DE60115288T2

DE60115288T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE60115288T2
Application number: DE60115288T
Authority: DE
Inventors: Miwa Hasegawa; Motokazu Watanabe; Tomohiro Yamamoto; Shin Ikeda; Shiro Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-12-06
Also published as: EP1347292B1; US6719887B2; CN1406337A; ES2249388T3; JP4183902B2; JP2002202283A; DE60115288D1; CN1193229C; US20030098234A1; EP1347292A4; EP1347292A1; WO2002054054A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, spezifisch einen Cholesterinsensor, der eine schnelle, hochempfindliche, einfache Bestimmung eines spezifischen Bestandteils in einer Probe durchführen kann.
Stand der Technik
Es wird eine Beschreibung eines Beispiels eines herkömmlichen Biosensors gegeben, in Bezug auf einen Glukosesensor.
Bei einem typischen Glukosesensor wird ein Elektrodensystem einschließlich wenigstens einer Messelektrode und einer Gegenelektrode auf einer isolierenden Grundplatte durch ein Verfahren wie etwa Siebdruck gebildet, und eine Enzymreaktionsschicht einschließlich eines hydrophilen Polymers, einer Oxidoreduktase und eines Elektronenvermittlers wird auf dem Elektrodensystem gebildet. Als Oxidoreduktase wird Glukoseoxidase verwendet; als der Elektronenvermittler wird ein Metallkomplex, eine organische Verbindung oder ähnliches, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat oder ein Chinonderivat verwendet. Ein Puffer wird, wenn notwendig, zu der Enzymreaktionsschicht gegeben.
Wenn eine Probenlösung mit einem Substrat auf die Enzymreaktionsschicht in dem Glukosesensor getropft wird, wird die Enzymreaktionsschicht aufgelöst, um eine Reaktion des Enzyms mit dem Substrat zu verursachen. Diese Reaktion führt zur Reduktion des Elektronenvermittlers. Nach Abschluss der Enzymreaktion kann eine Substratkonzentration in der Probenlösung von einem Wert des Oxidationsstroms bestimmt werden, welcher erzeugt wird, wenn dieser reduzierte Elektronenvermittler elektrochemisch oxidiert wird.
In diesem Typ von Glukosesensor wird nämlich ein Reduktant des Elektronenvermittlers, erzeugt als ein Ergebnis der Enzymreaktion, an der Elektrode oxidiert, um eine Glukosekonzentration aus dem Oxidationsstromwert zu bestimmen.
In der Theorie ist ein derartiger Biosensor für die Messung verschiedener Substanzen unter Verwendung eines Enzyms anwendbar, dessen Substrat zu messen ist. Wenn zum Beispiel Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase und Cholesterinesterase als Oxidoreduktase verwendet werden, ist es möglich, einen Cholesterinwert in einem Serum zu messen, um als ein diagnostischer Indikator in verschiedenen medizinischen Institutionen verwendet zu werden.
Da die Enzymreaktion der Cholesterinesterase sehr langsam abläuft, kann mit einem geeigneten dazugegebenen oberflächenaktiven Stoff, die Aktivität der Cholesterinesterase verbessert werden, um die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu reduzieren.
Jedoch hat der in dem Reaktionssystem vorhandene oberflächenaktive Stoff eine nachteilige Wirkung auf Hämozyten, was es unmöglich macht, das Vollblut selbst zu messen, wie es im Glukosesensor gemacht wird. Aus diesem Grund gab es einen Vorschlag, dass ein Filterteil in der Nähe einer Öffnung in einem Probenlösungzufuhrweg für eine unverzügliche Zufuhr nur von Plasma mit daraus filtrierten Hämozyten zu dem Sensor vorgesehen wird.
Jedoch enthält eine typische Enzymreaktionsschicht einen leicht löslichen Teil und einen schwer löslichen Teil. Ein Teil entlang der Kante des Probenlösungzufuhrweges ist leicht zu lösen, während der zentrale Teil davon schwer löslich ist.
Da die durch den Filter tretende Probenlösung vornehmlich über die Kanten des Probenlösungzufuhrweges fließt, schließt sie eine Lüftungsöffnung an der Endseite des Probenlösungzufuhrweges, vor der vollständigen Lösung des zentralen Teils davon, wobei Blasen in dem zentralen Teil zurückgelassen werden. In einem derartigen Fall gibt es das Problem, dass die Probenlösung nicht in einer Menge notwendig für die Messung in den Probenlösungszufuhrweg eingebracht wird, wodurch die Enzymreaktion nicht ausreichend abläuft.
Überdies gibt es ein weiteres Problem, dass die Blasen, die die Elektrode bedecken, die wesentliche Reaktionsfläche der Elektrode reduzieren, was in einem Messfehler resultiert.
Es ist folglich eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten Biosensor zur Verfügung zu stellen, so dass das Plasma mit daraus filtrierten Hämozyten unverzüglich das Elektrodensystem erreicht, um die vorher beschriebenen Nachteile zu überwinden. Ferner ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Cholesterinsensor mit hoher Genauigkeit und hervorragender Ansprechfähigkeit zur Verfügung zu stellen, der Vollblut messen kann.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit: einer isolierenden Grundplatte; einem Elektrodensystem, welches auf der Grundplatte vorgesehen ist, und eine Messelektrode und eine Gegenelektrode hat; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Lüftungsöffnung an der Endseite davon hat; ein Probenzufuhrteil; und einen Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenzufuhrteil angeordnet ist und Hämozyten filtriert, wo mit diesem Filter filtriertes Plasma mit Hämozyten darin in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund von Kapillarität eingesaugt wird, und dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale Teil eines sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungszufuhrweg mehr als sowohl das rechte, als auch das linke Ende davon hineinragt.
Es ist bevorzugt, dass der sekundäre Seitenteil des Filters bogenförmig oder halbkreisförmig in der Projektion davon ist, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche die gleiche wie die Oberfläche davon ist.
Es ist bevorzugt, dass der Probenlösungzufuhrweg eine Breite von nicht mehr als 2,0 mm und der Elektrodensystemabschnitt des Probenlösungzufuhrweges eine Höhe von nicht mehr als 0,2 mm hat.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor Druckteile für das Halten des primären Seitenteils des Filters von den oberen und unteren Seiten hat, und der Abstand dazwischen nicht mehr als 1,5 mm ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor Druckteile für das Halten der sekundären Seitenteile des Filters von den oberen und unteren Seiten hat und der Abstand dazwischen nicht mehr als 1,5 mm ist.
Es ist bevorzugt, dass der primäre Seitenteil des Filters eine Breite von nicht mehr als 5,0 mm hat.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Biosensor an der Öffnung in dem Probenlösungzufuhrweg ein konkaves Teil ausgestattet mit dem oberen Anteil oder dem unteren Anteil des sekundären Seitenteils des Filters umfasst.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass in dem Biosensor die Querschnittsfläche des Probenlösungzufuhrweges kleiner als die Querschnittsfläche des primären Seitenteils des Filters ist.
Es ist ebenfalls bevorzugt, dass in dem Biosensor die Querschnittsfläche des sekundären Seitenteils des Filters kleiner als die Querschnittsfläche des primären Seitenteils davon ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht, die einen Biosensor gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Die 2 ist eine Längsschnittansicht, die den Biosensor der 1 veranschaulicht.
Die 3 ist eine Draufsicht, die den Biosensor der 1 und 2 veranschaulicht, mit Ausnahme der Reaktionsschicht und des oberen Deckelelements.
Die 4 ist eine vergrößerte Schnittansicht, die den Hauptteil des Biosensors der 1 bis 3 veranschaulicht.
Die 5 ist ein Diagramm, die den Vorgang des Flusses des Plasmas im Probenlösungzufuhrweg erläutert.
Die 6 ist ein Diagramm, die die Ansprecheigenschaften des Cholesterinsensors in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 7 ist ein Diagramm, das den Vorgang des Flusses des Plasmas in dem Probenlösungzufuhrweg in einem herkömmlichen Beispiel erläutert.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor mit: einer isolierenden Grundplatte; einem Elektrodensystem, welches auf der Grundplatte vorgesehen ist, und eine Messelektrode und eine Gegenelektrode hat; eine Reaktionsschicht einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Lüftungsöffnung an der Endseite davon hat; ein Probenzufuhrteil; und einen Filter, welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenzufuhrteil angeordnet ist und Hämozyten filtriert, wo mit diesem Filter filtriertes Plasma mit Hämozyten darin in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund von Kapillarität eingesaugt wird, und dadurch gekennzeichnet ist, dass der zentrale Teil eines sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungszufuhrweg mehr als sowohl das rechte, als auch das linke Ende davon hineinragt.
Hierbei besteht der in der vorliegenden Erfindung verwendete Filter aus einem porösen Material mit Räumen, die miteinander in einer dreidimensionalen Art und Weise verbunden sind. Dieses poröse Material bewegt Blut von der Probenlösungzufuhrseite in Richtung der Seite des Probenlösungszufuhrweges aufgrund von Kapillarität, und dient zum Filtern von Hämozyten auf der Grundlage eines Unterschieds in den Zirkulationswiderständen des Plasmas und der Hämozyten. Ein Vlies aus einer Faser, wie etwa Glasfaser, Cellulose oder Zellstoff, Filterpapier oder ein anderes poröses Material, kann als der Filter eingesetzt werden. Der Filter ist bevorzugt hydrophil.
In dem erfindungsgemäßen Biosensor mit der derartig beschriebenen Struktur werden die Hämozyten, welche interferierende Substanzen sind, mit dem Filter entfernt, so dass das Plasma unmittelbar in das Elektrodensystem fließen kann.
Das bedeutet, dass weil der zentrale Teil des sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungzufuhrweg mehr als sowohl das rechte als auch das linke Ende des sekundären Teils hineinragt, fließt das Plasma vornehmlich in den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges. Da dieses Plasma vollständig die Reagenzschicht, wie etwa eine Reaktionsschicht und eine hydrophile Polymerschicht, die in dem zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges aufgebracht sind, kann das filtrierte Plasma unmittelbar in den Probenlösungzufuhrweg fließen, ohne Blasen in den zentralen Teil zurückzulassen.
Normalerweise wird die Reaktionsschicht durch Entwickeln und Trocknen einer wässrigen Lösung des Reagenz geformt. Beeinträchtigt durch die Tatsache, dass der zentrale Teil einer derartigen Reaktionsschicht dicker als deren Ende wird, fließt die Probenlösung (Plasma) in den dünneren Teil (Ende) der Reaktionsschicht in dem Probenlösungzufuhrweg, und füllt die Lüftungsöffnung auf, vor der vollständigen Lösung des zentralen Teils der Reaktionsschicht.
Im Gegensatz dazu, wird erfindungsgemäß das Hereinragen des zentralen Teils des sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungzufuhrweg den vornehmlichen Fluss der Probenlösung in den zentralen Teil des Probenlösungszufuhrweges erlauben.
Es ist zu beachten, dass: der primäre Seitenteil des Filters sich auf einen Teil bezieht, einschließlich dem Punkt, der zuerst im Kontakt mit der Probenlösung nach dem Auftropfen davon auf den Biosensor gerät und diese dann absorbiert; der sekundäre Seitenteil des Filters bezieht sich auf einen Teil einschließlich dem Punkt von welchem die Probenlösung (Plasma) in Richtung des inneren des Probenlösungzufuhrweges geht.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Elektronenvermittler kann ausgewählt werden aus Kaliumferricyanid, einer Redoxverbindung mit Elektronentransferfähigkeit zu und aus Oxidoreduktase, wie etwa Cholesterinoxidase, oder ähnliche.
Oxidoreduktase ist ein Enzym, dessen Substrat zu messen ist. Glukoseoxidase wird in einen Sensor angewendet, bei dem Glukose der zu messende Gegenstand ist. Für die Messung eines Cholesterinwerts in Blutserum, das als ein diagnostischer Indikator zu verwenden ist, wird das Enzym Cholesterinoxidase für die Katalyse einer Oxidationsreaktion von Cholesterin, oder das Enzymcholesterinesterase für die Katalyse des Vorgangs der Umwandlung von Cholesterindehydrogenase und Cholesterinester zu Cholesterin verwendet. Da die Enzymreaktion der Cholesterinesterase langsam abläuft, kann mit einem geeigneten oberflächenaktiven Stoff die Aktivität der Cholesterinesterase verbessert werden, um die für die Gesamtreaktion erforderliche Zeit zu reduzieren.
Der Elektronenvermittler und die Oxidoreduktase werden auf oder in der Nähe des Elektrodensystems in dem Sensor aufgebracht. In einem Sensor, welcher mit der Grundplatte vorgesehen mit dem Elektrodensystem kombiniert ist und ein Deckelelement umfasst, welches den Probenlösungzufuhrweg für eine Zufuhr der Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen der Grundplatte und dem Sensor bildet, kann der Elektronenvermittler und die Oxidoreduktase an der Stelle angeordnet werden, wie etwa dem Teil, welcher zu dem Probenlösungzufuhrweg oder der Öffnung in dem Probenlösungzufuhrweg exponiert ist.
Wo immer die Stelle ist, ist es bevorzugt, dass die eingebrachte Probenlösung die Reaktionsschicht leicht lösen kann und dann an dem Elektrodensystem ankommt. Es ist ebenfalls bevorzugt, die hydrophile Polymerschicht in Kontakt mit der oberen Fläche des Elektrodensystems zu bilden, um die Elektrode zu schützen und zu vermeiden, dass die gebildete Reaktionsschicht abgelöst wird. Anstelle der Bildung der hydrophilen Polymerschicht auf dem Elektrodensystem kann sie als die Grundlage der Reaktionsschicht gebildet werden, oder das hydrophile Polymer kann in der Grundreaktionsschicht enthalten sein.
Der in der Reaktionsschicht enthaltene Elektrodenvermittler wird bevorzugt von dem oberflächenaktiven Stoff für die Erhöhung ihrer Löslichkeit getrennt. Ebenfalls wird die Reaktionsschicht einschließlich des Elektrodenvermittlers bevorzugt von dem Enzym Cholesterinesterase getrennt, welches die Oxidationsreaktion von Cholesterin katalysiert, für den Zweck der Konservierung der Stabilität.
Es gab einen Vorschlag, dass in einem Biosensor für Messung eines Blutzuckerspiegels eine lipidhaltige Schicht gebildet wird, um eine Schicht gebildet auf dem Elektrodensystem oder ähnlichem abzudecken, um das Einbringen der Probenlösung in die Reaktionsschicht zu erleichtern (z. B. japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 2-062952). In dem erfindungsgemäßen Biosensor für die Messung von Cholesterin ist es bevorzugt, einen Teil der Reaktionsschicht durch Gefriertrocknen zu bilden, oder den oberflächenaktiven Stoff auf dem Deckelelement selbst zu fixieren. Die Verwendung einer derartigen Struktur eliminiert die Notwendigkeit für die Bildung einer Lipidschicht.
Das Beispiel für das hydrophile Polymer enthält wasserlösliche Cellulosederivate, wie etwa Ethylzellulose, Hydroxypropylcellulose oder Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyacrylsäure und deren Salze, Stärke und deren Derivate, Polymere von Maleinsäureanhydrid oder deren Salze, Polyacrylamid, Methacrylatharz und Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat.
Der oberflächenaktive Stoff kann ausgewählt werden aus n-Octyl-β-D-Thioglucosid, Polyethylenglucolmonododecylether, Natriumcholat, Dodecyl-β-Maltosid, Saccharosemonolaurat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurodeoxycholat, N,N-bis(3-D-Glukonamidpropyl)deoxycholamid und Polyoxyethylen (10) Octylphenylether.
Wenn ein Lipid verwendet wird, kann bevorzugt ein amphipathisches Phospholipid, wie etwa Lecithin, Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin verwendet werden.
Als das Messverfahren für den Oxidationsstrom ist ein 2-Elektrodensystem bestehend aus nur einer Messelektrode und einer Gegenelektrode und ein 3-Elektrodensystem mit einer Referenzelektrode anwendbar, und in dem 3-Elektrodensystem ist eine genauere Messung möglich.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Verwendung von spezifischen Ausführungsformen beschrieben, mit Bezugnahme auf die Zeichnungen.
Die 1 ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht, die einen Biosensor in Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform veranschaulicht.
Eine isolierende Grundplatte 1 wird aus einem isolierenden Harz, wie etwa Polyethylenterephthalat, hergestellt. Auf der oberen Fläche der linken Seite der Grundplatte 1 in der 1 wird eine Silberpaste durch Siebdruck aufgedruckt, um die Leitungen 2 und 3 und die Grundlage eines Elektrodensystems zu bilden. Eine leitfähige Kohlenstoffpaste einschließlich eines Bindeharzes wird weiterhin auf die Grundplatte 1 gedruckt, um ein Elektrodensystem einschließlich einer Messelektrode 4 und einer Gegenelektrode 5 zu bilden.
Ebenfalls wird eine isolierende Paste in einem spezifischen Bereich gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 zu bilden. Die isolierende Schicht 6 hält die exponierten Flächen der Messelektrode 4 und der Gegenelektrode 5 konstant und bedeckt teilweise die Leitungen 2 und 3.
Die Grundplatte 1 umfasst ferner eine Öffnung 7 an dem rechten Seitenteil davon. Ein halbkreisförmiges Teil 9 auf der Elektrodensystemseite der Öffnung 7 hat im Wesentlichen die Form eines Halbkreises in einer Projektion davon, die sich der flachen Fläche nähert, welche die gleiche ist, wie die Oberfläche der Grundplatte, um so das Ende des sekundären Seitenteils des folgenden erwähnten Filters 10 zu lokalisieren. Ein rechteckig konkaves Teil 8 wird neben dem Halbkreisteil 9 vorgesehen.
Ein Abstandshalter 11, der mit der Grundplatte 1 kombiniert wird, umfasst einen Schlitz 12, für die Bildung des im folgenden erwähnten Probenlösungzufuhrweges auf der linken und einen Öffnung 15 auf der rechten, welche identisch zu der Öffnung 7 in der Grundplatte 1 geformt ist. Die Öffnung 15 umfasst einen halbkreisförmigen Teil 19 auf der linken und einen rechteckigen konkaven Teil 14 daneben.
Ein oberer Hilfsdeckel 21 umfasst: eine Lüftungsöffnung 22, die mit der Endseite des Schlitzes 12 in dem Abstandshalter 11 verbunden ist; eine Öffnung 25, die mit der rechten Hälfte der Öffnung 15 in dem Abstandshalter 11 und mit der rechten Hälfte der Öffnung 7 in der Grundplatte 1 verbunden ist; und eine Öffnung 24, die mit dem konkaven Abschnitten 14 und 8 der Öffnungen 15 bzw. 7 verbunden ist; und einen trennenden Teil 26 für die Trennung der Öffnungen 24 und 25. Ein oberer Deckel 31 umfasst eine Lüftungsöffnung 32 bzw. eine Öffnung 35, die mit der Lüftungsöffnung 22 und der Öffnung 25 in dem oberen Hilfsdeckel 21 verbunden sind.
Ein unterer Hilfsdeckel 41 umfasst eine Öffnung 44 entsprechend der Öffnung 24 in dem oberen Hilfsdeckel 21. Ein unterer Hilfsdeckel 51 wird aus einer flachen Platte hergestellt.
Der vorher erwähnte obere Deckel 31, der obere Hilfsdeckel 21, der Abstandshalter 11, der untere Hilfsdeckel 41 und der untere Deckel 51 werden aus Polyethylenterephthalat hergestellt, wie in dem Fall mit der Grundplatte 1.
Der Filter 10 wird aus einem Glasfaserfilterpapier hergestellt und in der Projektion davon, die sich der Planfläche der Grundfläche nähert, welche die gleiche wie die Grundplatte 1 ist, umfasst er einen trapezförmigen Teil 10a mit einem oberen Saum vom 2 mm, einem unteren Saum von 4 mm und einer Höhe von 5 mm und einem halbkreisförmigen Teil 10b mit einem Radius von 1 mm, die den oberen Saum des trapezförmigen Teils 10a verbinden.
Dieser Sensor wird hergestellt durch Bildung einer Reaktionsschicht auf einem vorbestimmten Element, wie im folgenden beschrieben, Anordnen des unteren Hilfsdeckels 41 auf den unteren Deckel 51 und Anordnen der Grundplatte 1 auf dem unteren Hilfsdeckel 41, so dass die linke Kante der isolierenden Schicht 6 der Grundplatte 1 an der linken Kante des unteren Hilfsdeckels 41 ausgerichtet wird. Der Filter 10 wird dann auf den unteren Hilfsdeckel 41 gesetzt, so dass der sekundäre Seitenteil, nämlich die linke Kante, des Filter 10 in den halbkreisförmigen Teil 9 der Grundplatte 1 und den halbkreisförmigen Teil 19 des Abstandshalters 11 passt. Auf diesen Elementen werden nacheinander der Abstandshalter 11, der obere Hilfsdeckel 21 und der obere Deckel 31 kombiniert. Hierbei ermöglicht die Laminierung der Grundplatte 1, des Abstandshalters 11, der Hilfsdeckel 21 und 41 und der Deckel 31 und 51 in einer derartigen Positionsanordnung gezeigt durch die gestrichelten Linien in der 1, die Herstellung eines derartigen Sensors, wie in der 2 gezeigt.
In dem Filter 10 presst der trennende Teil 26 des oberen Hilfsdeckels 21 und des unteren Deckels 41 die untere Saumseite, nämlich den primären Seitenteil des trapezförmigen Abschnitts 10a, von den oberen und unteren Seiten. Der obere Hilfsdeckel 21 und der untere Hilfsdeckel 41 pressen ebenfalls das Ende des sekundären Seitenteils von den oberen und unteren Seiten. Die Öffnung 35 in dem oberen Deckel 31, die Öffnung 25 in dem oberen Hilfsdeckel 21, der rechte Seitenteil der Öffnung 15 in dem Abstandshalter 11 und der rechte Seitenteil der Öffnung 7 in der Grundplatte 1 sind miteinander verbunden, um ein konkaves Teil zu bilden, dessen Grund der untere Hilfsdeckel 41 ist. Dieser konkave Teil dient als ein Probenzufuhrteil.
Die Öffnung 24 in dem oberen Hilfsdeckel 21, die Öffnung 44 in dem unteren Hilfsdeckel 41 und die konkaven Teile 14 und 8 der Öffnungen 15 und 7, welche der Öffnung 24 und der Öffnung 44 entsprechen, bilden einen Raum, der den Filter 10 umgibt. Da dieser Raum vorhanden ist, ist es möglich, die Hämozyten daran zu hindern, durch die Oberflächen des oberen Hilfsdeckels 21, des unteren Hilfsdeckels 41 usw., welche den Filter halten, in das Elektrodensystem zu fließen, anstatt durch den Filter zu treten.
Der durch den Schlitz 12 in dem Abstandshalter 11 zwischen der Grundplatte 1 und dem oberen Hilfsdeckel 21 gebildete Raum bildete einen Probenlösungzufuhrweg. Das Ende dieses Probenlösungzufuhrweges ist mit der Außenseite über die Lüftungsöffnungen 22 und 32 verbunden. Das Ende der sekundären Seite des Filters 10 ist in der Führung des Probenlösungzufuhrweges eingebunden. Der Querschnitt des Probenlösungzufuhrweges ist rechtwinklig, dessen kürzere Seite der Richtung der Höhe des Probenlösungzufuhrweges entspricht. Wie aus der 2 ersichtlich, hat die Führung des Probenlösungzufuhrweges eine Tiefe äquivalent zu der Dicke der Grundplatte in dem halbkreisförmigen Teil 9 der Grundplatte 1. Die Führung des sekundären Seitenteils des Filters 10, die in diesem Teil beteiligt ist, ist halbkreisförmig in der Projektion davon, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche die gleiche wie die Oberfläche der Grundplatte 1 ist, und der zentrale Teil ragt in den Probenlösungzufuhrweg hinein, wie aus der 3 ersichtlich.
Das Beispiel des Filters, dessen Führung des sekundären Seitenteils halbkreisförmig in der Projektion davon ist, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche die gleiche wie die Oberfläche der Grundplatte 1 ist, kann einen Filter in dreieckiger oder „homebase"-Form in der Projektion davon haben, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche die gleiche wie die Oberfläche der Grundplatte 1 ist.
Eine Reaktionsschicht wird bei der 2 weggelassen, während sie in der 4 gezeigt wird. Eine hydrophile Polymerschicht 17 und eine Reaktionsschicht 18a werden auf dem Elektrodensystem der Grundplatte 1 gebildet. Eine Reaktionsschicht 18b wird auf der unteren Flächenseite des oberen Hilfsdeckels 21 gebildet, welche der Decke des Probenlösungszufuhrweges entspricht. Der Abstandshalter 11 wird an den oberen Hilfsdeckel 21 gebunden, das Ganze wird umgedreht, um das konkave Teil mit dem Schlitz 12 zu bilden, und eine Lösung zur Bildung einer Reaktionsschicht wird auf das erhaltene konkave Teil getropft, gefolgt durch Trocknen, um die Reaktionsschicht 18b zu bilden.
Während der in 1 gezeigte Biosensor unter Verwendung von sechs Typen von Elementen hergestellt wird, um die Konfiguration davon leicht verständlich zu machen, kann der obere Deckel 31 und der obere Deckel 21, oder ferner einschließend den Abstandshalter 11, aus einem Element aufgebaut werden. Der untere Hilfsdeckel 41 und der untere Deckel 51, oder ferner einschließlich die Grundplatte 1, kann ebenfalls aus einem Element gebildet werden.
Für die Messung von Cholesterin in Blut unter Verwendung dieses Sensors wird Blut als eine Probe von der Öffnung 35 in dem oberen Deckel 31 zu dem konkaven Teil geführt, der als ein Probenzufuhrteil dient. Das hier zugeführte Blut infiltriert von dem Ende des primären Seitenteils des Filters 10 dort hinein. In dem Filter 10 sondert sich das Plasma von dem Ende des sekundären Seitenteils des Filters ab, da die Infiltrationsgeschwindigkeit von Hämozyten langsamer als die des Plasmas ist, welches ein flüssiger Bestandteil ist. Das abgesonderte Plasma füllt dann den gesamten Probenlösungzufuhrweg von der Nähe des Elektrodensystems zu der Lüftungsöffnung 22, während ein Reaktionsreagenz, dass auf der Position getragen wird, die das Elektrodensystem bedeckt, oder auf der Rückfläche des Deckels, unmittelbar oberhalb des Elektrodensystems.
Wenn einmal der gesamte Probenlösungzufuhrweg mit der Flüssigkeit gefüllt ist, wird der Fluss der Flüssigkeit im Filter 10 ebenfalls gestoppt und folglich werden die Hämozyten zu diesem Zeitpunkt in der Position gehalten, ohne an dem Ende des sekundären Seitenteils des Filters 10 anzulangen. Dementsprechend ist der Filter 10 aufgebaut, um einen Unterschied in den Fliesswiderständen des Plasmas und der Hämozyten in einem derartigen Umfang zu haben, dass wenn Plasma in einer ausreichenden Menge zur Füllung des gesamten Probenlösungzufuhrweges durch den Filter getreten ist, die Hämozyten nicht den sekundären Seitenteil des Filters erreichen. Ein Tiefenfilter mit einer Porengröße von etwa 1 bis 7 μm wird bevorzugt als der Filter der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Nach der beschriebenen Filtration der Hämozyten, läuft eine chemische Reaktion der durch das Plasma gelösten, Reaktionsschicht, mit einem zu messenden Bestandteil (Cholesterin im Falle eines Cholesterinsensors) in dem Plasma ab, und ein Stromwert in der Elektrodenreaktion wird nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit gemessen, um den Bestandteil im Plasma zu bestimmen.
Die 4 stellt ein Beispiel der Anordnung der Reaktionsschicht in der Nähe des Elektrodensystems des Probenlösungzufuhrweges dar. Auf dem Elektrodensystem der Grundplatte 1 wird die Schicht 17 aus Natriumkarboxymethylzellulose als das hydrophile Polymer und die Schicht 18a einschließlich des Reaktionsreagenz, d. h. des Elektrodenvermittlers, gebildet. Auf der Rückfläche des durch Kombination des oberen Deckels 31, des oberen Hilfsdeckels 21 und des Abstandshalter 11 sich ergebenen Deckelelements wird die Reaktionsschicht 18b einschließlich Oxidoreduktase auf der Oberfläche gebildet, die zu dem Probenlösungzufuhrweg exponiert ist.
In den 1 bis 4 wird dargestellt, dass jede Querschnittsfläche des Schlitzes 12, die den Probenlösungzufuhrweg bildet, welche vertikal zu der Flussrichtung der Flüssigkeit ist, kleiner als die Querschnittsfläche des Filters 10 erzeugt wird. Der Filter 10 ist so aufgebaut, dass er in Gänze im Wesentlichen eine gleichförmige Dichte hat. Durch Erzeugen der Querschnittsfläche des Probenlösungzufuhrweges kleiner als die Querschnittsfläche des primären Seitenteils des Filters 10, wie vorher beschrieben, kann das Plasma mit den Hämozyten darin, filtriert mit dem Filter, aufgrund der Kapillarität direkt in den Probenlösungzufuhrweg eingesaugt werden.
Wie vorher beschrieben, umfasst die Reaktionsschicht im Allgemeinen einen leicht zu lösenden Teil und einen schwer zu lösenden Teil. Die Kante des Probenlösungzufuhrweges, nämlich der Teil entlang der Wandfläche des Schlitzes 12 in dem Abstandshalter 11, ist leicht zu lösen, während der zentrale Teil des Probenlösungzufuhrweges schwer zu lösen ist. Da die Probenlösung, die durch den Filter getreten ist, der vornehmlich entlang des Abstandshalters fließt, kann es viele Fälle geben, wo die Probenlösung vor vollständiger Lösung des zentralen Teils die Luftöffnung füllt. Das Herausragen des zentralen Teil des sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungzufuhrweg als sowohl die rechten und linken Enden davon, ermöglicht einen vornehmlichen Fluss der Probenlösung durch den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges, wodurch das Plasma unmittelbar in den Sensor ohne Zurücklassen von Blasen durch den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges fließen kann.
Die 5 ist ein Diagramm, das den Vorgang des Flusses des gefilterten Plasmas in dem Probenlösungzufuhrweg erläutert, welches eine Draufsicht zeigt, die den Probenlösungzufuhrweg 12, die Lüftungsöffnung 22 (32) und den Filter 10 zeigt. Ein Bezugsbuchstabe (a) zeigt einen anfänglichen Zustand an, während ein Bezugsbuchstabe (b) einen Zustand anzeigt, in welchem das Plasma 20, das mit dem Filter 10 filtriert wurde, beginnt in den Probenlösungzufuhrweg 12 einzudringen. Wie aus (b) ersichtlich, ermöglicht der Vorstoß des zentralen Teils des sekundären Seitenteils des Filters, der in dem Probenlösungzufuhrweg mehr als sowohl in die rechten und linken Enden davon hineinragt, den vornehmlichen Fluss des Plasmas 20 durch den zentralen Teil des Probenlösungzufuhrweges. Da das Plasma derartig an der Lüftungsöffnung 22 anlangt, wird der Probenlösungzufuhrweg nicht in einem Zustand sein, in dem Blasen eingeschlossen sind.
Auf der anderen Seite stellt die 7 den Fluss des Plasmas in dem Fall der Verwendung eines herkömmlichen Filters 10' dar, dessen Ende eben ist. Da eine Reagenzschicht des Teils entlang der Kante des Probenlösungzufuhrweges 12' leicht zu lösen ist, fließt das Plasma vornehmlich durch das Ende des Probenlösungzufuhrweges, es ergibt sich vermutlich ein Zustand, dass der Probenlösungzufuhrweg Blasen 30 in seinem zentralen Teil enthält.
In dem wie dargestellt aufgebauten Biosensor hat der primäre Seitenteil des Filters bevorzugt eine Breite von nicht mehr als 5 mm und eine Dicke von nicht mehr als 1 mm. Die Öffnung in dem Probenlösungzufuhrweg hat bevorzugt eine Breite von nicht mehr als 2 mm und eine Höhe von nicht mehr als 200 μm. Wenn Zum Beispiel der Filter eine Dicke von 450 μm und der Probenlösungzufuhrweg eine Höhe von 100 μm hat, hat die Grundplatte bevorzugt eine Dicke von 350 μm.
Im Folgenden wird ein Beispiel der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Beispiel 1
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Cholesterinsensor mit den Strukturen der 1 bis 4 hergestellt, wobei die Reaktionsschicht 18a den Elektronenvermittler und die Reaktionsschicht 18b Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und de oberflächenaktiven Stoff enthält.
Zunächst wurden 5 μl einer wässrigen Lösung mit 0,8 Gew.-% Natriumcarboxymethylcellulose (hiernach einfach als CMC bezeichnet) auf das Elektrodensystem der Grundplatte 1 getropft, und mit einer Trockenvorrichtung mit einem warmen Luftstrom von 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die CMC-Schicht 17 als die hydrophile Polymerschicht zu bilden.
Als nächstes wurden 4 μl einer wässrigen Kaliumferricyanidlösung (entsprechend 70 mA Kaliumferricyanid) auf die CMC-Schicht 17 getropft und in der Trockenvorrichtung mit warmem Luftstrom bei 50°C für 10 Minuten getrocknet, um die Schicht 18a einschließlich Kaliumferricyanid zu bilden.
Polyoxyethylen(10)octylphenylether (TritonX-100) als ein oberflächenaktiver Stoff wurde zu einer wässrigen Lösung hergestellt durch Lösung von Cholesterinoxidase von Nocardia (EC1.1.3.6) und Cholesterinesterase von Pseudomonas (EC.3.1.1.13) in Wasser, hergestellt. 1,3 μl der erhaltenen gemischten Lösung wurde auf das konkave Teil gebildet auf dem Schlitz 12 in dem Deckelelement aufgetropft, welches durch Kombination des oberen Deckels 31, des oberen Hilfsdeckels 21 und des Abstandshalters 11 erhalten wurde, mit flüssigem Stickstoff bei –196°C eingefroren und in einem Kolben in einer Gefriertrockenvorrichtung, über Nacht getrocknet, um die Reaktionsschicht 18b einschließlich einer Einheit (U)/Sensor an Cholesterinoxidase, 2,5 U/Sensor Cholesterinesterase und 2 Gew.-% des oberflächenaktiven Stoffes zu bilden.
Der hier verwendete Abstandshalter hatte eine Dicke von 100 mm und der Elektrodensystemteil des Probenlösungzufuhrweges hatte eine Höhe von 100 mm. Die Öffnung in diesem Probenlösungzufuhrweg war ein Teil, der dem halbkreisförmigen Teil 9 der Öffnung 7 in der Grundplatte 1 entspricht, mit einer Tiefe äquivalent zu der Dicke der Grundplatte 1 von 350 mm. Der Probenlösungzufuhrweg hatte eine Breite von 2 mm.
Der Filter 10 wurde unter Verwendung eines Glasfaserfilters mit einer Dicke von etwa 450 μm hergestellt. Dieser Filter wurde ausgestanzt, um eine Form zu haben mit einem trapezförmigen Teil 10a mit einem oberen Saum von 2 mm, einem unteren Saum von 4 mm und einer Höhe von 5 mm und im halbkreisförmigen Teil 10b mit einem Radius von 1 mm verbunden mit dem oberen Saum des trapezförmigen Teils 10a. Der erhaltene Filter wurde derartig angeordnet, dass das Ende davon in den konkaven Abschnitt 7 der Grundplatte passte.
Nachfolgend wurde das Deckelement mit den vorher erwähnten drei Elementen an das Element, hergestellt durch Verbindung der Grundplatte 1, des unteren Hilfsdeckels 41 und des unteren Deckels 51, verbunden, um einen Cholesterinsensor herzustellen.
20 μl Vollblut als die Probenlösung wurden in das Probenzufuhrteil dieses Sensors durch die Öffnung 35 gegeben und drei Minuten nach dem Einführen wurde eine Pulsspannung von +0,5 V an die Anode der Messelektrode relativ zu der Gegenelektrode angelegt, und fünf Sekunden nach dem Anlegen wurde der Wert des Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode fließt, gemessen. Die Ergebnisse sind in der 6 in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie aus der 6 ersichtlich, kann gemäß dem erfindungsgemäßen Sensor eine hervorragende Linearität zwischen der Cholesterinkonzentration und dem Antwortwert erhalten werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß dem erfindungsgemäßen Biosensor können Hämozyten, welche interferierende Substanzen sind mit einem Filter entfernt werden, ohne Blasen zu erzeugen und selbst in einem Fall wo Blasen erzeugt werden, können sie leicht entfernt werden, was eine unmittelbare Zufuhr von Plasma mit daraus entfernten Hämozyten zu dem Elektrodensystem ermöglicht. Die vorliegende Erfindung kann daher einen elektrochemischen Biosensor mit einer hervorragenden Antworteigenschaft zur Verfügung stellen.

Claims

Biosensor, mit: einer isolierenden Grundplatte (1); einem Elektrodensystem, welches auf der Grundplatte vorgesehen ist, und eine Messelektrode (4) und eine Gegenelektrode (5) hat; eine Reaktionsschicht (18a, 18b) einschließlich wenigstens einer Oxidoreduktase und einem Elektronenvermittler; einem Probenlösungszufuhrweg, welcher das Elektrodensystem und die Reaktionsschicht enthält und eine Lüftungsöffnung (22) an der Endseite davon hat; ein Probenzufuhrteil; und einen Filter (10), welcher zwischen dem Probenlösungszufuhrweg und dem Probenzufuhrteil angeordnet ist und Hämozyten filtriert, wo mit diesem Filter filtriertes Plasma mit Hämozyten darin in den Probenlösungszufuhrweg aufgrund von Kapillarität eingesaugt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale Teil eines sekundären Seitenteils des Filters in den Probenlösungszufuhrweg mehr als sowohl das rechte, als auch das linke Ende davon hineinragt.
Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der sekundäre Seitenteil des Filters bogenförmig oder halbkreisförmig in der Projektion davon ist, die sich der Planfläche der Grundplatte nähert, welche die gleiche wie die Oberfläche davon ist.
Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenlösungszufuhrweg eine Öffnung (15) mit einem konkaven Abschnitt (19), eingepasst in den oberen Teil oder den unteren Teil des sekundären Seitenteils des Filters, umfasst.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsfläche des Probenlösungszufuhrweges kleiner als die Querschnittsfläche eines primären Seitenteils des Filters ist.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsfläche des sekundären Seitenteils des Filters kleiner als die Querschnittsfläche des primären Seitenteils davon ist.