DE60118797T2

DE60118797T2 - Verfahren zur detektion und messung der biomasse

Info

Publication number: DE60118797T2
Application number: DE60118797T
Authority: DE
Inventors: Roger Steward Chittock; Paul Kau; Ian David Watkins; Alan Michael Davies
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-09-13
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2021-09-12
Also published as: EP1370680B1; ATE323174T1; WO2002022854A3; US20040096927A1; WO2002022854A2; DE60118797D1; JP2004508833A; AU2002223536A1; EP1370680A2

Description

Diese Erfindung betrifft den Nachweis und die Messung von Biomasse auf Basis von Verfahren zum enzymatischen Assay von Nicotinamidadenindinukleotid-Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Untersuchung der Spiegel von biologischem Material ("Biomasse") in Proben ist bei einem breiten Spektrum von Anwendungen wertvoll. Bei einigen Anwendungen erfolgt die Untersuchung, um Verfahren zu überwachen, zum Beispiel um die Spiegel an Mikroorganismen bei Fermentationsverfahren oder anderen mikrobiologischen Kulturen zu bestimmen. Bei anderen Anwendungen liefert die Messung von Biomasse einen indirekten Hinweis auf den Umwelthygienestatus und die Sauberkeit. Dies ist besonders relevant, wenn beispielsweise die Sauberkeit von Bereichen, die zur Nahrungsmittelzubereitung und -aufbewahrung verwendet werden, und ferner die Sauberkeit von Bereichen in Klinikumgebungen überprüft wird. Bei anderen Anwendungen kann die Messung von Biomasse zum direkten Nachweis und zur direkten Messung des Vorliegens unerwünschter Mikroorganismen oder anderer biologischer Materialien in Proben verwendet werden, von denen erwartet wird, dass sie frei von solchen Kontaminanten sind, zum Beispiel Petrochemikalien, Schmieröle, Nahrungsmittel, Industrieverfahrenswasser und andere Wasserversorgungen und -quellen.
Eine Vielzahl von Techniken zum Nachweis und zur Messung von Biomasse ist verfügbar. Man hat Biomasse aus dem Volumenanteil einer zwischen Cytoplasmamembranen eingeschlossenen Lösung abgeschätzt, wobei sie aus Dielektrizitäts- oder Kapazitätseigenschaften zum Beispiel unter Verwendung eines Potentiostats berechnet wurde ( GB 2 298 046 ).
Ein zweites Verfahren misst den Sauerstoffverbrauch einer Lösung unter Verwendung einer geeigneten Elektrode ( GB 2 280 431 ). Biomasse kann auch direkt aus den optischen ( US 4 893 935 ) oder den Sedimentationseigenschaften ( DE 38 19 540 ) einer Suspension von Mikroorganismen bestimmt werden. All diese Verfahren können nur bei Anwendungen eingesetzt werden, bei denen der Spiegel an Biomasse hoch ist, zum Beispiel der Analyse industrieller und städtischer Abwässer, weil sie relativ unempfindlich sind. Diese Verfahren hängen zudem von teuren Instrumenten ab.
Das Wachstum von Bakterien-, Hefe- und Säugerzellen, die in Fermentern und Bioreaktoren wachsen, hat man aus der direkten Fluoreszenz von Kulturen bestimmt, von der mehr als die Hälfte von intrazellulärem NADH und NADPH stammt (Zabriskie, D. W. und Humphrey, A. E. "Estimation of Fermentation Biomass Concentration by Measuring Culture Fluorescence" (1978) Applied and Environmental Microbiology 35, 337–343). Das Verfahren ist relativ unempfindlich und nur für Anwendungen geeignet, bei denen die Anzahl lebender Zellen extrem hoch ist. Weil NAD(P)H, aber nicht NAD(P), ein Fluoreszenzsignal erzeugt, ist das Verfahren anfällig für Artefakte aufgrund von Schwankungen im intrazellulären NAD(P): NAD(P)H-Verhältnis, wenn sich der Stoffwechselzustand der Zellen ändert. Eine Quantifizierung von Zellzahlen kann ebenfalls durch interne Screeningeffekte, Veränderungen in der Mediumzusammensetzung (insbesondere im H) und fluoreszierende Verbindungen im extrazellulären Medium behindert werden.
Eine weitere zum Nachweis und zur Messung von Biomasse verfügbare Technik ist die Messung der Produktion von Licht durch eine enzymatische Reaktion unter Verwendung von ATP als ein Substrat, weil dieses Molekül eine ubiquitäre Komponente ist, die in biologischen Materialien zellulären Ursprungs vorliegt (Hawronskyj, J. M. und Holah, J. "ATP: A universal hygiene monitor" (1997) Trends in Food Science and Technology 8, 79–84). ATP erzeugt Licht, das durch einen geeigneten Photodetektor mess bar ist, in Gegenwart von Leuchtkäfer-Luciferase (EC 1.13.12.7) und geeigneter Substrate. Alternativ kann das zelluläre Enzym Adenylatkinase zum Nachweis und zur Messung von Biomasse unter Verwendung von Leuchtkäfer-Luciferase zur Messung seiner ATP-Produktion bei Zugabe von ADP zur Probe verwendet werden (Squirrell, D. J. und Murphy, M. J. "Adenylate kinase as a cell marker in bioluminescent assays" (1994) in "Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects" Hrsg. Campbell, A. K., Kricka, L. J. und Stanley, P. E., Verlag Wiley and Sons, Chichester, GB.).
Verfahren, die die Lumineszenzmessung von ATP beinhalten, können quantitative Ergebnisse innerhalb von Minuten erzeugen. Dies stellt einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Verfahren dar, die mikrobiologische Zählung beinhalten, wie mikrobiologische Plattenzählung, die nur Mikroorganismen zählt und Tage zur Bereitstellung eines Ergebnisses benötigt, weil dies für viele Anwendungen zu langsam ist. Plattenzählverfahren messen ferner Populationen lebensfähiger Mikroorganismen selektiv je nach den gewählten Kulturbedingungen und -verfahren. Jedoch erfordern Verfahren, die die Lumineszenzmessung von ATP beinhalten, obwohl sie relative empfindlich sind, teure Instrumente und Reagenzien. Insbesondere kann das Lumineszenzergebnis dieser Verfahren nicht visuell überprüft werden.
Alternativ sind Testverfahren zur Messung von Biomasse vorstellbar, bei denen die Ergebnisse visuell überprüft werden können und die daher keine Verwendung eines Instruments erfordern. Ein Testverfahren, das kein Instrument benötigt, stellt, insbesondere für den seltenen Benutzer, eine potenzielle Verbesserung im Hinblick auf die Kostengünstigkeit gegenüber Lumineszenzverfahren dar. Zusätzlich hätte ein solches Verfahren die Vorteile einer leichten Interpretation und niedrigerer Anforderungen an Ausbildung und Wartung.
Es wurden Reagenzien beschrieben, die eine chemische Reaktion ergeben, die zur einer Farbänderung in Gegenwart von Analyten, wie Protein, Stärke oder Lipid, führen. Die diesen Reaktionen zugrunde liegende Chemie ist relativ einfach und bequem anzuwenden. Obwohl diese Färbungsreaktionen eine gewisse Anwendung bei der Untersuchung biologischer Materialien finden, die beispielsweise aus Nahrungsmitteln stammen, sind sie besonders unempfindlich und insbesondere für Biomassebestimmungen unter Umständen ungeeignet, bei denen Mikroorganismen in signifikanten Spiegeln innerhalb der Proben vorliegen, weil die Färbungen mit Mikroorganismen nicht leicht reagieren.
Eine weitere Technik verwendet die Dehydrogenase-Aktivität von Mikroorganismen zum Nachweis der in einer Probe vorhandenen Biomasse ( GB 1 603 183 ). Proben aus einem Bioreaktor oder Abwasserproben werden unter anaeroben Bedingungen 15 bis 20 Minuten mit einem Redox-Indikator, wie einem farblosen Tetrazoliumsalz, inkubiert. Dieser Indikator wird durch die verschiedenen, in den Mikroorganismen vorhandenen Dehydrogenase-Enzyme in ein unlösliches gefärbtes Formazanprodukt umgewandelt. Am Ende der Inkubation wird sämtliche Enzymaktivität gestoppt, das Formazanprodukt extrahiert und kolorimetrisch gemessen, um eine Abschätzung der Biomasse in der Probe zu erhalten. Dieses Verfahren beinhaltet keine Amplifizierung oder Rückgewinnung der relevanten Substrate und ist daher relativ unempfindlich, langwierig und unangenehm und speziell auf die Überwachung von Fermentation oder den Gehalt von Industrieabwasser zugeschnitten, in denen die Biomasse vergleichsweise hoch ist.
Verknüpfte Mehr-Enzym-Assays wurden beschrieben, die eine sichtbare Farbänderung (WO 94/25619) oder ein afluorometrisches Signal (Hansen, E. H., Gundstrup, M. und Mikkelsen, H. S. "Determination of minute amounts of ATP by flow injection analysis using enzyme amplification reactions and fluorescence detection." (1993) Journal of Biotechnology 31, 369–380) aus sub-nanomolaren ATP-Konzentrationen erzeugen. Es kommt zu Schwierigkeiten, weil diese Assays Wege beinhalten, die zwei Schritte erfordern, die beide mindestens zwei Enzymkomponenten enthalten.
Eine Verbesserung gegenüber bestehenden kolorimetrischen Bestimmungen von Biomasse würde einen signifikanten Nutzen erbringen, wenn sie eine zuverlässige Bestimmung einer in biologischem Material ubiquitären Verbindung erbrächte, wobei sie eine gute Leistung in der Breitenspektrumempfindlichkeit mit der Verwendung eines breiten Spektrums an einfachen und robusten Formulierungen, leichter Herstellung und Anpassungsfähigkeit an ein breites Spektrum von Formaten kombinierte.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Biomasse in einer Probe auf Basis des Nachweises des gesamten Pools von NAD(P) und NAD(P)H, dadurch gekennzeichnet, dass der gesamte Pool von NAD(P) und NAD(P)H als Marker für das Vorliegen von Biomasse gemessen wird, indem NAD(P) in der Probe durch Zugabe eines Enzyms E1 und eines Substrats S1 für das Enzym enzymatisch in NAD(P)H umgewandelt wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Vorliegen von Biomasse nicht nur nachgewiesen, sondern auch der Spiegel der Biomasse gemessen.
Vorzugsweise ist das Enzym E1 eine Dehydrogenase.
Bei einer Ausführungsform erfolgt der Nachweis der reduzierten Form der Nicotinamidadenindinukleotide fluorimetrisch.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der Nachweis oder die Messung durch Zugabe eines zweiten Enzyms E2 und eines zweiten Substrats S2, wodurch die folgende Umsetzung stattfindet:
und die Umwandlung von S2 in P2 ein Signal erzeugt, das eine Veränderung im Absorptionsspektrum ist, einschließlich einer Farbänderung, einer Fluoreszenzänderung, einer Lumineszenzreaktion oder einer elektrochemischen Reaktion, die zu einer Änderung im Potenzial oder im Strom an einer Elektrodenoberfläche führt. Vorzugsweise ist das Signal eine Farbänderung, die visuell nachgewiesen werden kann.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Umwandlung von NAD(P)H in NAD(P) alternativ direkt an der Oberfläche einer geeignete Elektrode erfolgen, um eine Änderung im Potenzial oder im Strom an der Elektrodenoberfläche zu erzeugen, ohne dass ein zweites Enzym E2 oder ein zweites Substrat S2 benötigt wird.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Substrate S1 und S2 im Überschuss zur Probe gegeben. So wird ein zyklisches Nachweissystem hergestellt, das die Empfindlichkeit der Messung verstärkt. Dies ist besonders zur Untersuchung des Hygienestatus einer Probe geeignet.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist E1 Lactatdehydrogenase, E2 Diaphorase, S1 Lithiumlactat und S2 Nitro-Blau-Tetrazolium.
Bei einer stark bevorzugten Ausführungsform ist E1 Glucosedehydrogenase, E2 Diaphorase, S1 Glucose und S2 Nitro-Blau-Tetrazolium.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe bei einer Temperatur zwischen 25 und 45°C, vorzugsweise bei 35 bis 45°C, erwärmt, so dass die Reaktionsrate erhöht und die Nachweisdauer minimiert wird.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden vor dem Nachweisen oder Messen der Menge an Biomasse ein Detergenz und gegebenenfalls anschließend ein Neutralisationsmittel zur Probe gegeben. Es ist sogar möglich, eine Bestimmung ohne Anwendung eines Detergenzes und eine mit Anwendung eines Detergenzes durchzuführen. Dies gibt die Möglichkeit, zwischen extra- und intrazellulären Nicotinamidadenindinukleotid-Pools zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des oben genannten Verfahrens zur Untersuchung des Mikrobengehalts oder des Hygienestatus einer Probe.
Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 und 2 sind mehr oder weniger allgemeine Schemata enzymatischer Reaktionen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
3 ist ein Vergleich von in Nahrungsresten vorliegenden Nicotinamidadenindinukleotid-Verbindungen, die durch die vorliegende Erfindung gemessen werden, sowie von in den gleichen Nahrungsmittelresten vorhandenem ATP, das mit dem HY-LiTE^®-Hygieneüberwachungssystem gemessen wird.
4 ist ein Beispiel für die vorliegende Erfindung, die zur Überwachung des Wachstums einer Bakterienkultur eingesetzt wird.
5 ist eine veranschaulichende schematische Ansicht eines längsgeströmten Teststreifens für die erfindungsgemäße Verwendung.
In Figuren, Tabellen und andernorts verwendete Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

ADP: Adenosin-5'-diphosphat
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
BSA: Rinderserumalbumin
DTAB: Dodecyltrimethylammoniumbromid
EDTA: Ethylenediamintetraacetat
G6P: Glucose-6-phosphat
G6PDH: Glucose-6-phosphatdehydrogenase
INT: Iodnitrotetrazolium-Violett
NAD: Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte Form)
NAD(P): Nicotinamidadenindinukleotid und Nicotinamidadeninphosphat (oxidierte Form)
NAD(P)H: Nicotinamidadenindinukleotid und Nicotinamidadeninphosphat (reduzierte Form)
NADH: Nicotinamidadenindinukleotid (reduzierte Form)
NADP: Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (oxidierte Form)
NADPH: Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (reduzierte Form)
NBT: Nitro-Blau-Tetrazolium
TVC: insgesamt lebensfähige Kolonien (total viable colonies)

Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay von Nicotinamidadenindinukleotiden, wie NAD, NADH, NADP und NADPH, zum Nachweis und zur Messung von Biomasse. Diese Verbindungen findet man als Komponenten von Zellen und frei in der Umgebung.
Die Messung von NAD(P)H allein zum Nachweis von Biomasse ist aufgrund des sich verändernden NAD(P)/NAD(P)H-Verhältnisses anfällig für Artefakte. Es wurde gefunden, dass diese Probleme gelöst werden können, indem das gesamte NAD(P) in der Probe in NAD(P)H umgewandelt und anschließend NAD(P)H als Marker für den gesamten Pool an NAD(P) und NAD(P)H in der Probe nachgewiesen wird, was ein einfaches und empfindliches Verfahren zum Nachweis von Biomasse liefert.
Ein Vorteil in Verbindung mit der Erfindung ist, dass Nicotinamidadenindinukleotide durch kolorimetrische Enzymassays unter Verwendung von Formulierungen, die viel einfacher sind als die für kolorimetrische Enzymassays von Markern, wie ATP und ADP, benötigten, leicht nachgewiesen und gemessen werden können. Ein sehr breites Spektrum von Enzymen und Substraten kann eingesetzt werden. Als zusätzlicher Vorteil kann die Messung dieser Verbindung erfolgreich auf die Bestimmung von Biomasse in Proben angewendet werden, die signifikante Spiegel an Mikroorganismen enthalten, und somit sind diese Messungen für solche Anwendungen besser geeignet als chemische Färbungen zur Bestimmung von Protein, Lipid oder Stärke.
Als weiterer Vorteil können Nicotinamidadenindinukleotide im Gegensatz zu derzeitigen Biomassemarkern, wie ATP, auch leicht durch elektrochemische und direkte spektroskopische Assays gemessen werden.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie im Reaktionsschema I gezeigt, zufolge werden Nicotinamidadenindinukleotide in der oxidierten Form, zum Beispiel NAD und NADP, die in einer Probe vorliegen, durch ein geeignetes Enzym (E1) mit seinem zweiten Substrat (S1) in Nicotinamidadenindinukleotide in der reduzierten Form, zum Beispiel NADH und NADPH, umgewandelt.
Ein geeignetes Enzym E1 ist jedes Enzym, das NAD(P) in NAD(P)H umwandelt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist dieses Enzym eine Dehydrogenase, zum Beispiel Glucose-6-phosphatdehydrogenase. In der Probe vorliegendes NADH und NADPH wird ebenfalls durch diesen Assay nachgewiesen. Dies liefert einen signifikanten Nutzen verglichen mit Assays, wie der UV-Fluoreszenz von Bakterien- und Zellkulturen, bei denen nur die reduzierte Form gemessen wird, weil das Verhältnis von oxidierten:reduzierten Nicotinamidverbindungen sich je nach dem Stoffwechselzustand der Zelle ändert. Die vorliegende Erfindung unterliegt diesem potenziellen Problem nicht, weil sowohl die oxidierten als auch die reduzierten Formen ((x+y) NAD(P)H nach Schema I) nachgewiesen werden können.
Der Nachweis kann direkt durch Messung der Fluoreszenz des NAD(P)H in der Probe oder indirekt durch Erzeugen eines nachweisbaren Signals P2 unter Verwendung einer zusätzlichen enzymatischen oder chemischen Reaktion, wie z.B. im Reaktionsschema II dargestellt, erfolgen:
Das Signal aus diesen Reaktionen kann eine Änderung der Farbe, anderer Spektraleigenschaften, der Fluoreszenzeigenschaften, der Lumineszenz oder des elektrochemischen Potenzials sein. Messungen von Signalen, die durch die Bestimmung von Nicotinamidadenindinukleotiden erzeugt werden, können jeweils unter Verwendung eines Reflektometers oder Spektrometers bei einem Farbsignal, je nachdem, ob das gefärbte Produkt in löslicher oder unlöslicher Form vorliegt, eines Fluorimeters bei einem Fluoreszenzsignal, eines Luminometers bei einem Lumineszenzsignal oder eines Potenziometers bei einem elektrochemischen Potenzial oder einem amperometrischen Signal erfolgen.
Zur Verbesserung der Empfindlichkeit werden bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung NAD(P) und NAD(P)H, die in der Probe vorliegen, rückgewonnen.
Wie aus Schema II ersichtlich, werden im Hinblick auf eine chemische oder enzymatische Nachweiseinrichtung NADH und NADPH durch Reaktion mit einem geeigneten Donormolekül S2 entweder direkt, über einen geeigneten chemischen Vermittler oder über eine enzymkatalysierte Reaktion wieder in NAD oder NADP umgewandelt. Reduktion dieses Donors, des zweiten Produkts der Dehydrogenase oder der reduzierten Form des erzeugten Nicotinamidadenindinukleotids führt zu einem Signal P2, das als Indikator für das Vorliegen von Biomasse verwendet wird.
Das bei dieser Reaktion erzeugte NAD(P) wird dann wiederum unter Verwendung des gleichen Enzyms E1, das ursprünglich zur Umwandlung des in der Probe vorhandenen NAD(P) in NAD(P)H verwendet wurde, wieder in NAD(P)H überführt. Infolgedessen wird ein einfaches zyklisches System erzeugt, das die Empfindlichkeit des Assays verbessert und besonders zum Nachweis kleiner Mengen an Biomasse geeignet ist. Damit dieses zyklische System gut arbeitet, ist es notwendig, einen Überschuss der Enzymsubstrate S1 und S2 bereitzustellen.
Ein Schema für ein zyklisches System, das zwischen der oxidierten und der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid oszillieren kann, ist in 1 dargestellt. Durch Einwirkung des Enzyms E1 wird NAD oder NADP bei entsprechender Oxidation des zweiten Substrates S1 des Enzyms, das im Überschuss vorhanden ist, in NADH oder NADPH umgewandelt. Das gebildete NAD(P)H wird mit entsprechender Reduktion eines geeigneten Donormoleküls S2, das im Überschuss vorhanden ist, wieder in NAD(P) überführt. Der Nachweis von in der ursprünglichen Probe vorhandenem NAD(P) und NAD(P)H kann anhand von Veränderungen in den Eigenschaften dieses Donormoleküls, wenn es reduziert ist, oder von Veränderungen im Substrat S1, wenn es oxidiert ist, erfolgen. Dies kann eine Änderung im Absorptionsspektrum sein, einschließlich einer Farbänderung, einer Fluoreszenzänderung, einer Lumineszenzreaktion oder einer elektrochemischen Reaktion, die zu einer Veränderung des Potenzials an einer Elektrodenoberfläche führt. Die Reaktion zwischen NADH und S2 kann direkt erfolgen oder durch ein chemisches Zwischenprodukt vermittelt werden oder durch ein Enzym E2 katalysiert werden.
Alternativ kann das NADH in einer Probe direkt durch eine elektrochemische Reaktion, die von einem geeigneten Enzym katalysiert wird, entweder mit einer Dehydrogenase oder einem anderen Enzym zur Rückgewinnung von NAD oder allein unter Verwendung eines geeigneten Detektors, um die notwendige Empfindlichkeit zu erreichen, nachgewiesen werden.
Ein spezifischeres Beispiel für die Erfindung ist in 2 dargestellt. Die Rückgewinnung wird durch zwei Enzyme erreicht, die mit einer für den Nachweis mit dem Auge geeigneten Farbänderung nach Reduktion des Donormoleküls verbunden sind. Das Enzym E1 ist Hefe-Glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC 1.1.1.49), die 6-Phosphoglucono-δ-lacton und NADPH aus D-Glucose-6-phosphat und NADP erzeugt. Enzym E2 ist Diaphorase (EC 1.8.1.4), die aus NADPH und einem Tetrazoliumsalz, zum Beispiel p-Iodnitrotetrazolium-Violett (INT), ein Formazanprodukt und NADP erzeugt. Das Fortschreiten der Reaktion, die das Vorliegen von NADP und NADPH in der ursprünglichen Probe anzeigt, wird durch die Farbänderung nach Produktion von Formazan überwacht, die mit dem Auge als rote Farbe oder spektralphotometrisch bei 500 nm verfolgt wird.
Viele Dehydrogenasen und die entsprechenden Substrate können anstelle von Glucose-6-phosphatdehydrogenase und D-Glucose-6-phosphat zur Reduktion von NAD(P) verwendet werden. Zum Beispiel Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus Leuconostoc mesenteroides (EC 1.1.1.49, die für NAD sowie NADP spezifisch ist), Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47), Lactatdehydrogenase (EC 1.1.1.27), Pyruvatdehydrogenase (EC 1.2.4.1), Malatdehydrogenase (EC 1.1.1.37), Aldehyddehydrogenase (EC 1.2.1.5) und Alkoholdehydrogenase (EC 1. 1. 1. 1).
In entsprechender Weise können viele andere Enzyme und ihre entsprechenden geeigneten Substrate anstelle von Diaphorase zur Oxidation von NAD(P)H und zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals verwendet werden.
Es ist zum Beispiel möglich, aus NADH unter Verwendung von Leber-Alkoholdehydrogenase und eines Nitrosamin-Substrats eine Farbe zu erzeugen, aber weil das Substrat toxisch ist, sollte es nicht zum Nachweis von Biomasse z.B. in Nahrungszubereitungs- oder klinischen Umgebungen verwendet werden.
Außerdem kann Diaphorase durch einen chemischen Vermittler, wie Meldola-Blau, ersetzt werden, das zuerst durch NADH reduziert und dann durch NBT unter Bildung des gefärbten Formazansalzes reoxidiert wird. NADH reagiert direkt mit NBT und bildet ein gefärbtes Formazan, aber diese Reaktion ist sehr langsam (~ Stunden). Weitere Verbindungen, die mit NAD(P)H unter Bildung einer Farbänderung reagieren können, sind DIP (Dichlorphenolindophenol), Methylenblau und Thionin.
Ein Lumineszenznachweis von NADH ist unter Verwendung des Enzyms bakterielle Luciferase möglich.
Zum spezifischen Nachweis von NADPH kann NADPH durch Glutathionoxidase unter Reduktion von Glutathion in NADP umgewandelt werden, das durch seine Reaktion mit DTNB (5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)) nachgewiesen werden kann.
Wenn NADH amperometrisch nachgewiesen wird, kann die Umwandlung von NAD(P)H in NAD(P) direkt an der Elektrodenoberfläche erfolgen, so dass kein zweites Enzym benötigt wird.
Geeignete Substrate, z.B. für die Reaktion mit Diaphorase, sind Tetrazoliumsalze, die ein gefärbtes Formazanprodukt ergeben. Beispiele sind NBT oder MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2-tetrazoliumbromid).
Die Enzymreaktionen können in jedem Standardpuffer durchgeführt werden, der mit den eingesetzten Enzymen kompatibel ist. Ein Beispiel für ein bevorzugtes Puffersystem sind ein Puffer, der aus 200 mM Tris, 50% Glycerin, 0,01% Proclin, 0,3% Tween 80, pH 8, besteht, und eine Substratformulierung, die aus 10 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 6, 0,01% Proclin und 2% (w/v) alpha-Cyclodextrin besteht.
Ein vorzeitige Farbreaktion kann verhindert werden, indem die Formulierung als Zwei-Reagenzien-Vormischungen hergestellt wird, die zum Einleiten der Reaktion mit Probe vermischt werden.
Die Messung von NADH und NADPH unter Verwendung einer hohen Konzentration einer gereinigten Dehydrogenase in der erfindungsgemäßen Assayformulierung liefert eine bessere Empfindlichkeit gegenüber kolorimetrischen Verfahren, die zum Beispiel auf dem Assay der endogenen Dehydrogenaseaktivität von Mikroorganismen durch Reduktion eines Redox-Indikators basieren ( GB 1 603 183 ).
Nicotinamidadenindinukleotide können als Marker für Biomasse unter Verwendung eines sehr großen Spektrums an Testformaten nachgewiesen und gemessen werden. Geeignete Testformate sind u.a. Mikrotitervertiefungen oder Teströhrchen sowie Tupfer, Teststreifen, Sensoren, Röhrchen und ferner Filter- und Membranoberflächen. Insbesondere kann die in flüssigen Proben vorhandene Biomasse vor dem Assay durch Filtration auf der Oberfläche geeigneter Membranen konzentriert werden.
Von Oberflächen können zum Beispiel Proben unter Verwendung eines Teststreifens genommen werden, der einen Kunststoffträger enthält, auf dem an einem Ende ein geeigneter Papierflecken befestigt ist, oder alternativ kann der Teststreifen durch einen herkömmlichen Tupfer, der einen Kunststoffschaft beinhaltet, um den an einem Ende ein Baumwoll- oder Synthetikmaterial fest gewunden ist, um einen Kopf herzustellen, oder alternativ eine ähnliche geeignete Probennahmevorrichtung ersetzt werden. Die Probennahmevorrichtung kann vor der Probennahme, wenn nötig, durch eine geeignete Benetzungslösung benetzt werden.
Als weiterer Aspekt innerhalb der vorliegenden Erfindung können Nicotinamidadenindinukleotide als Marker für Biomasse unter Verwendung von Verfahren nachgewiesen und gemessen werden, bei denen die Rate der Reaktionschemie durch Anwendung von Wärme erhöht wird. Weil bekannt ist, dass die Enzymaktivität proportional zur Temperatur ist und dass Enzyme durch Anwendung von Wärme zerstört werden, liegt die bevorzugte Temperatur für das erfindungsgemäße Verfahren zwischen 20 und 45°C. Ideale Temperaturen zur Verstärkung der Reaktion sind zwischen 25 und 45°C, vorzugsweise zwischen 35 und 45°C.
Als weiterer Aspekt innerhalb der vorliegenden Erfindung können Nicotinamidadenindinukleotide als Marker für Biomasse unter Verwendung von Verfahren nachgewiesen und gemessen werden, bei denen die biochemischen Reaktionen durch Zugabe eines geeigneten Reagenzes nach einem definierten Zeitraum abgestoppt werden. Die Reaktion kann chemisch oder durch Abwaschen der Reagenzien von der Probennahmevorrichtung gestoppt werden. Wenn z.B. ein gefärbtes Formazanprodukt auf einem Teststreifen erzeugt und der Teststreifen mit Wasser gewaschen wird, klebt das unlösliche Formazanprodukt am Teststreifen, während die anderen Reagenzien (Enzyme usw.) abgewaschen werden.
Als weiterer Aspekt innerhalb der vorliegenden Erfindung können Nicotinamidadenindinukleotide nach der Freisetzung aus Proben, die auf zellulären Materialien, beispielsweise Mikroorganismen, basieren, unter Verwendung einer geeigneten physikalischen oder chemischen Behandlung, wie Detergenzextraktion, nachgewiesen werden. Extraktionsreagenzien, wie Detergenzien, in einer geeigneten Formulierung können in Gemische mit anderen Assaykomponenten eingebracht oder getrennt ohne Schaden für die Assay-Biochemie/-Chemie zugegeben werden.
Bei dieser Erfindung wird insbesondere vorgeschlagen, dass intrazelluläre Nicotinamidadenindinukleotide aus Bakterien- und anderen Mikrobenzellen unter Verwendung eines kationischen Detergenzes, zum Beispiel einer quaternären Ammoniumverbindung, z.B. DTAB, extrahiert werden, gefolgt von der Verwendung eines Neutralisationsmittels, wie alpha- oder beta-Cyclodextrin, zur Neutralisation des Detergenzes. Die freigesetzten Nicotinamidadenindinukleotide sind dann für die Messung ohne potenzielle Störung durch das kationische Detergenz zugänglich (WO 92/12253). Nichtionische oder zwitterionische Detergenzien können ebenfalls zur Lyse von Säuger- oder anderen eukaryotischen Zellen für die Extraktion intrazellulärer Nicotinamidadenindinukleotide verwendet werden.
Als weiterer Aspekt innerhalb der vorliegenden Erfindung können Protokolle in Betracht gezogen werden, bei denen aus eukaryotischen Zellen stammendes und frei in der Probe befindliches Hintergrund-NAD(P)(H) unter Verwendung milder Verfahren, wie nichtionischer Detergenzien, extrahiert und dann durch eine geeignete NADase zerstört wird, bevor NAD(P)(H) aus mikrobiellen Quellen durch Verwendung stärkerer Extraktionsmittel, wie kationischem Detergenz, extrahiert wird. Auf diese Weise kann mikrobielles NAD(P)(H) in Gegenwart von erhöhtem NAD(P)(H), das aus dem Hintergrund oder eukaryotischen Zellen stammt, selektiv gemessen werden.
Als weiterer Aspekt innerhalb der vorliegenden Erfindung ist es durch Verwendung geeigneter Messungen und Kontrollen möglich, vergleichende Bestimmungen der Spiegel an Nicotinamidadenindinukleotiden vorzunehmen. Zum Beispiel kann eine vergleichende Bestimmung der Spiegel an Nicotinamidadenindinukleotiden in einer Probe mit und ohne Extraktion durch Detergenz dazu verwendet werden, den Spiegel an Nicotinamidadenindinukleotiden, die spezifisch innerhalb zellulärer Materialien, wie Bakterien, vorliegen, und somit annähernd die Zellen zu quantifizieren. Als weiteres Beispiel kann die Bestimmung der Veränderungen in den Spiegeln von Nicotinamidadenindinukleotiden mit der Zeit zum Nachweis von Wachstum und zur Bestimmung und Messung von Wachstumskurven lebender Zellen in einer Probe verwendet werden [siehe Beispiel 4]. Dies ist ein wichtiger Aspekt, bei dem die Bequemlichkeit der Handhabung und auch die Empfindlichkeit einen Vorteil gegenüber optischen Verfahren bringt, während die Zeit ein erheblicher Vorteil gegenüber Plattenzählverfahren ist. Es ist ebenfalls möglich, ein kolorimetrisches Signal zu erhalten, zum Beispiel zum Nachweis von Wachstum in Bakterien-Brühekulturen, bevor es möglich ist, das Wachstum visuell mit dem Auge zu sehen Als ein Aspekt der vorliegenden Erfindung können Nicotinamidadenindinukleotide als Marker für Biomasse aus einem sehr breiten Spektrum an Proben nachgewiesen und gemessen werden. Dazu gehören

• Nahrungsmittelherstellungs-, -zubereitungs-, -handhabungs-, aufbewahrungsoberflächen- und -flüssigkeitsproben sowie andere Proben zur Hygienetestung.
• Nahrungsmittel und Nahrungsmaterialien (einschließlich Milchprodukten und Getränken)
• Verfahrenswasser-, Kühlturm- und Wärmeaustauschersystem-, Rohrleitungs- und andere Industriewasserproben
• Öl-, Mineralöl-, Schmierstoff-, petrochemische Proben
• Reinigungsproben und -lösungen
• Dusche-, Bad-, Toiletten-, Swimmingpool-Proben
• Krankenhaus- und klinische/Klinik-/zahnärztliche Proben
• Medizinische und veterinärmedizinische Proben
• Luftproben im Allgemeinen; Aerosole im Allgemeinen
• Proben aus Gebäude- und Haushaltsumgebungen im Allgemeinen
• Biofilme (Filme von Mikroorganismen auf/haftend an Oberflächen)
• Luftübertragene Mikroorganismen [biologische Kriegsführung]
• Umweltproben
• Mikrobiologische Brühekulturen
• Mikrobiologische Fermentationen [Bier, Joghurt usw.]
• Zellgewebekultur
• Fermentationsstarterkulturen
• Proben aus Biowiederaufbereitungs- und Wasserbehandlungssystemen
• Assays unter Verwendung der Hemmung von Zellwachstum oder Bakterienwachstum zur Untersuchung von Schmutzstoffen oder pharmakologisch wirksamen oder anderen inhibitorischen Verbindun gen
• Messung von Bakterien- und Algenwachstum in Süßwasserflüssen und -seen
• Proben, die hinsichtlich der Wirksamkeit einer Biozidbehandlung getestet werden.

Offenbart ist ein Testkit, das zumindest die Reagenzien, die zur Durchführung der enzymatischen Umwandlung von NAD(P) in NAD(P)H nötig sind, und vorzugsweise auch die Reagenzien umfasst, die zum Nachweis von NAD(P)H durch Erzeugung eines Signals nötig sind. D.h. dass die Reagenzien die Enzyme E1 und E2 und die Substrate S1 und S2 in einem oder mehreren Behältern enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Testkit eine Benetzungslösung (z.B. Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit einem Alkohol, wie Isopropanol, oder ein Gemisch von Wasser mit einem Sterilisierungsmittel, wie Natriumhypochlorit), eine Substratlösung die z.B. NBT, Glucose, eine geeignete Pufferlösung usw. enthält) und eine Enzymlösung (z.B. Diaphorase, Glucosedehydrogenase, eine geeignete Pufferlösung usw.). Bei einer anderen bevorzugtem Ausführungsform umfasst das Testkit einen Behälter mit allen Enzymen und Substraten.
Vorzugsweise enthält das Testkit auch eine Probennahmevorrichtung in Form eines Teststreifens, eines Tupfers, eines absorbierenden Materials auf einem festen Träger usw. Zusätzlich können weitere Hilfsmittel, wie Standardlösungen, ein schriftliches Protokoll des Nachweisverfahrens, eine Standard-Farbtabelle usw. hinzugefügt werden.
Offenbart ist eine längsgeströmte Testvorrichtung zum Nachweis des Vorliegens von Biomasse in einer Probe gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die Testvorrichtung beinhaltet einen Teststreifen mit einem trockenen Matrixmaterial, das eine Flüssigkeit mittels Kapillarität dort entlang transportieren kann und mindestens eine Startzone zum Aufgeben der Probe und eine Reaktionszone mit mindestens einer Art eines darin immobilisierten Enzyms besitzt.
Die Startzone befindet sich vorzugsweise an einem Ende des Teststreifens. Die zu analysierende Probe wird auf die Startzone aufgegeben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Startzone ein Probenflecken, der aus einem absorbierenden Papier besteht. Glasfasermaterialien, faserförmige Kunststoffmaterialien, wie Porex^®-Schicht materialien (Porex Corporation), und Vliesstoffe, die Materialien, wie Viskose und Polyester, enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Vorzugsweise sollte solche Materialien eine einzige Schicht oder Lage bilden. Das Fassungsvermögen des Probenfleckens legt die anfängliche Probenaufnahme der Vorrichtung fest. Der Probenflecken kann auch als Filter wirken, der dazu beiträgt, ungewünschte teilchenförmige Materialien am Erreichen der Reaktionszone zu hindern. Das Material der Startzone trägt dazu bei, die Freisetzung jeglicher imprägnierter immobilisierter Komponenten des Assays an die übrige Vorrichtung zu steuern und sollte daher mit diesem Zweck kompatibel sein. Flüssige Proben können zur Startzone als einzelne Tropfen, z.B. unter Verwendung einer Pipette oder durch Eintauchen der Startzone in die flüssige Probe, gegeben werden. Die Startzone kann Komponenten enthalten, die auf sie aufgetrocknet werden, wie Komponenten des Enzymassays und/oder Chemikalien zur Verhinderung ("Blockierung") unspezifischer Bindungseffekte an der Reaktionszone und/oder Chemikalien zur Verstärkung von hydrophilen Eigenschaften, Rehydratisierung von Assaykomponenten und Längsströmungseigenschaften und/oder Analytfreisetzungsreagenzien und/oder Extraktionsmittel, vorzugsweise Detergenz-Extraktionsmittel.
Die Reaktionszone kann sich direkt neben der Startzone oder weiter abwärts des Teststreifens befinden. Sie enthält eine oder mehrere Komponenten des Enzymassays in einem stabilen Zustand, insbesondere mindestens eine Art Enzym, das an die Reaktionszone immobilisiert ist. Zusätzliche Komponenten können zusätzliche immobilisierte Enzyme und/oder immobilisierte oder getrocknete Enzymsubstrate, Co-Substrate, Cofaktoren usw. sein. Die Reaktionszone kann ein Fleck oder eine Membran sein, die so ausgewählt werden, dass sie für Verfahren zur nichtkovalenten oder kovalenten Immobilisierung von Protein ohne Denaturierung und auch für die Längsströmungseigenschaften des Materials geeignet sind. Die Reaktionszone kann aus einer Nitrocellulosemembran mit hoher Proteinbindungskapazität bestehen. Eine solche Membran kann auch Celluloseacetat enthalten. Der Flecken oder die Membran kann vor und/oder nach der Enzymimmobilisierung behandelt werden, um ungewünschte Effekte, wie unspezifische Bindung des Analyten und/oder von Assaykomponenten, zu minimieren und/oder hydrophile Eigenschaften und Längsströmung zu verstärken. An der Reaktionszone finden die Reaktionen statt, die den Assay ausmachen, und wird das Produkt gebildet, das das Vorhandensein des Analyten in der ursprünglichen Probe anzeigt.
Der Teststreifen enthält vorzugsweise ferner eine Reagenzzone, die üblicherweise aus Materialien ähnlich denjenigen, die für den Probenflecken eingesetzt werden, und vorzugsweise aus absorbierendem Papier oder Glasfaser oder Polyethylenfaser oder Polyester besteht und zwischen der Startzone und der Reaktionszone oder teilweise überlappend mit einer oder beiden Zonen angeordnet ist. Die Reagenzzone enthält eine oder mehrere Komponenten des Assays, die in einem stabilen Zustand getrocknet sind, wie Enzymsubstratkomponenten und/oder Chemikalien zur Verhinderung ("Blockierung") unspezifischer Bindungseffekte an der Reaktionszone und/oder Chemikalien zur Verstärkung von hydrophilen Eigenschaften, Rehydratisierung von Assaykomponenten und Längsströmungseigenschaften und/oder Analytfreisetzungsmittel und/oder Extraktionsmittel, vorzugsweise Detergenz-Extraktionsmittel anstelle der oder zusätzlich zur Startzone.
Vorzugsweise enthält der Teststreifen einen Docht oder eine vergleichbare Einrichtung, die flüssige Probe aus der Matrix des Teststreifens durch die Vorrichtung saugt und dadurch den Kapillarstrom vom Probenflecken antreibt. Der Strom der Lösung in den Docht gewährleistet einen nachhaltigen Strom von den Proben- und Reagenzflecken über die Reaktionsstelle der immobilisierten Enzyme, um die Menge an gebildetem Produkt zu maximieren. Der Docht besteht vorzugsweise aus ähnlichen Materialien, wie sie für den Probenflecken eingesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht der Docht aus einem absorbierenden Papier. Der Assay erreicht unter der Annahme, dass das Probenvolumen nicht limitierend ist, nur den Endpunkt, wenn das Fassungsvermögen des absorbierenden Fleckens gefüllt wird.
Der Teststreifen enthält ferner ein Kunststoffgehäuse oder eine andere Umhüllung, um der Vorrichtung zusätzliche Festigkeit und Steifigkeit zu verleihen und die Handhabung der Vorrichtung, ohne sie zu kontaminieren, zu erleichtern. Vorzugsweise ist der Teststreifen nur teilweise mit der Umhüllung bedeckt. Die Startzone ist vorzugsweise nicht mit der Umhüllung bedeckt, um leichtes Aufgeben der Probe zu gewährleisten.
Die verschiedenen absorbierenden Zonen des Teststreifens befinden sich sämtlich in der gleichen Ebene, so dass Kapillarstrom einer flüssigen Probe zwischen den Zonen möglich ist. Bei dem Verfahren wird (werden) jegliche Komponente(n), die im trockenen Zustand auf den Teststreifen aufgebracht wird (werden), wie Detergenz zur Extraktion des Analyten aus Matrices innerhalb der Probe, in Lösung rekonstituiert. Alle Zonen können weitere Reagenzien, wie Stabilisierungsmittel oder Puffer, enthalten, die z.B. die Aufbewahrung der Komponenten der Enzymreaktion unterstützen oder Reaktionsbedingungen (z.B. pH) bereitstellen, die für die Enzymreaktion geeignet sind. Bei einigen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, die Enzymreaktion mit einer chemischen Reaktion zu kombinieren, um z.B. die Erzeugung eines nachweisbaren Signals zu verbessern. In diesem Fall werden die Komponenten der chemischen Reaktion ebenfalls im trockenen Zustand in die Zonen des Teststreifens gegeben.
Vorzugsweise werden die Substrate der Enzymreaktion im Reagenzflecken platziert, weil sie üblicherweise ein niedriges Molekulargewicht besitzen und in Lösung mobil sind. Die Enzyme werden am Reaktionsflecken positioniert, weil sie ein höheres Molekulargewicht haben und relativ unbeweglich sind. Bei einer stark bevorzugten Ausführungsform besteht der Reak tionsflecken aus einer Nitrocellulosemembran, an die die Enzyme so fest binden, dass sie effizient immobilisiert werden.
Vorzugsweise enthält der Teststreifen eine Startzone, die ein getrocknetes Detergenz-Extraktionsmittel enthält, eine Reagenzzone, die ein oder mehrere getrocknete Enzymsubstrate und/oder Cofaktoren enthält, und eine Reaktionszone, die mindestens eine Art von immobilisiertem Enzym enthält.
5 ist eine veranschaulichende schematische Ansicht eines längsgeströmten Teststreifens für die erfindungsgemäße Verwendung. Auf einer selbstklebenden Kunststoffbasis (6) befinden sich ein Probenflecken als Startzone (1), eine Reagenzzone (2), die partiell mit der Startzone überlappt, eine Reaktionszone (4) mit dem darauf immobilisierten Enzym (3). Neben der Reaktionszone befindet sich ein Docht (5).
Diese längsgeströmte Testvorrichtung enthält zumindest die Reagenzien, die für die enzymatische Umwandlung von NAD(P) in NAD(P)H nötig sind, und vorzugsweise auch zumindest die Reagenzien, die zum Nachweis von NAD(P)H durch Erzeugen eines Signals notwendig sind.
Vorzugsweise enthält die Startzone, die aus einem absorbierenden Papier besteht, ein getrocknetes Detergenz-Extraktionsmittel, die Reagenzzone, die ebenfalls aus absorbierendem Papier oder Glasfaser besteht, die Substrate für die bei dem Assay verwendeten Enzyme, während die Enzyme selbst an der Reaktionszone immobilisiert sind, die aus einer Nitrocellulosemembran mit hoher Proteinbindungskapazität besteht. Bevorzugte Reagenzien für den Assay sind DTAB (Dodecyltrimethylammoniumbromid) als Detergenz-Extraktionsmittel an der Startzone, die an der Reaktionszone immobilisierten Enzyme Glucosedehydrogenase und Diaphorase und die entsprechenden Substrate NBT und Glucose, die auf der Reagenzzone aufgetrocknet sind.
Alternativ kann DTAB in das auf der Reagenzzone aufgetrocknete Substratreagenz eingebracht werden.
Eine an der Startzone aufgetragene flüssige Probe bewegt sich durch Kapillarwirkung in die Reagenzzone, wo die Enzymsubstrate rehydratisiert werden und mit der Probe zu den an der Reaktionszone immobilisierten Enzymen wandern. In Gegenwart der Analyten NAD, NADH, NADP und/oder NADPH wird das gelbe NBT durch Einwirkung der Enzyme und ihrer Substrate in das dunkelblaue Formazansalz umgewandelt, was eine für das Auge sichtbare Farbänderung hervorruft. Die verringerte Löslichkeit des Formazanprodukts bewirkt dessen Konzentration nahe der Reaktionsstelle, was eine intensivere Farbe ergibt. Eine hohe Empfindlichkeit wird erzielt, weil die beiden Enzyme NAD(P) und NAD(P)H zurückgewinnen, wodurch viele gefärbte Moleküle für jedes in der Probe vorhandene Analytmolekül erzeugt werden, vorausgesetzt, dass Substrate aus der Reagenzzone zugeführt werden.
Andere Tetrazoliumverbindungen oder Diaphorase-Substrate können anstelle von NBT eingesetzt werden, um mit NAD(P)H und Diaphorase ein leicht nachweisbares Produkt zu erzeugen. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Enzym Diaphorase durch geeignete Reagenzien ersetzt werden, zum Beispiel Meldola-Blau und NBT, die in Gegenwart von NAD(P)H ein leicht nachweisbares Produkt erzeugen.
Die Kapazität des Probenfleckens ist derart, dass ein einzelner Tropfen einer geeigneten Benetzungslösung den Probenflecken, aber nicht die anderen Komponenten der Testvorrichtung benetzt, so dass der Flecken zur Probennahme von einer Versuchsoberfläche verwendet werden kann, ohne die signalproduzierenden Reaktionen einzuleiten. Anschließend leitet ein zweiter Tropfen Benetzungslösung den Kapillarstrom ein, so dass die Assayreagenzien durch Benetzung der gesamten Vorrichtung rehydratisiert werden, wodurch es zur Signalproduktion in Gegenwart von NAD(P) oder NAD(P)H kommt.
Um die Messung zweier wichtiger Parameter zu ermöglichen, z.B. die Probenhygiene durch eine einzige Vorrichtung in der gleichen Probe zu überwachen, können Reagenzien, die eine kolorimetrische Reaktion mit Protein hervorrufen, auf dem Reaktionsstreifen an einer von den Enzymen und Substrate, die zum Nachweis von NAD(P) und NAD(P)H verwendet werden, getrennten Stelle immobilisiert werden. Ein Assay von Protein und NAD in der gleichen Probe liefert zusätzliche Empfindlichkeit und Information in Bezug auf die Zusammensetzung der Probe.
Als Reagenz zum Nachweis von Protein sind beim erfindungsgemäßen Verfahren diejenigen einsetzbar, die zum Nachweis gemäß den verschiedenen Proteinnachweisverfahren, wie Biuret-Reaktionsverfahren, Lowry-Verfahren, Coomassie-Färbeverfahren, BCA-Verfahren und Ninhydrin-Reaktionsverfahren, benötigt werden. Das Reagenz zum Nachweis von Protein wird vorzugsweise aus der Gruppe der nicht-octahalogenierten Sulfophthaleine, wünschenswerterweise aus der Gruppe, die aus Phenolsulfophthaleinen und Kresolsulfophthaleinen besteht, ausgewählt. Geeignete Reagenzien sind zum Beispiel Bromphenolblau, Bromkresolgrün, Bromkresolpurpur, Bromphenolrot, Bromthymolblau und Bromchlorphenol.
Es wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß nutzen kann. Die bevorzugten spezifischen Ausführungsformen und Beispiele sollen daher als rein veranschaulichend und nicht als auf irgendeine Weise beschränkend für den Rest der Offenbarung verstanden werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele stellen praktische Anwendungen der Erfindung dar.
Beispiel 1:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum praktischen Nachweis von Nahrungsmittelrückständen ist in 3 dargestellt. Eine Reihe üblicher Nahrungsmittel wird, homogenisiert in 1 ml reinem Wasser, als Proben in einem kolorimetrischen Assay, ähnlich dem in 1 beschriebenen, verwendet. Die Reduktion des Tetrazoliumsalzes Nitro-Blau-Tetrazolium (NBT) wird durch das Enzym Diaphorase vermittelt. Die zur Umwandlung von NAD in NADH verwendete Dehydrogenase ist Glucosedehydrogenase. Bei diesem Beispiel werden Glucose, Diaphorase und eine Probe, die aus NAD bekannter Konzentration (1 μM) oder Nahrungsmittelprobe besteht, zu einem geeigneten Puffer (75 mM Tris, 25 mM Kaliumchlorid, 5 mM Magnesiumacetat, 2 mM EDTA, 0,5 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100, 1,25% (w/v) alpha-Cyclodextrin, pH 7,75) gegeben. Die kolorimetrische Reaktion wird durch Zugabe von Glucosedehydrogenase eingeleitet.
Die Bildung des gefärbten Formazanprodukts nach 5 Minuten wird spektralphotometrisch bei 540 nm gemessen. Ein Vergleich mit der Farbe, die unter identischen Bedingungen durch einen NAD-Standard bekannter Konzentration gebildet wird, ermöglicht die Berechnung der NAD(H)-Konzentration in der Ursprungsprobe. Zur Validierung der Erfindung als praktische Anwendung ist es notwendig zu zeigen, dass sie mit bestehenden Sauberkeitsassays, zum Beispiel mit dem von Merck KGaA hergestellten HY-LITE^®-ATP-Lumineszenzassay, vergleichbar ist. Um einen vernünftigen Vergleich zu erzielen, wurde DTAB im HY-LITE^®-Assay weggelassen. Die ATP-Konzentrationen werden unter Verwendung dieses Produkts gemessen, indem zunächst der Probenstab eines Standard-HY-LITE^®-Stifts zurückgeschoben wird, um das gefriergetrocknete Feuerkäfer-Reagenz zu rehydratisieren, und die Hintergrundlumineszenz mit dem HY-LITE^®-Luminometer gemessen wird. Die Kunststoffkappe des Stifts wird dann entfernt, und 30 μl Probe werden zu dem Puffer im Hauptkörper des Stifts gegeben, und die Kunststoffkappe wird wieder aufgesetzt. Der Stift wird dann wieder in das Luminometer eingebracht, und die erhaltene Probenlumineszenz wird gemessen. Lumineszenzmessungen werden durch Kalibrierung unter Verwendung eines ATP-Standards bekannter Konzentration in einer getrennten Messung in ATP-Konzentrationen umgewandelt. Der in 3 veranschaulichte Vergleich der NAD(H)- und ATP-Konzentrationen, die in Nahrungsmittelproben gefunden wurden, zeigt, dass in den meisten Fällen der NAD(H)-Gehalt der Nahrung zumindest gleich dem ATP-Gehalt ist. Somit wird gezeigt, dass der Nachweis von Nahrungsmittelresten durch einen NAD(H)-Assay genauso gültig ist wie der Nachweis mit einem ATP-Assay.
In 3 stehen die Großbuchstaben für die folgenden üblichen Nahrungsmittel: A = gekochtes Ei, B = Senf, C = Karotte, D = Käse, E = Ananas, F = Portwein, G = Rotwein, H = Joghurt, I = Fleisch. Die x-Achse zeigt die Konzentration von ATP oder NAD(H) in nM.
Beispiel 2:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung der Sauberkeit von Oberflächen durch Messung von Oberflächen-Nicotinamidadenindinukleotiden ist in Tabelle 1 dargestellt. Ein Teststreifen, der aus einem Kunststoffträger besteht, auf dem ein geeigneter Papierflecken an einem Ende befestigt ist, wird zunächst unter Verwendung einer geeigneten Lösung (6% Isopropanol in destilliertem Wasser) benetzt. Der benetzte Streifen wird dann dazu verwendet, über die Testoberfläche (üblicherweise eine 30 cm² große Fläche) zu wischen, wodurch Probe von der Oberfläche auf den Teststreifen übertragen wird. Die in der Probe vorhandenen Nicotinamidadenindinukleotide werden durch Zugabe von Reagenzien zum Teststreifen gemessen, wodurch ein für das Auge sichtbares gefärbtes Produkt produziert wird. Zuerst wird ein Tropfen (etwa 40 μl) einer geeigneten Substratformulierung (10 mM Natriumcitrat pH 6, 2 mg/ml NBT, 300 mM Lithiumlactat, 0,01% Proclin, 2% (w/v) alpha-Cyclodextrin) zum Teststreifen gegeben, gefolgt von einem Tropfen einer geeigneten Enzymformulierung (200 mM Tris pH 8,6 mg/ml Diaphorase, 3 mg/ml Lactatdehydrogenase, 50% Glycerin, 0,01% Proclin, 0,3% Tween 80) zur Einleitung der Reaktion. Die bei diesem Test verwendeten Proben werden in einer Haushaltsküche genommen.
Das Vorliegen von Nicotinamidadenindinukleotiden zeigt sich durch die Entwicklung einer Farbe auf dem Teststreifen, die mit dem Auge leicht unterschieden werden kann. Je mehr Nicotinamidadenindinukleotide vorhanden sind, desto schneller entwickelt sich Farbe. Die Farbentwicklung wird bei diesem Beispiel 5 Minuten nach Einleiten der Reaktion untersucht. Diese Zeit kann je nach der Anwendung zwischen 1 und 10 Minuten variieren.
Tabelle 1 veranschaulicht die aus diesem Test erhaltenen Ergebnisse. Farbentwicklung, die eine "verschmutzte" Oberfläche anzeigt, ist mit + angegeben. Keine Farbentwicklung entsprechend einer "sauberen" Oberfläche ist mit – angegeben. Eine schnelle Farbbildung, die eine "stark verschmutzte" Oberfläche anzeigt, ist mit ++ angegeben. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die Erfindung in der bei diesem Test verwendeten Form in der Lage ist, Rückstände auf einer anscheinend sauberen Oberfläche durch eine sichtbare Farbänderung nachzuweisen. Ferner wird die Anzahl an nachgewiesenen unsauberen Oberflächen nach Säubern signifikant verringert, was zeigt, dass die Empfindlichkeit der Erfindung in dieser Form für die Anwendung korrekt ist.
Tabelle 1
Beispiel 3:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung der Sauberkeit von Oberflächen im Vergleich zu mikrobiologischer Hygieneüberwachung ist in Tabelle 2 veranschaulicht. Der Nicotinamidadenindinukleotid-Gehalt als Maß für die Sauberkeit der Oberfläche wird durch die vorliegende Erfindung, wie im Beispiel 2 beschrieben, gemessen. Der Bakteriengehalt der Oberfläche wird durch einen Abstrich von einer 10 cm × 10 cm großen Fläche und Abspülen des Tupfers 1 ml physiologische Kochsalzlösung bestimmt. Ein 100-μl-Aliquot der Lösung wird auf eine Nähragarplatte plattiert und die Anzahl an Kolonien nach 3-tägiger Inkubation bei 30°C als Maß für die Anzahl an Mikroben auf der Oberfläche (CFU/Abstrich) verwendet. Die Proben wurden bei diesem Beispiel in einer institutionellen Nahrungsmittelzubereitungsumgebung genommen.
Tabelle 2 veranschaulicht die vergleichsweisen Nutzen des Verfahrens. Das Plattenzählverfahren misst die Oberflächenkontamination mit aeroben Mikroorganismen mit der Möglichkeit, die Methodologie auf die Identifikation der vorhandenen Organismentypen auszuweiten. Die Messung von Oberflächen-Nicotinamidadenindinukleotid liefert Information in Bezug auf die Sauberkeits-/Hygieneniveaus. Anders gesagt, zeigt die Nicotinamidadenindinukleotid-Analyse eher den Spiegel an vorhandener organischer "Verschmutzung" (biologischem Abfallstoff) als die Zahlen lebensfähiger Mikroben. Das Vorliegen von Verschmutzung zeigt, dass eine Oberfläche nicht gründlich gereinigt wurde und potenziell die Bedingungen für eine Mikrobenkontamination liefert.
Tabelle 2
Die Daten unterstreichen die Vorteile der Messung von Nicotinamidadenindinukleotiden zur Untersuchung von Sauberkeit. In drei Fällen werden keine lebensfähigen Mikroorganismen durch das Plattenzählverfahren, aber die Gegenwart von Nicotinamidadenindinukleotiden nahe gelegt, was auf eine unsaubere Oberfläche deutet. Dies zeigt die Fähigkeit dieser Erfindung, biologische Abfallstoffe nachzuweisen. Es sollte auch beachtet werden, dass bei allen bei diesem Beispiel gemessenen Proben die Mikrobenkontamination, die durch Plattenzählung bestimmt wurde, unterhalb der Nachweisgrenze von Mikroorganismen für die im Beispiel 4 verwendete Form der Erfindung ist. Dies zeigt, dass der Großteil des als Marker für schlechte Oberflächensauberkeit nachgewiesenen Nicotinamidadenindinukleotids sich extrazellulär von Bakterienzellen befindet. Die Daten zeigen auch, dass die vorliegende Erfindung in der Lage ist, Spiegel an Nicotinamidadenindinukleotiden auf Oberflächen nachzuweisen, die bei visueller Untersuchung als sauber beurteilt werden.
Mikrobiologische Verfahren, wie Plattenzählungen, benötigen mehrere Tage, bis sie beendet sind, und können daher nur im Nachhinein ein Bild der Oberflächenkontamination vermitteln. Die luminometrische Untersuchung von ATP erfordert die Verwendung eines Instruments für Lichtmessungen. Diese Erfindung benötigt nur Minuten, erfordert keine Instrumente und ist weniger subjektiv als visuelle Untersuchungen. Diese Anwendung der Erfindung stellt die Fähigkeit bereit, die Oberflächensauberkeit in Echtzeit zu untersuchen, was eine sofortige Korrektur, wenn erforderlich, gestattet.
Beispiel 4:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Wachstumskurve einer Bakterienkultur und zum Nachweis von Bakterien ist in 4 veranschaulicht. Das Wachstum von E.-coli-NCTC-9001 in einer Kultur wird durch Zugabe einer Probe einer Bakterienkolonie zu einem geeigneten Wachstumsmedium, wie Nährbrühe, eingeleitet. Das Bakterienwachstum in der Kultur wird durch Entnehmen von Proben zu geeigneten Zeiten und Messen der optischen Dichte bei 600 nm, des Nikotinamidadenindinukleotid-Gehalts unter Verwendung der vorliegenden Erfindung und der Gesamtzahl lebensfähiger Kolonien (TVC) unter Verwendung einer Mikroben-Plattenzählung ermittelt. Bei diesem erfindungsgemäßen Beispiel wird ein Tropfen eines geeigneten Zelllysemittels, zum Beispiel DTAB, gefolgt von einem Tropfen eines geeigneten Substratmixes, der ein geeignetes Neutralisationsmittel, zum Beispiel alpha-Cyclodextrin, enthält, gefolgt von einem Tropfen einer geeigneten Enzymlösung zur Einleitung der Reaktion zur Probe gegeben, und die Rate der Farbentwicklung wird unter Verwendung eines Spektralphotometers gemessen. NAD wird durch das Enzym Lactatdehydrogenase mit ihrem Substrat Lithiumlactat in NADH umgewandelt. Die Farbe wird aus NADH durch das Enzym Diaphorase und NBT erzeugt. Die Rate der Farbentwicklung einer Probe bekannter NAD-Konzentration wird dazu verwendet, die Raten der Farbentwicklung von Proben mit absoluten Nikotinamidadenindinukleotid-Konzentrationen in Beziehung zu setzen.
4 zeigt, dass die vorliegende Erfindung die Wachstumsdynamik einer Bakterienpopulation überwachen kann, so dass sie mit der optischen Dichte und Messungen der gesamten lebensfähigen Kolonien, den zurzeit akzeptierten Routineverfahren zur Untersuchung des Bakteriengehaltes, korrelieren.
Beispiel 5:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Bakterien unter Verwendung einer mit dem Auge sichtbaren Farbänderung kann durch Eintauchen eines geeigneten Papierflecks, der am Ende eines Kunststoffstreifens befestigt ist, in eine E.-coli-NCTC-9001-Kultur mit einer mittels Plattenzählung bestimmten TVC von 5 × 10⁸ cfu/ml, so dass der Fleck mit der Kultur benetzt wird, demonstriert werden. Zu dem Fleck werden nacheinander ein Tropfen eines geeigneten Zelllysemittels, zum Beispiel DTAB, ein Tropfen eines geeigneten Substrats, zum Beispiel Lithiumlactat und NBT, einschließlich einer Neutralisierungsverbindung, zum Beispiel alpha-Cyclodextrin, und schließlich ein Tropfen einer ge eigneten Enzymformulierung, zum Beispiel Lactatdehydrogenase und Diaphorase, gegeben. Nach 5 Minuten bildet sich eine signifikante Färbung auf dem Fleck, was darauf hindeutet, dass diese Erfindung Bakterien durch eine sichtbare Farbänderung nachweisen kann.
Beispiel 6:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung mit einem Filter zur Konzentration von Bakterien kann die Empfindlichkeit des Mikroorganismennachweises verstärken. Als Beispiel werden 20 ml einer Kultur, die 6 × 10⁵ cfu/ml E.-coli-NCTC-9001 enthält, durch ein Nylonfilter mit 0,2 μm Porengröße geleitet. Zu diesem Filter werden nacheinander ein Tropfen (etwa 40 μl) eines Zelllysemittels (zum Beispiel DTAB), ein Tropfen einer ein geeignetes Neutralisationsmittel enthaltenden Substratlösung (zum Beispiel Lithiumlactat, NBT und alpha-Cyclodextrin) und schließlich ein Tropfen Enzymlösung (zum Beispiel Lactatdehydrogenase und Diaphorase) gegeben. Eine mit dem Auge deutlich sichtbare Farbe entwickelt sich innerhalb von 7 Minuten auf dem Filter. Wird das Experiment unter Verwendung nur eines einzigen Tropfens E.-coli-Kultur, die 6 × 10⁵ cfu/ml enthält, als Probe auf dem Filter wiederholt, entwickelt sich nach Zugabe von Zelllysereagenz, Substrat- und Enzymlösungen sogar nach 30 Minuten keine mit dem Auge sichtbare Farbe. Dieses Beispiel zeigt, dass durch Aufkonzentrieren des Mikrobengehaltes eines Lösung auf einem Filter, auf dem ein kolorimetrischer Assay durchgeführt werden kann, eine Steigerung der Empfindlichkeit erhalten werden kann.
Beispiel 7:
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung mit einem Heizblock zur Erhöhung der Reaktionsrate und zur Verringerung der Zeit, die für die Ablesung benötigt wird, wird mittels Durchführen eines Assays veranschau licht, bei dem ein Tropfen NAD bekannter Konzentration (d.h. etwa 40 μl einer 1,25 μM Lösung) zu einem Teststreifen gegeben wird, gefolgt von einem Tropfen einer Substratlösung, die aus Lithiumlactat und NBT besteht, und schließlich einem Tropfen Enzymlösung, die aus Lactatdehydrogenase und Diaphorase besteht. Die Zeit, die für ein mit dem Auge bestimmtes "positives" Ergebnis bei 20°C (Umgebungstemperatur) benötigt wird, beträgt 3,5 min. Wird das Experiment bei 40°C wiederholt, indem der Streifen auf einen dafür ausgelegten, thermostatgesteuerten Heizblock gelegt wird, beträgt die Zeit, die für ein mit dem Auge bestimmtes "positives" Ergebnis benötigt wird, 1 min.
Bei einem zweiten Beispiel werden Proben von NAD bekannter Konzentration, Substratlösung und Enzymlösung, wie oben beschrieben, in zwei geeignete Küvetten überführt, bei Temperaturen von 18°C bzw. 43°C inkubiert, und die Absorption wird nach 5 Minuten bei 540 nm gemessen. Die Absorption bei 18°C betrug 1,072, während diejenige bei 43°C 2,256 betrug, eine Steigerung der Farbentwicklungsrate von 210%.
Diese Ergebnisse zeigen, dass signifikante Verbesserungen der Assayempfindlichkeit möglich sind, indem der Assay bei Temperaturen über Umgebungstemperatur durchgeführt wird, die entweder unter Verwendung eines für diesen Zweck ausgelegten Heizblocks oder eines geeigneten Inkubators erreicht werden.
Beispiel 8 – Längsgeströmte Testvorrichtung: NAD
Eine längsgeströmte Testvorrichtung, die einen Nitrocellulose-Reaktionsstreifen, einen Papierprobenfleck, einen Reagenzfleck und einen Docht beinhaltet, ist wie in 5 dargestellt konstruiert. Der Reagenzfleck wird in einer Lösung der Substratformulierung, die 450 mM Glucose, 2 mg/ml NBT, 10 mM Citrat enthält, getränkt und dann vor dem Zusammenbau getrocknet. Die Vorrichtungen basieren auf der Millipore-SR-Membran, die eine Nitrocellulosemembran auf einen inerten Kunststoffträger enthält. Selbstklebende Abschnitte auf dem Kunststoffträger gestatten die Befestigung geeigneter Papierstreifen, die als Probenflecken, Reagenzflecken und Docht wirken. Die Vorrichtungen sind als 20 cm breite Streifen konstruiert, die in einzelne Vorrichtungen mit einer Breite von 5 mm geschnitten werden.
Zur Herstellung der Streifen für den Gebrauch wird 1 μl Enzymformulierung, die 200 mM Tris, 3 mg/ml Diaphorase, 8 mg/ml Glucosedehydrogenase enthält, auf den Nitrocelluloseabschnitt des Streifens gegeben, und man lässt bei 20°C 10 Minuten trocknen. Bei diesem Aufbau werden die Enzym- und Substratformulierungen getrennt gehalten, was die Langzeitstabilität der Vorrichtung verbessert. Zusätzlich enthält jede Reagenzfleckbreite von 5 mm das Äquivalent von etwa 20 μl Substrat, was gewährleistet, dass das auf dem Reaktionsstreifen immobilisierte Enzym über ausreichend Substrat für den gesamten Zeitverlauf der Reaktion verfügt.
Der Assay wird durch Zugabe einer Lösung, die 15 pmol NAD enthält, zum Probenflecken eingeleitet. Die Probe wandert in den Reagenzflecken, in dem die Enzymsubstrate rehydratisiert und mit der Probe in den Nitrocellulose-Reaktionflecken überführt werden. Hier reagieren NAD, Assay-Enzyme und -Substrate unter Bildung des purpurnen Formazanprodukts, das innerhalb von 5 Minuten bei 20°C mit dem Auge sichtbar ist, was zeigt, dass diese Vorrichtung NAD in Lösung nachweisen kann. Wenn das Experiment unter Verwendung einer Kontrolle von destilliertem Wasser anstelle von NAD-Lösung als Probe wiederholt wird, entwickelt sich nach 10 Minuten bei 20°C keine purpurne Farbe.
Beispiel 9 – Längsgeströmte Testvorrichtung: Biomasse
Um die Verwendung der längsgeströmten Testvorrichtung zum Nachweis von Biomasse zu demonstrieren, werden 30 μl einer Brühekultur von E.-coli-NovaBlue (Novagen, Katalog-Nr. 69009-3), die 7,2 × 10⁷ kolonienbildende Einheiten/ml (bestimmt mittels gesamter aerober mikrobiologischer Plattenzählung) enthielt, zum Probenflecken eines wie im Beispiel 8 beschrieben hergestellten Streifens gegeben. Zur Aktivierung der Vorrichtung werden 30 μl einer Extraktionsmittellösung, die aus 0,3% w/v DTAB in Wasser besteht, zum Probenflecken gegeben, was genügend Volumen bereitstellt, dass die flüssige Probe mittels Kapillarwirkung durch die Vorrichtung wandert. Das Extraktionsmittel lysiert die auf dem Probenflecken vorhandenen Bakterien, wodurch intrazelluläres NAD(P) und NAD(P)H mit der mobilen Probenphase über den Reagenzflecken zum Reaktionsflecken wandern können. Eine das Vorliegen von NAD(P)(H) anzeigende purpurne Farbe, die einem "schmutzigen" Ergebnis bei einem Hygieneüberwachungsassay entspricht, wird innerhalb von 5 Minuten erhalten. Wird das Experiment unter Verwendung von steriler Brühe, die keine Bakterien enthält, wiederholt, wird keine Farbentwicklung beobachtet.

Claims

Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens von Biomasse in einer Probe auf Basis des Nachweises des gesamten Pools von NAD(P) und NAD(P)H, dadurch gekennzeichnet, dass der gesamte Pool von NAD(P) und NAD(P)H als Marker für das Vorliegen von Biomasse gemessen wird, indem NAD(P) in der Probe durch Zugabe eines Enzyms E1 und eines Substrats S1 für das Enzym enzymatisch in NAD(P)H umgewandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorliegende Biomasse nachgewiesen und gemessen wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis fluorimetrisch erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis anhand der Umwandlung von NAD(P)H in NAD(P) an einer Elektrodenoberfläche erfolgt, was zu einer Änderung im Potenzial oder im Strom an einer Elektrodenoberfläche führt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch Zugabe eines zweiten Enzyms E2 und eines zweiten Substrats S2 erfolgt, wodurch die folgende Umsetzung stattfindet:
und die Umwandlung von S2 in P2 ein Signal erzeugt, das eine Veränderung im Absorptionsspektrum ist, einschließlich einer Farbänderung, einer Fluoreszenzänderung, einer Lumineszenzreaktion oder einer elektrochemischen Reaktion, die zu einer Änderung im Potenzial oder im Strom an einer Elektrodenoberfläche führt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate S1 und S2 im Überschuss zur Probe gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass E1 LactatDehydrogenase ist, E2 Diaphorase ist, S1 Lithiumlactat ist und S2 Nitro-Blau-Tetrazolium ist.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass E1 GlucoseDehydrogenase ist, E2 Diaphorase ist, S1 Glucose ist und S2 Nitro-Blau-Tetrazolium ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe auf eine Temperatur zwischen 25 und 45°C erwärmt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Nachweisen der Menge an Biomasse ein Detergenz und gegebenenfalls anschließend ein Neutralisationsmittel zur Probe gegeben werden.
Verwendung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10 zur Quantifizierung und/oder zum Nachweis von Mikroorganismen oder des Hygienestatus einer Probe.