DE4310322C2

DE4310322C2 - Assayvorrichtung und Assayverfahren

Info

Publication number: DE4310322C2
Application number: DE4310322A
Authority: DE
Inventors: Ryuzo Hayashi; Yukie Inoue; Akio Kariyone
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1999-08-05
Anticipated expiration: 2013-03-31
Also published as: DE4310322A1; GB2265718B; US5306413A; GB9306629D0; GB2265718A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches aber multi funktionelles System für ein Assay, welches immobilisierte Enzyme verwendet.

Die Technologie der immobilisierten Enzyme wird auf vielen Gebieten stark verwendet, wie z. B. bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, der Herstellung von Feinchemikalien und der Lösung von Umweltproblemen durch Bioreaktoren. Eine solche Technologie wird auch auf dem Gebiet der analytischen Chemie angewendet, wo eine hohe Substratspezifität, eine hohe Reak tionsgeschwindigkeit und hohe Empfindlichkeiten der Enzyme ausgenutzt werden. Analytische Vorrichtungen, welche immobili sierte Enzyme verwenden, sind allgemein unter dem Begriff Biosensoren bekannt und werden heute eingehend untersucht.

Biosensoren können aufgrund der verwendeten Bestim mungsmethoden eingeteilt werden in Elektroden, Feldwirkung- Transistoren, Photodetektoren, thermische Detektoren und andere Arten. Von diesen sind die Biosensoren mit Elektroden einfach in der Konstruktion und sie können zusätzliche Spezifität durch Auswahl der Elektrode sowie auch der ver wendeten Enzymarten erlangen. Im Gegensatz zu Feldwirkungs- Transistoren werden sie selten vom pH-Wert beeinflußt und - im Gegensatz zu Biosensoren auf der Grundlage der Photobe stimmung - werden sie von der Farbe oder Trübung der Proben praktisch nicht beeinflußt. Dementsprechend wurden verschiede ne Apparate oder Vorrichtungen, die insbesondere auf Biosenso ren mit Elektroden basieren, entwickelt.

Biosensoren unter Verwendung von Elektroden sind weiter in zwei Hauptklassen unterteilbar, nämlich Stromstärke (Ampere) messende Sensoren, bei denen eine Sauerstoffelektrode, eine Wasserstoffperoxidelektrode oder dergleichen verwendet wird, und potentiometrische Sensoren, bei denen eine Ionen-selektive Elektrode wie eine pH-Elektrode oder eine Ammoniakelektrode verwendet wird. Stromstärke-messende Sensoren werden häufiger verwendet, da sie eine lineare Beziehung zwischen Substanzkonzentrationen und dem erhaltenen elektrischen Wert ergeben, was die Datenverarbeitung erleichtert und es er möglicht, Vorrichtungen mit hoher Genauigkeit und hoher Sensibilität mit einfacher Struktur zu bauen.

Da Messtechniken unter Verwendung von Biosensoren nicht nur den Vorteil der Genauigkeit und Sensibilität, wie oben erwähnt, bieten, sondern auch den der Bequemlichkeit und Einfachheit der Handhabung und Datenverarbeitung, weitet sich der Umfang der Anwendung dieser Methoden aus.

Die meisten der heute verfügbaren Biosensoren verwenden jedoch eine Oxidase und messen die sich verringernde Sauerstoffkon zentration oder die ansteigende Konzentration von Wasserstoff peroxid. Mit anderen Worten, mit diesen Biosensoren sind die Meßziele auf Substanzen unter Verwendung von Oxidase be grenzt. Assay-Systeme, die eine Vielzahl anderer Enzyme wie Hydrolase, Isomerase, Dehydrogenase etc. (jeweils in immobili sierter Form) zusammen mit einer immobilisierten Oxidase verwenden, sind ebenfalls in Gebrauch. Die Verwendung dieser immobilisierten Enzyme ist insofern vorteilhaft, weil z. B. der Zielbereich der Assays erweitert, die Meßempfindlichkeit verbessert und die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht werden kann.

Unter solchen Assay-Systemen gewinnen Assay-Systeme für Milchsäure und Brenztraubensäure besondere Aufmerksamkeit wegen ihrer Bedeutung unter anderem bei der Fermentations regelung und klinischen Diagnose. Ein typisches Beispiel ist die Alkoholfermentation. Bei der Alkoholfermentation ist es wichtig, sowohl die Konzentration an Milchsäure als auch an Brenztraubensäure zu wissen, und zwar zur Bestimmung, ob das metabolische System der Hefe normal arbeitet oder nicht. Dies ist besonders bei dem Verfahren zum Brauen von Reiswein wichtig.

Als bekannte Beispiele von Assay-Systemen seien die folgenden erwähnt.

1. Das Verfahren, das die Immobilisierung von L-Laktat- Oxidase auf einem Träger und Bestimmung der Milchsäure auf der Basis der Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid umfaßt.
2. Das Verfahren, das die Immobilisierung von L-Lactat- Dehydrogenase auf einem Träger, die Reduzierung von Brenz traubensäure in Anwesenheit von NADH und die Bestimmung von Brenztraubensäure auf der Basis der Abnahme des Absorptions vermögens bei 340 nm umfaßt.
3. Das Verfahren, das das Kontaktieren von Brenztraubensäure mit Pyruvat-Oxidase in Anwesenheit von FAD⁺, TPP (Thiaminpyro- phosphat) und Mg²⁺ zur Bildung von Acetylphosphat und die Bestimmung der Brenztraubensäure auf der Basis der Mengenver änderung an Wasserstoffperoxid oder Sauerstoff umfaßt.
4. Das Verfahren, das die Co-Immobilisierung von L-Lactat- Oxidase und L-Lactat-Dehydrogenase umfaßt, wobei ein Substrat simultan mit beiden immobilisierten Enzymen in Kontakt gebracht wird, um dadurch das Substrat mit der Dehydrogenase zu reduzieren, das durch Oxidase-katalysierte Reaktion oxidiert wurde, und das so reduzierte Substrat durch Oxidase-kataly sierte Reaktion erneut zu oxidieren als Wiederholung. Entweder Brenztraubensäure oder Milchsäure oder beide zusammen werden bestimmt, und zwar mit hoher Empfindlichkeit. Dieses Assayver fahren verwendet das Prinzip der Enzymrückführung, das heißt, daß eine größere Zahl an Sauerstoffmolekülen als an Sub stratmolekülen zu Wasserstoffperoxid umgesetzt wird (geprüfte JP Nr. 3-65492).

Die obigen Verfahren (1) und (2) können entweder Milchsäure oder Brenztraubensäure bestimmen. In Fällen, wo es erforder lich ist, beide zu bestimmen, müssen Brenztraubensäure und Milchsäure separat bestimmt werden. Weil in Verfahren (1) Milchsäure zu Brenztraubensäure durch die L-Lactat-Oxidase oxidiert wird, wird Wasserstoffperoxid gebildet, das mit hoher Empfindlichkeit an der Elektrode gemessen werden kann. In Verfahren (2) wird Brenztraubensäure durch die L-Lactase- Dehydrogenase reduziert und die Menge an NADH vermindert, das spektrophotometrisch gemessen wird. Wenn man versucht, beide Substanzen gleichzeitig zu bestimmen, muß man wegen der Unmöglichkeit der präzisen Bestimmung von beiden aufgrund der obigen Unterschiede bei der Bestimmungsmethode fehlgehen.

Das oben angegebene Verfahren (3) hat den Nachteil, daß zwei Co-Enzyme erforderlich sind und Pyruvatoxidase nicht beständig ist.

Ein Nachteil des oben beschriebenen Kreisprozeßsystems (4), bei dem eine Enzymkombination verwendet wird, ist, daß die oxidierte Form und die reduzierte Form des Substrats für die Dehydrogenase am Verfahren beteiligt ist, sobald die enzymati sche Reaktion begonnen hat. Wenn L-Lactat-Dehydrogenase und L-Lactat-Oxidase immobilisiert verwendet werden und der Kreisprozeß durchgeführt wird, wird Brenztraubensäure in der Probe zuerst zu L-Milchsäure umgewandelt und zur selben Zeit wird L-Milchsäure zu Brenztraubensäure durch die durch Oxidase katalysierte Reaktion umgewandelt, falls gleichzeitig NADH (die reduzierte Form von Nikotinamid-adenin-dinukleotid) im System anwesend ist. Sofern NADH in ausreichender Menge anwesend ist und auch die Menge an gelöstem Sauerstoff ausreicht, wird der Kreisprozeß wiederholt, so daß sich das Wasserstoffperoxid, das bei der Oxidation von Milchsäure gebildet wird, akkumu liert. Wenn die Verringerung der Konzentration von Sauerstoff oder die Erhöhung der Konzentration von Wasserstoffperoxid elektrochemisch bestimmt werden, kann eine verbesserte Empfindlichkeit im Vergleich zu Verfahren ohne Rückführung erhalten werden. Sofern jedoch die Probe L-Milchsäure von Anfang an enthält, kann keine Unterscheidung gegenüber derjenigen aus Brenztraubensäure erfolgen. Mit anderen Worten: die Menge an Brenztraubensäure kann nicht genau bestimmt werden.

Somit weisen die bekannten Assayverfahren, die immobilisierte Enzyme verwenden, die oben genannten Probleme auf. Für Reaktionssysteme, bei denen Dehydrogenase verwendet wird, sind bisher keine leistungsfähigen Vorrichtungen beschrieben worden. Das hat insbesondere den Grund, weil die durch Dehydrogenase katalysierte Oxidation von Substraten in Gegenwart von NAD⁺ schwer durchgeführt werden kann. Daher ist es allgemeine Praxis, eine Oxidase zu verwenden. Ein weiterer Grund ist, daß die durch Dehydrogenase katalysierte Oxidation von Substraten NADH bildet, welches für Sensoren mit hoher Empfindlichkeit nicht geeignet ist.

Weiterhin beschreibt die DE-OS-35 26 334 einen enzyma tischen Assay für 3β-Hydroxysteroid oder 3-Ketosteroid in einer zu analysierenden Probe, der ebenfalls mit einem Kreisprozeßsystem arbeitet.

Auch die DE-OS-39 40 072 offenbart ein Rezyklisierungs system, wobei eine enzymatische Indikatorreaktion unter Verwendung immobilisierter Oxidase und immobilisierter Dehydrogenase (in Gegenwart eines Cofaktors bzw. Coenzyms) unter Rückführung des Reaktionsprodukts in das Ausgangspro dukt (Enzymsubstrat) beschrieben wird, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß immobilisiertes NAD/NADH als Cofak tor und eine weitere immobilisierte Dehydrogenase, mit deren Hilfe der Cofaktor regeneriert wird, verwendet wer den.

Schließlich ist aus der EP-A-0 310 824 eine Vorrichtung für die Bestimmung von zwei verschiedenen Substanzen (z. B. Glucose und Sucrose) in einer Probe unter der Verwendung von zwei hintereinander angeordneten Enzymelektroden bekannt. Dabei weist die erste Enzymelektrode die erste Substanz nach, und die zweite Enzymelektrode, welche ein Enzym umfaßt, das die Umwandlung der zweiten Substanz zu der ersten Substanz katalysiert, weist anschießend die erste Substanz, die ursprünglich in der Probe vorhanden war, sowie die erste Substanz, die durch die Umwandlung an der zweiten Enzymelektrode entstanden ist nach. Die Konzen tration der zweiten Substanz kann dann aus diesen Werten berechnet werden. Die Bestimmung (i) eines Substrates Box in oxidierter Form und eines Substrates Bred in reduzierter Form oder (ii) eines Coenzyms Ared in reduzierter Form und eines Substrates Bred in reduzierter Form wird dagegen nicht beschrieben.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Assay-Vor richtung und ein Assay-Verfahren, wobei eine Dehydrogenase in immobilisierter Form und eine Oxidase in immobilisierter Form verwendet werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer multifunktionellen Assay-Vorrichtung und eines Assay-Verfahrens, bei denen zwei Komponenten, nämlich ein Substrat in oxidierter Form (oder ein Co-Enzym in reduzierter Form) und ein Substrat in reduzierter Form von einer Dehydro genase gleichzeitig bestimmt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels der erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung, welche für die gleichzei tige Bestimmung von L-Milchsäure und Brenztraubensäure unter Verwendung geeigneter immobilisierter Enzyme verwendet wird.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Bildung einer Kurve für L- Milchsäure (erhaltene Werte von einem ersten Meßteil; Linie 1), L-Milchsäure (erhaltene Werte von einem zweiten Meßteil, Linie 2) und Brenztraubensäure (Linie 3) bei einem pH-Wert von 7,0.

Fig. 3 zeigt die relativen Werte von Milchsäure (1) und Brenztraubensäure (2) bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 4 zeigt die relativen Werte von Milchsäure (1) und Brenztraubensäure (2) bei verschiedenen Temperaturwerten.

Fig. 5 zeigt Tagesabweichungen von Meßwerten für L-Milchsäure (1) und Brenztraubensäure (2).

Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Bildung einer Kurve für NADH.

Fig. 7 ist eine schematische Darstellung, die Oxidase - und Dehydrogenase - katalysierte Reaktionen zeigt.

Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung mit paralleler Anordnung eines ersten Meßteils und eines zweiten Meßteils.

Fig. 9 zeigt eine erfindungsgemäße Fließvorrichtung.

Die Erfindung schafft eine Assayvorrichtung für die Bestimmung eines Substrats Box in oxidierter Form (oder eines Co-Enzyms Ared in reduzierter Form) und eines Substrats Bred in reduzierter Form durch:
eine Dehydrogenase, die die Reaktion zwischen dem Co- Enzym Ared in reduzierter Form und dem Substrat Box in oxidierter Form unter Bildung des entsprechenden Co-Enzyms Aox in oxidierter Form und des Substrats Bred in reduzierter Form katalysiert; und
eine Oxidase, die die Oxidation des Substrats Bred in reduzierter Form katalysiert,
wobei die Vorrichtung umfaßt:

1. einen ersten Meßteil einschließlich der Oxidase in immobilisierter Form und einer ersten Elektrode zur Bestimmung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz, d. h. einer elektroden aktiven Substanz als Ergebnis der durch Oxidase katalysierten Reaktion und
2. einen zweiten Meßteil einschließlich der Dehydrogenase in immobilisierter Form und der Oxidase in immobilisierter Form und einer zweiten Elektrode zur Bestimmung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz, d. h. einer elektroden aktiven Substanz, als Ergebnis der durch die Oxidase katalysierten Reaktion.

Die Erfindung beschreibt ferner ein bevorzugtes Beispiel der oben beschriebenen Assay-Vorrichtung, wobei der erste Meßteil mit dem zweiten Meßteil in Serie verbunden ist und der zweite Meßteil stromabwärts von dem ersten Meßteil angeordnet ist, und sich im zweiten Meßteil immobilisierte Dehydrogenase und immobilisierte Oxidase getrennt immobilisiert in den entsprechenden Reaktoren befinden. Die serienförmige Anordnung des ersten und zweiten Meßteils wird bevorzugt, da Änderungen der Meßbedingungen, wie pH-Wert, Temperatur und Fließgeschwindigkeit der Pufferlösung unter Verursachung von Meßfehlern nicht auftreten. Der Grund dafür liegt darin, daß zwei zu untersuchende Substanzen in einem gleichzeitigen Arbeitsgang gemessen werden.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Beispiel einer Apparatur beschrieben, bei der L-Laktat-Dehydrogenase und L-Laktat- Oxidase als Dehydrogenase bzw. Oxidase als bevorzugte Enzymkombination verwendet werden.

Ferner schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren der Bestimmung eines Substrats Box in oxidierter Form (oder eines Coenzyms Ared in reduzierter Form) und eines Substrats Bred in reduzierter Form, wobei angewendet wird:
Eine durch Dehydrogenase katalysierte Reaktion zwischen dem Coenzym Ared in reduzierter Form und dem Substrat Box in oxidierter Form unter Bildung des entsprechenden Coenzyms Aox in oxidierter Form und des Substrats Bred in reduzierter Form; und
eine durch Oxidase katalysierte Oxidation des Substrats Bred in reduzierter Form,
wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

1. Kontaktieren einer Probe zusammen mit einer Pufferlösung mit der immobilisierten Oxidase, um dadurch die Umwandlung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe in das Substrat Box in oxidierter Form zu bewirken, und Bestimmung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe durch Ermittlung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch- aktiven Substanz als Ergebnis dieser Umsetzung,
2. Kontaktieren der Probe zusammen mit einer Pufferlösung die das Co-Enzym Ared in reduzierter Form (oder das Substrat Box in oxidierter. Form) enthält mit der immobilisierten Dehydrogenase, um dadurch das Substrat Box in oxidierter Form zu reduzieren (oder das Co-Enzym Ared in reduzierter Form zu oxidieren) um das Substrat Bred in reduzierter Form herzustellen, wonach die Probe mit einer immobilisierten Oxidase in Kontakt gebracht wird, um das so hergestellte Substrat Bred in reduzierter Form und auch das bereits von Anfang an in der Probe enthaltene Substrat Bred in reduzierter Form zu dem Substrat Box in oxidierter Form zu oxidieren, und die elektrochemisch aktiven Substanz, deren Konzentration sich bei der durch Oxidase katalysierten Reaktion ändert, ermittelt wird, um die Gesamtkonzentration an Substrat Bred in reduzierter Form zu bestimmen und
3. die Bestimmung der Konzentration des Substrats Box in oxidierter Form (oder des Co-Enzyms Ared in reduzierter Form) durch Änderung des in Stufe (ii) erhaltenen Wertes unter Berücksichtigung des ursprünglich vorhandenen Substrats Bred in reduzierter Form entsprechend Stufe (i).

Wenn das Coenzym Ared in reduzierter Form zu der Pufferlösung zugegeben wird, kann das Assayverfahren das Substrat Box in oxidierter Form und Substrat Bred in reduzierter Form bestimmen. In gleicher Weise gilt, daß das Coenzym Ared in reduzierter Form und das Substrat Bred in reduzierter Form bestimmt werden können, wenn die Pufferlösung das Substrat Box in oxidierter Form enthält. Die Pufferlösung besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 6 bis 9. Als Beispiele für die Pufferlösung können genannt werden Phosphatpuffer, Tris chlorwasserstoffpuffer und dergleichen.

Zu elektrochemisch aktiven Substanzen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, zählen Wasserstoffperoxid, Sauerstoff, oder Mediatoren wie p-Benzochinon, Ferricyanide, Tetrathiofulvalen, Ferrocen und dergleichen. Das Coenzym Ared in reduzierter Form ist z. B. NADH, NADPH, FADH₂, FMNH₂ und dergleichen. Das Substrat Bred in reduzierter Form ist z. B. Ethanol, eine natürliche L-Aminosäure wie L-Glutaminsäure, Glukose, L-Milchsäure oder Galaktose. Zu den Dehydrogenasen zählen u. a. Alkohol-Dehydrogenase, L-Aminosäure-Dehydrogenase, L-Glutamat-Dehydrogenase, Glukose-Dehydrogenase, L-Laktat- Dehydrogenase und Galaktose-Dehydrogenase.

Als Co-Enzym Aox in oxidierter Form, Substrat Box in oxidierter Form und Oxidase können jene Verbindungen genannt werden, die dem Co-Enzym Ared in reduzierter Form, dem Substrat Bred in reduzierter Form und der Dehydrogenase, die oben beispielhaft genannt wurden, entsprechen.

Die erfindungsgemäße Meßvorrichtung und das Meßverfahren können z. B. bei den folgenden Systemen angewendet werden:

1. Das System, in dem Alkohol-Dehydrogenase und Alkohol- Oxidase verwendet werden und bei dem Acetaldehyd und Ethanol oder Ethanol und NADH oder NADPH bestimmt werden (pH-Wert des Puffers = etwa 7 bis etwa 9);
2. das System, in dem eine L-Aminosäure-Dehydrogenase und eine L-Aminosäure-Oxidase verwendet werden, und bei dem die L-Aminosäure und die entsprechende 2-Ketosäure oder die L- Aminosäure und NADH bestimmt werden. (pH-Wert des Puffers = etwa 7 bis etwa 8);
3. das System, bei dem L-Glutamat-Dehydrogenase und L- Glutamat-Oxidase verwendet werden und wo 2-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure oder L-Glutaminsäure und NADH oder NaDPH (die reduzierte Form von Nikotinamidadenin dinucleotidphosphat) bestimmt werden (pH-Wert des Puffers = etwa 6 bis etwa 9);
4. das System, in dem Glukose-Dehydrogenase und Glukose- Oxidase verwendet werden und wo Glukose und Glukono-δ-lakton oder Glukose und NADPH bestimmt werden (pH-Wert des Puffers etwa 7 bis etwa 9);
5. das System, in dem L-Laktat-Dehydrogenase und L-Laktat- Oxidase verwendet werden und wo L-Milchsäure und Brenztraubensäure oder L-Milchsäure und NADH bestimmt werden (pH-Wert des Puffers etwa 7 bis etwa 8); und
6. das System, in dem Galaktose-Dehydrogenase und Galaktose- Oxidase verwendet werden und wo Galaktose und Galaktono-δ- lakton oder Galaktose und NADPH bestimmt werden (pH-Wert des Puffers = etwa 8 bis etwa 10).

Obwohl gewöhnliche Reaktionen in Lösung ohne Immobilisierung der Enzyme durchgeführt werden können, ist die Reaktionszeit schwer zu regeln und die teuren Dehydrogenasen können nur einmal in dem Lösungssystem verwendet werden. Daher sind diese Lösungssysteme für die Analyse einer großen Zahl von Proben nicht geeignet. Bei Assayvorrichtungen, in denen kolonnenartige Reaktoren in einem kontinuierlichen Fluß angeordnet sind, hängt die Reaktionszeit nur von der Geschwindigkeit des Flusses der Pufferlösung oder - in anderen Worten - der Kontaktzeit zwischen den Proben und jedem immobilisierten Enzym ab. Daher ist eine solche Vorrichtung vorteilhaft, weil die Reaktionszeit durch genaue Regelung der Fließgeschwindigkeit leicht geregelt werden kann.

Im folgenden wird nun das erfindungsgemäß angewendete Meßprinzip näher erläutert, das eine gleichzeitige Bestimmung eines Substrats Box in oxidierter Form und eines Substrats Bred in reduzierter Form oder eine gleichzeitige Bestimmung eines Substrats Bred in reduzierter Form und eines Co-Enzyms Ared in reduzierter Form ermöglicht.

Wie in Fig. 7 zu sehen ist, verlaufen die Reaktionen, bei denen eine Dehydrogenase und eine Oxidase beteiligt sind, wie folgt:

Dehydrogenase: Ared + Box = Aox + Bred
Oxidase: Bred + O₂ = Box + H₂O₂
L-Laktat-Dehydrogenase: NADH + H⁺ + Brenztraubensäure = NAD⁺ + L-Milchsäure
L-Laktat-Oxidase: L-Milchsäure + O₂ = Brenztraubensäure + H₂O₂

Bei der Bestimmung der Konzentration eines Substrats Box in oxidierter Form (oder Co-Enzyms Ared in reduzierter Form) durch eine Dehydrogenase katalysierte Reaktion wird eine ausreichende Menge des Co-Enzyms Ared in reduzierter Form (oder Substrat Box in oxidierter Form) zu einem die Probe enthaltenden Puffer zugegeben, um die Bildung von dem Substrat Bred in reduzierter Form zu bewirken. Das Substrat Bred in reduzierter Form wird dann mit der immobilisierten Oxidase in Kontakt gebracht, und man erhält das Substrat Box in oxidierter Form und eine elektrochemisch-aktive Substanz (z. B. Wasserstoffperoxid). Die elektrochemisch-aktive Substanz (z. B. gebildetes H₂O₂ oder abnehmendes O₂), deren Konzentration bei der durch Oxidase katalysierte Reaktion variiert, wird dann ermittelt (quantitativ), wodurch das Substrat Box in oxidierter Form (oder das Co-Enzym Ared in reduzierter Form) bestimmt werden kann. Diese Methode ist jedoch nur anwendbar, wenn die Probe kein Substrat Bred in reduzierter Form enthält.

Sofern die Probe das Substrat Bred in reduzierter Form von Anfang an enthält, geht dessen Konzentration in das Versuchsergebnis ein, d. h. daß die Summe des am Anfang vorliegenden Substrats Bred in reduzierter Form und die Konzentration an Bred als Ergebnis der durch Dehydrogenase katalysierten Reaktion des Substrats Box in oxidierter Form (oder des Co-Enzyms Ared in reduzierter Form) nach der obigen Reaktionsgleichung gemessen wird. Es ist daher unmöglich, die Konzentration des Substrats Box in oxidierter Form (oder des Coenzyms Ared in reduzierter Form) allein zu bestimmen.

Erfindungsgemäß wird daher das Substrat Bred in reduzierter Form in einer Probe unabhängig durch die immobilisierte Oxidase bestimmt und danach die Gesamtmenge des Substrats Box in oxidierter Form (oder des Co-Enzyms Ared in reduzierter Form) und des Substrats Bred in reduzierter Form nach dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt. Der Anteil des Substrats Bred in reduzierter Form, der in der Probe von Anfang an vorhanden war, wird dann bei dem erhaltenen Wert berücksichtigt, wodurch das Substrat Box in oxidierter Form (oder das Co-Enzym Ared in reduzierter Form) richtig bestimmt werden kann. Auf diese Weise wird die Bestimmung der beiden genannten Komponenten möglich.

Die Methode des gleichzeitigen Assays macht es möglich, zwei Komponenten mit sehr hoher Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu bestimmen.

Das Verhältnis zwischen den erhaltenen Werten des Substrats Bred in reduzierter Form und Box in oxidierter Form im ersten Meßteil und im zweiten Meßteil wird unter Verwendung von Arbeitskurven bestimmt, die durch Einführung von Standardlösungen einer vorbestimmten Konzentration des Substrats Bred in reduzierter Form und des Substrats Box in oxidierter Form erhalten wurden. Bezüglich der Arbeitskurve des Substrats Bred in reduzierter Form sei festgestellt, daß zwei Reihen von Werten von den Standardlösungen des Substrats Bred in reduzierter Form erhalten werden und zwar von dem ersten Meßteil bzw. dem zweiten Meßteil, so daß zwei Arbeitskurven erstellt wurden (Nr. 1: erster Meßteil, Nr. 2: zweiter Meßteil). Dagegen wird bei der Arbeitskurve des Substrats Box in oxidierter Form eine Reihe von Werten der Standardlösung des Substrats Box lediglich mit dem zweiten Meßteil erhalten, so daß nur eine Arbeitskurve Nr. 3 erstellt wurde. Es liegen also insgesamt drei Arbeitskurven vor.

Ein Beispiel der erfindungsgemäßen Assay-Vorrichtung wird nun unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Fließ- Assayvorrichtung. Die Vorrichtung umfaßt:

a) einen ersten Meßteil mit Oxidase in immobilisierter Form (4) und einer ersten Elektrode (5) stromabwärts von dem ersten Meßteil angeordnet und
b) einen zweiten Meßteil mit einer Dehydrogenase in immobilisierter Form (6) einer Oxidase in immobilisierter Form (7) und einer zweiten Elektrode (8), die in dieser Reihenfolge angeordnet sind, wobei sich der zweite Meßteil in Serie zu dem ersten Meßteil liegend befindet.

Zur Bestimmung von z. B. einem Substrat Box in oxidierter Form und einem Substrat Bred in reduzierter Form wird das in der Probe enthaltene Substrat Bred in reduzierter Form zunächst anhand des in dem genannten ersten Meßteil gemessenen Wertes unter zu Hilfenahme der Arbeitskurve Nr. 1 bestimmt.

Die die Probe und das Coenzym Ared in reduzierter Form enthaltende Pufferlösung wird also zunächst mittels einer Beschickungspumpe (2) in den ersten Meßteil eingeführt. Die immobilisierte Oxidase katalysiert die Umsetzung des Substrats Bred in reduzierter Farm zu dem Substrat Box in oxidierter Form. Die Konzentration der elektrochemisch aktiven Substanz, die sich bei dieser Gelegenheit einstellt, wird mit der ersten Elektrode (5) gemessen, wodurch das ursprünglich in der Probe vorliegende Substrat Bred in reduzierter Form direkt bestimmt wird.

Der zweite Meßteil ist mit der immobilisierten Dehydrogenase (6), der immobilisierten Oxidase (7) und der zweiten Elektrode (8) zur Bestimmung der Konzentrationsänderung der elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der durch Oxidase katalysierten Reaktion der Endstufe ausgerüstet. In diesem Meßteil wird dann die Gesamtkonzentration des Substrats Bred in reduzierter Form, das sich aus dem in der Probe anwesenden Substrat Box in oxidierter Form und dem Co-Enzym Ared in reduzierter Form durch die Dehydrase-katalysierte Reaktion gebildet hat, und des Substrats Bred in reduzierter Form, das in der Probe von Anfang an anwesend war, bestimmt. Das Substrat Box in oxidierter Form in der Probe kann dadurch quantitativ bestimmt werden, indem man für die Ablesung in Kurve 2 anstelle der Konzentration von Bred nunmehr die Konzentration des Substrats Bred in reduzierter Form berücksichtigt, welche in der Probe ursprünglich enthalten und in der vorhergehenden Stufe (i) bestimmt worden war. Danach wird der erhaltene Wert von dem Wert von Bred, der im zweiten Meßteil angezeigt wurde, abgezogen. Zur Bestimmung der Konzentration von Box wird der abgezogene Wert und Arbeitskurve Nr. 3 verwendet. Auf diese Weise können Substrat Bred in reduzierter Form und Substrat Box in oxidierter Form gleichzeitig bestimmt werden.

Die Berichtigung des nach Stufe (ii) erhaltenen Wertes in Stufe (iii) unter Berücksichtigung des in Stufe (i) erhaltenen Wertes kann automatisch durch ein entsprechendes Computerprogramm vorgenommen werden.

Für das Beispiel, das L-Laktat-Dehydrogenase und L-Laktat- Oxidase jeweils in immobilisierter Form verwendet, werden die Meßbedingungen und andere Einzelheiten im folgenden näher erläutert.

Das Verfahren zur Immobilisierung von Dehydrogenase oder Oxidase ist nicht auf ein bestimmtes beschränkt, sondern umfaßt: die Adsorptionsmethode, die Methode der chemischen Kupplung oder covalenten Bindung, die Einschlußmethode und andere Methoden, die an sich bekannt sind. Von diesen Methoden wird die Methode der chemischen Bindung, mit der eine starke Enzymimmobilisierung erreicht werden kann, bevorzugt. Bei einer bevorzugten Methode der Immobilisierung werden die Enzyme an einen fein zerteilten Träger immobilisiert und jedes immobilisierte Enzym wird in einem Reaktor, z. B. eine Kolonne, eingebracht, um eine verbesserte Meßempfindlichkeit zu erhalten.

Beispiele von Trägern, die zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Diatomeenerde, Silikagel, Glasperlen, Tonerde, Keramikmaterialien, Kohlenstoff, Aktivkohle, Molekularsiebe, Silikonkautschuk, Zellulose, Agarose, Polymere auf der Basis von Aminosäuren und dergleichen. Bei einem bevorzugten Beispiel des chemischen Kupplungsverfahrens wird eine Aminogruppe mit Hilfe eines Aminosilan-Reaktionsmittels in die Trägeroberfläche eingebracht, und nach weiterer Formylierungsbehandlung unter Verwendung eines multifunktionellen Aldehyds wie Glutaraldehyd, wird ein Enzym mit dem Träger zur Immobilisierung in Kontakt gebracht.

Insbesondere wird ein Träger mit Hydroxylgruppen wie Diatomeenerde, kalzinierte Diatomeenerde (gebrannte Ziegel etc.), Zellulose, poröses Glas, Silikagel oder saurer Ton zur Umwandlung der Hydroxylgruppen zu Aminosilan behandelt und mit einem polyfunktionellen Aldehyd umgesetzt, wobei das polyfunktionelle Aldehyd kovalent an die Aminogruppen, die auf der Oberfläche des Trägers gebildet wurden, gebunden wird, um die Aldehydgruppen an den Träger zu binden. Nachfolgend wird das Enzym zur Immobilisierung an die Aldehydgruppen gebunden. Eine solche immobilisierte Dehydrogenase oder Oxidase wird im Hinblick auf die Verfahrenswirksamkeit und die geringere Abnahme der Enzymaktivität bevorzugt. Von diesen Trägern werden Diatomeenerde, kalzinierte Diatomeenerde, poröses Glas, Silikagel, saurer Ton und dergleichen, die Silikat umfassen, bevorzugt. Mehr bevorzugt werden Diatomeenerde und kalzinierte Diatomeenerde.

Die Umsetzung der Hydroxylgruppen zu Aminosilan kann durch Inkontaktbringen eines Reaktionsmittels wie 3- Aminopropyltriethoxysilan, 3-Aminoethyltrimethoxysilan oder dergleichen mit dem Träger in einem Lösungsmittel wie wasserfreiem Benzol, Toluol oder dergleichen erfolgen. Geeignete polyfunktionelle Aldehyde umfassen Glutaraldehyd, Glyoxal, Succinyldialdehyd etc.

Zuerst werden L-Lactat-Dehydrogenase oder L-Lactat-Oxidase bzw. eine ähnliche Dehydrogenase oder Oxidase jeweils durch chemische Kupplungsverfahren immobilisiert, um die entsprechenden immobilisierten Enzyme, jeweils in fein verteilter Form, zu erhalten. Die immobilisierten Enzyme werden jeweils in Kunststoff- oder Edelstahlsäulen mit einem inneren Durchmesser von etwa 1 bis 10 mm und einer Länge von etwa 2 bis 50 mm gegeben, um die jeweiligen Reaktoren zu erhalten. Die Reaktoren können verschiedene Größen haben, so daß der Assay-Konzentrationsbereich variiert werden kann. Dann wird eine Pumpe installiert, die 1 bis 500 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 (als eine Pufferlösung mit einem pH-Wert nahe dem optimalen pH-Wert der genannten Enzyme) mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1,0 ml/Min. befördern kann. Geeignet sind verschiedene Pumpenarten wie eine Tauchkolbenpumpe, peristaltische Pumpe usw. Die obige Pufferlösung kann andere Salze, einen Stabilisator, ein oberflächenaktives Mittel und/oder dergleichen enthalten. Die Assay-Temperatur beträgt vorzugsweise 25° bis 35°C.

Die Beschickungspumpe für die Proben kann z. B. ein Injektor für Hochleistungs-Flüssigchromatographie sein, wobei ein 6- Wege-Ventil verwendet wird. Ein die immobilisierte Oxidase enthaltender Reaktor wird stromabwärts zu dem Injektor angeordnet und L-Milchsäure in der Probe wird zuerst in diesem Reaktor oxidiert, worauf die Konzentration an Wasserstoffperoxid als elektrochemisch aktive Substanz ansteigt und die Sauerstoffkonzentration abnimmt. Wenn daher eine erste Wasserstoffperoxidelektrode oder eine Sauerstoffelektrode stromabwärts in dem die immobilisierte Oxidase enthaltenden Reaktor angeordnet wird, kann ein Wert erhalten werden, der der Menge der L-Milchsäure entspricht.

Weiter stromabwärts von dem Reaktor, der die immobilisierte Oxidase und eine Elektrode enthält, befinden sich ein die immobilisierte Dehydrogenase enthaltender Reaktor und ein die immobilisierte Oxidase enthaltender Reaktor in der genannten Reihenfolge. Weiter stromabwärts ist eine zweite Wasserstoffperoxid-Elektrode oder Sauerstoff-Elektrode angeordnet.

Zur Bestimmung von L-Milchsäure und Brenztraubensäure wird NADH zu der Pufferlösung zugefügt. Die Menge an zugefügtem NADH hängt davon ab, inwieweit die durch den Injektor eingeführte Probe durch Vermischen mit der. Pufferlösung verdünnt worden ist, bis sie den Reaktor erreicht hat, der die immobilisierte Dehydrogenase enthält. Die Reduktion von Brenztraubensäure zu L-Milchsäure erfolgt bei einem Molverhältnis an NADH. Brenztraubensäure von 1 : 1. Im allgemeinen reicht eine NADH-Konzentration aus, wenn sie etwa die Hälfte bis etwa 1 Hundertstel der Konzentration an Brenztraubensäure in der Probe beträgt. Wenn es auch möglich ist, NADH zu der Probe zuzugeben und die erhaltene Mischung in die Assayvorrichtung einzubringen, durch die die NADH- freie Pufferlösung fließt, wird diese Methode aus Kostengründen nicht bevorzugt, weil NADH gleichzeitig mit Brenztraubensäure, die eines der Assayziele ist, verdünnt wird. Dadurch wird eine erhöhte Menge an NADH bei der Volumenmenge der Lösung, die für ein Arbeiten zweckmäßig ist, erforderlich.

In der eingespritzten Probe wird zunächst L-Milchsäure mit der ersten Elektrode des ersten Reaktors bestimmt. Danach wird die Brenztraubensäure, die sich aus L-Milchsäure gebildet hat und die Brenztraubensäure, die ursprünglich von Anfang an in der Probe enthalten war, in dem Dehydrogenase-enthaltenden Reaktor reduziert. Diese Reaktion schreitet mit einer hohen Geschwindigkeit fort, da das Dehydrogenase-Reaktions gleichgewicht die Bildung von L-Milchsäure begünstigt.

Die aus Brenztraubensäure durch die Einwirkung der Dehydrogenase gebildete L-Milchsäure wird dann unter der Wirkung von Oxidase oxidiert und kann auf der Grundlage des konzentrationsabhängigen erhaltenen Wertes der Wasserstoffperoxidelektrode oder Sauerstoffelektrode bestimmt werden. Die Wechselbeziehung der Werte der ersten und zweiten Elektrode zu der L-Milchsäure-Konzentration kann dadurch ermittelt werden, daß vor der Bestimmung der Probe Standardlösungen an L-Milchsäure eingeführt werden. Die Wechselbeziehung der Werte der zweiten Elektrode zu der Brenztraubensäurekonzentration kann durch Einführung von Standardlösungen an Brenztraubensäure ermittelt werden. Es werden also zwei Arbeitskurven für L-Milchsäure und eine Arbeitskurve für Brenztraubensäure erhalten.

Bei der Analyse von Mischungen von Brenztraubensäure und L- Milchsäure wird zunächst die Konzentration an L-Milchsäure bestimmt und der Einfluß der L-Milchsäure auf die zweite Elektrode abgeschätzt. Die Konzentration an Brenztraubensäure, welche ursprünglich in der Probe enthalten war, kann durch Subtraktion des Wertes, der dem Einfluß von L-Milchsäure zuzuschreiben ist, berechnet werden. Dieses läßt sich leicht bewerkstelligen, indem man die mit beiden Elektroden gefundenen Werte nach der A/D-Umwandlung einem Mikrocomputer zuleitet. Zur gleichzeitigen Bestimmung von L-Milchsäure und NADH wird Brenztraubensäure anstelle von NADH in die Pufferlösung gegeben. Die obigen Reihen von Verfahren können auch bei anderen Enzymkombinationen durchgeführt werden.

Selbst wenn ein Substrat in oxidierter Form und ein Co-Enzym in reduzierter Form in der Probe vorliegt, werden die Assayergebnisse dadurch nicht beeinträchtigt.

Die Elektrode, die für die Bestimmung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz verwendet wird, ist z. B. eine Wasserstoffperoxidelektrode oder eine Sauerstoffelektrode. Die Materialien, die für eine Wasserstoffperoxidelektrode verwendet werden können, sind Kohlenstoff, Platin, Nickel, Palladium usw. auf der Anodenseite. Platin wird bevorzugt, weil die Überspannung niedrig ist, eine hohe Empfindlichkeit erhalten werden kann und das Potentialfenster breit ist. Die Oberfläche der Elektrode kann eine selektiv-permeable Membran aufweisen wie z. B. eine Polysiloxan-, Acrylharz-, Protein- oder Acetylzellulosemembran etc. Auf der Kathodenseite kann Kohlenstoff, Gold, Platin, Blei und dergleichen verwendet werden. Die Anode und Kathode können in einem Zylinder angeordnet sein, der eine innere, ein Elektrolyt enthaltende Lösung wie Kaliumchlorid enthält. Anode und Kathode können auch in einen Strom der Pufferlösung, die ein Elektrolyt wie Kaliumchlorid enthält, eingesetzt werden. Darüber hinaus kann ein Drei-Elektroden-System verwendet werden, das eine Arbeitselektrode, Bezugselektrode und Gegenelektrode umfaßt. Die Sauerstoffelektrode kann von bekannter Art sein. Eine Wasserstoffperoxid-Elektrode von der Art des Drei-Elektroden- Systems wird unter diesen Elektroden bevorzugt, und zwar aufgrund der Stabilität, der Schnelligkeit des Ansprechens und der Genauigkeit. Die Elektrode wird allgemein in eine Strömungszelle eingeführt und bildet ein Meßteil.

Fig. 8 zeigt eine andere Ausführungsform als Fig. 1, wobei erstere einen ersten Meßteil mit immobilisierter Oxidase (4) und einer ersten Elektrode (5) und einen zweiten Meßteil mit immobilisierter Dehydrogenase (6), einer immobilisierten Oxydase (7) und einer zweiten Elektrode (8) umfaßt, wobei der zweite Meßteil parallel zum ersten Meßteil angeordnet ist. Der erste Meßteil und der zweite Meßteil können, im Gegensatz zu einer Anordnung in Reihe, parallel angeordnet sein.

Die erfindungsgemäße Ausführungsform der Fig. 1 wird gegenüber der Ausführungsform nach Fig. 8 bevorzugt, da Änderungen des Abtrennverhältnisses einer Probe zwischen dem ersten Meßteil und dem zweiten Meßteil in der Vorrichtung nach Fig. 8 stattfinden können, wobei die Empfindlichkeit abnimmt.

Desweiteren kann die Erfindung unter Verwendung einer Fließvorrichtung, wie sie in Fig. 9 gezeigt wird, durchgeführt werden. Die Vorrichtung nach Fig. 9 unterscheidet sich von derjenigen von Fig. 1. In der Vorrichtung nach Fig. 9 fehlt der erste Meßteil mit einer immobilisierten Oxidase (4) und einer ersten Elektrode.

Die Schritte zur Messung von Substrat Bred in reduzierter Form werden in gleicher Weise wie die oben beschriebenen Assaymethode in dem ersten Meßteil durchgeführt, jedoch wird das Co-Enzym Ared in reduzierter Form in einer Pufferlösung nicht verwendet, um keine Dehydrogenase-Reaktion zu bewirken. Danach wird die Stufe zur Messung des Substrats Box in oxidierter Form unter Verwendung einer Co-Enzym Ared in reduzierter Form enthaltenden Pufferlösung in der gleichen Weise wie nach der Assaymethode im zweiten Meßteil durchgeführt, welche oben bezüglich der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung beschrieben ist.

Diese Methode hat den Vorteil, daß keine Notwendigkeit besteht, die kompliziertere Vorrichtung nach Fig. 1 oder Fig. 8 zu verwenden. Auf der anderen Seite hat dieses Verfahren deshalb Nachteile, weil die Einführung der Probe zweimal erforderlich ist und in jedem Fall Pufferlösungen notwendig sind, die einmal das Co-Enzym Ared in reduzierter Form enthalten und zum anderen nicht. Natürlich kann das Co-Enzym Ared in reduzierter Form zu einer Probe anstelle der Pufferlösung zugefügt werden.

Das obige Argument betrifft die Messung von Substrat Box in oxidierter Form und von Substrat Bred in reduzierter Form. Jedoch ist dasselbe Argument hinsichtlich der Messung des Co- Enzyms Ared in reduzierter Form und des Substrat Bred in reduzierter Form gültig.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung im einzelnen. Sie sollen natürlich keine Beschränkung der Erfindung darstellen.

Beispiel 1

Es wurden Assay-Vorrichtungen für L-Laktat und Pyruvat gebaut und die Charakteristik der jeweiligen immobilisierten Enzymreaktoren wurde bestimmt.

(1) Bereitstellung eines immobilisierte L-Lactat-Oxidase enthaltenden Reaktors

Ein Pulver von gebrannten Ziegeln (Diatomeenerde-artig, kieselhaltiger Träger; 30-60 mesh; 150 mg) wird vollständig getrocknet, in eine 10%ige Lösung von γ-Amino propyltriethoxysilan in wasserfreiem Toluol 1 Stunde getaucht, dann gut mit Toluol gewaschen und bei 120°C 2 Stunden getrocknet. Der Aminosilan-modifizierte Träger wird 1 Stunde in eine 5%ige wässrige Glutaraldehyd-Lösung getaucht und dann gut mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von der Substitution mit 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH-Wert 7,0). Der Puffer wird so weit wie möglich entfernt. Eine Lösung (200 µl) von L-Lactat-Oxidase (Sigma Chemical Company) (50 Einheiten/ml) in 100 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,0) wird in Kontakt mit den formylierten gebrannten Ziegeln gebracht. Man läßt die Mischung zur Enzym-Immobilisierung 1 Tag bei 10° C oder darunter stehen. Der so erhaltene immobilisierte, Enzym-tragende Träger wird in eine Acrylharz-Säule gegeben (3,5 mm Innendurchmesser, 30 mm Länge), um einen Reaktor mit immobilisierter L-Lactat-Oxidase zu erhalten.

(2) Herstellung eines immobilisierte L-Lactat-Dehydrogenase enthaltenen Reaktors

Das gleiche formylierte gebrannte Ziegelpulver wie es zur Immobilisierung von 1-Lactat-Oxidase verwendet wurde, wird mit 200 µl einer von Schweinemuskeln erhaltenen L-Lactat- Dehydrogenase-Lösung (Produkt von Boehringer, Mannheim) (4.500 Einheiten/ml) in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) in Kontakt gebracht. Man läßt die Mischung 1 Tag bei 10°C oder darunter zur Enzym-Immobilisierung stehen. Der so erhaltene immobilisierte Enzym-tragende Träger wird in eine Säule gegeben (3,5 mm Innendurchmesser, 30 mm Länge), um einen Reaktor mit immobilisierter L-Lactat-Dehydrogenase zu erhalten.

(3) Herstellung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode

Die Seitenfläche eines Platindrahtes mit einem Durchmesser von 2 mm wird mit hitzeschrumpfendem Teflon überzogen und ein Ende des Drahtes wird unter Verwendung einer Feile und Schmirgelpapier #1500 geglättet. Unter Verwendung dieses Drahtes als eine Arbeitselektrode, einer Platinplatte (1 cm × 1 cm) als eine Gegenelektrode und einer gesättigten Kalomel- Elektrode als eine Bezugselektrode wurde die elektrolytische Behandlung der Arbeitselektrode in 0,1 M Schwefelsäure bei +1,4 V für eine Dauer von 10 Minuten durchgeführt. Der Platindraht wird dann gut mit Wasser gewaschen, bei 40°C 10 Min. getrocknet, in eine 10%ige Lösung von γ- Aminopropyltriethoxysilan in wasserfreiem Toluol 1 Stunde getaucht und dann gewaschen.

Glutaraldehyd wird zu einer Lösung von 20 mg Rinderserum albumin (Produkt von Sigma Chemical Co, Fraction V) in 1 ml destilliertem Wasser bis zu einer Glutaraldehyd-Konzentration von 0,2% zugegeben. Ein Teil von 5 µl der erhaltenen Mischung wird rasch auf den wie vorstehend hergestellten Platindraht gegeben, gefolgt von Trocknen und Härten bei 40°C für eine Dauer von 15 Min., wobei eine Membran selektiv durchlässig für Wasserstoffperoxid gebildet wird. Der so bearbeitete Platindraht wird als Arbeitselektrode einer Wasserstoffperoxid-Elektrode verwendet.

Eine Silber/Silberchlorid-Elektrode wird als eine Bezugselektrode verwendet und auf eine Strömungszelle montiert. An der Austrittsseite der Strömungszelle wird ein leitendes Rohrsystem als eine Gegenelektrode benutzt. Zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid wird eine Spannung von +0,6 V, bezogen auf die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode, an der Arbeitselektrode bewirkt.

(4) Vorrichtung zum Simultan-Assay von L-Milchsäure und Brenztraubensäure

Es wird auf Fig. 1 hingewiesen. Eine 0,5 mM NADH enthaltende Pufferlösung wird kontinuierlich aus einem Puffertank (1) mit einer Beschickungspumpe (2) eingeleitet und befördert eine Brenztraubensäure und L-Milchsäure enthaltende Probe, injiziert aus einem Sampler (3) in einen Kessel mit konstanter Temperatur (9). In einem ersten, immobilisierte L-Lactat- Oxidase (4)-enthaltenden Reaktor in dem genannten Kessel, werden Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid aus L- Milchsäure in der Probe und Sauerstoff in der Pufferlösung gebildet. Diese Umwandlung wird bestimmt in einem ersten Meßteil (5), der mit einer ersten Wasserstoffperoxid- Elektrode ausgestattet ist.

Der Teil an Brenztraubensäure, der ursprünglich in der Probe enthalten war und der Teil an Brenztraubensäure, der durch L- Lactat-Oxidase-katalysierte Umsetzung gebildet wurde, reagieren weiterhin mit NADH in der Pufferlösung in einem Reaktor, der immobilisierte L-Lactat-Dehydrogenase (6) enthält, was L-Milchsäure und NAD ergibt. Dann wird in einem zweiten, immobilisierte L-Lactat-Oxidase (7)-enthaltenen Reaktor Wasserstoffperoxid in der gleichen Weise, wie oben erwähnt, gebildet. Diese Umwandlung wird durch den Meßteil (8), der mit einer zweiten Wasserstoffperoxid-Elektrode ausgestattet ist, ermittelt. Die Änderung der Stromstärke in diesen zwei Meßteilen wird in Volt-Änderungen durch einen Detektor (10) umgewandelt, der beispielsweise ein Potentiostat ist. Die Volt-Werte nach der weiteren A/D-Umwandlung werden zu einem Single-Board-Computer (11) gesandt. Die Volt-Werte werden schließlich einem Personal Computer (13) durch ein RS- 232C-Kabel (12) zur Datenverarbeitung übermittelt. Die Injektion der Probe und die Regelung der Pumpe werden mit einem Personal-Computer durchgeführt. In Fig. 1 bezeichnet das Bezugszeichen (14) ein Regelsignal für die Pumpe, (15) ein Regelsignal für den Sampler und (16) die Abwasserflüssigkeit.

(5) Assay-Verfahren

Die oben beschriebene Assay-Vorrichtung für L-Milchsäure und Brenztraubensäure wird verwendet. Die Menge an injizierter Probe beträgt 5 µl. In einem Vergleichsversuch wird Wasser verwendet. L-Milchsäure-Standardlösungen (1,0 mM und 2,5 mM, hergestellt durch Lösen von Lithium-L-lactat in destilliertem Wasser) und Brenztraubensäure-Standardlösungen (1,0 mM und 2,5 mM und 5,0 mM, hergestellt durch Lösen von Lithiumpyruvat in destilliertem Wasser) werden bestimmt. Es wird die Arbeitskurve von L-Milchsäure und Brenztraubensäure erstellt.

Die Zusammensetzung der Pufferlösung ist wie folgt: 100 mM Phosphorsäure, 50 mM Kaliumchlorid, 1 mM Natriumazid und 500 µm NADH. Die Messungen werden bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Fließgeschwindigkeit der Pufferlösung von 1,0 ml/Min. durchgeführt. Die Temperatur des Gefäßes beträgt 30°C.

Die auf der Grundlage der abgelesenen Werte erstellte Arbeitskurve, die von den beiden Meßteilen bei einem pH-Wert von 7,0 erhalten wurden, ist in Fig. 2 gezeigt. Die Arbeitskurve 1 resultiert von Milchsäure im ersten Meßteil, die Arbeitskurve 2 basiert auf den Werten für Milchsäure aus dem zweiten Meßteil und Arbeitskurve 3 auf den Werten für Brenztraubensäure. Jede Arbeitskurve zeigt einen guten linearen Charakter.

Arbeitskurven wurden in derselben Weise erstellt, wobei jedoch der pH-Wert der Pufferlösung variiert wurde. Auf der Grundlage der Gradienten der Kurven wurden die Veränderungen der Werte bei einem pH-Wert von 7,0 untersucht. Die Ergebnisse sind aus Fig. 3 zu ersehen. Die Kurve 1 in dieser Figur zeigt die pH- Wert-Anhängigkeit der erhaltenen Werte für Milchsäure. Ausgedrückt als relative Werte zeigen die Ergebnisse für Milchsäure von dem ersten und dem zweiten Meßteil das gleiche Verhalten, somit ist dieses Verhalten durch 1 Kurve darstellbar. Kurve 2 zeigt die erhaltenen Werte für Brenztraubensäure. Ein Maximum ist bei einem pH-Wert von etwa 7,25 ersichtlich.

Desweiteren wurde die Temperatur in dem Kessel variiert und die Gradient-Veränderungen als relative Werte ausgedrückt. Die Ergebnisse sind aus Fig. 4 ersichtlich. Wie in Fig. 3 stellt nur Kurve 1 die Veränderungen der erhaltenen Werte für Milchsäure dar. Kurve 2 zeigt die Veränderung der Werte für Brenztraubensäure in dem Meßteil, das mit der zweiten Elektrode ausgestattet ist. Es wurde gefunden, daß die optimale Temperatur bei etwa 39°C liegt.

Die für jeden Assay-Ansatz benötigte Zeit beträgt 90 Sekunden, somit ist ein schneller Assay möglich.

Auf der Grundlage der Ergebnisse der obigen Untersuchungen wurde ein pH-Wert von 7,0 und eine Temperatur von 30°C ausgewählt. Unter Anwendung der oben beschriebenen Assay- Vorrichtung wurde der Assay bei 30° jeden Tag 8 Stunden lang wiederholt und die immobilisierten Enzyme bei Zimmertemperatur (25°C) für den Rest jeden Tages stehen gelassen, um die Langzeitstabilität zu untersuchen. Die Tagesabweichungen werden in Fig. 5 gezeigt, wobei die Werte unmittelbar nach der Immobilisierung mit 100 angesetzt wurden. Kurve 1 von Fig. 5 betrifft Milchsäure und Kurve 2 Brenztraubensäure. Es wurde gefunden, daß die Enzyme über einen Zeitraum von etwa 2 Monaten beständig waren.

Beispiel 2

Standard-Mischlösungen von L-Milchsäure und Brenztraubensäure und Filtratproben von sake moromi (Reisweinmaische) wurden analysiert.

1. Bereitstellung von Reaktoren mit immobilisierten Enzymen

Das gleiche Verfahren, wie es in Beispiel 1 angewendet wurde, wurde sowohl für Dehydrogenase als auch Oxidase verwendet.

2. Bereitstellung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode

Es wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.

3. Assay-Vorrichtung

Die gleiche Assay-Vorrichtung wie in Beispiel 1 wurde verwendet.

4. Assay-Verfahren

Die Bestimmung wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der pH-Wert der Pufferlösung betrug 7,0 und die Meßtemperatur lag bei 30°C.

Die Konzentrationen der Standard-Mischlösungen sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

5. Assay-Ergebnisse

Die Assay-Ergebnisse für die Standard-Mischlösungen sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Die Arbeitskurve für die Bestimmung von L-Milchsäure an der ersten Elektrode im ersten Meßteil (5) gab die folgende Gleichung:

Y = 32,6X + 0,13 (Korrelations-Koeffizient: 1.000)

worin X = die Milchsäurekonzentration (mM) und
Y = die Änderung der Stromstärke (nA) sind.

Die Arbeitskurve für die Bestimmung von L-Milchsäure an der zweiten Elektrode im zweiten Meßteil (8) ergab die folgende Gleichung:

Y = 46,2X - 0,31 (Korrelations-Koeffizient: 1.000)

Die Arbeitskurve für die Bestimmung von Brenztraubensäure an der zweiten Elektrode ergab die folgende Gleichung:

Y = 23,4X + 0,03 (Korrelations-Koeffizient: 0,999)

worin X = Brenztraubensäurekonzentration (mM) und
Y = die Änderung der Stromstärke (nA) sind.

Die Konzentrationen an L-Milchsäure und Brenztraubensäure, die unter Verwendung dieser Arbeitskurven bestimmt wurden, sind richtig, wie oben zu sehen ist.

Filtrate von sake moromi, dessen Gehalt an Milchsäure und Brenztraubensäure durch Verfahren mit gelösten Enzymen bestimmt worden war, wurden mit der vorliegenden Methode ohne Verdünnung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zu sehen.

Tabelle 2

Tabelle 2 zeigt eine gute Übereinstimmung mit den Resultaten des Verfahrens mit gelösten Enzymen. Somit sind die Assay- Vorrichtung und das Assay-Verfahren nach der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, weil ein Arbeiten unter Verdünnung nicht notwendig ist und die Möglichkeit der Automatisierung des analytischen Verfahrens besteht.

Beispiel 3

Es wurden Standard-Lösungen, die L-Milchsäure und NADH enthalten, analysiert.

1. Bereitstellung von Reaktoren mit immobilisierten Enzymen

Mit Dehydrogenase bzw. Oxidase wurde das in Beispiel 1 angewendete Verfahren wiederholt.

2. Bereitstellung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode

Es wurde nach dem in Beispiel 1 angewendeten Verfahren vorgegangen.

3. Assay-Vorrichtung

Die Assay-Vorrichtung nach Beispiel 1 wurde verwendet.

4. Assay-Verfahren

Es wurde nach dem Verfahren von Beispiel 2 vorgegangen, wobei jedoch die Pufferlösung 0,5 mM Brenztraubensäure anstelle von NADH enthielt.

5. Assay-Ergebnisse

Bezüglich Milchsäure wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten. In Fig. 6 ist die Arbeitskurve für NADH dargestellt. Es ist ersichtlich, daß NADH für die Bestimmung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. Die Analysenergebnisse der Mischlösungen sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Claims

1. Assayvorrichtung für die Bestimmung eines Substrats Box in oxidierter Form oder eines Co-Enzyms Ared in reduzierter Form und eines Substrats Bred in reduzierter Form durch:
eine Dehydrogenase, die die Reaktion zwischen dem Co- Enzym Ared in reduzierter Form und dem Substrat Box in oxidierter Form unter Bildung des entsprechenden Co- Enzyms Aox in oxidierter Form und des Substrats Bred in reduzierter Form katalysiert; und
eine Oxidase, die die Oxidation des Substrats Bred in reduzierter Form katalysiert,
wobei die Vorrichtung umfaßt:

1. einen ersten Meßteil einschließlich der Oxidase in immobilisierter Form und einer ersten Elektrode zur Ermittlung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der durch Oxidase katalysierten Reaktion und
2. einen zweiten Meßteil einschließlich der Dehydrogenase in immobilisierter Form und der Oxidase in immobilisierter Form und einer zweiten Elektrode zur Ermittlung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis der durch die Oxidase katalysierten Reaktion.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Meßteil mit dem zweiten Meßteil in Serie verbunden ist, wobei der zweite Meßteil stromabwärts zum ersten Meßteil angeordnet ist und im zweiten Meßteil die Dehydrogenase und Oxidase jeweils getrennt immobilisiert in den entsprechenden Reaktoren vorliegen.

3. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase L- Laktat-Dehydrogenase und die Oxidase L-Laktat-Oxidase ist.

4. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dehydrogenase immobilisiert in einem Reaktor vorliegt, wobei die immobilisierte Dehydrogenase hergestellt worden ist durch:
Bindung eines Aminosilan-Kupplungsmittels an den Hydroxylgruppen-enthaltenden Träger, Umsetzung der auf der Oberfläche des Trägers gebildeten Aminogruppen mit einem polyfunktionellen Aldehyd, um den polyfunktionellen Aldehyd an diese zu binden und Bindung der Dehydrogenase an den polyfunktionellen Aldehyd.

5. Verfahren zur Bestimmung eines Substrats Box in oxidierter Form und eines Substrats Bred in reduzierter Form, wobei angewendet wird:
Eine durch Dehydrogenase katalysierte Reaktion zwischen dem Co-Enzym Ared in reduzierter Form und dem Substrat Box in oxidierter Form unter Bildung des entsprechenden Co-Enzyms Aox in oxidierter Form und des Substrats Bred in reduzierter Form; und
eine durch Oxidase katalysierte Oxidation des Substrats Bred in reduzierter Form,
wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

1. Kontaktieren einer Probe zusammen mit einer Pufferlösung mit der immobilisierten Oxidase, um dadurch die Umwandlung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe in das Substrat Box in oxidierter Form zu bewirken, und Bestimmung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe durch Ermittlung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis dieser Umsetzung,
2. Kontaktieren der Probe zusammen mit einer Pufferlösung, die das Co-Enzym Ared in reduzierter Form enthält, mit der immobilisierten Dehydrogenase, um dadurch das Substrat Box in oxidierter Form zu reduzieren, um das Substrat Bred in reduzierter Form herzustellen,
wonach die Probe mit einer immobilisierten Oxidase in Kontakt gebracht wird, um das so hergestellte Substrat Bred in reduzierter Form und auch das bereits von Anfang an in der Probe enthaltene Substrat Bred in reduzierter Form zu dem Substrat Box in oxidierter Form zu oxidieren, und die elektrochemisch aktive Substanz, deren Konzentration sich bei der durch Oxidase katalysierten Reaktion ändert, ermittelt wird, um die Gesamtkonzentration an Substrat Bred in reduzierter Form zu bestimmen und
3. Bestimmung der Konzentration des Substrats Box in oxidierter Form durch Korrektur des in Stufe (ii) erhaltenen Wertes unter Berücksichtigung des anfangs vorhandenen Substrats Bred in reduzierter Form entsprechend Stufe (i).

6. Verfahren zur Bestimmung eines Co-Enzyms Ared in reduzierter Form und eines Substrats Bred in reduzierter Form, wobei angewendet wird:
Eine durch Dehydrogenase katalysierte Reaktion zwischen dem Co-Enzym Ared in reduzierter Form und dem Substrat Box in oxidierter Form unter Bildung des entsprechenden Co-Enzyms Aox in oxidierter Form und des Substrats Bred in reduzierter Form; und
eine durch Oxidase katalysierte Oxidation des Substrats Bred in reduzierter Form,
wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

1. Kontaktieren einer Probe zusammen mit einer Pufferlösung mit der immobilisierten Oxidase, um dadurch die Umwandlung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe in das Substrat Box in oxidierter Form zu bewirken, und Bestimmung des Substrats Bred in reduzierter Form in der Probe durch Ermittlung der Konzentrationsänderung einer elektrochemisch aktiven Substanz als Ergebnis dieser Umsetzung,
2. Kontaktieren der Probe zusammen mit einer Pufferlösung, die das Substrat Box in oxidierter Form enthält, mit der immobilisierten Dehydrogenase, um dadurch das Co-Enzym Ared in reduzierter Form zu oxidierter, um das Substrat Bred in reduzierter Form herzustellen,
wonach die Probe mit einer immobilisierten Oxidase in Kontakt gebracht wird, um das so hergestellte Substrat Bred in reduzierter Form und auch das bereits von Anfang an in der Probe enthaltene Substrat Bred in reduzierter Form zu dem Substrat Box in oxidierter Form zu oxidieren, und die elektrochemisch aktive Substanz, deren Konzentration sich bei der durch Oxidase katalysierten Reaktion ändert, ermittelt wird, um die Gesamtkonzentration an Substrat Bred in reduzierter Form zu bestimmen und
3. Bestimmung der Konzentration des Co-Enzyms Ared in reduzierter Form durch Korrektur des in Stufe (ii) erhaltenen Wertes unter Berücksichtigung des anfangs vorhandenen Substrats Bred in reduzierter Form entsprechend Stufe (i).

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung nach Anspruch 1 verwendet wird, wobei Stufe (i) im ersten Meßteil und Stufe (ii) im zweiten Meßteil durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung verwendet wird, die immobilisierte Dehydrogenase, immobilisierte Oxidase und eine Elektrode zur Ermittlung der elektrochemisch aktiven Substanz umfaßt, deren Konzentration bei der Oxidase katalysierten Reaktion variiert, wobei

a) in Stufe (i) das Substrat Bred in reduzierter Form, welche in der Probe von Anfang an enthalten war, dadurch bestimmt wird, daß diese zusammen mit einer Pufferlösung in Abwesenheit von Co-Enzym Ared in reduzierter Form in die Vorrichtung eingeführt und die Konzentrationsänderung einer elektrochemisch-aktiven Substanz als Ergebnis der Oxidase-katalysierten Reaktion aufgrund des Einflusses der immobilisierten Oxidase bestimmt wird und
b) in Stufe (ii) eine Probe in der Vorrichtung mit einem Puffer, der ein Co-Enzym Ared in reduzierter Form enthält, in Kontakt gebracht und die elektrochemisch aktive Substanz ermittelt wird, deren Konzentration variiert und die aufgrund der Einwirkung der immobilisierten Dehydrogenase und immobilisierten Oxidase gebildet wird.

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung verwendet wird, die immobilisierte Dehydrogenase, immobilisierte Oxidase und eine Elektrode zur Ermittlung der elektrochemisch aktiven Substanz umfaßt, deren Konzentration bei der Oxidase katalysierten Reaktion variiert, wobei

a) in Stufe (i) das Substrat Bred in reduzierter Form, welche in der Probe von Anfang an enthalten war, dadurch bestimmt wird, daß diese zusammen mit einer Pufferlösung in Abwesenheit von Substrat Box in oxidierter Form in die Vorrichtung eingeführt und die Konzentrationsänderung einer elektrochemisch-aktiven Substanz als Ergebnis der Oxidase-katalysierten Reaktion aufgrund des Einflusses der immobilisierten Oxidase bestimmt wird und
b) in Stufe (ii) eine Probe in der Vorrichtung mit einem Puffer, der ein Substrat Box in oxidierter Form enthält, in Kontakt gebracht und die elektrochemisch aktive Substanz ermittelt wird, deren Konzentration variiert und die aufgrund der Einwirkung der immobilisierten Dehydrogenase und immobilisierten Oxidase gebildet wird.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Co-Enzym Ared in reduzierter Form in der Pufferlösung enthalten ist und das Substrat Box in oxidierter Form und Substrat Bred in reduzierter Form bestimmt werden.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Box in oxidierter Form in der Pufferlösung enthalten ist und das Co-Enzym Ared in reduzierter Form und Substrat Bred in reduzierter Form bestimmt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Co-Enzym Ared in reduzierter Form = NADH, das Substrat Box in oxidierter Form = Brenztraubensäure und das Substrat Bred in reduzierter Form = L-Milchsäure ist.