DE60123142T2

DE60123142T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE60123142T2
Application number: DE60123142T
Authority: DE
Inventors: Tomohiro Hirakata-shi YAMAMOTO; Motokazu Katano-shi WATANABE; Shin Katano-shi Ikeda; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: DE60123142D1; ES2270958T3; CN1309294A; US6436255B2; EP1118675A2; EP1118675B1; US20010050227A1; JP2001201479A; CN1157599C; EP1118675A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, welcher eine schnelle und hochgradig genaue Quantifizierung eines Messsubjekts (zu messendes Subjekts) in einer vereinfachten Art und Weise erleichtert, das in einer Probe enthalten ist,.
Ein Biosensor wurde in herkömmlicher Weise in der japanischen offengelegten Patentveröffentlichung Hei 2-062952 als System für die vereinfachte Quantifizierung einer spezifischen Komponente in einer Probe ohne Verdünnen oder Rühren einer Probenlösung vorgeschlagen.
Dieser Biosensor wird hergestellt durch zunächst Bilden eines Elektrodensystems, welches eine Messelektrode, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode umfasst, auf einer elektrisch isolierenden Grundplatte unter Verwendung eines Siebdruckverfahrens oder dergleichen und dann Bilden einer Enzymreaktionsschicht, welche ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und einen Elektronenvermittler umfasst. Wenn es die Umstände erfordern, wird ein Puffer zu dieser Enzymreaktionsschicht hinzugegeben.
Wenn eine Probenlösung, welche ein Trägermaterial enthält, auf die Enzymreaktionsschicht des auf diese Weise gebildeten Biosensors getropft wird, findet eine Auflösung der Enzymreaktionsschicht statt, welche wiederum eine Reaktion zwischen dem Enzym und dem Trägermaterial auslöst, was eine Reduktion des Elektronenvermittlers hervorruft. Beim Abschluss der Enzymreaktion wird der reduzierte Elektronenvermittler elektrochemisch oxidiert. Die Konzentration des Trägermaterial in der Probenlösung kann aus dem Stromwert der Oxidation bestimmt werden, der in diesem Oxidationsschritt gemessen wurde.
Dieser Biosensor kann theoretisch für Messungen von verschiedenen Materialien verwendet werden, wenn ein geeignetes Enzym für jedes dieser Materialien als Trägermaterial ausgewählt wird. Zum Beispiel kann die Verwendung von Glucoseoxidase als Oxidoreductase einen Biosensor für die Messung des Blutzuckerwertes realisieren. Dieser Sensor wird breit gefächert als Glukosesensor praktisch angewendet. Die Verwendung von Cholesterinoxidase als Oxidoreduktase kann einen Biosensor zur Messung von Serumcholesterin realisieren.
Der Serumcholesterinwert, welcher als diagnostischer Standard dient, ist die Summe von Serumcholesterin und Cholesterinester-Konzentrationen. Da Cholesterinester nicht als Trägermaterial für die Oxidation durch Cholesterinoxidase dienen kann, wird ein zusätzlicher Schritt des Umwandelns von Cholesterinester in Cholesterin notwendig, um die Serumcholesterin-Konzentrationen als diagnostischen Standart zu bestimmen. Cholesterinesterase ist als Enzym für die Katalyse dieses Verfahrens bekannt.
Das Einschließen von dieser Cholesterinesterase zusammen mit Cholesterinoxidase in der Enzymreaktionsschicht kann einen Biosensor zur Messung der gesamten Cholesterinkonzentration im Serum realisieren.
In dem Biosensor mit einem solchen Aufbau wird die Enzymreaktionsschicht durch Auftropfen einer wässrigen Reagenslösung, welche mindestens eine Oxidoreduktase enthält, auf das Elektrodensystem und Trocknen der aufgetropften Lösung gebildet. Ein solcher Biosensor weist ein Problem auf, wenn die Menge des Reagens groß ist, dass die Reaktionsschicht nicht schnell aufgelöst wird, nachdem die Probenlösung darauf getropft wurde, so dass die Messung einen langen Zeitraum benötigt.
Insbesondere in dem Cholesterinsensor müssen zwei Arten von Enzymen, Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase in der Enzymreaktionsschicht enthalten sein, wie vorher beschrieben wurde. Folglich enthält die Enzymreaktionsschicht einen bemerkenswert großen Betrag an Reagensien, so dass die Auflösung dieser Schicht einen signifikant langen Zeitraum nach dem Auftropfen der Probenlösung in Anspruch nimmt, was es unmöglich macht, eine schnelle Messung durchzuführen.
Um das zuvor genannte Problem zu lösen, wurde in der japanischen offengelegten Patentveröffentlichung 2000-039416 ein Biosensor vorgeschlagen. Der Biosensor umfasst eine isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, welches mindestens eine Messelektrode und eine Gegenelektrode einschließt, die auf der Grundplatte gebildet wurde, ein Bedeckungselement, welches in die Grundplatte integriert ist, und einen Probenlösungszufuhrweg zum Zuführen einer Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen dem Bedeckungselement und der Grundplatte, und einen Träger, welcher eine Faser zum Tragen des Reagens umfasst, das mindestens eine Oxidureduktase enthält, wobei der Träger in dem Zufuhrweg für die Probenlösung angeordnet ist.
Ebenso umfasst dieser Biosensor gemäß einer anderen Ausführungsform eine isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, welches mindestens eine Messelektrode und eine Gegenelektrode einschließt, die auf der Grundplatte gebildet wurden, und einen Träger, welche eine Faser zum Tragen des Reagenses umfasst, welcher mindestens eine Oxidureduktase enthält, wobei der Träger mit einem Haftmittel in der Umgebung des Elektrodensystems befestigt ist.
In diesem Biosensor wird jedoch die Höhe des Zufuhrweges für die Probenlösung mindestens gleich oder größer als die Dicke des Trägers benötigt, da der Träger in dem Zufuhrweg der Probenlösung angeordnet ist. Darüber hinaus weist der aktuelle Biosensor eine Struktur auf, dass der Träger und das Elektrodensystem einander gegenüberliegend angeordnet sind, wodurch ein gewisser Abstand zwischen dem Elektrodensystem und der Oberfläche des Trägers benötigt wird, um den Kontakt zwischen Ihnen zu verhindern. Auf diese Weise wird eine noch größere Höhe des Zufuhrweges für die Probenlösung benötigt.
Aus diesen Gründen, wenn der Träger in dem Zufuhrweg für die Probenlösung angeordnet ist, benötigt der Biosensor die Probenlösung in einer relativ großen Menge, um den Zufuhrweg für die Probenlösung mit der Probenlösung zu füllen. Die Menge wird durch Multiplizieren des Trägervolumens, das aus seinen äußeren Abmessungen mit der Porösität des Trägers errechnet wurde, um ein Produkt zu erhalten, und durch Addieren des zuvor genannten Raumes zwischen dem Elektrodensystem und der Oberfläche des Trägers zu dem Produkt bestimmt.
Inzwischen ist es mehr bevorzugt, dass die Porösität des Trägers höher ist, um die Auflösung der Reagensien zu verbessern.
Aufgrund solcher beschriebener Eigenschaften neigt der zuvor beschriebene Biosensor dazu, eine größere Menge an Probenlösung für die Messung zu benötigen als der Biosensor ohne Träger.
Ebenso weist, insbesondere wenn die Probenlösung Blut ist und der Biosensor mit einer Funktion des Filterns von Blutkörperchen-Komponenten mit einem porösen Material mit einem Filter versehen ist, das poröse Material zum Filtern der Blutkörperchen-Komponenten manchmal eine Schwierigkeit zum Filtern der Probenlösung auf, um in den Zufuhrweg für die Probenlösung einzudringen, da der Träger in dem Zufuhrweg für die Probenlösung angeordnet ist.
Das Dokument US-A-5,695,947 offenbart einen Biosensor. Die Ausführungsform der 1E und 1F weist die Merkmale des Oberbegriffes des Patentanspruchs 1 auf.
Das Dokument WO-A-9702487 offenbart einen Biosensor, welcher eine Grundschicht, eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, welche Seite an Seite auf der Grundschicht angeordnet sind, eine Bedeckungsschicht, und eine durch einen Ausschnitt in der Bedeckungsschicht vorgesehene Vertiefung umfasst. Der Biosensor und enthält ein Reaktionsmittelsystem, ein Verteilungsnetz auf der Oberseite der Vertiefung und ein oberflächenaktives Mittel.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Angesichts der vorstehenden Probleme ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, in welchem die Auflösung der Reagensien verbessert ist, um eine schnelle Quantifizierung und eine Verringerung der Menge der Probenlösung zu ermöglichen. Ferner ist es ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, in welchen die Probenlösung schnell eingeführt werden kann.
Ein Biosensor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfasst eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, das mindestens eine Messelektrode und eine Gegenelektrode einschließt, die auf der Grundplatte gebildet wurden, ein Bedeckungselement, welches auf der Grundplatte montiert ist und zwischen dem Bedeckungselement und der Grundplatte einen Zufuhrweg für die Probenlösung bildet mit einer Öffnung zum Zuführen einer Probenlösung zu dem Elektrodensystem und ein Luftventil an einem Ende des Zufuhrweges für die Probenlösung gegenüberliegend der Öffnung, ein Reagens-System, welches mindestens einen Elektronenvermittler und eine Oxidoreduktase einschließt, und einen Träger welcher mindestens den Elektronenübermittler und die Oxidoreduktase des Reagens-Systems trägt, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger durch oder von der Öffnung sich so ausdehnt, dass er mindestens teilweise außerhalb des Zufuhrweges für die Probenlösung angeordnet ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Träger einen Abschnitt auf, welcher mindestens den Elektronenvermittler oder die Oxidoreduktase trägt, die dichter an dem Elektrodensystem angeordnet ist als ein Bereich, welcher nichts von dem Reagens-System trägt.
Ebenso ist es wirkungsvoll, dass die Oxidoreduktase Cholesterinoxidase ist.
Ferner ist es bevorzugt, dass das Reagens-System ein Enzym enthält, das zum Hydrolysieren von Cholesterinester fähig ist.
Es ist wirkungsvoll, dass das Enzym, welches zum Hydrolysieren von Cholesterinester fähig ist, Cholesterinesterase ist.
Darüber hinaus ist es bevorzugt, dass das Reagens-System ein oberflächenaktives Mittel enthält.
Es ist wirkungsvoll, dass der Träger porös ist und ferner, dass der Träger in fasriger Form vorliegt oder Fasern umfasst.
Während die neuen Merkmale der Erfindung insbesondere in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt sind, wird die Erfindung, sowohl der Aufbau als auch der Inhalt, besser verstanden und gewürdigt zusammen mit ihren anderen Zielen und Merkmalen aus der folgenden detaillierten Beschreibung, welche in Verbindung mit den Zeichnungen vorgenommen wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines Biosensors in Übereinstimmung mit einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine perspektivische Ansicht eines Bedeckungselements, welches durch Integrieren eines Überzuges und eines Abstandhalters des in 1 gezeigten Biosensors gebildet wurde, wobei es in umgekehrter Ansicht im Gegensatz zu der Ansicht von 1 angeordnet ist.
3 ist eine längslaufende Querschnittsansicht der Hauptteile des in 1 gezeigten Biosensors.
4 ist eine längslaufende Querschnittsansicht der Hauptteile eines Biosensors in Übereinstimmung mit einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.
5 ist eine längslaufende Querschnittsansicht der Hauptteile eines Biosensors in Übereinstimmung mit noch einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.
6 ist eine längslaufende Querschnittsansicht der Hauptteile eines Biosensors in Übereinstimmung mit einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.
7 ist eine längslaufenden Querschnittsansicht der Hauptteile eines Biosensors in Übereinstimmung mit noch einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In dem Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Reagens, welches mindestens einen Elektronenvermittler und eine Oxidoreduktase einschließt, auf einem Träger getragen, welcher zum Beispiel ein poröses Material umfasst.
Das Reagens wird auf dem Träger in einer solchen Art und Weise getragen, dass es an der Oberfläche des porösen Materials anhaftet, welches den Träger aufbaut. Auf diese Weise wird die Oberfläche des Reagens in Kontakt mit einer Probenlösung größer, was zu einer Verbesserung in der Auflösung des Reagens in der Probenlösung führt.
Als Träger können verschiedene Arten verwendet werden, wenn sie eine Funktion des Tragens des Reagens aufweisen und mit der Enzymreaktion und der elektrochemischen Reaktion inaktiv sind, welche in dem Biosensor auftreten. Zum Beispiel kann eine Lage durch Laminieren von Zellulosefaser, Glasfaser oder einer polymeren Verbindungsfaser zu einem Vlies oder einer Filzform bevorzugt sein.
In Bezug auf die Auslegung des Trägers in dem Biosensor sind verschiedene Veränderungen möglich.
In einer Ausführungsform ist der gesamte Träger außerhalb des Zufuhrweges für die Probenlösung des Bedeckungselements angeordnet, während ein Ende des Trägers in Kontakt mit der Öffnung des Zufuhrweges für die Probenlösung gebracht wird.
In einer anderen Ausführungsform ist ein Teil des Trägers in den Zufuhrweg für die Probenlösung des Bedeckungselements eingesetzt.
Was diese Ausführungsformen anbetrifft, wird durch Freilegen mindestens eines Teils des Trägers gegenüber der Außenseite des Zufuhrweges für die Probenlösung, die Permeation der Probenlösung in den Träger erleichtert, wodurch die schnelle Auflösung des Reagens ermöglicht wird, das auf dem Träger getragen wird.
Ebenso kann in dem Fall der Verwendung einer Probenlösung wie Blut, das eine feste Komponente enthält, die einen nachteiligen Einfluss auf die Elektrodenreaktion oder die Enzymreaktion haben kann, mindestens ein Teil des Trägers mit einem Bereich versehen sein, in dem das Reagens nicht getragen wird, durch welchen Bereich die Probenlösung zur Permeation eingeführt wird, um die feste Komponente herauszufiltern.
Wenn der Träger in Kontakt mit dem Zufuhrweg für die Probenlösung des Bedeckungselements gebracht wird, ist es wünschenswert, dass der Träger entweder an einem Teil des Bedeckungselements oder an einem Teil der isolierenden Grundplatte mit dem darauf gebildeten Elektrodensystem anhaftet oder gesichert ist, oder an beiden davon.
Als Haftmittel ist es bevorzugt, eines zu verwenden, das eine hohe Viskosität aufweist, um die Permeation in dem Träger unter der Umgebung der Sensorherstellung zu verhindern, eines mit einer schlechten Löslichkeit in Wasser nach der Anhaftung oder eines mit einer elektrochemischen Inaktivität in einer wässrigen Lösung, selbst wenn es in Wasser löslich ist. Es ist zum Beispiel bevorzugt, ein Haftmittel aus der Holzbearbeitung wie das kommerziell erhältliche Haftmittel unter dem Handelsnamen Cemedine C von Cemedine Company Ltd. zu verwenden.
Als auf dem Träger zu tragende Oxidoreduktase können verschiedene Verbindungen verwendet werden. Zum Beispiel werden Glukoseoxidase, Lactatoxidase, Cholesterinoxidase und dergleichen aufgeführt.
Wenn das Serumcholesterinniveau gemessen wird, werden Cholesterinoxidase und ein Enzym, welches zum Hydrolysieren von Cholesterinester fähig ist verwendet. Als Enzym, welches zum Hydrolysieren von Cholesterinester fähig ist, werden Cholesterinesterase, Lipoproteinlipase und dergleichen aufgeführt. Insbesondere ist Cholesterinesterase vorteilhaft, da sie Cholesterinester in Cholesterin schnell unter Verwendung eines geeigneten oberflächenaktiven Mittels umwandeln kann.
Wenn das Enzym, welches zur Hydrolyse von Cholesterinester fähig ist, verwendet wird, ist es bevorzugt, dass ein oberflächenaktives Mittel mit der Wirkung des Verbesserns der Aktivität dieses Enzyms in dem Reagens enthalten ist, welches auf dem gesamten Träger oder einem Teil des Trägers getragen wird, da die Zeitdauer, die für die Enzymreaktion benötigt wird, verringert werden kann.
Als oberflächenaktives Mittel zum Verbessern der Aktivität der Cholesterinesterase ist es möglich, eine willkürliche Auswahl von n-Octyl-β-D-thioglucosid, Polyethylenglycolmonodecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-maltosid, Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurodeoxycholat, N,N-Bis(3-D-gluconamidpropyl)cholamid, N,N-Bis (3-D-gluconamidpropyl)deoxycholamid, Polyoxyethylen-p-t-octylphenylether (zum Beispiel TritonX-100, hergestellt von SIGMA Co., Ltd) und dergleichen zu verwenden.
Wenn das Elektrodensystem des Biosensors unter Verwendung eines elektrochemischen Metalls wie Platin gebildet wurde, ist der erhaltene Stromwert der Oxidation frei von Fehlern. Da jedoch ein solches Metall teuer ist, wird das Elektrodensystem eines wegwerfbaren Sensors durch Bilden einer Silberelektrode mit einer Silberpaste und dergleichen und nachfolgende Beschichtung mit einer Kohlenstoffpaste hergestellt.
Wenn das oberflächenaktive Mittel jedoch in der Probenlösung enthalten ist, permeiert die Probenlösung zwischen die Kohlenstoffteilchen durch die Wirkung des oberflächenaktiven Mittels. Als Ergebnis kann die Aktivität der Kohlenstoffelektrode herabgesetzt werden und die Probenlösung kommt in Kontakt mit der Silberelektrode. Wenn daher eine Spannung an die Messelektrode unter einer solchen Bedingung angelegt wird, ruft die Silberelektrode eine Oxidationsreaktion hervor, die einen Strom erzeugt, so dass ein positiver Fehler in den gemessenen Stromwert eingeschlossen ist.
Zum Unterdrücken eines solchen Phänomens wird ein Verfahren verwendet, bei dem die Oberfläche des Elektrodensystems mit einem hydrophilen Polymer beschichtet wird. Dieses hydrophile Polymer bildet eine viskose Schicht selbst unter der Einführung der Probenlösung, was den Kontakt der Probenlösung mit der Elektrode unterdrückt.
Beispiele eines solchen hydrophilen Polymers schließen Carboxymethylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Ethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Gelatine, Polyacrylsäure und ihre Salze, Stärke und ihre Derivate, Maleinsäureanhydrid und ihre Salze, Polyacrylamid, Methacrylatharz, Poly-2-hydroxyethylmethacrylat und dergleichen ein.
Ein Enzym wie Oxidoreduktase oder Cholesterinesterase können so getragen werden, dass sie die zuvor beschriebene hydrophile Polymerschicht bedecken. In diesem Fall wird ein Elektronenvermittler auf dem zuvor genannten Träger getragen.
Es ist bevorzugt, ferner eine amphipathische Substanzschicht so zu bilden, dass sie die zuvor genannte Schicht über dem Elektrodensystem bedeckt, das heißt, die hydrophile Polymerschicht oder die Enzymschicht, welche die hydrophile Polymerschicht bedeckt. Die amphipathische Substanzschicht wird durch Auftropfen einer Lösung, die durch Lösen einer amphipathischen Substanz wie Lecithin in einem organischen Lösungsmittel hergestellt wurde, und nachfolgendes Trocknen derselben gebildet.
Obwohl eine solche amphipathische Substanzschicht nicht für die Enzymreaktion und die Elektrodenreaktion notwendig ist, ermöglicht die Bildung dieser Schicht eine glatte Einführung der Probenlösung. Bevorzugte Beispiele einer solchen amphipathischen Substanz schließen Phospholipide wie Lecithin ein.
Ferner kann eine oberflächenaktive Schicht auf dem Abschnitt des Bedeckungselements bereitgestellt sein, welches dem Zufuhrweg für die Probenlösung oder der Oberfläche des Elektrodensystems gegenübersteht. Diese Schicht ermöglicht der Probenlösung, welche ihre Reaktion abgeschlossen hat oder sich in Reaktion mit dem Reagens-System, das in dem Träger enthalten ist, befindet, glatt durch den Zufuhrweg für die Probenlösung zu permeieren, wodurch sie das Elektrodensystem erreicht.
Das für einen solchen Zweck verwendete oberflächenaktive Mittel wird wünschenswerter Weise aus dem zuvor aufgeführten oberflächenaktiven Mittel zur Verbesserung der Aktivität der Cholesterinesterase auswählt, aber jedes andere oberflächenaktive Mittel als diese kann verwendet werden, wenn es das Reaktionssystem nicht stört.
Wenn das oberflächenaktive Mittel zur Verfügung gestellt wird, ist es essentiell, um die zuvor genannte hydrophile Polymerschicht zu bilden, welche die Oberfläche des Elektrodensystems bedeckt. In diesem Fall muss die oberflächenaktive Schicht durch Lösen eines oberflächenaktiven Mittels in einem Lösungsmittel gebildet werden, welches die hydrophile Polymerschicht nicht löst, um eine Lösung zu enthalten, Auftropfen der hergestellten Lösung, so dass sie die hydrophile Polymerschicht bedeckt und nachfolgendes Trocknen der selben.
Als Elektronenvermittler, welcher auch auf dem Träger zu tragen ist, kann jede wasserlösliche Verbindung, welche die Elektronenübertragung zwischen dem Enzym und der Elektrode vermitteln kann wie Kaliumferricyanid, p-Benzochinone, Phenazinmethosulfat oder Ferrocenderivate (oxidierte Form), verwendet werden.
Als Messverfahren des Oxidationsstroms kann ein Zweielektrodensystem, das nur aus einer Messelektrode und einer Gegenelektrode zusammengesetzt ist, oder ein Dreielektrodensystem, welches ferner eine Referenzelektrode umfasst, angewendet werden. Das Dreielektrodensystem kann genauere Messergebnisse ergeben.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung spezieller beschrieben, wobei sie sich auf konkrete Beispiele bezieht, obwohl die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele begrenzt ist. 1 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Biosensors gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.
Wie in 1 gezeigt wird, stellt Bezugszeichen 1 eine elektrisch isolierende Grundplatte aus Polyethylenterephthalat dar, und die Anschlussdrähte 2 und 3 und die Erdung für ein Elektrodensystem sind auf dieser Grundplatte 1 durch Drucken einer Silberpaste unter Verwendung eines Siebdruckverfahrens gebildet. Auf der Grundplatte 1 wird ferner eine elektrisch leitfähige Kohlenstoffpaste, welche einen Harzbinder enthält, aufgedruckt, um das Elektrodensystem zu bilden, welches eine Messelektrode 4 und eine Gegenelektrode 5 enthält. Eine elektrisch isolierende Paste wird aufgedruckt, um eine elektrisch isolierende Schicht 6 zu bilden. Die Messelektrode 4 wird mit dem Anschlussdraht 2 und die Gegenelektrode 5 mit dem Anschlussdraht 3 jeweils verbunden. Die elektrisch isolierende Schicht 6 ermöglicht konstante Bereiche der freiliegenden Abschnitte der Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 und bedeckt die Anschlussdrähte teilweise.
Die elektrisch isolierende Grundplatte 1 mit dem darauf gebildeten Elektrodensystem, ein Überzug 9 mit einem Luftventil 11 und ein Abstandhalter 8 und ein Träger 13, welcher ein Reagens trägt, werden unter der positionellen Beziehung wie durch die strichgepunktete Linien in 1 angebracht, um einen Biosensor zu bilden.
In dem Biosensor mit einem solchen Aufbau ist ein Raum, welcher einen Zufuhrweg für die Probenlösung aufbaut, der in einem Schlitz 12 des Abstandhalters 8 zwischen der Grundplatte 1 und dem Überzug 9 gebildet ist.
Eine Probenlösung wird in den Sensor von einer Öffnung 10, welche einen Anschluss des Zufuhrweges für die Probenlösung bildet, eingeführt. In diesem Beispiel ist die Länge von der Öffnung 10 zu der Kante des Luftventils 11, welches näher an der Öffnung ist, 4,5 mm, die Breite des Schlitzes 2,0 mm und die Tiefe des Schlitzes 0,1 mm bis 0,3 mm.
Diese Dimensionen werden vorgesehen, um die Dimensionen des Trägers zu definieren, welcher nachstehend beschrieben wird. Aber die Dimensionen des Trägers sind nicht auf die vorstehend angegebenen Werte begrenzt.
2 ist eine perspektivische Ansicht eines Bedeckungselements, welches durch Auflegen des Abstandhalters 8 auf die Oberseite der Bedeckung 9 gebildet wurde, die von oben nach unten umgedreht entgegen der Ansicht in 1 angeordnet ist. Durch Kombinieren dieses Bedeckungselements mit der Grundplatte wird der Raum gebildet, der den Zufuhrweg für die Probenlösung aufbaut.
3 ist eine längslaufende Querschnittsansicht des Biosensors gemäß eines Beispiels der vorliegenden Erfindung. In der gleichen Art und Weise wie in 1 wird die elektrisch isolierende Grundplatte 1 mit dem Elektrodensystem versehen, über welchen eine hydrophile Polymerschicht 7 gebildet wird. Eine Enzymschicht 18, welche Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase enthält, wird ferner so gebildet, dass sie diese hydrophile Polymerschicht 7 bedeckt. Und eine oberflächenaktive Schicht 19, welche TritonX-100 umfasst, wird zudem darüber gebildet.
Darüber hinaus wird eine Lecithinschicht 17 auf der inneren Oberfläche der Bedeckung 9 abgeschieden, welche den Zufuhrweg für die Probenlösung bildet, und der Träger 13, welcher ein Reagens trägt, wird an der Bedeckung 9 mit einem Haftmittel 14 so angebracht, dass sie in Kontakt mit dem Zufuhranschluss für die Probenlösung 10 kommt.
4 ist eine längslaufende Querschnittsansicht des Biosensors gemäß eines anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung. In der gleichen Art und Weise wie in 3 wird die elektrisch isolierende Grundplatte 1 mit dem Elektrodensystem versehen, über welchem eine hydrophile Polymerschicht 7 und eine Lecithinschicht 17 gebildet werden. Ferner wird der Träger 13, welcher das Reagens trägt, mit einem Haftmittel 14 an der Bedeckung 9 von der Umgebung des Zufuhranschlusses 10 der Probenlösung zu der Außenseite des Zufuhrweges für die Probenlösung in einer solchen Art und Weise befestigt, dass ein Teil des Trägers in den Zufuhrweg für die Probenlösung eingesetzt wird.
Die 5 bis 7 sind längslaufende Querschnittsansichten von einem Teil des Biosensors gemäß eines anderen Beispiels der vorliegenden Erfindung, wobei das Elektrodensystem, die hydrophile Polymerschicht und die oberflächenaktive Schicht weggelassen wurden.
Bei dem in 5 dargestellten Biosensor ist ein Teil des Trägers 13 mit einem Haftmittel 14 an der inneren Oberfläche der Bedeckung befestigt, welche den Zufuhrweg für die Probenlösung aufbaut. Das Ende des Trägers 13, das gegenüber der Außenseite freiliegt, erstreckt sich über das Ende der isolierenden Grundplatte auf der Seite des Zufuhranschlusses für die Probenlösung hinaus. Diese Struktur ermöglicht dem Träger, mit einer Probe von der Oberseite (das heißt der Bedeckungsseite) oder der unteren Seite (das heißt der Seite der isolierenden Grundplatte) versorgt zu werden.
In dem in 6 dargestellten Biosensor erstreckt sich das Ende der isolierend Grundplatte an der Seite des Zufuhranschlusses für die Probenlösung über das Ende des Trägers 13 hinaus, der gegenüber der Außenseite frei liegt, das heißt, umgekehrt wie die Anordnung in 1. Diese Struktur ermöglicht es der Probe, eingeführt und auf der isolierenden Grundplatte getragen zu werden, was vorteilhaft ist, wenn die Permeation der Probe wie Blut in den Träger eine relativ lange Zeit benötigt.
In dem in 7 dargestellten Biosensor ist der Träger 13 durch mindestens einen oder mehrere Vorsprünge 15, die auf der isolierenden Grundplatte 1 gebildet wurden, welche den Zufuhrweg für die Probenlösung aufbauen, gesichert. Diese Struktur ermöglicht es dem Träger 13, ohne die Verwendung eines Haftmittels befestigt zu werden. Ebenso macht es die Bildung von mindestens einem Vorsprung 15 in einer schwellenähnlichen Form möglich, das Phänomen zu verhindern, dass die Probenlösung direkt das Elektrodensystem nur durch die Umgebung des Trägers erreicht, so dass sie das Reagens, das auf dem Träger getragen wird, nicht ausreichend auflöst.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde ein Biosensor mit dem Aufbau aus 4 hergestellt, wie nachstehend beschrieben wird.
Zunächst wurde auf das Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 in 1 eine 0,5 Gew.-%ige wässrige Lösung des Natriumsalzes von Carboxymethylcellulose (hiernach als "CMC" bezeichnet), welches ein hydrophiles Polymer ist, aufgetropft und in einem Heißlufttrockner für 10 Minuten bei 50 °C getrocknet, um eine CMC-Schicht 7 zu bilden.
Nachfolgend wurden 2 μl einer gemischten Lösung, die durch Mischung von 400 Einheiten/ml Cholesterinoxidase (hiernach als "ChOx" bezeichnet) und zwei Kiloeinheiten Cholesterinesterase (hiernach als "ChE" bezeichnet) erhalten wurde, aufgetropft, um die CMC Schicht 7 zu bedecken und eine Enzymschicht 18 zu bilden.
Ferner wurde 1 μl einer 5,0 eigen Ethanollösung von TritonX-100 aufgetropft, um die Enzymschicht 18 zu bedecken, und getrocknet um eine oberflächenaktive Schicht 19 zu bilden. Die oberflächenaktive Schicht 19 wurde bereitgestellt, um die glatte Dispergierung der Probenlösung durch das Elektrodensystem zu erleichtern, und TritonX-100 wurde verwendet, um die Aktivität von ChE zu verbessern. Darüber hinaus wurde eine Lecithinschicht 17 auf der inneren Oberfläche der Bedeckung bereitgestellt, welche den Zufuhrweg für die Probenlösung aufbaut.
Ebenso wurde ein filzförmiger Glasfilter von 0,2 mm Dicke, 2 mm Breite und 10 mm Länge hergestellt. Der Glasfilter wurde durch flüssigen Stickstoff gekühlt und eine wässrige Lösung, welche Kaliumferricyanid als Elektronenvermittler enthielt, dann auf das Spitzenende des Glasfilters getropft. Diese Lösung fror augenblicklich nach dem Auftropfen und folglich dispergierte sie nicht durch den Glasfilter, da der Glasfilter durch flüssigen Stickstoff gekühlt worden war.
Demzufolge wurde die Kaliumferricyanidlösung aufgetropft und ihr 2 mm von dem Spitzenende des Glasfilters entfernt ermöglicht, zu permeieren. Danach wurde der Glasfilter unter verringertem Druck für etwa 4 Stunden in einem Gefriertrockner getrocknet. Als Ergebnis wurden 0,33 μmol Kaliumferricyanid pro 1 mm² in einer Fläche 2 mm von dem Spitzenende des Glasfilters getragen.
Wie in 4 dargestellt wird, wurde der Glasfilter, welcher Kaliumferricyanid in einem Abschnitt davon in der zuvor beschriebenen Art und Weise trug, angebracht und an der Bedeckung 9 als Träger befestigt. In diesem Vorgang wurde der Träger in einer solchen Art und Weise freigelegt, dass der Endabschnitt, welcher das Kaliumferricyanid trug, in Kontakt mit der Öffnung des Zufuhrweges für die Probenlösung gebracht wurde. Dann wurde dieses Bedeckungselement und die Grundplatte 1 unter der positionellen Beziehung, wie sie durch die strichgepunktete Linie in 1 gezeigt wird, angebracht, um einen Biosensor zu bilden.
Hierin wurde die Tiefe eines Schlitzes 12 des Zufuhrweges für die Probenlösung auf 0,1 mm hergestellt. 10 μl einer Probenlösung wurden dem auf diese Weise gebildeten Biosensor von dem anderen Ende des Trägers 13, welcher kein Kaliumferricyanid trug, so zugeführt, dass sie davon absorbiert wurde. Als Probenlösung wurde Blut oder eine gemischte Lösung, welche durch Zugeben von Blutkörperchen zu einer Standardserumlösung erhalten wurde, die verdünnt wurde, während der osmotische Druck bei einem konstante Niveau aufrechterhalten wurde, verwendet.
Bevor die Blutkörperchenkomponente der Probenlösung den Abschnitt des Trägers erreichte, welcher das Kaliumferricyanid trug, löste sls Ergebnis die gefilterte flüssige Komponente der Probenlösung das Kaliumferricyanid, welches auf dem Träger getragen wurde, und drang in den Zufuhrweg für die Probenlösung von dem Zufuhranschluss für die Probenlösung ein, so dass die Oberfläche des Elektrodensystems mit der Probenlösung gefüllt wurde. 3 Minuten nach der Zufuhr der Probenlösung wurde eine Pulsspannung von + 0,5 V an die Messelektrode in der anodischen Richtung unter Verwendung der Gegenelektrode als Referenz angelegt. 5 Sekunden nach Anlegen dieser Spannung wurde der Stromwert, welcher zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode floss, gemessen.
Als Ergebnis zeigte der gemessene Wert eine Stromantwort abhängig von der gesamten Cholesterinkonzentration in der Probenlösung.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wurde ein Biosensor mit der in 3 gezeigten Konstitution wie nachstehend beschrieben hergestellt.
In der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 wurden eine CMC-Schicht 7 und eine Lecithinschicht 17 über dem Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 in 1 gebildet. Die Lecithinschicht 17 wurde ebenso auf einer inneren Oberfläche der Bedeckung gebildet, welche den Zufuhrweg für die Probenlösung aufbaut.
Als nächstes wurden Kaliumferricyanit, ChOx, ChE und TritonX-100 auf einem filzförmigen Glasfilter von 0,2 mm Dicke, 2 mm Breite und 4,5 mm Länge aufgetragen. Hierin wurde TritonX-100, welches ein oberflächenaktives Mittel ist, verwendet, um die Aktivität von ChE zu verbessern. Die getragenen Menge des Kaliumferricyanit war 0,33 μmol pro 1 mm² des Glasfilters. Die getragene Menge an ChoX 0,1 Einheit / 1 mm² des Glasfilters. Ebenso waren die getragenen Mengen von ChE und TritonX-100 jeweils eine Einheit und 0,5 mg.
Ein Haftmittel aus der Holzverarbeitung (das herkömmlich erhältliche Haftmittel unter dem Handelsnamen Cemedine C von Cemedine Company Co., Ltd) als Haftmittel 14 wurde auf die innere Oberfläche der Bedeckung aufgetragen, auf welchem dann der Glasfilter angebracht und als Träger so befestigt wurde, dass ein Ende des Trägers an einer Position abgeschieden wurde, welche 1 mm ins Innere des Zufuhranschlusses für die Probenlösung reichte. Als Ergebnis wurde ein Biosensor hergestellt, der eine Konstitution aufwies, bei der das meiste des Trägers der Außenseite hin des Zufuhrweges für die Probenlösung offenlag.
Ein Standardserum oder eine Lösung, welche durch Verdünnen eines Standardserums mit physiologischer Kochsalzlösung hergestellt worden war, wurde als Probenlösung dem auf diese Weise hergestellten Biosensor durch Einführen derselben in einen Abschnitt des Trägers, welcher der Außenseite hin frei lag, des Zufuhrweges für die Probenlösung zugeführt. Dann wurde der Antwortwert in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 gemessen. Als Ergebnis zeigte der gemessene Wert eine hervorragenden Stromantwort abhängig von der gesamten Cholesterinkonzentration. In diesem Beispiel war die Auflösung des Reagens in dem Träger exzellent. Darüber hinaus war das Eindringen der Probenlösung in den Zufuhrweg für die Probenlösung ebenso sehr glatt.
Wie vorstehend beschrieben ermöglicht er die vorliegende Erfindung eine glatte Einführung der Probenlösung, selbst wenn die Menge der Probenlösung klein ist, und verbessert die Auflösung des Reagens. Folglich ist es möglich, eine schnelle Quantifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Bezug auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es zu verstehen, dass eine solche Offenbarung nicht als begrenzend interpretiert werden sollte.

Claims

Biosensor, welcher eine isolierende Grundplatte (1), ein Elektrodensystem umfasst, das mindestens eine Messelektrode (4) und eine Gegenelektrode (5), die auf der Grundplatte (1) gebildet wurden, ein Bedeckungselement (8, 9), das auf der Grundplatte (1) befestigt ist, um zwischen dem Bedeckungselement (8, 9) und der Grundplatte (1) ein Zufuhrweg für die Probenlösung (12) mit einer Öffnung (10) zum Zuführen einer Probenlösung zu dem Elektrodensystem und einem Luftventil (11) an einem Ende des Zufuhrweges für die Probenlösung (12) gegenüber der Öffnung (10) zu bilden, ein Reagens-System, welches mindestens einen Elektronenvermittler und eine Oxidoreduktase einschließt, und ein Träger (13), welcher mindestens den Elektrodenvermittler oder die Oxidoreduktase des Reagens-Systems trägt, einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (13) durch oder von der Öffnung (10) sich so erstreckt, dass er mindestens teilweise außerhalb des Zufuhrweges für die Probenlösung (12) angeordnet ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1, wobei der Träger (13) einen Bereich hat, welcher mindestens den Elektronenvermittler oder die Oxidoreduktase trägt, wobei er dichter an dem Elektronensystem angeordnet ist als ein Bereich, welcher kein Reagens-Systems trägt.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oxidoreduktase Cholesterinoxidase ist.
Der Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagens-System ein Enzym enthält, welches zur Hydrolyse von Cholesterinester fähig ist.
Der Biosensor nach Anspruch 4, wobei das Enzym, welches zur Hydrolyse von Cholesterinester fähig ist, Cholesterinesterase ist.
Der Biosensor nach Anspruch 4 oder 5, wobei das Reagens-System ein oberflächenaktives Mittel enthält.
Der Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger (13) porös ist.
Der Biosensor nach Anspruch 7, wobei der Träger (13) faserig ist.