DE4227569C1 - Verfahren zum empfindlichen enzymatischen Nachweis von anorganischem Phosphat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum enzymatischen Nachweis von anorganischem Phosphat in wäßrigen Medien. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein Enzymsystem, das aus drei Enzymen besteht und durch Substratrezyklisierung eine empfindliche Bestimmung von anorganischem Phosphat ermöglicht. Das Verfahren eignet sich vor allem zur Anwendung in amperometrischen Biosensoren.

Die Bestimmung von Phosphat nimmt in der klinischen Diagnostik und in der Umweltüberwachung einen bedeutenden Platz ein.

Erhöhte bzw. erniedrigte Phosphatkonzentrationen im Serum treten bei einer Reihe von Krankheiten (wie z. B. chronische Niereninsuffizienz, Vitamin-D-Intoxikationen, primärer Hyperparathyreoidismus, Rachitis) auf. Anorganisches Phosphat und die sich daraus ableitenden Phosphorsäureester spielen eine wichtige Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle, bei der Glykolyse, beim Mineral- und Nukleinsäurestoffwechsel sowie beim Aufbau von Zellmembranen.

In analoger Weise ist Phosphat auch für die pflanzliche Zelle von zentraler Bedeutung. In der Landwirtschaft werden deshalb zur Ertragssteigerung phosphathaltige Düngemittel eingesetzt. Gelöste Phosphate werden jedoch nicht aus landwirtschaftlichen Nutzflächen ausgetragen. Vielmehr liegt die Bedeutung auf dem Phosphat-Gehalt der mit Niederschlägen erodierten Bodenkrumen. Gemessen an der Gesamtbelastung eines Flusses mit Phosphat entfallen auf die Düngemittel nur etwa 10%.

Der mit 80% größte Anteil der Phosphate in einem Fluß stammt aus den häuslichen Abwässern (45% Waschmittel, 35% Exkremente etc.).

Analytisch lassen sich drei Formen der Phosphate unterscheiden: die gelösten ortho- Phosphate, die gesamt-Phosphate und die im Schwebstoff oder Sediment gebundenen ungelösten Phosphate. Während in Quellwässern, quellnahen Bächen und auch im Regenwasser das ortho-Phosphat gegenüber den anderen Formen nur zu einem geringen Anteil auftritt, dominiert es in abwasserbelasteten Fließgewässern. So kann es auch als Indikator für Abwassereinleitungen angesehen werden. Während die ortho- Phosphatbelastung der Mosel bei Koblenz 1961 noch 0,1-0,2 mg/l (entspricht etwa 1-2 µmol/l) betrug, zeigte sich 1975 eine Belastung von bis zu 2 mg/l (entspricht etwa 20 µmol/l) (Hellmann, Analytik von Oberflächengewässern, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1986).

Da Phosphate einen wesentlichen Anteil an der Eutrophierung der Gewässer haben, ist eine ständige Überwachung des Phosphatgehaltes und des Phosphateintrages unerläßlich. Eine einfache, empfindliche und zugleich kostengünstige Phosphatbestimmung wäre in Form eines Biosensors oder Teststreifens möglich.

Potentielle Einsatzgebiete wären vor allem die kontinuierliche Gewässerüberwachung, die Steuerung biologischer Kläranlagen und die Vor-Ort-Analytik.

In der Routineanalytik wird Phosphat häufig mittels der sogenannten Molybdänblau-Methode bestimmt, wobei die Phosphationen mit einem Molybdat versetzt werden. Der resultierende Molybdatkomplex wird darauffolgend zu Phosphormolybdänblau reduziert und kann photometrisch bestimmt werden (Martland und Robinson, Biochem. J. 20, 848, 1926; Harwood et al., Water Res. 3, 417, 1969).

Bei klinischen Phosphatanalysen ist ein enzymatisches Verfahren von Bedeutung: Glycogen wird durch die Phosphorylase a phosphoryliert. Das gebildete Glucose-1-phosphat wird mittels Phosphoglucomutase in Glucose-6-phosphat umgewandelt, das daraufhin durch die NAD-abhängige Glucose-6-phosphat-dehydrogenase umgesetzt wird. Das entstehende NADH wird spektrophotometrisch gemessen und ist propotional zum Phosphatgehalt der zu messenden Probe (Gawehn, in "Methods of Enzymatic Analysis" (Bergmeyer ed), Vol 7, 552, VCH Weinheim, 1985).

Beide Verfahren sind aufgrund ihrer umfangreichen Prozeduren vor allem für die Laboranalytik geeignet.

Ein anderes Verfahren, das vor allem in Biosensoren Anwendung findet, basiert auf einer Enzymaktivitätshemmung der alkalischen oder der sauren Phosphatase in Anwesenheit von anorganischem Phosphat.

So fixieren Guilbault und Nanjo (Anal. Chim. Acta 78, 69, 1975) alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase vor einer amperometrischen Redoxelektrode. Nach Zugabe von Glucose-6- phosphat wird die durch die Phosphatasereaktion freigesetzte Glucose durch Glucoseoxidase unter O₂-Verbrauch umgesetzt. Die Abnahme von O₂ wird amperometrisch bei einem Potential von -0,6 V an der Redoxelelektrode gemessen. In Anwesenheit von Phosphat verringert sich proportional zur Konzentration die Phosphataseaktivität und damit der O₂-Verbrauch, was zu einer Verminderung des Meßsignals führt.

Das gleiche Meßprinzip verwenden Schubert et al. (DD 83-255472, 1983; Anal. Chem. 56 1677, 1984). Anstatt der alkalischen Phoshatase wird jedoch hier ein Kartoffelknollengewebeschnitt eingesetzt, der saure Phosphatase enthält. Die untere Nachweisgrenze für Phosphat beträgt 25 µM.

Ein Nachteil dieses Prinzips besteht darin, daß der Biosensor so konzipiert sein muß, daß eine geringe Änderung der Enzymaktivität ein großes Signal hervorruft. Änderungen der Enzymaktivität, die nicht durch Phosphat hervorgerufen werden, beeinträchtigen somit erheblich die Reproduzierbarkeit des Messignals und die Stabilität des Sensors.

Ein enzymatisches Verfahren zur Bestimmung von Phosphat, bei dem der Analyt nicht die Enzymaktivität ändert, sondern direkt als Enzymsubstrat dient, beruht auf der Kopplung von Nucleosidphosphorylase und Xanthinoxidase. In Anwesenheit von Phosphat wird das im Überschuß vorliegende Nucleosid (Inosin) durch die Nucleosidphosphorylase zu Ribose-1- phosphat und freier Base (Hypoxanthin) umgesetzt. Die proportional zur Phosphatkonzentration gebildete freie Base (Hypoxanthin) wird durch Xanthinoxidase unter Sauerstoffverbrauch zu Harnsäure und Wasserstoffperoxid oxidiert. Beide Reaktionsprodukte sind elektrochemisch aktiv und liefern an amperometrischen Redoxelektroden bei entsprechender Polarisationsspannung ein phosphatproportionales Stromsignal (de Groot, EP 147867, 1984; de Groot, EP 159513, 1985; Harada und Osawa, JP 60151551, 1985). Durch das zusätzliche Einbringen von alkalischer Phosphatase in das Enzymsystem wird Phosphat aus Ribose-1-phosphat freigesetzt und erneut durch die Nucleosidphosphorylase umgesetzt, was zu einer Signalverstärkung führt (Wollenberger et al., Biosensors 92 Proceedings, 173, 1992).

Der größte Nachteil der beschriebenen Konfiguration ist die unzureichende Stabilität der verwendeten Enzyme und damit die Langzeitstabilität des Biosensors (Haemmerli et al. Anal. Biochem. 191, 106, 1990).

In einer Patentschrift von Pierre et al. (US 657976, 1976) wird eine enzymatische Bestimmungsmethode für anorganisches Phosphat beschrieben, bei der Phosphat in Gegenwart von Maltose durch das Enzym Maltosephosphorylase zu β-D-Glucose-1- phosphat umgesetzt wird, das wiederum durch β-D-Phoshoglucomutase in Glucose-6- phosphat überführt und mittels NAD-abhängiger Glucose-6-phosphat-dehydrogenase zu 6- Phosphogluconat oxidiert wird. Die einhergehende Reduktion des Cofaktors zu NADH ist proportional zur Phosphatkonzentration und wird spektrophotometrisch gemessen.

In einer Patentschrift von Katayama und Kanejima (Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 63, 146, 800; 1988) wird anorganisches Phosphat mit Sucrose durch das Enzym Sucrosephosphorylase zu D-Fructose und α-D-Glucose-1-phosphat umgesetzt. Durch das Enzym Mannitoldehydrogenase wird die entstehende D-Fructose unter NADH-Verbrauch zu D- Mannitol und NAD⁺ umgesetzt. Die NADH-Abnahme wird spektrophotometrisch durch Absorptionsmessung (λ = 340 nm) erfaßt und ist direkt proportional zur Phosphat­ konzentration in der Probe.

Schließlich ist bekannt, daß das Enzym Pyruvatoxidase neben Thiaminpyrophosphat und FAD anorganisches Phosphat zur Oxidation von Pyruvat benötigt. Dabei wird Sauerstoff verbraucht und es entsteht Wasserstoffperoxid. Bei Überschuß an Thiaminpyrophosphat, FAD und Pyruvat wird die Reaktion durch die Phosphatkonzentration bestimmt. Verfolgt wird die Reaktion entweder durch amperometrische Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs (Kubo et al., Anal. Lett. 24, 1711, 1991) oder durch amperometrische Bestimmung der Wasserstoffperoxidbildung (Ngo, Appl. Biochem. Biotechnol. 13, 127, 1986).

Wesentlichstes Problem dieser Methode ist die mangelnde Stabilität der Pyruvatoxidase.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Schaffung eines empfindlichen, stabilen und wirtschaftlichen Verfahrens zur Bestimmung von anorganischem Phoshat, das sich besonders gut in Form eines Biosensors realisieren läßt.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabenstellung wird dadurch gelöst, daß ein neuartiges signalverstärkendes Enzymsystem, bestehend aus einer Disaccharidphosphorylase, einer Phosphatase und einer Glucose-Oxidoreduktase, verwendet wird. Diese Enzymsequenz generiert aus einem Molekül Phosphat zwei Moleküle Glucose, wobei das Phosphatmolekül danach wieder in freier Form vorliegt, so daß es erneut die Enzymsequenz durchlaufen kann. Durch diese Kombination wird im Vergleich zu bekannten Verfahren eine Signalverstärkung erreicht, die mindestens zu einer doppelten Empfindlichkeit führt. Die Bestimmung der Glucose in der Enzymsequenz erfolgt dann relativ einfach über die Oxidoreduktasereaktion.

Als geeignet für eine derartige Enzymsequenz erweist sich die Verwendung von Maltosephosphorylase bzw. Trehalosephosphorylase als Disaccharidphosphorylase in Kombination mit alkalischer oder saurer Phosphatase, D-Glucose-1-phosphatase oder Zuckerphosphatase als Phosphatase. In Anwesenheit von anorganischem Phosphat wird proportional zu dessen Konzentration das im Überschuß vorliegende Disaccharid durch die Disaccharidphosphorylase zu D-Glucose-1-phosphat und D-Glucose umgesetzt. Die Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom D-Glucose-1-phosphat ab, so daß ein weiteres Molekül D-Glucose entsteht und das abgespaltene Phosphatmolekül erneut durch die Disaccharidphosphorylase umgesetzt werden kann. Die in großen Mengen gebildete D- Glucose wird dann durch die Glucose-Oxidoreduktase oxidiert. Dieser Schritt dient als eigentliche Indikationsreaktion und führt zu optisch- oder elektrochemisch- erfaßbaren Produkten (ig. 1: 1a-1c).

Eine zweite geeignete Enzymsequenz, die eine einfache chemische Signalverstärkung enthält, basiert auf der Kombination von Cellobiosephosphorylase, Maltosesynthase und einer Glucose-Oxidoreduktase. In Anwesenheit von anorganischem Phosphat wird proportional zu dessen Konzentration die im Überschuß vorliegende Cellobiose durch die Cellobiosephosphorylase zu α-D-Glucose-1-phosphat und D-Glucose umgesetzt. Maltosesynthase bildet daraufhin aus zwei Molekülen α-D-Glucose-1-phosphat ein Molekül Maltose und zwei Moleküle Phosphat, die wiederum durch die Cellobiosephosphorylase umgesetzt werden und somit zu einer hohen Glucosebildung führen. Die auf diese Weise gebildete D-Glucose wird wie bei der erfindungsmäßig zuerst beschriebenen Methode durch eine Glucose-Oxidoreduktase oxidiert. Dieser Schritt dient als eigentliche Indikationsreaktion und führt zu optisch- oder elektrochemisch- erfaßbaren Produkten (ig. 1: 2a-2c).

Als Glucose-Oxidoreduktase wird Glucoseoxidase, NAD(P)-abhängige Glucosedehydrogenase oder PQQ-haltige Glucosedehydrogenase eingesetzt.

Amperometrisch wird der Umsatz der Glucose bei Verwendung von Glucoseoxidase über den mit der Enzymreaktion einhergehenden Sauerstoffverbrauch oder über die Wasserstoffperoxidbildung direkt an der Elektrode bei einem Potential von -0,6 V bzw. +0,6 V verfolgt.

Bei Verwendung von mediatormodifizierten Redjoxelektroden erfolgt die amperometrische Indikation bei Verwendung von Glucoseoxidase über eine mediatorvermittelte Oxidation der reduzierten prosthetischen Gruppe (FADH₂), bei Verwendung der Glucosedehydrogenase entweder über die Oxidation der reduzierten prosthetischen Gruppe (PQQH₂) oder über den reduzierten Cofaktor (NAD(P)H.

Die Reduktions- bzw. Oxidationsströme, die bei der elektrochemischen Indikation auftreten sind proportional zur Glucosekonzentration und damit auch proportional zur Phosphatkonzentration.

Spektralphotometrisch wird der Umsatz von Glucose bei Verwendung von Glucoseoxidase über eine Mediator- oder Peroxidase-gekoppelte Farbreaktion verfolgt, bei Verwendung der Glucosedehydrogenase über die Fluoreszenz oder Absorption des NAD(P)H. Die auftretenden Absorptionsänderungen sind proportional zur Glucosekonzentration und damit auch proportional zur Phosphatkonzentration.

Neben dem neuartigen Prinzip der Signalverstärkung durch die erfindungsgemäßen Enzymsequenzen, weisen die Enzyme gegenüber bisher beschriebenen vergleichsweise gute Stabilitäten und spezifische Aktivitäten auf. Ein weiterer Vorteil basiert auf der Verwendung von Glucose-Oxidoreduktasen in der Indikationsreaktion. Sie sind in Biosensorkonfiguration umfassend charakterisiert und von den Eigenschaften her am besten für eine Sensorkopplung geeignet.

Zur Funktion der enzymatischen Reaktionsschritte ist als zusätzliches Reagenz lediglich eines der genannten Disaccharide erforderlich, das neben einer einfachen Handhabung umweltverträglich und sehr kostengünstig ist.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele erläutert, die verwendet werden können, um Phosphat in Versuchsproben zu bestimmen.

Beispiel 1 (Phosphatmessung mit einem Biosensor)

Es wurde eine Enzymschicht durch Immobilisierung in Gelatine hergestellt. Pro cm² wurden dabei 10 U Maltosephosphorylase, 10 U saure Phosphatase und 5 U Glucoseoxidase coimmobilisiert. Die Enzymmembran wurde zwischen zwei Dialysemembranen (MWCO 15 000) vor einer amperometrischen Elektrode fixiert, die zur Wasserstoffperoxiddetektion auf +0,6 V polarisiert wurde.

Der schematische Aufbau ergibt sich wie in Fig. 2 dargestellt.

Der so präparierte Biosensor tauchte in eine gerührte Meßzelle. Die Phosphatbestimmung erfolgte in der Form, daß zuerst in die Meßzelle 2 ml einer 50 mM Maltoselösung in 50 mM Citratpuffer pH 5.0 pipettiert wurde. Danach wurden unterschiedliche Konzentrationen Natriumdihydrogenphosphat zu der Meßlösung pipettiert und eine Strom-Zeit-Kurve aufgenommen. Fig. 3 zeigt eine nach diesem Verfahren erhaltene Kalibrationskurve.

Beispiel 2 (Phosphatbestimmung mit einem Teststreifen)

Mehrere PVC-Streifen mit am Ende fixierten quadratischen bindungsaktiven Nylonmembranen wurden in eine 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,2) getaucht, in der sich das Enzym Maltosephosphorylase zu 2 mg/ml befand. Nach 5 min wurden die Teststreifen ausgiebig mit Phosphatpuffer gewaschen und in Phosphatpufferlösung getaucht, die 0,5 mg/ml saure Phosphatase, 1 mg/ml Glucoseoxidase und 0,2 mg/ml Peroxidase enthielt. Nach ausgiebigem Waschen mit Phosphatpuffer und 0,5 M Acetatpuffer (pH 5.0) standen die Teststreifen zur Phosphatbestimmung zur Verfügung. Proben mit 1 µM-100 µM Natriumdihydrogenphosphat (in bidest.) und eine Probe ohne Phosphat wurden mit einer Lösung aus 100 mM Maltose, 10 mM 4-Chlor-1-naphthol (in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5.0) in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt. In jede Lösung wurde ein Teststreifen getaucht und nach 5 min die Farbentwicklung verglichen. In dem Bereich zwischen 10 µM und 100 µM Phosphat zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen der Phosphatkonzentration und der Farbentwicklung.

Claims (6)

1. Verfahren zur Bestimmung und zum Nachweis von anorganischem Phosphat in einer wäßrigen Probe oder zur Indikation phosphatfreisetzender Reaktionen, wobei ein signalverstärkendes Enzymsystem bestehend aus einer Phosphorylase, einer Phosphatase oder Maltosesynthase (EC 2.4.1.139), und einer Oxidoreduktase verwendet wird und als Rezeptorsystem für Biosensoren und Teststreifen geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymsystem aus einer Disaccharidphosphorylase, einer Phosphatase oder Maltosesynthase (EC 2.4.1.139) und einer Glucose- Oxidoreduktase besteht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Disaccharid­ phosphorylase Maltosephosphorylase (EC 2.4.1.8), Trehalosephosphorylase (EC 2.4.1.64) oder Cellobiosephosphorylase (EC 2.4.1.20) verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphatase alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1), saure Phosphatase (EC 3.1.3.2), Zuckerphosphatase (EC 3.1.3.23) oder Glucose-1-phosphatase (EC 3.1.3.10) verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Glucose-Oxidoreduktase Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) oder eine Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.118, EC 1.1.1.119, EC 1.1.99.10, EC 1.1.99.17) verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eigentliche Indikationsreaktion der Oxidoreduktase-katalysierten Glucoseoxidation amperometrisch über eine Wasserstoffperoxidoxidation oder eine mediator- oder enzymgekoppelte elektrokatalytische Oxidation eines Cofaktors (NAD(P)H, PQQH₂, FADH), spektralphotometrisch über die Messung der Absorption oder Fluoreszenz eines enzymatischen Cofaktors oder photometrisch über eine mediator- oder Peroxidase­ gekoppelte Farbreaktion verfolgt/erfaßt und/oder ausgewertet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anorganische Phosphat­ bestimmung oder Indikation nach folgenden enzymatischen Reaktionsschritten erfolgt: