose enthielten; mit diesen Lösungen wurden die Eichkurven 14, 15 erhalten, die in Fig. 6 dargestellt sind. Das Ansprechverhältnis k der ersten Enzymelektrode 2 und der zweiten Enzymelektrode 4 für Glucose wurde aus den Eichkurven 11, 12 bestimmt (in Fig. 5 beträgt das Verhältnis des Ausgangsstroms der ersten Enzymelektrode 2 zum Ausgangsstrom der zweiten Enzymelektrode 4 für Glucose 0,46), womit die Eichkurve 15 in Fig. 6 für Glucose mit Zusatz von Saccharose korrigiert wurde, wie in Fig. 7 dargestellt ist. Die Eichkurve 16 in Fig. 7 für Saccharose, die entsprechend frei von einem Einfluß von Glucose ist, wurde aus den Ausgangsströmen der ersten Enzymelektrode 2 und der zweiten Enzymelektrode 4 erhalten. Die Eichkurve 16 stimmte mit der Eichkurve 13 in Fig. 5 überein.
Während in Fig. 6 der Ausgangsstrom I&sub2; der zweiten Enzymelektrode 4, bezogen auf Glucose und Saccharose, durch 15 dargestellt ist, und der Ausgangsstrom I&sub1; der ersten Enzymelektrode 2, bezogen auf Glucose, durch 14 dargestellt ist, zeigt Fig. 7 die entsprechende Eichkurve für den auf die Saccharosekonzentration bezogenen Ausgangsstrom I&sub3;, d. h., die Werte für I&sub2; - 0,46 · I&sub1;; mit dieser Kurve kann der Wert der Saccharosekonzentration ermittelt werden. Selbst wenn die zweite Enzymelektrode mit einer 30 mM Glucoselösung in Kontakt steht, reicht ihr Linearbereich zur Erfassung von Saccharose bis zu 50 mM, woraus ersichtlich ist, daß sogar Proben hoher Konzentration gut erfaßbar sind.

Vergleichsbeispiel 1

Die Messung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch ohne Verwendung der Verdünnungspipeline 5 von Fig. 1. Die Eichkurven 17 der Elektroden 2, 4 für Glucose zeigten eine Tendenz zum Übergang in einen Sättigungswert (Abweichung von der Linearität) bei etwa 30 mM, wie aus Fig. 8 ersichtlich ist. Dies bedeutet, daß die Ausgangs ströme der zweiten Enzymelektrode bei Proben mit einem Gehalt von Glucose von 30 mM sowie von Saccharose außerhalb des Linearbereichs lagen und daher keine genaue Messung möglich war.

Beispiel 2

Als Enzymelektrode 2 in Fig. 1 wurde eine Glucose erfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase verwendet; als zweite Enzymelektrode 4 diente eine Glucose und Oligomaltosen erfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und Glucoamylase (Rhizopus, Sigma). Die erste Enzymelektrode besaß gleichen Aufbau wie die in Beispiel 1 verwendete erste Enzymelektrode. Die zweite Enzymelektrode 4 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, wobei verschiedene Arten von Enzymen verwendet wurden. Die übrige Anordnung war gleich wie in Beispiel 1.
Nach der gleichen Verfahrensweise, wie sie in Beispiel 1 angewandt worden war, wurde eine wäßrige Lösung von lediglich Glucose zunächst durch die Einspritzeinrichtung eingeführt, wobei die in Fig. 9 durch die Linie 18 dargestellte Eichkurve erhalten wurde. Die durch die Linie 19 dargestellte Eichkurve wurde von der zweiten Enzymelektrode 4 erhalten. Anschließend wurde lediglich Maltose durch die Einspritzeinrichtung 1 eingeführt, worauf die durch 110 dargestellte Eichkurve erhalten wurde.
Ferner wurden Maltoselösungen (innerhalb eines Maltose- Konzentrationsbereichs von 5 bis 100 mM) mit einem Gehalt an Glucose von 30 mM hergestellt; mit der ersten Enzymelektrode 2 wurde die in Fig. 10 durch die Linie 111 dargestellte Ansprechcharakteristik erhalten, während sich mit der zweiten Enzymelektrode 4 die durch die Linie 112 dargestellte Ansprechcharakteristik ergab. Aus diesen Kennlinien und gemäß den oben angegebenen Gleichungen α und β kann eine Eichkurve 113 erhalten werden, welche die Beziehung zwischen der Konzentration an Maltose und dem Ausgangsstromwert der zweiten Enzymelektrode 4, der lediglich durch Maltose bedingt ist, angibt, wie in Fig. 11 dargestellt ist.

Vergleichsbeispiel 2

Die Messung wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt, jedoch ohne Verwendung der Verdünnungspipeline 5. Es wurde eine Eichkurve erhalten, die durch die Linie 114 in Fig. 12 dargestellt ist. Der Ausgangsstrom der ersten Enzymelektrode 2 und der Ausgangsstrom der zweiten Enzymelektrode 4 zeigten die Tendenz zum Übergang in einen Sättigungswert bei einer Glucosekonzentration von etwa 30 mM. Daher lag der Ausgangsstrom der zweiten Enzymelektrode für Proben mit einem Glucosegehalt von 30 mM und Gehalt an Maltose außerhalb des meßbaren Proportionalbereichs, weshalb es unmöglich war, genaue Messungen der Maltosekonzentration durchzuführen.
Beispiel 1, Vergleichsbeispiel 1 und Vergleichsbeispiel 2 können wie folgt zusammengefaßt werden. In Beispiel 1 kann die Glucosekonzentration auf der Basis der Ausgangsstromwerte der ersten Enzymelektrode 2 in Fig. 1 gemessen werden. Selbst bei Proben mit einem Glucosegehalt von 30 mM ist es möglich, die Saccharosekonzentration aus den Ausgangsstromwerten der ersten Enzymelektrode 2 und der zweiten Enzymelektrode 4 zu messen, wie aus Fig. 7 hervorgeht. In Beispiel 2 kann die Glucosekonzentration aus dem Ausgangsstromwert der ersten Enzymelektrode 2 in Fig. 9 ermittelt werden, wobei es selbst dann, wenn die Proben Glucose in einer Konzentration von 30 mM enthalten, möglich ist, die Maltosekonzentration aus den Ausgangsstromwerten der ersten und der zweiten Enzymelektrode zu messen, wie Fig. 11 zeigt. Im Gegensatz dazu ist aus den Vergleichsbeispielen 1 und 2 ersichtlich, daß die Obergrenze des linearen Meßbereichs der zweiten Enzymelektrode bereits erreicht ist, wenn die Proben Glucose in einer Konzentration von 30 mM enthalten, weshalb es unmöglich ist, eine genaue Messung von Saccharose (in Vergleichsbeispiel 1) und von Maltose (in Vergleichsbeispiel 2) durchzuführen.

Beispiel 3

Als erste Enzymelektrode 2 in Fig. 1 wurde eine Glucose erfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase verwendet, während als zweite Enzymelektrode 4 in Fig. 1 eine Glucose und Lactose erfassende Elektrode mit darauf immobilisierter Glucoseoxidase und β-Galactosidase (Aspergillus oryzae, Sigma) Verwendung fand.
Der Aufbau der ersten Enzymelektrode 2 war gleich wie bei der ersten Enzymelektrode 2 von Beispiel 1, und die zweite Enzymelektrode 4 wurde in gleicher Weise wie die zweite Enzymelektrode 4 in Beispiel 1 hergestellt. Die übrige Anordnung war gleich wie in Beispiel 1.
Bei diesem System wurden zunächst 5 ul wäßriger Lösungen von lediglich Glucose (innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 5 bis 60 mM) mit dem Injektor 1 eingespritzt, wobei von der ersten Enzymelektrode 2 die durch die Linie 115 in Fig. 13 dargestellte Eichkurve erhalten wurde. Dann wurden wäßrige Lösungen von lediglich Glucose (innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 5 bis 70 mM) in einer Menge von 5 ul durch die Einspritzeinrichtung 1 eingespritzt, wobei von der zweiten Enzymelektrode 4 die durch die Linie 116 in Fig. 14 dargestellte Eichkurve erhalten wurde. Aufgrund der Funktion der Verdünnungspipeline 5 blieb der Ausgangsstrom der zweiten Enzymelektrode 4 innerhalb des linearen Bereichs.
Danach wurden wäßrige Lösungen von lediglich Lactose (innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 0 bis 70 mM) in einer Menge von 5 ul durch die Einspritzeinrichtung 1 eingespritzt, wobei die durch die Linie 117 in Fig. 15 dargestellte Eichkurve von der zweiten Enzymelektrode 4 erhalten wurde.

Vergleichsbeispiel 3

Die Messungen wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei jedoch die Verdünnungspipeline 5 in Fig. 1 nicht verwendet wurde. Es wurde bestätigt, daß, wie die Linie 118 in Fig. 16 zeigt, die Eichkurve der zweiten Enzymelektrode 4 die Tendenz zum Übergang in einen Sättigungswert von etwa 50 mM ergab. Demzufolge lag der Ausgangsstrom der zweiten Enzymelektrode 4 außerhalb des meßbaren Proportionalbereichs, wenn die Proben einen Glucosegehalt von 50 mM sowie Lactose enthielten; es zeigte sich entsprechend, daß es unmöglich war, eine genaue Messung der Lactosekonzentration durchzuführen.
Beispiel 3 und Vergleichsbeispiel 3 können wie folgt zusammengefaßt werden. In Beispiel 3 kann die Glucosekonzentration auf der Basis der Ausgangsstromwerte der ersten Enzymelektrode 2 gemessen werden, wie in Fig. 13 dargestellt ist. Aus den Fig. 14 und 15 geht ferner hervor, daß die Lactosekonzentration bei Proben, die Glucose in einer Menge von 50 mM enthalten, aus den Ausgangsstromwerten der ersten Enzymelektrode 2 und der zweiten Enzymelektrode 4 gemessen werden kann. Im Gegensatz dazu bestätigt Vergleichsbeispiel 3, daß die Obergrenze des Proportionalbereichs der Messungen bei der zweiten Enzymelektrode 4 bereits erreicht wird, wenn die Proben eine Glucosekonzentration von 50 mM aufweisen, wie aus Fig. 16 hervorgeht, weshalb es unmöglich ist, eine genaue Messung der Lactose durchzuführen.

Claims

1. Flow-injection-Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer in einer flüssigen Probe enthaltenen Substanz (zweite Substanz), die enzymatisch in eine andere Substanz (erste Substanz) umgewandelt werden kann, mit zwei Enzymelektroden (2, 4), welche die erste Substanz erfassen, wobei die zweite Enzymelektrode (4) die Umwandlung der zweiten Substanz in die erste Substanz vor ihrer Erfassung katalysiert,

das folgende Schritte umfaßt:

(I) Bestimmung des Ansprechverhältnisses (k) der beiden Enzymelektroden (2, 4) bezüglich der ersten Substanz

durch

(A) Vorsehen eines konstanten Stroms einer Pufferlösung

(B) Einspritzen der ersten Substanz in den Strom der Pufferlösung,

(C) Hindurchleiten der in Schritt (B) erhaltenen Lösung durch eine erste Meßzelle (3), welche die erste Enzymelektrode (2) enthält, zur Erfassung der ersten Substanz und Messung des Ausgangsstroms

(D) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (C) durch eine Verdünnungspipeline (5; 5a), und

(E) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (D) durch eine zweite Meßzelle (11), welche die zweite Enzymelektrode (4) enthält, zur Erfassung der ersten Substanz und Messung des Ausgangsstroms (Ib),

(II) Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach der Gleichung α,

k = Ib/Ia (α),

(III) Wahl einer geeigneten Länge der Verdünnungspipeline (5; 5a) in Abhängigkeit vom Konzentrationsverhältnis der ersten und der zweiten Substanz,

(IV) Bestimmung der zweiten Substanz

durch

(F) Einspritzen der zu analysierenden Probe, welche die erste und die zweite Substanz enthält, in den Strom der Pufferlösung,

(G) Hindurchleiten der in Schritt (F) erhaltenen Lösung durch die erste Meßzelle (3), welche die erste Enzymelektrode (2) enthält, und Messung des Ausgangsstroms (I&sub1;),

(H) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (G) durch die Verdünnungspipeline (5; 5a) und

(J) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (H) durch die zweite Meßzelle (11), welche die zweite Enzymelektrode (4) enthält, welche die zweite, zu bestimmende Substanz in die erste Substanz umzuwandeln vermag, und Messung des Ausgangsstroms (I&sub2;),

sowie

(V) Berechnung des der Menge der zweiten, zu bestimmenden Substanz entsprechenden Wertes des Stroms I&sub3; nach der Gleichung (β),

I&sub3; = I&sub2; - k·I&sub1; (β),

worin k das in Schritt (II) bestimmte Ansprechverhältnis bedeutet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase aufweist, wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Saccharose sind,

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und α-Glucosidase aufweist, wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Maltose sind,

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und β-Glucosidase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz ein β-Glucosid sind,

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Glucoamylase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweiten Substanzen Oligomaltosen sind,

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Lactase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Lactose sind, und

- Verwendung einer ersten Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase aufweist, und einer zweiten Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase aufweist,

wenn die erste Substanz freies Cholesterin und die zweite Substanz ein Cholesterinester sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auch die erste Substanz aus dem Ausgangsstrom (I&sub1;) der ersten Meßzelle quantitativ bestimmt wird, der in Schritt (G) gemessen wurde und der Menge der ersten Substanz entspricht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte (I), (B) bis (V) intermittierend durchgeführt werden.

5. Flow-injection-Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung einer in einer flüssigen Probe enthaltenen Substanz (zweite Substanz), die enzymatisch in eine andere Substanz (erste Substanz) umgewandelt werden kann, mit zwei Enzymelektroden (2, 4),

insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 4,

die aufweist:

- eine Fördereinrichtung (6) zur kontinuierlichen Förderung einer Pufferlösung (8) mit vorgegebenem Durchsatz,

- eine Einspritzeinrichtung (1) zum Einspritzen der zu messenden Proben in den Strom der Pufferlösung (8),

- eine erste Meßzelle (3), die eine erste Enzymelektrode (2) zur Erfassung der ersten Substanz aufweist und stromab von der Einspritzeinrichtung (1) vorgesehen ist,

- eine Verdünnungspipeline (5; 5a), die stromab von der ersten Meßzelle (3) vorgesehen ist und zur Verdünnung der Probe längs ihrer Strömungsrichtung dient,

- eine zweite Meßzelle (11), die am stromab liegendenden Ende der Verdünnungspipeline (5) vorgesehen ist und eine zweite Enzymelektrode (4) aufweist, die ein darauf immobilisiertes Enzym aufweist, das die Umwandlung der zweiten Substanz in die erste Substanz katalysiert und zur Erfassung (a) der ursprünglich in der Probe enthaltenen ersten Substanz und (b) der aus der Umwandlung der zweiten Substanz resultierenden ersten Substanz dient,

- eine Einrichtung (16) zur Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach der Gleichung α,

k = Ib/Ia (α);

worin

Ia den gemessenen Wert des Ausgangsstroms der ersten Meßzelle (3), und

Ib den gemessenen Wert des Ausgangsstroms der zweiten Meßzelle (11) bedeuten,

und zur Berechnung des der Konzentration der zweiten, zu bestimmenden Substanz entsprechenden Wertes des Stroms I&sub3; nach der Gleichung β,

I&sub3; = I&sub2; - k · I&sub1; (β),

worin

I&sub1; den Ausgansstrom der ersten Meßzelle (3) und

I&sub2; den Ausgangsstrom der zweiten Meßzelle (11) bedeuten, und

- eine Einrichtung (14, 15) zur Wahl einer geeigneten Länge der Verdünnungspipeline (5; 5a) in Abhängigkeit vom Konzentrationsverhältnis der ersten und der zweiten Substanz,

wobei die Vorrichtung so ausgebildet ist, daß sie folgende Schritte durchführen kann:

durch

(A) Vorsehen eines konstanten Stroms einer Pufferlösung (8),

(B) Einspritzen der ersten Substanz in den Strom der Pufferlösung,

(C) Hindurchleiten der in Schritt (B) erhaltenen Lösung durch die erste Meßzelle (3) und Messung des Ausgangsstroms (Ia),

(D) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (C) durch die Verdünnungspipeline (5; 5a), und

(E) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (D) durch die zweite Meßzelle (11), und Messung des Ausgangsstroms (Ib),

(II) Berechnung des Ansprechverhältnisses k nach der Gleichung α,

k = Ib/Ia (α),

(IV) Bestimmung der zweiten Substanz

durch

(G) Hindurchleiten der in Schritt (F) erhaltenen Lösung durch die erste Meßzelle (3) und Messung des Ausgangsstroms (I&sub1;),

(H) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (G) durch die Verdünnungspipeline (5; 5a), und

(J) Hindurchleiten der Lösung nach Schritt (H) durch die zweite Meßzelle (11), und Messung des Ausgangsstroms (I&sub2;), und

I&sub3; = I&sub2; - k · I&sub1; (β).

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch ein oder mehrere der folgenden Merkmale:

- Die Einspritzeinrichtung (1) ist eine HPLC-Einspritzeinrichtung;

- die Verdünnungspipeline (5; 5a) weist einen Strömungskanal mit einem Innendurchmesser von 0,1 bis 2,0 mm und einer axialen Länge von 0,2 bis 100 m auf;

- die Verdünnungspipeline (5; 5a) besteht aus einem Kunstharz;

- die Verdünnungspipeline (5; 5a) besteht aus rostfreiem Stahl;

- die Verdünnungspipeline (5; 5a) liegt in einer gewickelten Form vor;

- es sind mehrere Verdünnungspipelines (5; 5a), die jeweils unterschiedliche Innendurchmesser und/oder unterschiedliche axiale Länge aufweisen, sowie Schaltventile (14, 15) vorgesehen, mit denen eine der Verdünnungspipelines (5, 5a) zwischen die erste Meßzelle (3) und die zweite Meßzelle (11) eingeschaltet werden kann.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, gekennzeichnet durch

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und eine zweite Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und Invertase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz saccharose sind;

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und eine zweite Enzymelektrode (4, die darauf immobilisierte Glucoseoxidase, Mutarotase und α-Glucosidase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Maltose sind,

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und eine zweite Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und β-Glucosidase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz ein β-Glucosid sind,

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist, und eine zweite Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Glucoamylase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweiten Substanzen Oligomaltosen sind,

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase aufweist und eine zweite Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Glucoseoxidase und Lactase aufweist,

wenn die erste Substanz Glucose und die zweite Substanz Lactose sind, und

- eine erste Enzymelektrode (2), die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase aufweist, und eine zweite Enzymelektrode (4), die darauf immobilisierte Cholesterinoxidase und Cholestetinesterase aufweist,

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (16) zur Berechnung des Ansprechverhältnisses so ausgebildet ist, daß sie auch die erste Substanz aus dem Ausgangsstrom (I&sub1;) der ersten Meßzelle (2) quantitativ bestimmt, der in Schritt (G) gemessen wurde und der Menge der ersten Substanz entspricht.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur intermittierenden Durchführung der Schritte (I) (B) bis (V).