DE69837712T2

DE69837712T2 - Mediatoren zum regenerieren von kofaktoren in biosensoren

Info

Publication number: DE69837712T2
Application number: DE69837712T
Authority: DE
Inventors: Nigel J. Forrow; Gurdial S. Bedford SANGHERA; Jared L. Watkin; Stephen Walters
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2018-10-17
Also published as: EP2298928A3; AR020978A2; CA2305800A1; TW584723B; CA2305800C; WO1999019507A1; ATE361373T1; ES2349059T3; AR019002A1; EP2119795B1; AU1090999A; AU743468B2; BR9814086A; DE69837712D1; DE69841877D1; EP1023455B1; EP2298928A2; CA2667767C; CA2667767A1; EP1023455A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft das allgemeine Feld von Elektroden für amperometrische Biosensoren. Genauer betrifft die Erfindung das Gebiet von Verbindungen zur Verwendung als Mediatoren für das Recycling von Kofaktoren, die in diesen Elektroden verwendet werden.
NAD- und NADP-abhängige Enzyme sind von großem Interesse insoweit, als viele Substrate von klinischem Wert haben, wie zum Beispiel Glucose, D-3-Hydroxybutyrat, Laktat, Ethanol und Cholesterin. Amperometrische Elektroden für die Detektion dieser Substrate und anderer Analyte können entwickelt werden durch Einschließen dieser Klasse von Enzymen und Erstellen einer elektrischen Kommunikation mit der Elektrode über die vermittelte Oxidation der reduzierten Kofaktoren NADH und NADPH.
NAD- und NADP-abhängige Enzyme sind im Allgemeinen intrazelluläre Oxidoreduktasen (EC 1.x.x.x). Die Oxidoreduktasen sind weiter klassifiziert entsprechend der Identität der Donorgruppe eines Substrats, auf das sie wirken. Zum Beispiel werden Oxidoreduktasen, die auf eine CH-OH-Gruppe innerhalb eines Substrats wirken, als EC 1.1.x.x klassifiziert, wohingegen diejenigen, die auf ein Aldehyd oder eine Keto-Gruppe eines Substrats wirken, als EC 1.2.x.x klassifiziert werden. Einige wichtige Analyte (zum Beispiel Glucose, D-3-Hydroxybutyrat, Laktat, Ethanol und Cholesterin) sind Substrate der EC 1.1.x.x-Enzyme.
Die Kategorie der Oxidoreduktasen wird auch unterteilt entsprechend dem Typ von Akzeptor, der vom Enzym verwendet wird. Die Enzyme, die für die vorliegende Erfindung relevant sind, haben NAD⁺ oder NADP⁺ als Akzeptoren und sind klassifiziert als EC 1.x.1.x. Diese Enzyme besitzen im Allgemeinen Sulphydryl-Gruppen innerhalb ihrer aktiven Stellen und können somit irreversibel gehemmt werden durch Thiol-reaktive Reagenzien, wie zum Beispiel Jodacetat. Ein irreversibler Inhibitor bildet eine stabile Verbindung, oft durch die Bildung einer kovalenten Bindung mit einem bestimmten Aminosäure-Rest (zum Beispiel Cystein, oder Cys), welcher für die enzymatische Aktivität wesentlich ist. Zum Beispiel wird Glyceraldehyd-3-P-Dehydrogenase (EC 1.2.1.9) stöchiometrisch alkyliert durch Jodacetat bei Cys₁₄₉ mit gleichzeitigem Verlust der katalytischen Aktivität. Zusätzlich sind die Enzyme Glucosedehydrogenase, D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH) und Laktatdehydrogenase dafür bekannt, dass sie durch Thiol-Reagenzien irreversibel gehemmt werden. Somit ist, wenn man stabile Biosensoren, die NAD- oder NADP-abhänge Dehydrogenasen enthalten, entwickeln will, das Vermeiden von Verbindungen, welche mit Thiolen reaktiv sind, unbedingt erforderlich, da sie als Enzym-Inhibitoren wirken können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von NAD⁺- und NADP⁺-Mediatorverbindungen, die sich nicht irreversibel an Thiolgruppen in den aktiven Stellen von intrazellulären Dehydrogenase-Enzymen binden. Solche Mediatorverbindungen vermeiden eine allgemeine Art der Enzym-Hemmung. Die Mediatoren können deshalb die Stabilität und die Verlässlichkeit der elektrischen Reaktion in amperometrischen Elektroden erhöhen, die aus NAD- oder NADP-abhängigen Enzymen konstruiert wurden.
In einer Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch ein Testelement für einen amperometrischen Biosensor aus. Das Element schließt eine Elektrode ein, welche Testreagenzien hat, die auf ihr verteilt sind. Das Testelement der Erfindung ist ein wegwerfbarer Einweg-Elektrodenstreifen für die Anheftung an die Signal-Ablese-Schaltung eines Sensorsystems, um einen Strom zu detektieren, der repräsentativ ist für einen Analyten in einer wässerigen Probe, wobei der Streifen Folgendes umfasst:

a) einen lang gestreckten Träger, der eine im Wesentlichen flache, ebene Oberfläche hat, angepasst für die wieder ablösbare Anheftung an die Ablese-Schaltung;
b) einen ersten Leiter, der sich entlang der Oberfläche erstreckt und der ein leitendes Element für die Verbindung mit der Ablese-Schaltung umfasst; eine aktive Elektrode auf der Oberfläche in Kontakt mit dem ersten Leiter, wobei die aktive Elektrode ein Nikotinamid-Kofaktor-abhängiges Enzym, einen Nikotinamid-Kofaktor und eine Mediatorverbindung, die eine der folgenden zwei Formeln hat:
oder einen Metallkomplex oder ein Chelat davon umfasst, worin X und Y unabhängig Sauerstoff, Schwefel, CR³R⁴, NR³ oder NR³R⁴⁺ oder die funktionelle Gruppe CZ¹Z² sein können, worin Z¹ und Z² Elektronen abziehende Gruppen sind; R₁ und R₂ können unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe sein, und R₃ und R₄ können unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Amino-, Alkoxyl- oder Aryloxylgruppe sein, worin die aktive Elektrode mit Füll- und Bindemittel-Inhaltsstoffen formuliert ist, sodass die Elektrode eine einförmige Reaktion auf Konzentrationen des Analyten zwischen ungefähr 1 und 8 mM gibt, wenn die Messung in einer kinetischen Art und Weise durchgeführt wird, in welcher die Oxidation und Reduktion des Mediators während der Messung gleichzeitig auftreten, wobei der Bindemittel-Inhaltstoff Materialien einschließt, welche die Viskosität von wässerigen Medien rasch erhöhen und die Bildung von Filmen oder Schichten fördern, und wobei der Füllstoff-Inhaltsstoff ein partikuläres Material ist, welches chemisch inert ist gegenüber den Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die an der Messung beteiligt sind, und in wässerigen Medien unlöslich ist;
c) einen zweiten Leiter, der sich entlang der Oberfläche erstreckt und ein leitendes Element für die Verbindung mit der Ablese-Schaltung umfasst;
d) eine Referenz-/Zähler-Elektrode in Kontakt mit dem zweiten Leiter;
e) wobei die Leiter so voneinander beabstandet sind, dass sie nicht in elektrischem Kontakt stehen, und so ausgestaltet sind, dass sie nicht in elektrischen Kontakt gebracht werden, wenn die wässerige Probe auf den Streifen platziert wird;
f) wobei die aktive Elektrode und die Referenz-/Zähler-Elektrode so ausgestaltet sind, dass beide gleichzeitig mit einem kleinen Tropfen der wässerigen Probe bedeckt werden können, um einen elektrisch leitenden Weg zwischen den Elektroden bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Messung der Konzentration in einer wässerigen Probe eines Analyten, der durch ein NAD(P)⁺-abhängiges Enzym. einer Oxidation unterzogen wird, Folgendes umfassend:

a) Oxidieren des Analyten mit dem NAD(P)⁺-abhängigen Enzym in der Anwesenheit von NAD(P)⁺; Oxidieren des NAD(P)H, das durch Reaktion mit dem Analyten und dem NAD(P)⁺-abhängigen Enzym erzeugt wurde, mit einer Mediatorverbindung, die eine der folgenden zwei Formeln hat:
oder einem Metallkomplex oder Chelat davon, worin X und Y unabhängig Sauerstoff, Schwefel, CR³R⁴, NR³ oder NR³R⁴⁺ oder die funktionelle Gruppe CZ¹Z² sein können, worin Z¹ und Z² Elektronen abziehende Gruppen sind; R₁ und R₂ können unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe sein; und R³ und R⁴ können unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Amino-, Alkoxyl- oder Aryloxylgruppe sein; wobei das NAD(P)⁺-abhängige Enzym, NAD(P)⁺ und die Mediatorverbindung auf die Oberfläche der Elektrode in Kombination mit einem Bindemittel und einem Füllstoff aufgebracht wurden; und
b) Anbringen eines elektrischen Potenzials an einer Elektrode, um die Mediatorverbindung, die bei der Oxidation von NAD(P)H reduziert wurde, zu reoxidieren, und Beobachten des resultierenden Stroms, worin ein Teil der Mediatorverbindung durch Reaktion mit NAD(P)H reduziert wird, während ein Teil der Mediatorverbindung durch Transfer von Elektronen zu der Elektrode während einer Messperiode oxidiert wird, und worin die Geschwindigkeit der Oxidation der Mediatorverbindung über den Messzeitraum und folglich der resultierende beobachtete Strom einförmig mit der Konzentration des Analyten in der Probe korreliert.

Vorzugsweise korreliert der während des Messzeitraums beobachtete Strom linear mit der Konzentration des Analyten in der Probe. Vorzugsweise beträgt das angelegte Potenzial 200 mV oder weniger.
Jede Alkylgruppe, solange nicht anderweitig angegeben, kann linear oder verzweigt sein und kann bis zu 12, vorzugsweise bis zu 6 und insbesondere bis zu 4 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugte Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl. Wenn ein Alkylanteil einen Teil einer anderen Gruppe bildet, zum Beispiel der Alkylanteil einer Alkoxylgruppe, wird es bevorzugt, dass er bis zu 6, insbesondere bis zu 4, Kohlenstoffatome enthält. Bevorzugte Alkylanteile sind Methyl und Ethyl.
Eine aromatische oder Arylgruppe kann jede aromatische Kohlenwasserstoffgruppe sein und kann von 6 bis 24, vorzugsweise 6 bis 18, noch stärker bevorzugt 6 bis 16, und insbesondere 6 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten. Bevorzugte Arylgruppen schließen Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl- und Pyrylgruppen ein, insbesondere eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, und speziell eine Phenylgruppe. Wenn ein Arylanteil einen Teil einer anderen Gruppe bildet, zum Beispiel der Arylanteil einer Aryloxylgruppe, wird es bevorzugt, dass er ein Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl- oder Pyryl-, insbesondere Phenyl- oder Naphthyl-, und im Speziellen ein Phenylanteil ist.
Eine heteroaromatische oder Heteroarylgruppe kann jedes aromatische monozyklische oder polyzyklische Ringsystem sein, welches mindestens ein Heteroatom enthält. Vorzugsweise ist eine Heteroarylgruppe ein 5- bis 18-gliedriges, insbesondere ein 5- bis 14-gliedriges, und speziell ein 5- bis 10-gliedriges, aromatisches Ringsystem, das mindestens ein Heteroatom enthält, gewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoffatomen. 5- und 6-gliedrige Heteroarylgruppen, insbesondere 5-gliedrige Gruppen, werden besonders bevorzugt. Heteroarylgruppen, die mindestens ein Stickstoffatom enthalten, werden besonders bevorzugt. Bevorzugte Heteroarylgruppen schließen Pyridyl-, Pyrylium-, Thiopyrylium-, Pyrrolyl-, Furyl-, Thienyl-, Indolinyl-, Isoindolinyl-, Indolizinyl-, Imidazolyl-, Pyridonyl-, Pyronyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Oxazolyl-, Thiazolyl-, Purinyl-, Chinolinyl-, Isochinolinyl-, Chinoxalinyl-, Pyridazinyl-, Benzofuranyl-, Benzoxazolyl- und Acridinylgruppen ein.
Wenn irgendeiner der obigen Substituenten als substituiert bezeichnet wird, können die Substituentengruppen, welche vorhanden sein können, irgendeine oder mehrere derjenigen sein, die üblicherweise verwendet werden in der Entwicklung von Verbindungen zur Verwendung in elektrochemischen Reaktionen und/oder der Modifikation von solchen Verbindungen, um ihre Struktur/Aktivität, ihre Löslichkeit, Stabilität, Vermittlungsfähigkeit, ihr formales Potenzial (E⁰) oder eine andere Eigenschaft zu beeinflussen. Spezifische Beispiele für solche Substituenten schließen zum Beispiel Halogenatome, Oxo, Nitro, Cyano, Hydroxyl, Cycloalkyl, Alkyl, Haloalkyl, Alkoxy, Haloalkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Formyl, Alkoxycarbonyl, Carboxyl, Alkanoyl, Alkylthio, Alkylsulfinyl, Alkylsulfonyl, Arylsulfinyl, Arylsulfonyl, Carbomoyl, Alkylamido, Aryl oder Aryloxygruppen ein. Wenn irgendeiner der obigen Substituenten eine Alkyl-Substituentengruppe darstellt oder enthält, kann diese linear oder verzweigt sein und bis zu 12, vorzugsweise bis zu 6 und insbesondere bis zu 4 Kohlenstoffatome enthalten. Eine Cycloalkylgruppe kann von 3 bis 8, vorzugsweise von 3 bis 6, Kohlenstoffatome enthalten. Eine Arylgruppe oder ein Arylanteil kann von 6 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wobei Phenylgruppen besonders bevorzugt werden. Ein Halogenatom kann ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom sein und jegliche Gruppe, welche einen Haloanteil enthält, wie zum Beispiel eine Haloalkylgruppe, kann somit irgendeines oder mehrere von diesen Halogenatomen enthalten.
Eine Elektronen abziehende Gruppe kann jede Gruppe sein, welche eine stabile Methylengruppe CZ¹Z² bildet. Solche Elektronen abziehenden Gruppen können Halogenatome, Nitro, Cyano, Formyl, Alkanoyl, Carboxyl und Sulfonsäuregruppen einschließen.
Vorzugsweise sind sowohl X als auch Y Sauerstoffatome.
Es wird auch bevorzugt, dass R₁ und R₂ unabhängig gewählt werden aus Phenyl-, Naphthyl-, Pyridyl- und Pyrrolylgruppen, wobei Pyridylgruppen besonders bevorzugt werden. Der Begriff "Pyridylgruppe" schließt auch das N-Oxid davon ebenso wie Pyridinium und N-substituierte Pyridiniumgruppen ein.
Vorzugsweise sind R₁ und R₂ unsubstituiert oder nur durch eine oder mehrere, vorzugsweise eine oder zwei, Alkylgruppen, insbesondere Methylgruppen, substituiert. Es wird besonders bevorzugt, dass R₁ und R₂ unsubstituiert sind.
R₃ und R₄ sind, wenn vorhanden, vorzugsweise unabhängig gewählt aus Wasserstoffatomen und Alkylgruppen.
Metallkomplex und Chelate schließen Komplexe und Chelate mit Übergangsmetallen ein, besonders Übergangselemente der ersten, zweiten und dritten Reihe, wie zum Beispiel Ruthenium, Chrom, Kobalt, Eisen, Nickel und Rhenium, wobei Ruthenium besonders bevorzugt wird. Andere Gruppen, wie zum Beispiel 4-Vinyl-4'-methyl-2,2'-bipyridyl-(v-bpy-) und Bipyridyl-(bpy-)Gruppen können auch in solche Komplexe und Chelate als Teile eines Komplex-Metall-Ions eingeschlossen sein. Typischerweise werden sich solche Komplexe und Chelate bilden als Resultat davon, dass Heteroatome in R₁ und R₂ sich mit einem Metall-Ion oder Metall-Ionen-Komplex koordinieren.
Die Test-Reagenzien können auf die Elektrode in einer oder mehreren Farbstoff-basierten Schichten aufgetragen werden. Die Test-Reagenzien können auf die Arbeits-Elektrode in einer einzigen Schicht siebgedruckt werden.
Das Test-Element, wie oben definiert, kann ein amperometrischer Trockenstreifen-Sensor sein, der einen verlängerten, elektrisch isolierenden Träger mit einem Paar von longitudinalen, im Wesentlichen parallelen elektrisch leitenden Bahnen darauf und ein Paar von Elektroden einschließt. Die Elektroden sind jeweils mit einer anderen der Bahnen elektrisch verbunden; eine der Elektroden ist eine Referenz-/Zähler-Elektrode, während die andere Elektrode eine Arbeits-Elektrode ist. Das Element kann auch eine Dummy-Elektrode einschließen. Des Weiteren kann das Element eine Membran einschließen, die positioniert ist, um die Proben vor ihrer Auftragung auf die Elektroden zu filtern.
Der Sensor kann zusätzlich einen stützenden Streifen von elektrisch isolierendem Trägermaterial einschließen (zum Beispiel ein synthetisches Polymer, wie zum Beispiel Polyvinylchlorid, oder eine Mischung aus synthetischen Polymeren).
Die Mediatorverbindung kann ein Chinon sein. Beispiele für geeignete Chinone schließen 1,10-Phenanthrolinchinon, 1,7-Phenanthrolinchinon und 4,7-Phenanthrolinchinon ein.
In einer Ausführungsform enthält die Erfindung einen Elektrodenstreifen für einen amperometrischen Sensor mit einer Anzeige. Der Streifen schließt einen Träger ein, der angepasst ist für die wieder ablösbare Anheftung an die Anzeige, einen ersten Leiter, der sich entlang des Trägers erstreckt und ein leitendes Element für die Verbindung mit der Anzeige umfasst; eine Arbeits-Elektrode in Kontakt mit dem ersten Leiter und positioniert, um mit einer Proben-Mischung in Kontakt zu stehen; einen zweiten Leiter, der sich entlang des Trägers erstreckt und ein leitendes Element für die Verbindung mit der Anzeige umfasst, und eine Referenz-/Zähler-Elektrode in Kontakt mit dem zweiten Leiter und angeordnet, um in Kontakt mit der Probe und den zweiten Leiter zu stehen. Die aktive Elektrode des Streifens schließt eine Mediatorverbindung ein, die eine der folgenden Formeln hat:
worin X, Y, R₁ und R₂ wie zuvor definiert sind.
Wiederum eine andere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer wässerigen Probe unter Verwendung von vermitteltem Elektronen-Transfer zwischen einer Elektrode und einem Nikotinamid-Kofaktor. Das Verfahren schließt die Schritte der Verwendung einer Mediatorverbindung in der Anwesenheit eines Nikotinamid-Kofaktor-abhängigen Enzyms ein, worin die Mediatorverbindung eine chinoide Verbindung ist, die nicht in der Lage ist, sich irreversibel an die Thiolgruppen zu binden. Die Mediatorverbindung kann beispielsweise reaktive ungesättigte Bindungen in benachbarten aromatischen Ringen haben. Geeignete Mediatorverbindungen schließen diejenigen ein, die die folgenden Formeln haben:
worin X, Y, R₁ und R₂ wie zuvor definiert sind.
Zum Beispiel kann die Mediatorverbindung 1,10-Phenanthrolinchinon, 1,7-Phenanthrolinchinon oder 4,7-Phenanthrolinchinon sein.
Das Nikotinamid-Kofaktor-abhängige Enzym kann zum Beispiel Folgendes sein: Alkoholdehydrogenase, Laktatdehydrogenase, 3- Hydroxybutyratdehydrogenase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Formaldehyddehydrogenase, Malatdehydrogenase oder 3-Hydroxysteroiddehydrogenase.
Beispiele für geeignete Nikotinamid-Kofaktor-abhängige Enzyme, wenn die Mediatorverbindung 1,10-Phenanthrolinchinon ist, sind Glucosedehydrogenase und 3-Hydroxybutyratdehydrogenase.
Solange nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung wie üblicherweise von jemandem mit durchschnittlichem Können in dem Fachgebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
Ein Vorteil der hierin offenbarten Mediatoren zur Verwendung in der Erfindung ist ihre Nicht-Reaktivität hinsichtlich Thiolgruppen an aktiven Stellen in Enzymen. Dies verbessert die Stabilität und die Haltbarkeitsdauer von Biosensorelektroden in einem unerwarteten Maß.
NAD- und NADP-abhängige Dehydrogenase-Enzyme sind im Allgemeinen teuer und labil, und eine Verbesserung ihrer Stabilität ist deshalb hochgradig wünschenswert.
Vorteilhafterweise erfordern die Verbindungen, die. hierin offenbart sind, niedrige Oxidations-Potenziale für die Reoxidierung nach der Reaktion mit NADH oder NADPH. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn in Vollblut getestet wird, in welchem das Potenzial für die Störbeeinflussung von exogenen elektro-aktiven Spezies (zum Beispiel Ascorbinsäure, Harnsäure) besonders hoch ist. Das niedrige Potenzial kann vorteilhaft sein, weil es die Notwendigkeit einer Dummy-Elektrode, um elektro-aktive Spezies in der Probe zu entfernen, überflüssig macht. Auch kann die oxidierte native Form des Mediators den Hintergrund-Strom, der bei einem reduzierten Mediator vorhanden sein würde, vermindern.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine auseinander gezogene Darstellung eines Elektrodenstreifens gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
2 ist eine Darstellung eines zusammengesetzten Elektrodenstreifens.
3 ist eine graphische Darstellung des Stroms in μA gegen die NADH-Konzentration in mM für gedruckte Elektroden, die 1,10-Phenanthrolinchinon enthalten.
4 ist eine graphische Darstellung des Stroms in μA gegen die NADH-Konzentration in mM für gedruckte Elektroden, die Meldola's Blau enthalten.
5 ist ein Balkendiagramm, das restliche Enzym-Aktivität (das heißt, als Prozentsatz der anfänglichen Aktivität) nach der Inkubation von HBDH mit verschiedenen Mediatoren zeigt.
6 ist eine graphische Darstellung des Stroms in μA gegen die D-3-Hydroxybutyrat-Konzentration in mM für gedruckte Elektroden, die 1,10-Phenanthrolinchinon, D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase und NAD⁺ enthielten, getestet nach 4, 14 und 26 Wochen.
7 ist eine graphische Darstellung des Stroms in μA gegen die D-3-Hydroxybutyrat-Konzentration in mM für gedruckte Elektroden, die Meldola's Blau, D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase und NAD⁺ enthielten, getestet nach 2 bzw. 14 Wochen.
8 ist eine graphische Darstellung einer kalibrierten Antwort auf Glucose in Vollblut für gedruckte Elektroden, die 1,10-Phenanthrolinchinon, Glucosedehydrogenase und NAD⁺ enthielten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine Klasse von Verbindungen, ausgewählt nach ihrer Unfähigkeit, sich irreversibel mit Thiolen zu verbinden, ist für die Verwendung als NADH- oder NADPH-Mediatoren offenbart. Die strukturellen, elektronischen und sterischen Charakteristika dieser Mediatoren machen sie beinahe unfähig mit Thiolen zu reagieren. Weil diese Mediatoren praktisch von der irreversiblen Bindung an die Sulfhydrylgruppen der aktiven Stelle von NAD- und NADP-abhängigen Dehydrogenasen ausgeschlossen sind, wird eine Inaktivierung des Enzyms und der anschließende Verlust der Biosensor-Stabilität umgangen.
Die NADH- und NADPH-Mediatoren können in der Herstellung von amperometrischen Enzym-Sensoren für einen Analyten verwendet werden, worin der Analyt ein Substrat eines NAD- oder NADP-anhängigen Enzyms ist, das in dem Sensor vorhanden ist, wie zum Beispiel diejenigen von der Art, die in EP 125867-A beschrieben ist. Dementsprechend können amperometrische Enzym-Sensoren zur Verwendung in der Prüfung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probe, insbesondere einer wässerigen Probe, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Probe eine komplexe biologische Probe sein, wie zum Beispiel eine biologische Flüssigkeit (zum Beispiel Vollblut, Plasma oder Serum) und der Analyt kann ein natürlich vorkommender Metabolit sein (zum Beispiel Glucose, D-3-Hydroxybutyrat, Ethanol, Laktat oder Cholesterin) oder eine eingeführte Substanz, wie zum Beispiel ein Arzneistoff.
Von besonderer Nützlichkeit für die Herstellung von amperometrischen Enzym-Sensoren der vorliegenden Erfindung sind Farbstoffe, wie hierin beschrieben.
Auch können ein Vorläufer, ein Addukt oder eine reduzierte (Leuco-)Form der oben genannten Mediatoren in situ durch Oxidation oder Zersetzung in die entsprechenden aktiven Mediatoren umgewandelt werden. Solche Vorläufer oder Addukte können Hemiacetale, Hemithioacetale, zyklische Acetale, Metall-O-Chinon-Komplexe, protonierte Formen, Aceton-Addukte etc. einschließen.

Eine nicht einschränkende Liste von Enzymen, die zusammen mit den Mediatoren verwendet werden können, wird in Tabelle 1 bereitgestellt. Tabelle 1

1.1.1.1	Alkoholdehydrogenase
1.1.1.27	Laktatdehydrogenase
1.1.1.31	3-Hydroxybutyratdehydrogenase
1.1.1.49	Glucose-6-phosphatdehydrogenase
1.1.1.47	Glucosedehydrogenase
1.2.1.46	Formaldehyddehydrogenase
1.1.1.37	Malatdehydrogenase
1.1.1.209	3-Hydroxysteroiddehydrogenase

Amperometrische Enzym-Sensoren, die die Mediatoren annehmen, verwenden ein Testelement, welches ein Einmal-Verwendungs-Streifen ist. Ein wegwerfbares Testelement trägt eine Arbeits-Elektrode mit den Testreagenzien, einschließlich des Enzyms, des Nikotinamid-Kofaktors (das heißt NAD⁺ oder NADP⁺) und der Mediatoren zur Erzeugung eines Stroms, der die Menge an Analyt anzeigt, und eine Referenz-/Zähler-Elektrode. Die Testreagenzien können in einer oder mehreren Farbstoff-basierten Schichten vorliegen, welche mit der Arbeits-Elektrode in dem Testelement assoziiert sind. Dementsprechend können die Sensorelektroden z. B. einen Elektrodenbereich einschließen, der durch Drucken, Sprühen oder eine andere geeignete Auftragungstechnik gebildet wird.
Bezug nehmend auf die 1 und 2, trägt ein Elektroden-Träger 1, typischerweise hergestellt aus PVC, Polycarbonat oder Polyester oder einer Mischung aus Polymeren (zum Beispiel Valox, einer Mischung aus Polycarbonat und Polyester) drei gedruckte Bahnen von elektrisch leitender Kohlenstoff-Tinte 2, 3 und 4. Die gedruckten Bahnen definieren die Position der Arbeits-Elektrode 5, auf welche die Arbeits-Elektroden-Tinte 16 aufgetragen wird, der Referenz-/Zähler-Elektrode 6, der Füll-Indikator-Elektrode 7 und der Kontakte 8, 9 und 10.
Die lang gestreckten Abschnitte der leitenden Bahnen sind entsprechend überlagert mit Silber-/Silberchlorid-Partikel-Bahnen 11, 12 und 13 (wobei der vergrößerte freie Bereich 14 von Bahn 12 die Referenz-Elektrode 6 überlagert), und sie sind weiter überlagert mit einer Schicht von hydrophobem elektrisch isolierendem Material 15, das nur die Positionen der Referenz-/Zähler-Elektrode 14, der Arbeits-Elektrode 5, der Füll-Indikator-Elektrode 7 und die Kontaktbereiche 8, 9 und 10 exponiert lässt. Dieses hydrophobe isolierende Material dient dazu, Kurzschlüsse zu vermeiden. Weil dieses isolierende Material hydrophob ist, kann es dazu dienen, die Probe auf die exponierten Elektroden zu begrenzen. Ein geeignetes isolierendes Material ist Sericard, kommerziell erhältlich von Sericol, Ltd. (Broadstairs, Kent, UK). Wahlweise können eine erste Maschenschicht 17, eine zweite isolierende Schicht 18, eine zweite Maschenschicht 19, eine dritte isolierende Schicht 20 und ein Band 21 das hydrophobe isolierende Material überlagern.
Entsprechende Farbstoff-Mischungen können auf eine leitende Bahn auf einem Träger in der Nähe einer Referenz-Elektrode 14, die mit einer zweiten Bahn verbunden ist, aufgebracht werden. Auf diese Art kann ein Sensor produziert werden, welcher in der Lage ist, mit einer kleinen Probe von Blut oder einer anderen Flüssigkeit, die den effektiven Elektrodenbereich 5 bedeckt, zu funktionieren. Die Mischungen werden vorzugsweise, aber nicht ausschließlich, durch Siebdruck auf den Träger aufgetragen.
Im Allgemeinen katalysieren NAD(P)-abhängige Dehydrogenasen Reaktionen gemäß der Gleichung: RH₂ + NAD(P)⁺ → R + NAD(P)H + H⁺ worin RH₂ das Substrat (Analyt) und R das Produkt darstellt. In dem Prozess der Hin-Reaktion wird NAD(P)⁺ (das heißt, NAD⁺ oder NADP⁺) zu NAD(P)H reduziert. Geeignete amperometrische Biosensoren stellen einen elektrochemischen Mediator bereit, der NAD(P)H reoxidieren kann, wodurch NAD(P)⁺ regeneriert wird. Die Reoxidation tritt auf an einer Elektrode, um einen Strom zu erzeugen, der die Konzentration des Substrats anzeigt.
In einer Ausführungsform wird ein trockener Sensor bereitgestellt. Der Sensor schließt einen lang gestreckten elektrisch isolierenden Träger ein, der ein Paar von longitudinalen, im Wesentlichen parallelen, elektrisch leitenden Bahnen darauf hat, wobei jede Bahn an demselben Ende mit Mitteln für die elektrische Verbindung mit einer Anzeige ausgestattet und mit einer Elektrode ausgestattet ist, wobei eine der Elektroden die Referenz-/Zähler-Elektrode und die andere die Arbeits-Elektrode ist, zusammen mit Testreagenzien. Der Sensor kann in Form eines tragenden Streifens von elektrisch isolierendem Trägermaterial ausgestaltet sein, wie zum Beispiel einem synthetischen Polymer (zum Beispiel PVC, Polycarbonat oder Polyester, oder einer Mischung aus Polymeren, wie zum Beispiel Valox), welches die zwei Elektroden trägt, die auf elektrisch leitenden Bahnen zwischen seinen Enden gehalten werden. Zum Beispiel können die Elektroden die Form von zwei rechteckigen Flächen Seite an Seite auf dem Trägerstreifen haben, wie in 2 gezeigt (das heißt, Elektroden 14 und 16). Solche Flächen können als Zielbereich gestaltet werden, der von einem einzelnen Tropfen Probe, wie zum Beispiel Vollblut, bedeckt werden soll, zum Testen des Analyten. Wenn gewünscht, können nicht rechteckige Bereiche (zum Beispiel rautenförmige, halbkreisförmige, runde oder dreieckige Bereiche) verwendet werden, um einen Zielbereich für den optimierten Kontakt durch eine flüssige Probe bereitzustellen.
Der Träger schließt mindestens zwei Elektroden ein, nämlich eine Referenz-/Zähler-Elektrode und eine Arbeits-Elektrode. Andere Elektroden, wie zum Beispiel eine Dummy-Elektrode, können auch eingeschlossen sein. Diese anderen Elektroden können eine ähnliche Formulierung wie die Arbeits-Elektrode haben (das heißt, mit den assoziierten Testreagenzien), aber es können ihnen eine oder mehrere der aktiven Komponenten der Arbeits-Elektrode fehlen. Eine Dummy-Elektrode kann zum Beispiel verlässlichere Ergebnisse liefern, insofern als, wenn Ladung, welche an der Dummy-Elektrode hindurchgeht, von der Ladung subtrahiert wird, die an der Arbeits-Elektrode hindurchgeht, geschlossen werden kann, dass die resultierende Ladung auf die Reaktion von Interesse zurückzuführen ist.
Eine Membran kann an dem oder oberhalb des Ziels bereitgestellt werden, um eine Filtrier-Funktion auszuführen. Zum Beispiel kann eine Membran Blutzellen aus einer Probe abfiltrieren, bevor die Probe in den Teststreifen eindringt. Beispiele für kommerziell erhältliche Membranen, die verwendet werden können, schließen Hemasep V, Cytosep und Hemadyne (Pall Biosupport, Fort Washington, NY 11050) ein. Als Alternative kann eine Filtrations- oder zelluläre Abtrenn-Membran in situ gegossen werden. Dies kann erreicht werden durch Gießen von hydrophoben Polymeren, wie zum Beispiel Zelluloseacetat, Polyvinylbutyral und Polystyren und/oder hydrophilen Polymeren, wie zum Beispiel Hydroxypropylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol und Polyvinylacetat.
Wie oben definiert, wird ein wegwerfbarer Einweg-Elektrodenstreifen für die Anbringung an eine Signal-Anzeige-Schaltung eines Sensorsystems bereitgestellt. Der Streifen kann einen Strom detektieren, der für einen Analyten in einer flüssigen Mischung, repräsentativ ist. Der Streifen schließt einen lang gestreckten Träger ein, der für die wieder ablösbare Anheftung an die Anzeige-Schaltung angepasst ist; einen ersten Leiter, der sich entlang dem Träger erstreckt und ein leitendes Element für die Verbindung mit der Anzeige-Schaltung einschließt; eine Arbeits-Elektrode auf dem Streifen in Kontakt mit dem ersten Leiter und positioniert, um mit der Mischung in Kontakt zu stehen; einen zweiten Leiter, der sich entlang dem Träger erstreckt und ein leitendes Element umfasst, für die Verbindung mit der Anzeige-Schaltung; und eine Referenz-/Zähler-Elektrode in Kontakt mit dem zweiten leitenden Element und positioniert, um mit der Mischung und dem zweiten Leiter wie in 1 gezeigt in Kontakt zu stehen.
Die Arbeits-Elektrode kann eine gedruckte Schicht auf dem. Träger einschließen, und die gedruckte Schicht selbst schließt ein NAD- oder NADP-abhängiges Dehydrogenaseenzym ein, das in der Lage ist, eine Reaktion zu katalysieren, die ein Substrat für das Enzym einschließt. Diese Schicht schließt auch den entsprechenden Nikotinamid-Kofaktor und einen Mediator ein, der hierin offenbart und in der Lage ist, Elektronen zwischen der Enzym-katalysierten Reaktion und dem ersten Leiter über NADH oder NADPH zu transferieren, um einen Strom zu erzeugen, der repräsentativ ist für die Aktivität sowohl des Enzyms als auch des Analyten.
Das erste leitende Element und die aktive Elektrode sind von dem zweiten leitenden Element und der Referenz-/Zähler-Elektrode beabstandet, und die Elektroden haben eine Größe und Position, um einen kombinierten effektiven Bereich bereitzustellen, der klein genug ist, um vollständig von einem Tropfen Blut oder anderer Testprobe bedeckt zu werden; typischerweise beträgt die Reaktionszone 5 mm², aber sie kann bis zu 25 mm² groß sein. Die Testprobe vervollständigt eine elektrische Schaltung über die aktive Elektrode und die Referenz-/Zähler-Elektrode für die amperometrische Detektion der Aktivität des Enzyms.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Arbeits- Elektrode erzeugt durch Verwendung einer Formulierung, welche nicht nur das Enzym, Nikotinamid-Kofaktor und den Mediator einschließt, sondern auch Füll- und Bindemittel-Inhaltsstoffe, welche bewirken, dass die Arbeits-Elektrode eine einförmig zunehmende Antwort gibt auf Konzentrationen von Interesse des untersuchten Analyten, wenn in einer kinetischen Art und Weise gemessen wird, in welcher sowohl Oxidation als auch Reduktion des Mediators während der Messung auftreten. Das Konzept ist, eine stabile Reaktionsschicht auf der Oberfläche der Arbeits-Elektrode bereitzustellen, wenn die Probe aufgebracht wird. Dies ermöglicht die Verwendung von Mediatoren, welche in der Probe gering löslich sind. Wenn der Mediator durch Reaktion mit dem Enzym, dem Kofaktor und dem Analyten reduziert wird, wird er sehr nahe an der Elektroden-Oberfläche gehalten, sodass er leicht reoxidiert werden kann, ohne signifikanten Verlust an Ausfällung. Das Aufrechterhalten dieser dünnen Reaktionsschicht ermöglicht auch, dass die gesamte analytische Reaktion in einem kleinen Volumen der Gesamtprobe auftritt, so dass das, was letztendlich gemessen wird, der Fluss des Analyten von der Hauptmassen-Probe zu dieser Reaktionsschicht ist.
Diese Reaktionsschicht muss für mindestens die Zeit stabil bleiben, die nötig ist, um eine reproduzierbare kinetische Messung durchzuführen. Typische Zeiten für eine solche Messung liegen im Bereich zwischen ungefähr 5 und 60 Sekunden, obwohl eine Stabilität für längere Zeiten bevorzugt wird. Typischerweise sind die wegwerfbaren Elektrodenstreifen von Interesse Massenprodukte und es ist deshalb wünschenswert, einen Sicherheitsspielraum hinsichtlich jeder erforderlichen Eigenschaft zu haben, um der innewohnenden Variabilität bei jedem Massenherstellungs-Verfahren Rechnung zu tragen.
Die Stabilität der Reaktionsschicht kann durch eine geeignete Kombination von Füllstoffen und Bindemitteln verbessert werden. Die Schicht ist vorzugsweise ausreichend stabil, um eine ungefähr lineare reproduzierbare Reaktion in einer kinetischen Messung über den Konzentrationsbereich von Interesse für einen bestimmten Analyten zu ergeben. Zum Beispiel würde das bei Keton-Körpern (gemessen als Hydroxybutyrat) zwischen ungefähr 1 und 8 mM liegen, während es bei Glucose zwischen ungefähr 2 und 40 mM wäre.
Die kinetische Messung schließt das Kreisen des Mediators zwischen einem oxidierten Stadium und einem reduzierten Stadium ein. Die Geschwindigkeit dieses Kreislaufs, welche sich in dem beobachteten Strom während des Verlaufs des Tests zeigt, ist abhängig von der Konzentration des Analyten in der Probe. Je größer die Konzentration des Analyten, desto mehr Enzym-Kofaktor, welcher während der Oxidation des Analyten durch das Enzym reduziert wird. Der Mediator wiederum wird bei der Reoxidierung des Kofaktors reduziert und wird dann an der Elektroden-Oberfläche reoxidiert. Jedoch ist, auf Grund seiner sehr geringen Löslichkeit, nur eine kleine Menge des Mediators sofort verfügbar, um mit dem reduzierten Kofaktor zu reagieren. Folglich wird Mediator, welcher mit reduziertem Kofaktor reagiert und an der Elektrode reoxidiert wird, dann mit weiterem reduzierten Kofaktor reagieren und dies setzt sich fort über den gesamten Verlauf einer kinetischen Messung. Somit ist, je höher die Konzentration des reduzierten Kofaktors (was eine höhere Konzentration des Analyten in der Probe reflektiert), die treibende Kraft für den Zyklus des Mediators desto größer, und somit desto größer auch die Geschwindigkeit des Zyklus.
In einigen Fällen kann der Kofaktor auch in den Zyklus zwischen einem oxidierten Stadium und einem reduzierten Stadium während der kinetischen Messung eintreten. Dies hängt davon ab, ob es eine ausreichende Menge an Kofaktor gibt, die anfänglich vorhanden ist, um den gesamten Analyten, der in der Reaktionsschicht vorhanden ist, umzuwandeln. Wenn es nicht genügend Kofaktor gibt, der anfänglich vorhanden ist, während oxidierter Kofaktor regeneriert wird, fördert er die Oxidation von jeglicher Analytmenge, die in der Reaktionsschicht zurückbleibt, indem er wieder reduziert wird.
Was jedoch entscheidend ist, ist, dass eine bestimmte Konzentration von reproduzierbarem Analyt in der Erzeugung desselben Signals in dem kinetischen Test bei einem speziellen Elektrodenstreifen-Design resultiert und dass das Signal einförmig, vorzugsweise linear, mit der Konzentration des Analyten über den Konzentrationsbereich von Interesse ansteigt (mit anderen Worten, dass das Signal eine wahre Funktion der Analyt-Konzentration ist). Dies ermöglicht es dem Hersteller der Elektrodenstreifen, eine universelle Kalibrierung für eine bestimmte Charge von Elektrodenstreifen zu erstellen, so dass jedes gegebene Signal, das von einem gegebenen Streifen unter Standard-Testbedingungen erhalten wird, eindeutig mit einer bestimmten Analyt-Konzentration korreliert. Somit ist es wichtig, dass innerhalb des Konzentrationsbereichs von Interesse keine unkontrollierbare Variable außer der Analyt-Konzentration ist, welche das Signal wesentlich beeinflusst.
Das Signal kann der beobachtete Strom zu einer festgesetzten Zeit sein, nachdem der Test begonnen wurde, oder es kann der Strom sein, der über einen beliebigen Zeitraum nach einem festgesetzten Zeitpunkt, nachdem der Test begonnen wurde, integriert wurde (eigentlich die Ladung, die über einen solchen Zeitraum transferiert wurde). Der Test wird durchgeführt durch Bedecken der Arbeits-Elektrode und einer Referenz-/Zähler-Elektrode mit Probe und anschließendes Anbringen eines Potenzials zwischen ihnen. Der Strom, welcher dann fließt, wird über einen bestimmten Zeitraum beobachtet. Das Potenzial kann angelegt werden, sobald die Probe die Elektroden bedeckt, oder es kann nach einer kurzen Verzögerung, typischerweise ungefähr 3 Sekunden, angelegt werden, um eine gute Befeuchtung der Elektroden durch die Probe sicherzustellen. Die festgesetzte Zeit, bis der Strom oder die Stromintegration als das Signal genommen wird, sollte lang genug sein, um sicherzustellen, dass die Hauptvariable, die den beobachteten Strom beeinflusst, die Analyt-Konzentration ist.
Die Referenz-Elektrode/Zähler-Elektrode kann eine klassische Silber-/Silberchlorid-Elektrode sein, aber sie kann in der Konstruktion auch identisch mit der Arbeits-Elektrode sein. In einer Ausführungsform können die zwei separaten leitenden Bahnen beide mit einer geeigneten Formulierung von Enzym, Kofaktor und Mediator in einem Bindemittel und Füllstoff enthaltenden wässerigen Vehikel beschichtet sein, um eine Beschichtung zu ergeben. In den Fällen, in welchen die Beschichtung nicht leitend ist, zum Beispiel wenn der Füllstoff kein Leiter ist, kann eine gemeinsame Beschichtung beide Elektroden überlagern. Wenn ein Potenzial angelegt wird, wird eine der Elektroden als Referenz-/Zähler-Elektrode fungieren, durch Absorbieren der Elektronen, die an der anderen, der Arbeits-Elektrode, freigesetzt werden. Der Mediator an der Referenz-/Zähler-Elektrode wird einfach reduziert als Ergebnis der Wechselwirkung mit dem Elektronenfluss an seiner Elektrode.
Die Reaktionsschicht, welche zu dem gewünschten Verhalten führt, wird gewonnen durch Formulieren der Arbeits-Elektrode mit Bindemittel- und Füllstoff-Inhaltsstoffen. Das Ziel ist, der Probe zu ermöglichen, mit dem Enzym, dem Kofaktor und dem Mediator zu interagieren, aber auch sicherzustellen, dass diese chemisch aktiven Inhaltsstoffe in der unmittelbaren Nähe der Oberfläche der Elektrode bleiben. Der Bindemittel-Inhaltsstoff sollte Materialien einschließen, welche die Viskosität des wässerigen Mediums schnell erhöhen und die Bildung von Filmen oder Schichten fördern. Typisch für solche Materialien sind die Polysaccharide, wie zum Beispiel Guargummi, Alginat, Johannesbrotgummi, Carrageenan und Xanthan. Ebenso hilfreich sind Materialien, die allgemein als Filmbildner bekannt sind, wie zum Beispiel Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrol, Zelluloseacetat, Carboxymethylzellulose und Poly(vinyloxazolidinon). Der Füllmittel-Inhaltsstoff sollte ein partikuläres Material sein, welches chemisch inert ist gegenüber den Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die an der Messung beteiligt sind, und unlöslich in wässerigem Medium. Er kann elektrisch leitend oder nicht leitend sein. Typische Materialien schließen Kohlenstoff, im Allgemeinen in der Form von Graphit, Titandioxid, Siliziumdioxid und Aluminiumoxid, ein.
Die aktive Elektrode kann geeigneter Weise hergestellt werden, durch Formulieren der Enzym-, Kofaktor-, Mediator- und Bindemittel- und Füllstoff-Inhaltsstoffe in ein wässeriges Vehikel und Aufbringen der selben auf den verlängerten, elektrisch isolierenden Träger, der leitende Spuren hat. Die Formulierung kann aufgebracht werden durch Drucken, wie zum Beispiel Siebdrucken oder andere geeignete Techniken. Die Formulierung kann auch andere Inhaltsstoffe einschließen, wie zum Beispiel einen Puffer, um das Enzym während der Verarbeitung zu schützen, einen Protein-Stabilisator, um das Enzym gegen Denaturierung zu schützen und ein Anti-Schaummittel. Diese zusätzlichen Inhaltsstoffe können auch einen Effekt auf die Eigenschaften der Reaktionsschicht haben.
Die Arbeits-Elektrode hat typischerweise eine Trockendichte zwischen ungefähr 2 und 50 μm; vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und 25 μm. Die tatsächliche Trockendichte wird bis zu einem bestimmten Ausmaß von der Aufbringungstechnik abhängen, die verwendet wird, um die Inhaltsstoffe, welche die Arbeits-Elektrode ausmachen, aufzutragen. Zum Beispiel sind Dicken zwischen ungefähr 10 und 25 μm typisch für den Siebdruck.
Jedoch ist die Dicke der Reaktionsschicht nicht allein eine Funktion der Trockendichte der Arbeits-Elektrode, sondern hängt auch von dem Effekt der Probe auf die Arbeits-Elektrode ab. In dem Fall von wässerigen Proben wird die Formulierung der Arbeits-Elektrode-Inhaltsstoffe den Grad der Wasseraufnahme, den diese Schicht zeigt, bewirken.
Der Füllstoff macht typischerweise zwischen ungefähr 20 und 30 Gewichtsprozent des wässerigen Vehikels aus. Die Mengen der anderen Inhaltsstoffe sind typischerweise geringer als ungefähr 1 Gewichtsprozent des wässerigen Vehikels und werden empirisch eingestellt, um die gewünschten Endeigenschaften zu. erzielen. Zum Beispiel werden die. Menge an Puffer und Protein-Stabilisator eingestellt, um den gewünschten Grad an restlicher Enzym-Aktivität zu erzielen. In dieser Hinsicht kann man mehr Enzym und weniger Stabilisator oder weniger Enzym und mehr Stabilisator verwenden, um den selben Endspiegel an Enzym-Aktivität zu erreichen. Die Menge an Bindemittel und Anti- Schaummittel sollte so eingestellt werden, um geeignete Viskositäten für das Aufbringungs-Verfahren zu ergeben, wobei höhere Viskositäten geeignet sind für den Siebdruck und geringere Viskositäten geeignet sind für den Rotations-Tiefdruck.

Eine geeignete wässerige Farbstoff-Formulierung kann in Übereinstimmung mit Tabelle 2 formuliert werden, wobei der Rest (die Differenz zu 100%) Deformer, Puffer, Enzymaktivitäts-Verbesserer und Wasser ist, um 1 Gramm an formuliertem Farbstoff auszumachen. Das Enzym, der Mediator, der Füllstoff und das Bindemittel sind wie oben definiert. Tabelle 2

Enzym (wie zum Beispiel Glucosedehydrogenase oder 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase)	200 bis 4000 Einheiten
Nikotinamid-Kofaktor (wie zum Beispiel NAD)	5 bis 30 Gewichtsprozent
Mediator (wie zum Beispiel 1,10 Phenanthrolinchinon)	0,1 bis 1,5 Gewichtsprozent
Füllstoffe (wie zum Beispiel ultrafeiner Kohlenstoff oder Titandioxid)	10 bis 30 Gewichtsprozent
Bindemittel (wie zum Beispiel Alginat oder Guargummi)	0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent
Protein-Stabilisator (wie zum Beispiel Trehalose oder Rinderserum-Albumin)	0,01 bis 2 Gewichtsprozent

Die Stabilität der Reaktionsschicht kann leicht bewertet werden, unter Verwendung von zyklischer Voltammetrie mit verschiedenen Zeitverzögerungen. Die Arbeits-Elektrode-Formulierung wird bewertet, in dem sie einer Probe ausgesetzt wird, die eine relativ hohe Konzentration an Analyt enthält und sie einem stetig ansteigendem Potenzial unterworfen wird bis zu einem maximalen Wert und dann einem stetig absinkenden Potenzial unterworfen wird, zurück zu keinem angelegten Potenzial. Der resultierende Strom steigt bis zu einem Spitzen-Wert an und fällt dann ab, wenn das Durchfahren der Spannung andauert. Solche zyklischen Voltammetrie-Bewertungen werden nach verschiedenen Verzögerungs-Zeiträumen durchgeführt, nachdem die Arbeits-Elektrode gegenüber der Probe ausgesetzt ist. Die Änderung im Spitzen-Strom mit ansteigend langen Verzögerungszeiträumen ist ein Maß der Stabilität der Reaktionsschicht. Je stabiler die Reaktionsschicht, desto kleiner die Verminderung im Spitzen-Strom.
Eine Bewertung wurde durchgeführt, um die Stabilität einer Arbeits-Elektrode, die in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Erfindung formuliert wurde, mit der einer "Arbeits-Elektrode", die gemäß den Lehren von Geng et al. Auf Seiten 1267 bis 1275 von Biosensors and Bioelectronics, Band II, Nummer 12 (1996) formuliert wurde, zu vergleichen. Die Arbeits-Elektrode, die für die vorliegende Erfindung repräsentativ ist, wurde mit ungefähr 25 Gewichtsprozent Füllstoff (ultrafeinem Kohlenstoff), Bindemittel, Protein-Stabilisator und Deformer, wie hierin oben gelehrt, formuliert, und die Arbeits-Elektrode, die für. Geng repräsentativ ist, wurde mit einem hoch Molekular-gewichtigen Polyethylenoxid, wie auf Seite 1267 des Geng Artikels beschrieben, formuliert. In jedem Fall wurde ein Potenzial angelegt bei einer Abtastrate von 50 Millivolt pro Sekunde bis zu 400 mV versus einer Silber/Silberchlorid-Referenz-Elektrode nach Exponieren der Arbeits-Elektrode gegenüber einer 20 mM wässerigen Lösung von Glucose für 3 Sekunden und 60 Sekunden. Die Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt eine stabile Reaktionsschicht, in welcher der Spitzen-Strom nach 60 Sekunden 60 Prozent von dem ist, der nach 3 Sekunden beobachtet wurde, während die Formulierung gemäß dem Geng Artikel eine instabile Reaktionsschicht ergibt, in welcher kein Spitzen-Strom nach 60 sekündiger Exposition beobachtbar war.
Dies wird einer Auflösung der Elektrode mit einem Verlust der Reagenzien zu der Bulk-Lösung zugeschrieben. Die entsprechenden voltammetrischen Kurven sind wie folgt:
Formulierung mit Bindemittel und Füllstoff (vorliegende Erfindung)
PEO-Formulierung (Geng Papier)
Die Teststreifen dieser Erfindung können Analyten detektieren, die Substrate von NAD- oder NADP-abhängigen Dehydrogenase-Enzymen sind, unter Verwendung eines Mediators, der gewählt ist aus den hierin offenbarten Verbindungen, wie zum Beispiel 1,10-PQ.
Teststreifen gemäß dieser Erfindung sollen für die Verwendung mit elektronischen Apparate- und Mess-Systemen beabsichtigt sein. Diese steuern das Fortschreiten der elektrochemischen Reaktion (zum Beispiel durch Aufrechterhalten eines speziellen Potenzials an den Elektroden), überwachen die Reaktion und berechnen und zeigen das Ergebnis. Ein spezielles Merkmal, das in einem Mess-System zur Verwendung mit Teststreifen diesen Typs wünschenswert ist, ist die Fähigkeit, die Befeuchtung der Reaktionszone durch Probenflüssigkeit zu detektieren, wodurch ein zeitiger Beginn der Messung und eine Reduzierung des Potenzials für Ungenauigkeiten, die durch Benutzerfehler verursacht sind, zu erlauben. Dieses. Ziel kann erreicht werden, durch Anbringen eines Potenzials an die Elektroden des Teststreifens sobald der Streifen in die Messvorrichtung eingeführt wird; dieses Potenzial kann für einen kurzen Zeitraum entfernt werden, um die Befeuchtung vervollständigen zu lassen, bevor die Messung begonnen wird.
Die Messvorrichtung kann auch ein Mittel kennzeichnen für die automatische Identifizierung von Teststreifen für die Messung von unterschiedlichen Analyten. Dies kann beispielsweise erzielt werden, wenn einer oder mehrere Kreisläufe auf den Teststreifen gedruckt sind; jeder Kreislauf kann eine Resistenz-Charakteristik des Typs von Streifen bereit stellen, wie beschrieben in US-Patent-Nr. 5,126,034 in Spalte 4, Zeilen 3 bis 17. Als eine weitere Alternative könnten Aussparungen oder andere Formen in das proximale Ende des Teststreifens geschnitten werden; Schalter oder optische Detektoren in der Messvorrichtung können das Vorhandensein oder die Abwesenheit von jeder Aussparung detektieren. Andere Erkennungs-Techniken vom Streifentyp schließen das Variieren der Farbe der Streifen und das Bereitstellen der Messvorrichtung mit einem Photo-Detektor ein, welcher in der Lage ist, den Bereich von Farben zu unterscheiden; und Bereitstellen der Streifen mit Barcodes, magnetischen Streifen oder anderen Markierungen, und Bereitstellen der Messvorrichtung mit einem geeigneten Ablese-Anordnung.
In einem Beispiel eines Teststreifens für die industrielle Produktion haben die Streifen-Elektroden eine Zwei-Elektroden-Konfiguration, die eine Referenz/Zähler-Elektrode und eine Arbeits-Elektrode umfasst. Der Träger kann aus irgend einem Material gemacht sein, das eine elektrisch isolierende Oberfläche hat, einschließlich Poly(vinylchlorid), Polycarbonat, Polyester, Papier, Pappe, Keramik, Keramik-beschichtetes Metall, Mischungen aus diesen Materialien (zum Beispiel eine Mischung aus Polycarbonat und Polyester), oder eine andere isolierende Substanz.
Ein leitender Farbstoff wird auch den Träger aufgetragen durch ein Ablagerungs-Verfahren, wie zum Beispiel Siebdruck. Diese Schicht bildet die Kontaktbereiche, welche erlauben, dass die Mess-Vorrichtung eine Grenzfläche bildet mit dem Teststreifen und stellt einen elektrischen Kreislauf bereit, zwischen den Kontakten und der aktiven Chemie, die auf dem Streifen stattfindet. Der Farbstoff kann eine Luft-getrocknete, organisch-basierte Kohlenstoff-Mischung, zum Beispiel, sein. Alternative Formulierungen schließen Wasser-basierte Kohlenstoff-Farbstoffe und Metall-Farbstoffe, wie zum Beispiel Silber, Gold, Platin und Palladium ein. Andere Verfahren zur Trocknung oder Härtung der Farbstoffe schließen die Verwendung von Infrarot-, Ultraviolet- und Hochfrequenzstrahlung ein.
Eine Schicht, die die Referenz/Zähler-Elektrode bildet, wird mit einem organischen Lösungsmittel-basierten Farbstoff, der eine Silver/Silverchlorid-Mischung enthält, aufgedruckt. Alternative Referenzpaare schließen Ag/AgBr, Ag/AgI und Ag/Ag₂O ein. Der Druck erstreckt sich, um teilweise die mittlere Spur des Kohlenstoffdrucks zu bedecken, wo er sich in die Reaktionszone hinein erstreckt. Es ist nützlich, wenn getrennte Teile dieses Drucks verlängert werden, um Teile der anderen Kohlenstoffspuren außerhalb der Reaktionszone zu bedecken, so dass der gesamte elektrische Widerstand von jeder Spur reduziert wird.
Eine Schicht von dielektrischem Farbstoff kann wahlweise aufgedruckt sein, um den Großteil des aufgedruckten Kohlenstoffs und der Silber/Silberchlorid-Schichten zu bedecken. In diesem Fall bleiben zwei Gebiete unbedeckt, nämlich die elektrischen Kontaktbereiche und der Abtastbereich, welcher der reaktiven Zone unterliegt, wie in 1 und 2 gezeigt. Dieser Druck dient dazu, das Gebiet der reaktiven Zone zu definieren und exponierte Spuren vor einem Kurzschluss zu schützen.
Für die Arbeits-Elektrode werden einer oder mehrere Farbstoffe bis zu einer präzisen Dicke innerhalb eines definierten Bereichs oberhalb einer der leitenden Spuren innerhalb der Reaktionszone abgelagert, um das Enzym, den Kofaktor und einen Mediator der vorliegenden Erfindung ab zu lagern. Es ist bequem, dies mit Hilfe von Siebdruck zu machen. Andere Wege zur Abscheidung dieses Farbstoffs schließen Tintenstrahldruck, volumetrische Dosierung, Tiefdruck, Flexodruck und Hochdruck ein. Wahlweise kann eine zweiter teilweise aktiver Farbstoff auf einer zweiten leitenden Spur abgelegt werden, um eine Dummie-Elektrode zu bilden.
Wie oben diskutiert, können Polysaccharide in die Farbstoff-Fomulierung als ein Material in dem Bindemittel-Inhaltsstoff eingeschlossen werden. Geeignete Polysaccharide schließen Guargummi, Alginat, Johannesbrotgummi, Karragenan und Xanthan ein. Der Farbstoff kann auch einen Filmbildern einschließen; geeignete Film-bildende Polymere schließen Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrol, Zelluloseacetat, CMC und Poly(vinyloxazolidinon) ein. Farbstoff-Füllmittel können Titandioxid, Siliziumdioxid, Aluminiumoxid oder Kohlenstoff. einschließen.
Die Folgenden sind veranschaulichende, nicht einschränkende Beispiele der Praxis der Erfindung:
BEISPIEL 1
Mediatoren:
Meldola's Blau (MB) (Verbindung 3) wurde als das Hemi-ZnCl₂-Salz von Polysciences, Inc. Erhalten. 2,6-Dichlorindophenol (DCIP) (Verbindung 6) und Trispuffer wurden von Sigma erworben. Die Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) (Dulbecco's Formulierung) wurde aus Tabletten hergestellt, die von ICN Biomedicals, Ltd. Geliefert wurden.
D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase (HBDH; EC 1.1.1.30) von Pseudomonas sp. wurde von Toyobo Co., Ltd. Erworben. P-Nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD⁺) und D,L-3-Hydroxybuttersäure wurden von Boehringer Mannheim geliefert.
1,10-Phenanthrolinchinon (1,10-PQ) (Verbindung 7) wurde gemäß dem Verfahren von Gillard et al. (J. Chem. Soc. A, 1447–1451, 1970) hergestellt. 7,1-Phenanthrolinchinon (1,7-PQ) (Verbindung 8) wurde unter Verwendung des Verfahrens, das durch Eckert et al. (Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 79: 2533–2536, 1982) beschrieben ist, synthetisiert. 2,9-Dimethyl-1,10-phenanthrolinchinon (2,9-Me₂-1,10-PQ) (Verbindung 10) wurde als ein Nebenprodukt der Nitrierung von Neokuproin synthetisiert, wie offenbart durch Mullins et al. (J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 75–81, 1996). 1-Methoxyphenazinmethasulphat (1-MeO-PMS) (Verbindung 5) wurde über die Methylierung von 1-Methoxyphenazin hergestellt, angepasst von dem Verfahren, das von Surrey (Org. Synth. Coll. Band 3, Ed. E. C. Horning, Wiley, New York, 753–756) beschrieben ist. 1-Mehtoxyphenazin wurde synthetisiert durch eine modifizierte Wohl-Aue-Reaktion, wie berichtet von Yoshioka (Yakugaku Zasshi, 73: 23–25, 1953). 4-Methyl-1,2-benzochinon (4-Me-BQ) (Verbindung 4) wurde hergestellt über die Oxidation von 4-Methylcatechol mit o-Chloranil entsprechend einem allgemeinen Verfahren von Carlson et al. (J. Am. Chem. Soc., 107: 479–485, 1985). Der 1,10-PQ-Komplex [Ru(bpy)₂(1,10-PQ)] (PF₆)₂ (Verbindung 12) wurde erhalzen von [Ru(bpy)₂Cl₂] (Strem Chemicals, Inc.) wie von Goss et al (Inorg. Chem. 24: 4263–4267, 1985) berichtet.
Herstellung von 1-Me-1,10-Phenanthroliniumchinontrifluormethansulphonat (1-Me-1,10-PQ⁺) (Verbindung 11):
Methyltrifluormethansulphonat (Aldrich (1,0 ml) wurde zu einer Lösung von 1,10-PQ (0,50 g, 2,38 mmol) in Wasser-freiem Methylenchlorid (25 ml) unter Stickstoff hinzu gefügt. Eine sofortige Ausfällung trat auf und die resultierende Mischung wurde für 24 Stunden gerührt. Die Filtration gefolgt von Waschen mit Methylenchlorid lieferte 1-Me-1,10-PQ⁺ (0,65 g, 73%) als ein feines gelbes Pulver.
Bewertung von Meldola's Blau und 1,10-PQ als NADH Mediatoren in trockenen Streifen:
Sieb-gedruckte Elektroden, die 1,10-PQ und MB einschlossen, wurden aus einem organischen Kohlenstoff-Farbstoff, der diese NAD(P)H Mediatoren bei einem Spiegel von 3,5 mg/g Farbstoff enthielt, erzeugt. Die festen Mediatoren wurden in einen kommerziellen leitenden Kohlenstoff-Farbstoff gemischt (Gwent Electronic Materials).
Die Dosis-Antwort-Kurve für die Elektroden, die 1,10-PQ enthielten, getestet mit wässerigen NADH Lösungen (0–16,7 mM) in PBS bei einem Poise Potenzial von +400 mV versus einer gedruckten Ag/AgCl Referenz-Elektrode, ist in 3 gezeigt. Eine Neigung von 0,58 μA mM^–1 NADH wurde aufgezeichnet. Die Dosis-Antwort-Kurve für die Elektroden, die MB enthielten, getestet mit wässerigen NADH Lösungen (0–12,4 mM) bei einem Poise Potenzial von +100 mV versus einer gedruckten. Ag/AgCl Referenz-Elektrode, ist in 4 gezeigt. Eine erhöhte Neigung von 8,48 μA mM^–1 NADH wurde beobachtet.
Bewertung der Mediator-Hemmung von D-3-Hydroxybutyratdehydrogenase:
Eine Serie von 18 Lösungen (2,5 ml jeweils) wurde hergestellt, jeweils 50 U/ml HBDH und 1,29 oder 2,58 mg der folgenden NAD(P)H Mediatoren enthaltend: MB(3), 4-Me-Bq(4), 1-MeO-PMS85), DCIP(6), 1,10-PQ(7), 1,7-PQ(8), 2,9-Me₂-1,10-PQ(10), 1-Me-1,10-PQ⁺(11) und [Ru(bpy)₂(1,10-PQ)](PF₆)₂(12) in Trispuffer (50 mM, pH 8,2). Eine Kontroll-Lösung wurde ebenfalls hergestellt, welche Enzym enthielt, aber keinen Mediator. Die Lösungen wurden für 0,5 Stunden bei 37,5°C inkubiert, dann (dreimal) auf NADH bei 340 nm untersucht, unter Verwendung eines Sigma Diagnostics D-3-Hydroxybutyratkits. Das Ausmaß der Interferenz des hinzugefügten Mediators mit der Assay-Geschwindigkeit verglichen mit der Kontrolle lieferte ein quantitatives Maß der Effizienz des Mediators als ein Oxidationsmittel von NADH.
Das Enzym wurde dann wieder isoliert aus den Mediator-Lösungen durch Filtration durch eine Polysulfon-Membran (nominaler Molekulargewicht Cut-Off: 30000) in einem mikrozentrifugen Filter (Millipore). Das Enzym, das auf dem Filter zurück bliebt, wurde in Trispuffer (0,2 ml) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde (dreifach) mit dem Sigma Kit untersucht. Durch Vergleichen der Ergebnisse der Assays vor und nach der Filtration, konnte der Effekt von jedem Kofalent und/oder irreversibel gebundenen Mediator auf die Enzym-Aktivität bestimmt werden.

Die Ergebnisse der zwei Assays auf jede Lösung vor und nach der Filtration sind in Tabelle 3 gesammelt. Tabelle 3

Mediator (Verbindung Nr.)	Assay-Geschwindigkeit (Extinktions-Einheiten/Min.)
Mediator (Verbindung Nr.)	Kontrolle (kein Mediator)	Vor der Filtration	Nach der Filtration
1,10-PQ	0,167	0,149	0,160 (96%)
1,7-PQ	0,155	0,115	0,150 (97%)
MB	0,167	0,008	0,026 (16%)
4-Me-BQ	0,170	0,005	0,007 (4%)
1-MeO-PMS	0,150	0,009	0,071 (47%)
DCIP	0,150	0,104	0,085 (57%)
2,9-Me₂-1,10-PQ	0,197	0,189	n/a
1-Me-1,10-PQ+	0,197	0,150	0,185 (94%)
[Ru(bpy)₂(1,10-PQ)](PF₆)₂	0,197	0,114	0,193 (98%)

Obwohl diese Ergebnisse zeigten, dass die Phenanthrolinchinon-Mediatoren relativ ineffiziente NADH Mediatoren waren, verglichen mit Meldola's Blau und 1-MeO-PMS (das heißt, die Assay-Geschwindigkeit "vor der Filtration" war nur in geringem Ausmaß vermindert), wurden über 90% der ursprünglichen Enzym-Aktivität für die Lösungen, welche 1,10-PQ, 1,7-PQ, 1-MeO-1,10-PQ, oder [Ru(bpy)₂(1,10-PQ)](PF₆)₂ enthielten, "nach der Filtration" wieder hergestellt. Dies war nicht der Fall für MB, 1-MeO-PMS, DCIP oder 4-Me-BQ. Tatsächlich hat der Chinon-Mediator 4-Me-BQ bewiesen, dass er der potenteste Inhibitor ist mit nur 4% von der ursprünglichen Aktivität verbleibend "nach der Filtration". Somit inaktivieren die letzteren vier Mediatoren teilweise HBDH, während die neuen beschriebenen Mediatoren vorteilhafter Weise einen geringen oder keinen Effekt auf die Enzym-Aktivität hatten.
Die prozentualen restlichen Enzym-Aktivitäten für jeden Mediator sind als ein Balkendiagramm in 5 gezeigt, welches enthüllt, dass die Mediatoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, dargestellt durch schwarze Balken, keine starken Inhibitoren von HBDH sind. Im Gegensatz dazu hemmten MB, 4-Me-BQ, 1-MeO-PMS und DCIP alle irreversibel HBDH, mit gleichzeitigen Verlusten in der Aktivität im Bereich von 43 bis 96%; diese Ergebnisse sind durch graue Balken in 5 dargestellt.
BEISPIEL 2
Bewertung von Meldola's Blau und 1,10-PQ in trockenen Streifen, die HBDH enthalten:
Sieb-gedruckte Elektroden wurden erzeugt von einem wässerigen Kohlenstoff-Farbstoff, der 1,10-PQ oder MB bei einem Spiegel von 2,4 bzw. 4,3 mg/g Farbstoff, zusammen mit dem Enzym HBDH (120 Einheiten/g Farbstoff) und NAD⁺ (110 mg/g Farbstoff) einschloss. Der Farbstoff enthielt auch ein Polysaccharid-Bindemittel.
Die Dosis-Antwort-Kurven für die Elektroden, die 1,10-PQ enthielten, sind in 6 gegeben. Die Elektroden wurden nach 4, 14 und 26 Wochen Lagerung getestet (30°C, dehydratisiert) mit wässerigen D-3-Hydroxybutyrat-Lösungen (0–25 mM) in PBS bei einem Poise-Potenzial von +400 mV versus einer gedruckten Ag/AgCl Referenz-Elektrode. Alle drei Dosis-Antworten waren nicht linear und glichen sich aus mit einem Strom von 8,5 μA, welcher bei 24 mM D-3-Hydroxybutyrat aufgezeichnet wurde. Dies zeigte, dass die Reaktion der trockenen Elektroden für mindestens 26 Wochen stabil war.
Die Dosis-Antwort-Kurven für die Elektroden, die MB enthielten, sind in 7 bereit gestellt. Die Elektroden wurden nach 2 und 14 Wochen Lagerung (30°C, dehydratisiert) getestet mit wässerigen D-3-Hydroxybutyrat-Lösungen (0–28 mM) in PBS bei einem Poise-Potenzial von +100 mV versus einer gedruckten Ag/AgCl Referenz-Elektrode. Die Dosis-Antwort-Kurven waren ähnlich zu denjenigen in 4. Ein Strom von 8,6 μA wurde aufgezeichnet bei 24 mM D-3-Hydroxybutyrat für diese Elektroden nach 2 Wochen Lagerung. Dies ist beinahe identisch zu den Antworten, die von trockenen Streifen erhalten wurden, die 1,10-PQ enthielten.
Dieses Ergebnis zeigte, dass die Fähigkeit einer Verbindung wie zum Beispiel MB, sehr effizient mit NADH zu vermitteln, verglichen mit 1,10-PQ, überwiegt, durch die Tatsache, dass sie HBDH hemmt. Des Weiteren ist die Stabilität der Elektroden-Antwort auf D-3-Hydroxybutyrat durch die Inaktivierung von HBDH durch MB gefährdet. 7 zeigt, dass die Reaktion dieser Elektroden abfiel durch einen inakzeptablen Spielraum von ungefähr 7 nach 14 Wochen Lagerung.
Zusammengefasst zeigten Biosensorelektroden, die einen Mediator enthielten, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, Reaktionen, welche nach mindestens 26 Wochen Lagerung stabil waren. Im Gegensatz dazu zeigten diejenigen Elektroden, die einen traditionellen Mediator, wie zum Beispiel MB einschlossen, welcher ein irreversibler Enzym-Inhibitor ist, Reaktionen, welche nach nur 14 Wochen Lagerung abfielen.
BEISPIEL 3
Bewertung von 1,10-PQ in trockenen Streifen, die Glucosedehydrogenase (GDH) enthielten:
Sieb-gedruckte Elektroden wurden von einem wässerigen Kohlenstoff-Farbstoff erzeugt, der 1,10-PQ oder MB bei einem Spiegel von 2,4 bzw. 4,3 mg/g Farbstoff einschloss, zusammen mit dem Enzym Glucosedehydrogenase (120 Einheiten/g Farbstoff) und NAD⁺ (110 mg/g Farbstoff). Der Farbstoff enthielt auch ein Polysaccharid-Bindemittel.
Die kalibrierte Dosis-Antwort-Kurve für die Elektroden ist in 8 gegeben. Die Elektroden wurden mit Vollblut getestet, das physiologisch relevante Konzentrationen von Glucose im Bereich von 3,3 bis 26 mM enthielt. Ein Poise-Potenzial von +50 mV wurde gegen eine gedruckte Ag/AgCl Elektrode gehalten. Die Elektroden erzeugten eine lineare Reaktion über den Glucose-Bereich. Somit wurden gezeigt, dass ein Mediator, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, verwendet werden kann, um einen klinisch nützlichen Glucose-Sensor zu konstruieren, welcher bei einem besonders niedrigen angewendeten Potenzial arbeitet.
BEISPIEL 4
Elektroden-Streifen wurden hergestellt unter Verwendung der Konstruktion, die in 1 und 2 veranschaulicht ist, mit einer Silber/Silberchlorid Referenz/Zähler-Elektrode und einer Arbeits-Elektrode, die durch Sieb-Drucken einer Formulierung in Übereinstimmung mit Tabelle 2 hergestellt wurde. In einem Fall war der Füllstoff 25 Gewichtsprozent ultrafeiner Kohlenstoff, und in dem anderen Fall war der Füllstoff 25 Gewichtsprozent Titandioxid. In beiden Fällen war das Enzym Glucosedandrogenase (GDH), der Kofaktor war NAD, der Mediator war 1,10-PQ, das Bindemittel war Guargummi, der Protein-Stabilisator war Rinderserumalbumin (BSA) und der Puffer war Tris (.325 Gewichtsprozent).
Diese Elektroden-Streifen wurden bewertet durch Anlegen eines 200 mV Potenzials zwischen der Referenz/Zähler-Elektrode und der Arbeits-Elektrode, während eine wässerige Glucose-Lösung beide Elektroden bedeckte. Der beobachtete Strom von 15 bis 20 Sekunden nach der Anlegung des Potenzials wurde integriert und gegen die Glucose-Gehalte der Testlösungen aufgetragen. Die Kohlenstoff-gefüllte Formulierung ergab eine Neigung von 2,6 Mikrocoulomb pro mM Glucose und einen X-Achsenabschnitt von –1 Mikrocoulomb, während die Titandioxid-gefüllte Formulierung eine Neigung von 1,5 Mikrocoulomb pro mM Glucose ergab, und einen X-Achsenabschnitt von 0,6 Mikrocoulomb. Die graphischen Darstellungen waren wie folgt:

Claims

Ein wegwerfbarer Elektrodenstreifen zur einmaligen Verwendung für die Anbringung an das Signal-Ablese-Schaltsystem eines Sensorsystems, um einen Strom nachzuweisen, der kennzeichnend ist für einen Analyten in einer wässerigen Probe, wobei der Streifen folgendes umfasst: a) einen verlängerten Träger, der eine im wesentlichen flache, ebene Oberfläche hat, angepasst zur wieder lösbaren Anbringung an das Ablese-Schaltsystem; b) einen ersten Leiter, der sich entlang der Oberfläche erstreckt und der ein leitendes Element umfasst, für die Verbindung mit dem Ablese-Schaltsystem; eine aktive Elektrode auf der Oberfläche in Kontakt mit dem ersten Leiter, wobei die aktive Elektrode ein Nicotinamidcofaktor-abhängiges Enzym, einen Nicotinamidcofaktor, und eine Mediatorverbindung umfasst, die eine der folgenden zwei Formeln hat:
oder einen Metallkomplex oder ein Chelat davon, worin X und Y unabhängig Sauerstoff, Schwefel, CR³R⁴, NR³ oder NR³R⁴⁺ oder die funktionelle Gruppe CZ¹Z² sein können, worin Z¹ und Z² Elektronen-abziehende Gruppen sind; R₁ und R₂ können unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder heteroaromotische Gruppe sein, und R³ und R⁴ können unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Amino-, Alkoxyl- oder Aryloxylgruppe sein, worin die aktive Elektrode mit Füll- und Bindemittel-Inhaltsstoffen formuliert ist, so dass die Elektrode eine monotone Antwort gibt auf Konzentrationen des Analyten zwischen ungefähr 1 und 8 mM, wenn die Messung in einer kinetischen Art und Weise durchgeführt wird, in welcher eine simultane Oxidation und Reduktion des Mediators während der Messung auftritt, wobei der Bindemittel-Inhaltsstoff Materialien einschließt, welche die Viskosität von wässerigen Medien ohne weiteres erhöhen, und die Bildung von Filmen oder Schichten fördern, und der Füll-Inhaltsstoff ein partikuläres Material ist, welches chemisch inert ist gegenüber den Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die in die Messung involviert sind, und in wässerigen Medien unlöslich ist; c) einen zweiten Leiter, der sich entlang der Oberfläche erstreckt, der ein leitendes Element für die Verbindung an das Ablese-Schaltsystem umfasst; d) eine Referenz/Gegen-Elektrode in Kontakt mit dem zweiten Leiter; e) wobei die Leiter so voneinander beabstandet sind, damit sie nicht in elektrischem Kontakt stehen, und so konfiguriert sind, damit sie nicht in elektrischen Kontakt gebracht werden, wenn die wässerige Probe auf den Streifen aufgetragen wird; f) wobei die aktive Elektrode und die Referenz/Gegen-Elektrode so konfiguriert sind, dass sie beide gleichzeitig von einem kleinen Tropfen der wässerigen Probe bedeckt werden können, um einen elektrisch leitenden Pfad zwischen den Elektroden bereitzustellen.
Der Elektrodenstreifen von Anspruch 1, worin die Mediator-Verbindung 1,10-Phenanthrolinchinon ist.
Der Elektrodenstreifen von Anspruch 2, worin das Cofaktor-abhängige Enzym Glucosedehydrogenase ist.
Der Elektrodenstreifen von Anspruch 2, worin das Cofaktor-abhängige Enzym 3-Hydroxybutyratdehydrogenase ist.
Ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer wässerigen Probe, der einer Oxidation durch ein NAD(P)⁺- abhängiges Enzym ausgesetzt wird, das folgendes umfasst: a) Oxidieren des Analyten mit dem NAD(P)⁺-abhängigen Enzym in der Anwesenheit von NAD(P)⁺; Oxidieren des NAD(P)H, das durch Reaktion mit dem Analyten und NAD(P)⁺-abhängigen Enzym erzeugt wurde, mit einer Mediator-Verbindung, die eine der folgenden zwei Formeln hat;
oder ein Metallkomplex oder ein Chelat davon, worin X und Y unabhängig Sauerstoff, Schwefel, CR³R⁴, NR³ oder NR³R⁴⁺ oder die funktionelle Gruppe CZ¹Z² sein können, worin Z¹ und Z² Elektronen-abziehende Gruppen sind; R₁ und R₂ können unabhängig eine substituierte oder unsubstituierte aromatische oder heteroaromatische Gruppe sein; und R³ und R⁴ können unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Amino-, Alkoxyl-, oder Aryloxylgruppe sein; wobei das NAD(P)⁺-abhängige Enzym, NAD(P)⁺ und die Mediator-Verbindung auf die Oberfläche der Elektrode in Kombination mit einem Bindemittel und einem Füllmittel aufgebracht wurden; und b) Anlegen eines elektrischen Potentials an einer Elektrode, um die Mediatorverbindung zu reoxidieren, die bei der Oxidierung von NAD(P)H reduziert wurde, und Beobachten des resultierenden Stroms, wobei etwas von der Mediatorverbindung durch Reaktion mit NAD(P)H reduziert wird, während etwas der Mediatorverbindung durch Transfer von Elektronen zu der Elektrode während eines Mess-Zeitraums oxidiert wird, und die Geschwindigkeit der Oxidation der Mediatorverbindung über den Mess-Zeitraum und folglich der resultierende beobachtete Strom wird monoton zur Konzentration des Analyten in der Probe ins Verhältnis gesetzt.
Das Verfahren von Anspruch 5, worin der während des Mess-Zeitraums beobachtete Strom linear mit der Konzentration des Analyten in der Probe ins Verhältnis gesetzt wird.
Das Verfahren von Anspruch 5, worin die Mediator-Komponente 1,10-Phenynthrolinchinon ist.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin das Cofaktor-abhängige Enzym Glucosedehydrogenase ist.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin das Cofaktor-abhängige Enzym 3-Hydroxybutyratdehydrogenase ist.
Das Verfahren von Anspruch 5, worin das angelegte Potential 200 mV oder weniger ist.