DE69735127T2

DE69735127T2 - Enzymsensor

Info

Publication number: DE69735127T2
Application number: DE69735127T
Authority: DE
Inventors: Thomas Ahl; Milton Allan BYRNARD
Original assignee: Radiometer Medical ApS
Current assignee: Radiometer Medical ApS
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2017-11-08
Also published as: DE69735127D1; EP0944731A1; EP0944731B1; US6051389A; JP2000507457A; DK0944731T3; ATE316147T1; WO1998021356A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit und eine Membran für einen Enzymsensor, die hinsichtlich der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität verbessert wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der Enzymstabilität (Haltbarkeit) von Enzymsensoren im Allgemeinen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Enzymsensoren sind Sensoren, bei denen eine zu messende chemische Spezies (ein Analyt) vor der Bestimmung eine enzymatisch katalysierte Reaktion in dem Sensor durchläuft. Die Reaktion zwischen Analyt und Enzym (für das der Analyt ein Substrat sein sollte) ergibt eine Sekundärspezies, deren Konzentration (unter Idealbedingungen) proportional zu oder identisch mit der Konzentration des Analyts ist. Die Konzentration der Sekundärspezies wird dann mittels eines Transducers, beispielsweise mittels einer Elektrode, ermittelt.
Das Enzym eines Enzymsensors ist üblicherweise in einer Membran enthalten, die für den Kontakt mit der Prüfflüssigkeit geeignet ist. Das Enzym kann als Teil einer Membran eines Sensors enthalten sein oder sich hinter einer solchen Membran befinden. Eine weitere Möglichkeit ist die Einarbeitung des Enzyms in den eigentlichen Sensor, z. B. als Teil einer Schicht aus Kohlepaste einer Elektrode. Somit kommt der Analyt nach Diffusion in den äußeren Teil des Sensors (z. B. die Membran oder die Schicht aus Kohlepaste) mit dem Enzym in Berührung, die Enzym/Analyt-Reaktion findet statt und die Sekundärspezies diffundiert anschließend zu dem Detektorteil des Sensors, z. B. einer Elektrode.
Bei einem herkömmlichen eine Membran umfassenden Enzymsensor muss die Membran einerseits eine geeignete Porosität aufweisen, sodass der Analyt kontrolliert aus der Prüfflüssigkeit zu dem Enzym diffundieren kann, und andererseits gegenüber dem fraglichen Enzym impermeabel oder im Wesentlichen impermeabel sein, um ein Auslaugen des Enzyms in die Prüfflüssigkeit zu vermeiden.
Eine Möglichkeit zur Lösung dieses Problems ist die Immobilisierung des fraglichen Enzyms auf einem Makromolekül, sodass die physische Größe und die allgemein niedrige Löslichkeit von Enzym/Makromolekül ein Auslaugen durch die poröse Membran verhindert. Eine mögliche Alternative, die möglicherweise für in situ polymerisierte Membranen geeigneter ist, kann der Einschluss von Enzymen in Polymeren sein.
Ein interessantes Beispiel eines Analyts, der beispielsweise in Körperflüssigkeiten vorhanden ist, ist Lactat. Lactatsensoren, in denen Lactatoxidase auf bovinem Serumalbumin immobilisiert ist, sind bekannt (Hu et al., 1993, Analytica Chimica Acta, 281, S. 503–511; Tsuchida et al., 1985, Biotechnology and Bioengineering, 27, S. 837–841; Pfeiffer et al., 1992, Biosensors & Bioelectronics, 7, S. 661–671; Baker et al., 1995, Anal. Chem., 67, S. 1536–1540 und Liu et al., 1995, Electrochemica Acta, 40, S. 1845–1849). Die genannte Haltbarkeit der Lactatsensoren liegt üblicherweise bei ungefähr 14 Tagen (siehe beispielsweise Winckers et al., 1996, Clinical Chemistry, 42, Nr. S6, S. S278, Poster Nr. 761).
Wenn ein Enzym, z. B. Lactatoxidase, immobilisiert wird, nimmt die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms im Vergleich zu der entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym ab. Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass das Enzym, oder wenigstens ein Teil (eine Domäne) davon, seine aktive Konformation während oder nach der Immobilisierungsreaktion nicht bewahrt oder dass funktionelle Gruppen des Enzyms, die sich in dem oder sehr nahe an dem aktiven Zentrum des Enzyms befinden, an der Immobilisierungsreaktion beteiligt sind. Somit kann eine beträchtliche Menge an Enzym durch die Immobilisierungsreaktion inaktiviert werden. Die Gegenwart großer Mengen an inaktiviertem, teilweise inaktiviertem oder denaturiertem Enzym in einem Sensor ist ausgesprochen unerwünscht, da dies zu längeren Ansprechzeiten führen kann.
Es wurde berichtet, dass die Immobilisierung von Trypsin auf einem festen Material in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors zu einer fast vollständigen Erhaltung der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität führt (Kuga et al., 1976, Mem. Fac. Sci. Kyushu Univ. Ser. C, 10, S. 77–90; CA: 85:42969h). Außerdem ist die Verwendung eines polymeren kompetitiven Inhibitors bei der Immobilisierung von Trypsin auf wasserunlösliche Träger beschrieben (Brown et al., 1981, Makromol. Chem., 182, S. 1605–1616). Keine dieser Veröffentlichungen beschäftigt sich mit der Verwendung von immobilisiertem Trypsin in einem Enzymsensor und es liegt, soweit der Anmelderin bekannt, keine andere Veröffentlichung vor, die sich mit der Verwendung von immobilisiertem Trypsin in einem Enzymsenor beschäftigt. Demzufolge wurden die besonderen Bedingungen für und Anforderungen an immobilisierte Enzyme für Enzymsensoren weder angesprochen noch offensichtlich gemacht.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Enzymsensoren mit einer verbesserten anfänglichen spezifischen Enzymaktivität. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung der Enzymaktivität von Enzymsensoren, sodass die Haltbarkeit von Enzymsensoren verlängert werden kann.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelderin hat festgestellt, dass sich Enzyme, die in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors immobilisiert werden, für Enzymsensoren besonders eignen, in denen ein hohes (anfängliches) Verhältnis von aktivem zu inaktivem Enzym wünschenswert/erforderlich ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei der Sensor wenigstens eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei das immobilisierte Enzym durch Bildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen, wahlweise unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, zwischen dem Enzym und wenigstens einer Art Makromolekül in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms erhalten wird.
Die Verwendung von immobilisierten Enzymen in einem Enzymsensor, die in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors immobilisiert wurden, wird als nicht nahe liegend betrachtet. Der Fachmann würde eher zu dem Schluss neigen, dass der kompetitive Inhibitor einen nachteiligen Einfluss auf die anschließenden Messeigenschaften des Sensors haben könnte.
Für das Auftragen der Enzymschicht auf den Sensor stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. So kann die Enzymschicht als Teil einer Membran eines Sensors enthalten sein oder sich hinter einer solchen Membran befinden. Alternativ kann die Enzymschicht ein fester Bestandteil des Sensors sein, z. B. in einer Schicht aus Kohlepaste einer Elektrode enthalten sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Enzymschicht in der an dem Sensor anzubringenden Membran enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Membran für einen Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei die Membran eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei das immobilisierte Enzym durch Bildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen, wahlweise unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, zwischen dem Enzym und wenigstens einer Art Makromolekül in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms erhalten wird.
Es wird angenommen, dass Enzymsensoren und Membranen, die wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden, zu Enzymsensoren und Membranen führen, die im Vergleich zu herkömmlich hergestellten Sensoren und Membranen bisher unübertroffen hohe anfängliche spezifische Enzymaktivitäten aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter einen Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei der Sensor wenigstens eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms, wie mit derselben Prüfung bestimmt, wenigstens 50 % der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym beträgt.
Das Auftragen des Enzyms auf den Sensor erfolgt wie vorstehend beschrieben. Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine Membran für einen Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei die Membran wenigstens eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisiertes Enzyms wenigstens 50 % der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym beträgt.
Weiterhin hat sich herausgestellt, dass die Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors in dem Enzymsensor, im Gegensatz zur herkömmlichen Annahme, nicht nur während der Immobilisierungsreaktion, sondern auch danach von Vorteil ist. Die Anmelderin hat festgestellt, dass es besonders vorteilhaft sein kann, das immobilisierte Enzym, das in einem Enzymsensor enthalten ist, einem kompetitiven Inhibitor auszusetzen, um die Stabilität der Enzymaktivität zu erhöhen und damit die Haltbarkeit eines Sensors zu verlängern.
Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität eines immobilisierten Enzyms, das in einem Enzymsensor enthalten ist, bereit, das einen periodischen oder ununterbrochenen Kontakt des immobilisierten Enzyms mit einer Lösung umfasst, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst.
Die verbesserte Stabilität wird sowohl bei einem Enzymsensor mit einem immobilisierten Enzym erreicht, der durch Bildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen zwischen dem Enzym und einem Makromolekül in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms erhalten wird, als auch bei einem Enzymsensor mit einem immobilisierten Enzym, der wie vorstehend beschrieben, jedoch in Abwesenheit eines kompetitiven Inhibitors erhalten wird, sowie bei jedem anderen Enzymsensor mit einem immobilisierten Enzym.
Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung neue und ausgesprochen wertvolle Enzymsensoren und Membranen für Enzymsensoren bereit. Enzymsensoren gewinnen für analytische Zwecke zunehmend an Bedeutung, da es wünschenswert ist, routinemäßig eine hohe Anzahl an Prüfflüssigkeiten unter Verwendung automatischer Vorrichtungen im Hinblick auf ihre Konzentration (oder Aktivität) zu untersuchen. Ein Beispiel für eine vollautomatische Analysevorrichtung zur Behandlung biologischer Proben, und für die die neuen Enzymsensoren besonders geeignet sind, ist das Blutgassystem ABL^TM System 625 (Radiometer Medical A/S, Kopenhagen, Dänemark). Von einem solchen System erwartet der Anwender, dass es lange Nutzungszeiten (Betriebszeit) und sehr kurze und seltene Wartungszeiten (Ausfallzeit) hat. Demzufolge sollten Enzymsensoren, die in derartigen Einrichtungen zum Einsatz kommen, eine lange Haltbarkeit aufweisen. Die vorliegende Erfindung stellt Enzymschichten für Enzymsensoren mit langer Haltbarkeit bereit.
Der Analyt, der von dem Enzymsensor gemessen werden soll, kann jeder Stoff sein, der ein Substrat eines Enzyms darstellt, das in der Membran eines Sensors enthalten sein kann. Insbesondere interessante Analyte sind im vorliegenden Zusammenhang Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkohole, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteine, Triglyceride, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin. Ein besonders relevanter Analyt im vorliegenden Zusammenhang ist Lactat. Andere Analyte, deren Messung von Interesse sein könnte, sind glykierte Aminosäuren, Gerinnungsfaktoren und Sepsismarkern.
Die Wahl eines einschlägigen Enzyms für einen Sensor wird selbstverständlich von dem Analyt bestimmt. Dabei sollte ebenfalls beachtet werden, dass eines oder mehrere der Reaktionsprodukte der Enzym/Analyt-Reaktion (der Sekundärspezies) entweder direkt oder nach einer anschließenden Umwandlung in einen nachweisbaren Stoff nachweisbar sein müssen. Eine bevorzugte Sekundärspezies ist Wasserstoffperoxid, das durch herkömmliche Elektroden nachgewiesen werden kann.
Demgemäß sind die bevorzugten Enzyme im vorliegenden Zusammenhang solche, für die ein Analyt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkoholen, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteinen, Triglyceriden, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin, ein Substrat ist.
Insbesondere interessante Enzyme sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus α-Hydroxyoxidase (E.C.1.1.3.15), Lactatoxidase (E.C.1.1.3.2.), Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4), Urease (E.C.3.5.1.5), Kreatin-Amidohydrolase (E.C.3.5.2.10), Kreatin-Amidinohydrolase (E.C.3.5.3.3), Sarcosinoxidase (E.C.1.5.3.1), Glutamatdehydrogenase (E.C.1.4.1.3), Pyruvatkinase (E.C.2.7.1.40), langkettige Alkoholoxidase (E.C.1.1.3.20) und Lactatdehydrogenase (E.C.1.1.1.27), wobei Lactatoxidase besonders bevorzugt ist.
Der Analyt kann im Prinzip in jeder beliebigen Art von Prüfflüssigkeit vorliegen, wobei im vorliegenden Zusammenhang der Begriff "Prüfflüssigkeit" jede Flüssigkeit bedeuten soll, die einen Analyt umfasst, dessen Konzentration oder Aktivität wünschenswerterweise gemessen werden soll.
Einschränkungen im Hinblick auf die Art der Prüfflüssigkeit werden häufig durch die Materialien auferlegt, die für den Enzymsensor und insbesondere die Membran gewählt wurden. Vorzugsweise ist die Prüfflüssigkeit eine wässrige Prüfflüssigkeit, z. B. eine Prüfflüssigkeit natürlichen Ursprungs.
Insbesondere interessante Prüfflüssigkeiten sind im vorliegenden Zusammenhang biologische Proben von Tieren und Menschen, insbesondere von Menschen. Derartige biologische Proben können entweder direkt verwendet werden oder sie können verdünnt oder auf verschiedene Weise behandelt werden, um Spezies zu entfernen, die ansonsten das Enzym, den Detektor oder den Analyt stören könnten. Beispiele für biologische Proben sind Vollblut, z. B. verdünntes oder unverdünntes Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Rückenmarksflüssigkeit, Synovia, Urin, Speichel und Milch. Weitere interessante Prüfflüssigkeiten sind z. B. Dialyseflüssigkeiten.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Vorteile von kompetitiven Inhibitoren bei Immobilisierungsreaktionen und anschließend als Stabilisierungsmittel. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass die Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors bei der Bildung von kovalenten Bindungen zwischen einem Enzym und einem oder mehreren Makromolekülen das Risiko ausschaltet oder senkt, dass chemische funktionelle Gruppen an dem aktiven Zentrum des Enzyms (dem Ort, an dem ein Substrat des Enzyms bei der Ausübung der enzymatischen Wirkung angelagert wird) an der Reaktion zur Bildung der kovalenten Bindung beteiligt sind. Somit wird angenommen, dass in den Fällen, in denen kein kompetitiver Inhibitor vorhanden ist, chemische funktionelle Gruppen an dem aktiven Zentrum, z. B. Amino- und Guanidingruppen von Lysinen bzw. Argininen, an der Reaktion zur Bildung der kovalenten Bindung beteiligt sein können, wodurch die Enzymaktivität gesenkt oder unterdrückt wird.
Ein kompetitiver Inhibitor eines bestimmten Enzyms ist dadurch gekennzeichnet, dass er an dem oder in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrum(s) des Enzyms bindet, sodass ein Substrat des Enzyms daran gehindert wird, sich sofort an das aktive Zentrum anzulagern. In Abhängigkeit von der Affinität (für das fragliche Enzym) und der Konzentration des kompetitiven Inhibitors im Vergleich zu der Affinität (für das fragliche Enzym) und der Konzentration des Substrats kommt es jedoch zu einer Konkurrenzreaktion (daher kompetitiv) zwischen dem Inhibitor und dem Substrat bezüglich des Besetzens des aktiven Zentrums.
Geeignete kompetitive Inhibitoren können alle kompetitiven Inhibitoren des fraglichen Enzyms sein, die in dem Fachgebiet bekannt sind. Auch "teilweise" kompetitive Inhibitoren gelten im vorliegenden Zusammenhang als kompetitive Inhibitoren. Es wird jedoch angenommen, dass die kompetitiven Inhibitoren, die im vorliegenden Zusammenhang von besonderer Relevanz sind, diejenigen sind, die einerseits während der Immobilisierungsreaktion wirksam an dem fraglichen Enzym binden und andererseits durch das Substrat (den Analyt) des fraglichen Enzyms ersetzt werden können, wenn das immobilisierte Enzym in dem Enzymsensor enthalten ist. Es ist vorgesehen, dass insbesondere geeignete kompetitive Inhibitoren solche sind, die eine Affinität (1/K_i) für das fragliche Enzym aufweisen, die ungefähr das 0,0001- bis 10fache, wie das 0,001- bis 5fache, der Affinität des Substrats für das Enzym beträgt.
Für eines der interessantesten Enzyme im vorliegenden Zusammenhang, d. h. Lactatoxidase, werden bevorzugte kompetitive Inhibitoren ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oxalacetat, Oxalat, α-Hydroxysulfonat, Bisulfit und Phenylacetat. Oxalat hat sich als besonders bevorzugt erwiesen.
Analog zur Gegenwart von kompetitiven Inhibitoren sollte es ebenfalls selbstverständlich sein, dass jedes Co-Enzym, ohne das das Enzym keine Enzymaktivität zeigen kann, während der Immobilisierungsreaktion vorhanden ist, sodass (i) die Immobilisierungsreaktion durchgeführt wird, wenn das Enzym in seiner aktiven Konformation vorliegt, und (ii) das Zentrum, an das das Co-Enzym gebunden ist, nicht durch kovalente Bindungen an das oder die Makromoleküle blockiert ist.
Im vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff "Makromolekül" als ein Molekül mit hohem Molekulargewicht zu verstehen, das das eigentliche Enzym sein kann. Das Makromolekül sollte eine chemische funktionelle Gruppe aufweisen, die die Bildung von kovalenten Bindungen zwischen dem Makromolekül und dem fraglichen Enzym zulässt. Es ist offensichtlich, dass das Makromolekül sowohl natürlichen Ursprungs als auch synthetischen Ursprungs (z. B. ein synthetisches organisches Polymer) sein kann.
Beispiele für Makromoleküle natürlichen Ursprungs sind Proteine, z. B. Albumine und Albuminderivate, wie Serumalbumin (z. B. bovines Serumalbumin und bovines Serumalbumin-Cysteinyl), Conalbumin (Ovotransferrin) Ovalbumin (Eiweiß-Albumin), Lactalbumin, Weizenalbumin und Sojaalbumin.
Beispiele für Makromoleküle synthetischen Ursprungs sind polymere Verbindungen, wie Polyolefine und Derivate davon, z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und Poly(meth)acrylat, Polyester, Polyethern, Polyalkylenglycole, z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Polybutylenglycol, Polyamide und synthetische Polypeptide, Dextrane und Proteine.
Unter den vorstehend genannten einschlägigen Beispielen sind Makromoleküle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Albuminen und Albuminderivaten, wie bovinem Serumalbumin, bovinem Serumalbumin-Cysteinyl, Conalbumin (Ovotransferrin) und Ovalbumin (Eiweiß-Albumin), besonders bevorzugt.
Das gewichtsgemittelte Molekulargewicht der Makromoleküle, die in Verbindung mit der Immobilisierung von Enzymen von besonderer Relevanz sind, beginnt bei 10.000, wie in dem Bereich von 10.000 bis 1.000.000, vorzugsweise 10.000 bis 200.000, insbesondere 20.000 bis 100.000.
Die Immobilisierungsreaktion (Vernetzungsreaktion) kann entweder mittels einer direkten Reaktion zwischen dem Enzym und dem Makromolekül oder unter Verwendung eines Vernetzungsmittels durchgeführt werden. Üblicherweise ist ein Vernetzungsmittel erforderlich. Vernetzungsmittel sind dem Fachmann bekannt, besonders bevorzugte Vernetzungsmittel für die hier beschriebenen Enzyme sind jedoch ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glutaraldehyd, Divinylsulfon, Cyanurchlorid, Diisocyanaten, Polyisocyanaten, Diisothiocyanaten und Polyisothiocyanaten, wobei Glutaraldehyd bevorzugt ist.
Der Vernetzungsgrad sollte derart sein, dass einerseits ein Auslaugen des immobilisierten Enzyms verhindert wird und andererseits die Mobilität der verschiedenen Domänen des Enzyms erhalten bleibt (da ansonsten die Enzymaktivität beeinträchtigt ist). Es wird angenommen, dass ein gewichtsgemitteltes Molekulargewicht des Enzym/Makromolekül-Konjugats (des immobilisierten Enzyms) wenigstens 100.000 betragen und vorzugsweise in dem Bereich von 100.000 bis 5.000.000, insbesondere 200.000 bis 4.000.000, liegen sollte, damit das immobilisierte Enzym nicht in der Lage ist oder im Wesentlichen nicht in der Lage ist, durch die Außenschicht eines Enzymsensors, z. B. eine Diffusion begrenzende Schicht (siehe nachstehend), zu diffundieren und gleichzeitig in einem wässrigen Medium, z. B. einem Puffer, ausreichend löslich oder dispergierbar ist, sodass eine Handhabung vor die Aufnahme in die Membran möglich ist.
Die immobilisierten Enzyme werden vorzugsweise wie folgt hergestellt: (a) es wird eine Lösung hergestellt, die das Enzym, wenigstens eine Art Makromolekül und einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst und (b) ein Vernetzungsmittel in die Lösung eingebracht. Weiterhin kann nach Ablauf der gewünschten Reaktionszeit (c) ein Quenchreagenz zugegeben werden, um Reste des Vernetzungsmittels zu inaktivieren und die Reaktion wirksam zu beenden. Quenchreagenzien sind Reagenzien, die mit dem Vernetzungsmittel oder einer Zwischenstufe, die von dem Vernetzungsmittel abgeleitet ist, reagieren.
Es wird angenommen, dass ein gründliches Vermischen der Lösung, die das Enzym, das Makromolekül und den kompetitiven Inhibitor umfasst, durchgeführt werden sollte, um ein Gleichgewicht zwischen dem gelösten kompetitiven Inhibitor und dem enzymgebundenen kompetitiven Inhibitor zu erreichen.
Die Vernetzungsreaktion sollte vorzugsweise bei einer Temperatur in dem Bereich von 0–40 °C, mehr bevorzugt in dem Bereich von 10–30 °C, stattfinden, sodass das Enzym während der Vernetzungsreaktion nicht denaturiert wird. Die Vernetzungsreaktion wird vorzugsweise bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Was das Reaktionsmedium betrifft, wird angenommen, dass ein wässriges Medium gegenüber einem organischen Medium bevorzugt ist. Das wässrige Medium sollte vorzugsweise ein Puffer sein, dessen pH-Wert auf einen Wert in dem Bereich 5,0–9,0, insbesondere in dem Bereich 6,0–8,0, eingestellt ist. Besonders bevorzugt sind Phosphatpuffer.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird immobilisierte Lactatoxidase für den Sensor aus 4–7 Gew.-Teilen, wie 5–6 Gew.-Teilen, Lactatoxidase, 8–12 Gew.-Teilen, wie 9–11 Gew.-Teilen, bovinem Serumalbumin-Cysteinyl und 1,5–3,5 Gew.-Teilen, wie 2–3 Gew.-Teilen, Vernetzungsmittel unter Verwendung von 12–15 Gew.-Teilen, wie 13–14 Gew.-Teilen, Natriumoxalat hergestellt (siehe Beispiel 1).
Es ist offensichtlich, dass es vorteilhaft sein kann, einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms für den Fall zuzugeben, dass das immobilisierte Enzym vor der Aufnahme in einen Sensor oder eine Membran eines Sensors gelagert werden muss.
Das Enzym eines Enzymsensors ist üblicherweise in einer Membran enthalten, die für den Kontakt mit der Prüfflüssigkeit geeignet ist.
Die erfindungsgemäßen Membranen sind vorzugsweise Membranen, die eine Enzymschicht umfassen, die als Teil einer Membran enthalten ist oder sich hinter einer solchen Membran befindet. Die Membran kann mehrere Aufgaben erfüllen, einschließlich der Gewährung von Schutz vor potenziell schädlichen Stoffen in der Prüfflüssigkeit, der Gewährleistung einer Rückhaltung des Enzyms in der Membran und der Ermöglichung von optimalen Diffusion begrenzenden Bedingungen für den zu untersuchenden Analyt, um eine ausreichende Linearität des Sensors zu erhalten.
Demzufolge ist es bevorzugt, dass die Membranen eine Diffusion begrenzende Schicht umfassen, die so beschaffen ist, dass sie die Enzymschicht von der Prüfflüssigkeit trennt. Die Diffusion begrenzende Schicht ist eine poröse Membranschicht, die die Diffusion des Analyts in die Enzymschicht derart begrenzt, dass die Kapazität des immobilisierten Enzyms bei der Umwandlung des Analyts nicht überschritten wird und dass für die enzymatische Umwandlung des Analyts in der Enzymschicht ausreichend O₂ vorhanden ist. Das Prinzip der Diffusion begrenzenden Schichten ist in dem Dänischen Patent Nr. 170103 beschrieben.
Die Diffusion begrenzende Schicht kann aus einer Membran eines Typs bestehen, der normalerweise für Sensoren verwendet wird. Diese umfassen Membranen vom Typ Lösung/Diffusion (z. B. Hydrogele), Track-Etch-Membranen (mit geraden Poren), Verbundmembranen und Membranen nach dem Prinzip der pasteurschen Schleife.
Zu den Materialien für eine Diffusion begrenzende Schicht kann jedes Membranmaterial für Sensoren gehören, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Beispiele sind Polyolefine und Derivate davon, z. B. Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol und Poly(meth)acrylat, Polyester, Polyethern, Polyalkylenglycole, z. B. Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und Polybutylenglycol, Polyamide, Silikone und regenerierte Cellulose. Polyestern, wie Polyethylenterephthalat, können besonders geeignet sein. Andere Polymere, wie z. B. Polycarbonate und Polyurethane, können ebenfalls nützlich sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Diffusion begrenzende Schicht durchgehende Poren, die für den Analyt permeabel und für das immobilisierte Enzym impermeabel oder im Wesentlichen impermeabel sind, und wenigstens ein Teil der Poren sollte sich natürlich von der Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht, die angepasst ist, zu der Prüfflüssigkeit zu weisen, zu der Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht, die so beschaffen ist, dass sie zu der Enzymschicht weist, erstrecken.
Es ist offensichtlich, dass die durchgehenden Poren der Diffusion begrenzenden Schicht Wände aufweisen und dass die Oberfläche dieser Wände zusammen mit der Oberfläche, die angepasst ist, zu der Prüfflüssigkeit zu weisen, eine zugängliche Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht bestimmt, d. h. die für die Prüfflüssigkeit zugängliche Oberfläche. Diese zugängliche Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht sollte vorzugsweise hydrophil sein, damit sich z. B. keine Blutproteine an der Oberfläche anlagern können. Demzufolge kann die zugängliche Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht, wenn sie selbst nicht hydrophil genug ist, derivatisierbare chemische Gruppen aufweisen, von denen wenigstens ein Teil mit einer hydrophilen Komponente derivatisiert ist, wodurch die zugängliche Oberfläche hydrophiler gemacht wird als die entsprechende nicht derivatisierte Oberfläche.
Die derivatisierbaren chemischen Gruppen können in der natürlichen Form des Materials der Membranschicht vorliegen oder sie können nach einer Behandlung des Materials der Membranschicht mit einem chemischen Reagenz oder nach einer Bestrahlung der Membran entstehen.
Die hydrophile Komponente sollte so ausgewählt sein, dass die oberflächenbehandelte Membranschicht unter normalen Reinigungs- und Spülbedingungen, die für Enzymsensoren gelten, nicht zersetzt wird. Somit ist vorgesehen, dass Polyalkylenglycole, wie Polyethylenglycol (PEG), Heparin, Hyaluronsäure, Phospholipide, Agarose, Chitosan, Cyclodextrin, Alginat, Collagen, Lignin, Pektin sowie Polysaccharide und Polymere auf Cellulosebasis, wie Dextrin, Hydroxyalkylcellulosen, Celluloseacetate, Albumin, Gelatine, Agar, Carageenane und Stärke als hydrophile Komponenten geeignet sind. Außerdem können hydrophile synthetische organische Polymere, z. B. Polyvinylalkohol/Polyvinylacetate, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyalkyl(meth)acrylate, wie Hydroxymethyl(meth)acrylat und Hydroxyethyl(meth)acrylat, (Meth)Acrylsäure, Allylalkohol und Acrylpolymere (Hydrogele) verwendet werden.
Unter diesen möglichen hydrophilen Komponenten sind Polyethylenglycol und Heparin besonders interessant. Weiterhin gelten Polyethylenglycole mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 100 bis ungefähr 2000, wie von ungefähr 200 bis ungefähr 1000, als besonders relevant als hydrophile Komponenten.
Es ist offensichtlich, dass aus praktischen Gründen häufig die gesamte Oberfläche der Membranschicht und der Poren modifiziert ist, d. h. auch die Oberfläche der Membranschicht, die angepasst ist, zu der Enzymschicht zu weisen.
Die erfindungsgemäße Membran kann ferner eine Störungen eliminierende Schicht aufweisen, die für das Produkt der Enzym/Analyt-Reaktion permeabel und für den Analyt und das immobilisierte Enzym impermeabel oder im Wesentlichen impermeabel ist. Die Störungen eliminierende Schicht sollte vorzugsweise auch für andere chemische Komponenten, die in der Prüfflüssigkeit vorhanden sein können, impermeabel sein. Ein höchst geeignetes Material, das z. B. für HEPES, Ascorbinsäure und Paracetamol impermeabel und für z. B. H₂O₂ permeabel ist, ist Celluloseacetat.
Somit umfasst die Membran in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung:

(a) eine Diffusion begrenzende Schicht, die Polyethylenterephthalat umfasst, wobei die zugängliche Oberfläche der Diffusion begrenzenden Schicht Carboxylgruppen aufweist, wobei wenigstens ein Teil dieser Carboxylgruppen durch kovalent daran gebundenes Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht in dem Bereich von 100–1000 derivatisiert ist;
(b) eine Enzymschicht, die immobilisierte Lactatoxidase umfasst, und
(c) eine Störungen eliminierende Schicht, die Celluloseacetat umfasst.

Die einzelnen Membranschichten werden in kongruente Stücke geschnitten und z. B. in einem Membranring zusammengesetzt. Die Membran weist vorzugsweise eine Dicke in dem Bereich von 10–50 μm, insbesondere in dem Bereich von 10–30 μm auf. Die Dicke der Diffusion begrenzenden porösen Membranschicht beträgt vorzugsweise 5–20 μm, die der Enzymschicht vorzugsweise 1–3 μm und die der Störungen eliminierenden Schicht vorzugsweise 5–10 μm.
Der erfindungsgemäße Sensor kann auf einem oder mehreren anwendbaren Detektorprinzipien beruhen, wie den elektrochemischen oder optischen Prinzipien. Demzufolge kann die Oberfläche des Detektorteils des Sensors z. B. ein Teil einer Elektrode oder eines optischen Detektors sein. Der Detektorteil des Sensors ist vorzugsweise ein Teil einer Elektrode.
Die Elektrode kann eine Anode z. B. aus Kohlepaste oder Platin, Gold, Iridium, Rhodium, Palladium und Legierungen oder Pasten davon und eine Bezugselektrode z. B. aus Silber/Silberchlorid, Silber/Silberoxid oder Quecksilber/Quecksilber(I)chlorid umfassen. Die Elektrode kann ferner jede erforderliche Elektrolytlösung umfassen. Vorzugsweise umfasst die Elektrode eine Platinanode und eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode.
Wie vorstehend beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung Enzymsensoren und Membranen für Enzymsensoren bereit, deren anfängliche spezifische Enzymaktivität verbessert wurde. Somit beträgt die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms, das in einer Membran eines Enzymsensors enthalten ist, in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wenigstens 50 % der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym. Vorzugsweise und dazu realistisch beträgt die anfängliche spezifische Enzymaktivität wenigstens 60 %, wie wenigstens 70 %, insbesondere wenigstens 80 % oder sogar wenigstens 90 %, im Vergleich zu der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym.
In Beispiel 4 beträgt die anfängliche spezifische Enzymaktivität von immobilisierter Lactatoxidase 78 % (Tabelle 1). Demzufolge stellt immobilisierte Lactatoxidase, die wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurde, eine bevorzugt Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, wenn sie in eine Membran des Enzymsensors eingearbeitet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms wenigstens das 1,5fache der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an Enzym, das, sofern erforderlich, unter Verwendung desselben Vernetzungsmittels in Abwesenheit eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms auf derselben Art Makromolekül immobilisiert wurde. Aus Beispiel 4 geht hervor, dass immobilisierte Lactatoxidase dieses Kriterium erfüllt, siehe Tabelle 1.
Wie aus dem vorstehend Genannten eindeutig hervorgehen sollte, stellt die vorliegende Erfindung Enzymsensoren und Membranen für Enzymsensoren bereit, die so aufgebaut sind, dass sie eine bisher unübertroffene Haltbarkeit haben. Die anfängliche spezifische Enzymaktivität ist somit bei Verwendung einer bestimmten Menge eines (nicht immobilisierten) Enzyms in der hier beschriebenen Immobilisierungsreaktion höher als bei Verwendung unter herkömmlichen Bedingungen und folglich ist der Zeitraum, bis die Enzymaktivität ein Niveau erreicht, bei dem der Sensor nicht länger verwendbar ist, länger.
Neben den neuen Enzymsensoren mit langer Haltbarkeit hat die Anmelderin festgestellt, dass die Aufbewahrung von Enzymen in einem Medium, das einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, die Stabilität der Enzymaktivität verbessert (siehe Beispiel 5). Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung, wie vorstehend erwähnt, ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität eines immobilisierten Enzyms bereit, das in einem Enzymsensor zum Messen der Konzentration eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit enthalten ist, wobei der Analyt ein Substrat des Enzyms darstellt, wobei das Verfahren einen periodischen oder ununterbrochenen Kontakt des immobilisierten Enzyms mit einer Lösung umfasst, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst.
Hinsichtlich der Definitionen für den Sensor, das Enzym und den kompetitiven Inhibitor usw. gelten hier auch die vorstehend genannten Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen. Somit kann das immobilisierte Enzym als fester Bestandteil des Sensors oder in einer Membran des Enzymsensors enthalten sein.
Es ist offensichtlich, dass das Verfahren auch dann anwendbar ist, wenn eine Austauschmembran eines Enzymsensors vor dem Anbringen an dem Sensor aufbewahrt werden muss. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität eines immobilisierten Enzyms bereit, das in einer Membran für einen Enzymsensor enthalten ist.
In einer höchst interessanten Ausführungsform, bei der das Verfahren in Verbindung mit einem Enzymsensor durchgeführt wird, der entweder getrennt von oder als Teil einer vollautomatischen Vorrichtung verwendet wird, wird die Enzymschicht, die das immobilisierte Enzym umfasst, zwischen jeder oder im Wesentlichen jeder Messung des Analyts oder zwischen jeder oder im Wesentlichen jeder Messreihe mit dem Analyt in Kontakt mit einer Lösung gebracht, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst. Auf diese Weise kann der kompetitive Inhibitor in der Spülflüssigkeit des Sensors enthalten sein, um den Spülvorgang des Sensors zu optimieren und zu vermeiden, dass der Kontakt der Enzymschicht mit dem kompetitiven Inhibitor ein getrennter Verfahrensschritt wird.
Die Konzentration des kompetitiven Inhibitors in der Spülflüssigkeit sollte vorzugsweise derart sein, dass die Erhöhung von t_½ der Enzymaktivität wenigstens 50 %, wie wenigstens 100 %, insbesondere wenigstens 200 % beträgt, wenn das fragliche Enzym auf Dauer in der Spülflüssigkeit, die den kompetitiven Inhibitor in genauer dieser Konzentration umfasst, aufbewahrt wird.
Einschlägige kompetitive Inhibitoren, die einerseits die Fähigkeit aufweisen, eine Enzymzusammensetzung, insbesondere eine Zusammensetzung mit immobilisiertem Enzym, wirksam zu stabilisieren und andererseits den Ablauf der Enzymreaktion in (gleichzeitiger) Gegenwart eines Substrats des Enzyms ermöglichen, sind solche, die eine Bindungsaffinität für das aktive Zentrum des Enzyms aufweisen, die gleich der oder etwas geringer als die Bindungsaffinität des fraglichen Substrats ist.
In einer besonders interessanten Ausführungsform wird das Verfahren mit Lactatoxidase durchgeführt, die in einem Enzymsensor zum Messen von Lactat in einer biologischen Probe enthalten ist.
Dieses ausgesprochen wertvolle Prinzip zur Stabilisierung der Enzymaktivität kann für Enzymsensoren im Allgemeinen verwendet werden, sodass die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Lösung, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, als Stabilisierungsmittel eines immobilisierten Enzyms, das in einem Enzymsensor enthalten ist, betrifft. Eine derartige Lösung kann eine Spül- oder Reinigungsflüssigkeit für den Sensor darstellen. Es sei jedoch bemerkt, dass eine Lösung, die einen kompetitiven Inhibitor umfasst, auch zur Stabilisierung von nicht immobilisierten Enzymen oder Enzymen, die auf eine andere Weise als hier beschrieben immobilisiert wurden, verwendet werden kann.
Die hier beschriebenen Enzymsensoren und Membranen sind besonders zur Verwendung in vollautomatischen Vorrichtungen zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines oder mehrerer Analyte in einer Prüfflüssigkeit geeignet. Es ist möglich, das erfindungsgemäße Verfahren in derartigen im Handel erhältlichen vollautomatischen Vorrichtungen mit nur geringen baulichen Veränderungen oder dem Austausch der Spülflüssigkeit(en) des Enzymsensors bzw. der Enzymsensoren zu verwenden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines oder mehrerer Analyte in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei die Vorrichtung einen Enzymsensor mit einer Schicht immobilisiertem Enzym umfasst, für das wenigstens einer der Analyte ein Substrat darstellt, wobei die Vorrichtung weiterhin einen oder mehrere Behälter mit einer oder mehreren Lösungen, die für den Betrieb der Vorrichtung erforderlich sind, wobei wenigstens eine Lösung einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, und Mittel zum periodischen In-Kontakt-Bringen des Sensors mit der Lösung, die den kompetitiven Inhibitor umfasst, umfasst.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Enzymsensor 1, der eine Elektrode und eine Membran umfasst,
2 zeigt detailliert den Membranteil der Membran aus 1 und
3 zeigt skizzenhaft eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1 zeigt einen Enzymsensor 1 zum Messen von Lactat.
Eine durch Enzyme katalysierte Reaktion zwischen Lactat und Sauerstoff ergibt Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und Pyruvat. Das erzeugte Wasserstoffperoxid wird anschließend mit einer amperometrischen Elektrode erfasst. Der Sensor 1 eignet sich für das Anbringen in einer Vorrichtung zum Messen der Konzentration von Analyten in einer biologischen Probe, z. B. einem Blutgassystem ABL^TM 625 (Radiometer Medical A/S, Kopenhagen, Dänemark).
Grundsätzlich umfasst der Sensor 1 eine Elektrode 2, an der ein Membranring 3 angebracht ist. Die Elektrode 2 umfasst eine Platinanode 4, die mit einem Platindraht 5 verbunden ist, der wiederum über einen Mikrostecker 6 mit einem Anodenkontaktkörper 7 aus Silber verbunden ist. Die Platinanode 4 und der untere Teil des Platindrahts 5 sind dicht in einem Glaskörper 8 eingeschlossen. Zwischen dem Glaskörper 8 und dem Mikrostecker 6 ist der Platindraht 5 durch Schrumpfschlauchmaterial geschützt. Eine röhrenförmige Bezugselektrode 10 aus Silber umhüllt den oberen Teil des Glaskörpers 8 und erstreckt sich über die Länge der Elektrode 2 zu dem Anodenkörper 7, der mittels eines Befestigungskörpers 11 und Epoxyd 12 in der Bezugselektrode 10 befestigt ist. Der untere Teil des Glaskörpers 8 ist von einem Elektrodenträger 13 umgeben, an dem der Membranring 3 angeordnet ist.
Der obere Teil der Bezugselektrode 10 ist von einem Steckteil 14 umgeben, mit dem die Elektrode 2 in einem entsprechenden Stecker an der Analysevorrichtung (nicht dargestellt) angebracht und mit einer Verkleidung 15 gesichert wird. Zwischen der Elektrode 2 und der Verkleidung 15 sind Dichtungen 16 und 17 angeordnet, mit denen sichergestellt wird, dass Elektrolyt an der Messoberfläche der Elektrode 2 nicht verdampft. Der Membranring 3, der an einem Ende der Verkleidung 15 angebracht ist, umfasst einen Ring 20. Eine Membran 21 wird gestreckt über die untere Öffnung des Rings 20 gelegt. Diese Membran 21 ist detailliert in 2 dargestellt.
2 zeigt eine Membran 21, die drei Schichten umfasst: eine Störungen eliminierende Membranschicht 22, die zu der Platinanode 4 der Elektrode 2 weist, eine Enzymschicht 23 und eine Diffusion begrenzende poröse Membranschicht 24, die zu der Prüfflüssigkeit weist. Die Störungen eliminierende Membranschicht 22 kann eine 6 ± 2 μm dicke poröse Membran aus Celluloseacetat (CA) sein. Die Enzymschicht ist üblicherweise eine ungefähr 1–2 μm dicke Schicht aus vernetzter Lactatoxidase (7 Einheiten/Membran). Die Diffusion begrenzende poröse Membranschicht 24 kann eine ungefähr 10 μm dicke Schicht aus Polyethylenterephthalat (PETP) (Porendurchmesser ungefähr 0,1 μm; Porendichte: 8 × 10⁵ Poren/cm²) sein.
3 zeigt skizzenhaft eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 30. Die Vorrichtung 30 umfasst mehrere Sensoren 1, 31–36 zum Messen der Konzentration oder Aktivität verschiedener Analyte in einer Prüfflüssigkeit. Zu den Sensoren gehört eine Bezugselektrode 31, Sensoren zum Messen von z. B. pH, pO₂, pO₂ usw. 32–36 und ein Enzymsensor 1 zum Messen von Lactat, der dem Sensor ähnlich ist, der vorstehend unter Bezugnahme auf 1 und 2 beschrieben ist. Die Sensoren 1, 31–36 befinden sich in einem Messabschnitt, der durch die gestrichelte Linie 38 markiert ist.
Die Vorrichtung 30 weist einen Eingang 40 zur Einführung einer Prüfflüssigkeit in die Vorrichtung 30 sowie mehrere Behälter 50–54 mit Lösungen, die für den Betrieb der Vorrichtung 30 erforderlich sind, auf. Somit umfasst der Behälter 50 eine Elektrolytbrückenlösung für die Bezugselektrode 31, die Behälter 51 und 53 umfassen verschiedene Kalibrierungslösungen für die Sensoren 1, 32–36, der Behälter 52 umfasst eine Reinigungslösung für die Sensoren 1, 32–36 und schließlich umfasst der Behälter 54 eine Spüllösung für die Sensoren 32–36. Die Spüllösung in dem Behälter 54 umfasst Oxalat, das, wie vorstehend erwähnt, einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms Lactatoxidase in dem Lactat-Enzymsensor 1 darstellt.
Die Vorrichtung 30 umfasst des Weiteren einen Abfallbehälter 55 und Lufteinlässe 56, 57. Ein Kanalsystem für Flüssigkeiten (als dunkle Linien dargestellt) verbindet den Eingang 40, die Behälter 50–55 und die Lufteinlässe 56, 57 mit den Sensoren 1, 31–36. In dem Kanalsystem für Flüssigkeiten können die Prüfflüssigkeit vom Eingang, die Lösungen aus den verschiedenen Behältern 50–54 und wahlweise die Luft von den Lufteinlässen 56, 57 mittels Pumpen 61, 62 und einem Hauptventil 63, das durch nicht dargestellte Software der Vorrichtung 30 gesteuert wird, gefördert werden.
Wenn eine Prüfflüssigkeit in den Eingang eingeführt wurde, werden die Pumpen 61, 62 und das Hauptventil 63 aktiviert, um die Prüfflüssigkeit zu dem Messabschnitt 28 zu fördern und die Prüfflüssigkeit wird analysiert. Dann wird die Prüfflüssigkeit zu dem Abfallbehälter 55 gefördert. Anschließend wird ein Spülvorgang durchgeführt, der das Aktivieren der Pumpen 61, 62 und des Hauptventils 63 zum Fördern von Spülflüssigkeit aus dem Behälter 54 durch das Kanalsystem für Flüssigkeiten zu den Sensoren 1, 31–36 in dem Messabschnitt 28 und von dort zu dem Abfallbehälter 55 umfasst. Während dieses Spülvorgangs kommt der Lactat-Enzymsensor 1 mit dem Oxalat, das in der Spülflüssigkeit enthaltend ist, in Kontakt. Somit ist der Lactat-Enzymsensor 1, der in der Vorrichtung 30 enthalten ist, häufig dem kompetitiven Inhibitor Oxalat ausgesetzt, da dies nach jeder Messung, die in der Vorrichtung 30 durchgeführt wird, stattfindet.
PRÜFUNGSSPEZIFIKATIONEN
Prüfung der Enzymaktivität
Kolorimetrisches Lactatoxidase-Assay
Lactatoxidase (LOD) katalysiert die Reaktion: L-Lactat + ½O₂ + H₂O → Pyruvat + H₂O₂
Die Bildung von H₂O₂ wird in einem Peroxidase (POD) -Assaysystem bestimmt, in dem ein Chinonimin-Farbstoff gebildet wird. Die Menge an gebildetem Chinonimin-Farbstoff wird spektralfotometrisch bei 490 nm bestimmt.
Peroxidase katalysiert die Reaktion: H₂O₂ + 4-Hydroxybenzolsulfonsäure + 4-Aminoantipyrine → Chinonimin (λ_max: 505 nm)
Verfahren:
Reagenz A:

2 ml 3,3-Dimethylglutarsäure/NaOH (50 mM) Puffer pH 6,5
1 ml Peroxidase (50 E./ml; 3,25 mg in 10 ml H₂O)
1 ml 4-Aminoantipyrin, 15 mM in H₂O
1 ml DL-Lactat 0,5 M, eingestellt auf pH 6,5 mit NaOH
3 ml H₂O
2 ml 0,2 % (Vol./Vol.) 4-Hydroxybenzolsulfonsäure in H₂O

Enzymlösung (zu prüfende Enzymzusammensetzung):

10 ml (immobilisiert) Lactatoxidase (Prüflösung ungefähr 0,04 E./ml in einem 5 mM KH₂PO₄/NaOH-Puffer pH 7,0)

Bezugsenzymlösung:

10 ml Lactatoxidase (Pediococcus) 0,04 E./ml in einem 5 mM KH₂PO₄/NaOH-Puffer pH 7,0

100 μl Reagenz A werden in ein Well einer Mikrotiterplatte (Immunoplate, Nunc, Roskilde, Dänemark) eingetragen. Die Farbreaktion wird durch Zugabe von 100 μl der Enzymlösung gestartet. Sofort danach wird die Mikrotiterplatte in den Plattenhalter eines Inkubators THERMOmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA) mit folgenden Voreinstellungen gestellt: 37 °C, kinetischer Modus, Verzögerungszeit 5 min, Lesedauer 15 min und Automix.
Um einen Bezugswert der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität zu erhalten, werden anstatt der Enzymlösung 100 μl der Bezugsenzymlösung in ein Well gegeben.
Andere Enzyme können auf ähnliche Weise unter Verwendung derselben Reagenzien, sofern das fragliche Enzym Wasserstoffperoxid bildet, oder anderer Reagenzien, die auf ein Produkt der Enzym/Substrat-Reaktion reagieren, geprüft werden.
Prüfung der Enzymstabilität
Die Enzymaktivität von Lactatoxidase (und anderer Enzyme) nimmt exponentiell ab. Aus diesem Grund ist die Halbwertzeit (t_½) der Enzymaktivität unabhängig von der Anfangskonzentration und t_½ ist somit ein hervorragender Ausdruck für die Stabilität eines Enzyms unter verschiedenen Bedingungen.
Die Enzymaktivität der fraglichen Enzymzusammensetzung wird (wie vorstehend unter Prüfung der Enzymaktivität beschrieben) wenigstens vier Mal in dem fraglichen Zeitraum, z. B. jeden Tag über wenigstens vier Tage (Tag 0 bis Tag 3), bestimmt. Anschließend wird t_½ anhand von üblichen mathematischen Verfahren ermittelt.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von immobilisierter Lactatoxidase
2720 Einheiten Lactatoxidase und 40,0 mg bovines Serumalbumin-Cysteinyl wurden in 400 μl 10 mM Phusphatpuffer (pH 7,0) und 1,60 ml 250 mM Dinatriumoxalat gelöst. Die Mischung wurde 10 min lang mit 200 Vibrationen pro min gemischt. Es wurden 400 μl 2,5 % (Vol./Vol. aq.) Glutaraldehyd zugegeben und die Mischung 10 min lang gerührt. Die Mischung wurde mit 100 μl 1 M Glycin gequencht.
Die immobilisierte Lactatoxidase wurde zu einem Volumen von 400 μl ultrafiltriert. Dann wurden 400 μl eines 10 mM Imidazolpuffers (pH 7,0) zugegeben, der 40 % Saccharose enthielt.
Die endgültige Konzentration der immobilisierten Lactatoxidase betrug ungefähr 3400 E./ml.
Beispiel 2
Herstellung einer modifizierten PETP-Membranschicht
Materialien:

Polyethylenterephthalat-Folie Mylar A (Whatmann S.A., Louvain La-Neuve, Belgien) (Dicke: 10 μm ± 1 μm; Porendurchmesser: ungefähr 0,1 μm; Porendichte: 8 × 10⁵ Poren/cm²);
10 g PEG-200-(OH)₂ (Polyethylenglycol mit zwei Hydroxygruppen, mittleres Molekulargewicht 200 g/Mol, Mindestgehalt an Tetraethylenglycol 20 %; Mindestgehalt an Tri-, Tetra- und Pentaethylenglycol 60 %);
2 g CMC-MTS (1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, 95 %) als Kupplungsreagenz;
0,2 g Triton CF-54 und
4000 ml entmineralisiertes Wasser (pH 6,0–6,5)

Das PETP-Material wurde in Bögen geschnitten und jeder Bogen in einem Rahmen befestigt. Der Rahmen wurde 18 Stunden lang in einer Reaktionsmischung bestehend aus PEG-200-(OH)₂, CMC-MTS, Triton CF-54 und Wasser eingetaucht. Anschließend wurden die Bögen unter Rühren 15 min lang mit 0,1 % Triton X-100 in entmineralisiertem Wasser und danach zwei Mal 10 min lang mit entmineralisiertem Wasser gewaschen. Schließlich wurden die Bögen wenigstens 16 Stunden lang unter einer Haube getrocknet. Alle Abläufe fanden bei Raumtemperatur statt.
Die PEG-200-Ketten auf der Oberfläche der Membranschicht dienen als ein Hydrogel, das die Oberfläche polar und nicht reaktiv macht, sodass die Fähigkeit von z. B. Blutprotein, sich an die Oberfläche anzulagern, gemindert oder ganz ausgeschaltet wird.
Beispiel 3
Herstellung einer Membran
Es wurde eine Celluloseacetatmembran von einem in dem Fachgebiet bekannten Typ, wie z. B. in US 3,979,274 beschrieben, hergestellt.
2,0 μl der Lösung, die die immobilisierte Lactatoxidase (Beispiel 1) umfasst, wurde auf die Membranschicht aus Celluloseacetat abgegeben. Die oberflächenmodifizierte PETP-Membranschicht wurde über der Celluloseacetat/Enzym-Schicht angebracht und der "Membranverbund" trocknen gelassen.
Die Membran konnte dann in einem Membranring eines Enzymsensors untergebracht werden.
Beispiel 4
Wirkung der Verwendung von Oxalat in Vernetzungsreaktionen
Es wurden drei Enzymlösungen A, B und C wie folgt hergestellt:
Grundlösung
20 mg (680 Einheiten) Lactatoxidase und 10 mg bovines Serumalbumin-Cysteinyl wurden unter 5 min langem Rühren in 100 μl 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst. Jeweils 25 μl dieser Lösung wurden für die Lösungen A–C verwendet.
Enzymlösung A
100 μl 250 mM Dinatriumoxalat wurden in die Grundlösung eingebracht und anschließend wurde 5 min lang gerührt. Es wurden 25 μl 2,5 % (Vol./Vol. aq.) Glutaraldehyd zugegeben und weitere 10 min lang gerührt, wonach 6,25 μl 1 M Glycin zugegeben wurden.
Enzymlösung B (ohne kompetitiven Inhibitor)
100 μl destilliertes Wasser wurden in die Grundlösung eingebracht und anschließend wurde 5 min lang gerührt. Es wurden 25 μl 2,5 % (Vol./Vol. aq.) Glutaraldehyd zugegeben und weitere 10 min lang gerührt, wonach 6,25 μl 1 M Glycin zugegeben wurden.
Enzymlösung C (ohne Vernetzungsmittel)
100 μl 250 mM Dinatriumoxalat wurden in die Grundlösung eingebracht und anschließend wurde 5 min lang gerührt. Es wurden 25 μl destilliertes Wasser zugegeben und weitere 10 min lang gerührt, wonach 6,25 μl 1 M Glycin zugegeben wurden.
Jede der Lösungen wurde mit einem 10 mM Imidazolpuffer (pH 7,0) auf 0,04 E./ml verdünnt.
Die Stabilität der Zusammensetzungen wurde mit dem hier beschriebenen Stabilitätstest bestimmt.
Die anfängliche spezifische Enzymaktivität von Enzymlösung A und B wurde mit der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität der Bezugslösung (Enzymlösung C) verglichen.
Tabelle 1
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die anfängliche spezifische Enzymaktivität nach dem Vernetzen von Lactatoxidase in Gegenwart von Oxalat verglichen mit der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität der Bezugslösung mit nicht immobilisiertem Enzym 78 % beträgt. Das Vernetzen in Abwesenheit von Oxalat ergab eine anfängliche spezifische Enzymaktivität von nur 37 %.
Beispiel 5
Oxalat als Stabilisierungsmittel für Lactatoxidase
Oxalat ist ein kompetitiver Inhibitor von Lactatoxidase.
Oxalat bindet vermutlich an das aktive Zentrum des Enzyms, weswegen angenommen wird, dass Oxalat die Enzymaktivität von Lactatoxidase stabilisiert, da das Enzym in Gegenwart von Oxalat in der aktiven Konformation "gesperrt" ist.
Es wurde eine Lösung aus 0,04 E./ml Lactatoxidase in Spüllösung S4932 (Radiometer Medical A/S, Kopenhagen, Dänemark) hergestellt. Dazu wurde Dinatriumoxalat gegeben, sodass die Gesamtkonzentration 1, 2, 4, 8 und 16 mM Oxalat betrug. Die Enzymaktivität der Lösungen wurde über einen Zeitraum von 13 Tagen fünf Mal bestimmt. Die Enzymstabilität dieser Lösungen wurde mit der Enzymstabilität einer Lösung ohne Oxalat verglichen.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der spektralfotometrischen Messungen (OD: optische Dichte) und die ermittelten t_½-Werte. Die t_½-Werte der Lösungen zeigen eindeutig, dass die Gegenwart von Oxalat eine bemerkenswert positive Wirkung auf die Stabilität hat. Bei der höchsten Konzentration, 16 mM, wurde die Stabilität (ausgedrückt als t_½) verdreifacht. Somit wird eine etwas geringere anfängliche spezifische Enzymaktivität nach 8–9 Tagen vollständig ausgeglichen.

Claims

Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit, wobei der Sensor wenigstens eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei das immobilisierte Enzym durch Bildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen, wahlweise unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, zwischen dem Enzym und wenigstens einer Art Makromolekül in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms erhalten wird.
Enzymsensor nach Anspruch 1, wobei die Enzymschicht in einer Membran des Enzymsensors enthalten ist.
Enzymsensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym aus Enzymen ausgewählt ist, für die ein Stoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkoholen, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteinen, Triglyceriden, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin, ein Substrat ist.
Enzymsensor nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Enzym Lactatoxidase ist.
Enzymsensor nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das Enzym auf einem Makromolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Albuminen und Albuminderivaten, wie bovinem Serumalbumin, bovinem Serumalbumin-Cysteinyl, Conalbumin (Ovotransferrin) und Ovalbumin (Eiweiß-Albumin), immobilisiert ist.
Enzymsensor nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms wenigstens 50 % der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an nicht immobilisiertem Enzym beträgt.
Enzymsensor nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Enzym Lactatoxidase ist und der kompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxalacetat, Oxalat, α-Hydroxysulfonat, Bisulfit und Phenylacetat.
Enzymsensor nach Anspruch 7, wobei der kompetitive Inhibitor Oxalat ist.
Enzymsensor nach einem der Ansprüche 1–8, wobei die anfängliche spezifische Enzymaktivität des immobilisierten Enzyms wenigstens das 1,5fache der anfänglichen spezifischen Enzymaktivität einer entsprechenden Menge an Enzym, das, sofern erforderlich, unter Verwendung desselben Vernetzungsmittels in Abwesenheit eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms auf derselben Art Makromolekül immobilisiert wurde, beträgt.
Membran eines Enzymsensors zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit bereit, wobei die Membran wenigstens eine Enzymschicht aufweist, die ein immobilisiertes Enzym umfasst, für das der Analyt ein Substrat darstellt, wobei das immobilisierte Enzym durch Bildung einer oder mehrerer kovalenter Bindungen, wahlweise unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, zwischen dem Enzym und wenigstens einer Art Makromolekül in Gegenwart eines kompetitiven Inhibitors des Enzyms erhalten wird.
Membran nach Anspruch 10, wobei das Enzym aus Enzymen ausgewählt ist, für die ein Stoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreativ, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkoholen, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteinen, Triglyceriden, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin, ein Substrat ist, wobei das Enzym vorzugsweise Lactatoxidase ist.
Membran nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Enzym auf einem Makromolekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Albuminen und Albuminderivaten, wie bovinem Serumalbumin, bovinem Serumalbumin-Cysteinyl, Conalbumin (Ovotransferrin) und Ovalbumin (Eiweiß-Albumin), immobilisiert ist.
Membran nach einem der Ansprüche 10–12, wobei das Enzym Lactatoxidase ist und der kompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxalacetat, Oxalat, α-Hydroxysulfonat, Bisulfit und Phenylacetat, wobei der kompetitive Inhibitor vorzugsweise Oxalat ist.
Verfahren zur Verbesserung der Stabilität der Enzymaktivität eines immobilisierten Enzyms, das in einem Enzymsensor zum Messen der Konzentration eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit enthalten ist, wobei der Analyt ein Substrat des Enzyms darstellt, wobei das Verfahren einen periodischen oder ununterbrochenen Kontakt des immobilisierten Enzyms mit einer Lösung umfasst, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das immobilisierte Enzym in einer Membran des Enzymsensors enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Enzym zwischen jeder oder im Wesentlichen jeder Messung des Analyts oder zwischen jeder oder im Wesentlichen jeder Messreihe mit dem Analyt mit einer Lösung, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Lösung, die den kompetitiven Inhibitor umfasst, eine Spülflüssigkeit des Sensors ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14–17, wobei das Enzym aus Enzymen ausgewählt ist, für die ein Stoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkoholen, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteinen, Triglyceriden, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin, ein Substrat ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Enzym Lactatoxidase ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der kompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxalacetat, Oxalat, α-Hydroxysulfonat, Bisulfit und Phenylacetat.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der kompetitive Inhibitor Oxalat ist.
Verwendung einer Lösung, die einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, als Stabilisierungsmittel eines immobilisierten Enzyms, das in einem Enzymsensor enthalten ist, wobei der Enzymsensor zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines Analyts in einer Prüfflüssigkeit beschaffen ist, wobei der Analyt ein Substrat des Enzyms ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das immobilisierte Enzym in einer Membran des Enzymsensors enthalten ist.
Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Enzym aus Enzymen ausgewählt ist, für die ein Stoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glucose, Cholesterin, Lactat, Kreatin, Kreatinin, Harnstoff, Harnsäure, Pyruvat, Alkoholen, Bilirubin, Ascorbat, Phosphat, Proteinen, Triglyceriden, Phenylalanin, Tyrosin und Hypoxanthin, ein Substrat ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Enzym Lactatoxidase ist und der Analyt Lactat ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der kompetitive Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Oxalacetat, Oxalat, α-Hydroxysulfonat, Bisulfit und Phenylacetat.
Verwendung nach Anspruch 26, wobei der kompetitive Inhibitor Oxalat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 22–27, wobei die Lösung, die den kompetitiven Inhibitor umfasst, eine Spülflüssigkeit des Sensors ist.
Vorrichtung zum Messen der Konzentration oder Aktivität eines oder mehrerer Analyte in einer Prüfflüssigkeit, wobei die Vorrichtung einen Enzymsensor mit wenigstens einer Schicht immobilisiertem Enzym umfasst, für das wenigstens einer der Analyte ein Substrat darstellt, wobei die Vorrichtung weiterhin einen oder mehrere Behälter mit einer oder mehreren Lösungen, die für den Betrieb der Vorrichtung erforderlich sind, wobei wenigstens eine Lösung einen kompetitiven Inhibitor des Enzyms umfasst, und Mittel zum periodischen In-Kontakt-Bringen des Sensors mit der Lösung, die den kompetitiven Inhibitor umfasst, umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei das immobilisierte Enzym in einer Membran des Enzymsensors enthalten ist.
Vorrichtung nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Lösung, die den kompetitiven Inhibitor umfasst, eine Spülflüssigkeit des Sensors ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 29–31, wobei der Analyt Lactat ist, das Enzym Lactatoxidase ist und der kompetitive Inhibitor der Lösung Oxalat ist.