WO2010070719A1 - バイオセンサおよび基質濃度の測定方法 - Google Patents

バイオセンサおよび基質濃度の測定方法 Download PDF

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WO2010070719A1
WO2010070719A1 PCT/JP2008/072778 JP2008072778W WO2010070719A1 WO 2010070719 A1 WO2010070719 A1 WO 2010070719A1 JP 2008072778 W JP2008072778 W JP 2008072778W WO 2010070719 A1 WO2010070719 A1 WO 2010070719A1
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直樹 篠塚
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株式会社札幌イムノ・ダイアグノスティック・ラボラトリー
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor that can easily and rapidly measure a substrate contained in various specimens such as living organisms, foods, and environmental specimens without requiring complicated pretreatment. More specifically, the present invention relates to a biosensor capable of performing stable substrate concentration measurement by removing an influential substance contained in the sample and a substrate concentration measuring method.
  • a reactive substance generated from an oxidase and a dehydrogenase for example, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) generated from a dehydrogenase, reacts with an electron mediator to form a reducing electron mediator.
  • NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide
  • Electromediators used in biosensors include phenazines such as 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy PMS) (Analyst, Vol.119, p.2531994 (1994)) and Meldola Blue ( Analytica Chimica Acta, Vol.329 p.215 (1996)), ferricyanide (Analytical Chemistry, Vol.59, p.2111 (1987)), ferrocene (Analytical Chemistry, Vol.70, p.4320 (1998)) And quinones (Biosensers & Bioelectrnics, Vol.11, p.1267 (1996)), etc., and biosensors having their respective characteristics have been developed.
  • phenazines such as 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy PMS) (Analyst, Vol.119, p.2531994 (1994)) and Meldola Blue (
  • the present inventors have also developed various biosensors so far, and dehydrogenase and coenzyme oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) and 1-methoxy PMS as an electron mediator.
  • a biosensor integrated with an electrode Japanese Patent Laid-Open No. 2000-35413, WO00 / 04378, and a biosensor that can be measured with higher sensitivity and accuracy by adding a tetrazolium salt. (WO00 / 57166, WO02 / 18924) have been devised, and biosensors that allow simple and rapid quantification of various substrates have been constructed.
  • biosensors have a buffer component on the working electrode of the electrode formed by a printing method using conductive ink, 1-methoxy PMS on the counter electrode, dehydrogenase, coenzyme, and an absorbent carrier made of cellulose fiber.
  • Each structure has a structure in which a tetrazolium salt is fixed and an absorbent carrier is disposed between the working electrode and the counter electrode.
  • a biosensor is composed of at least two types of electrodes, and a biosensor having a working electrode and a counter electrode structure (for example, WO00 / 57166, WO02-18924, WO02 / 057767, etc.), and applying a more stable potential.
  • a biosensor having a structure including a reference electrode for example, Japanese Patent Laid-Open Nos. 63-144245 and 10-48177
  • a biosensor having an electrode for confirming an insertion state of a specimen for example, , WO03 / 091717, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-330581, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-215034, etc.
  • biosensors having electrodes having various functions for example, , WO03 / 091717, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-330581, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-215034, etc.
  • Some of these sensors are composed of three kinds of electrodes similar to the biosensor of the present invention
  • Alcohol and glucose substrates are present in large amounts in the sample and are higher than the enzyme's Km (Michaelis constant), so the enzyme reaction proceeds rapidly and the measurement is completed within 1 minute after inserting the sample. Free diffusion is not a problem.
  • Km Melaelis constant
  • the substrate concentration is low and lower than the Km (Michaelis constant) of the enzyme, so the enzyme reaction is slow, and when using a very expensive enzyme, the measurement takes several minutes, so the reaction product is free. Diffusion can occur and affect the accurate measurement of substrate concentration.
  • an object of the present invention is to easily and rapidly measure a substrate contained in various specimens such as living organisms, foods and environmental specimens without requiring a complicated pretreatment, and depending on the influence substance contained in the specimen.
  • An object of the present invention is to provide a biosensor and a substrate concentration measuring method capable of removing the influence on the substrate concentration measurement and performing stable substrate concentration measurement.
  • redox substances contained in the specimen such as uric acid and ascorbic acid
  • the measurement value includes a response current generated by oxidation of redox substances such as uric acid and ascorbic acid by applying a potential. It was found that this occurred because the measured response current increased.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention has a configuration in which a working electrode, a counter electrode, and a blank electrode are provided on the same insulating support, and the enzymes immobilized on each electrode are not eluted to cause free diffusion of the reaction product. As a result, it has been found that the above object can be achieved, and the present invention has been completed.
  • the cover comprising: a first membrane having a dense structure; and a second membrane having a rough structure including a buffer component laminated in close contact with the first membrane. Sample inlet at a position corresponding to the membrane laminate is provided, the biosensor is provided. The membrane laminate is inserted in a compressed state between the insulating support and the cover so as to prevent free diffusion of reactants.
  • the first membrane is a membrane having a dense structure.
  • the first membrane has a medium pore diameter (typically capable of removing solids and the like contained in the sample that do not contribute to the reaction).
  • Is preferably a porous membrane having around 2 ⁇ m).
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably 10 ⁇ m or less.
  • porous membranes having an asymmetric structure with different pore densities are suitable.
  • the average pore diameter of the porous membrane is preferably 7 ⁇ m or less in order to prevent passage of blood cell components.
  • Examples of the material for the first membrane include nitrocellulose, nylon, polysulfone, polyestersulfone, polypropylene, cellulose acetate, and polycarbonate.
  • nitrocellulose nylon, polysulfone, polyestersulfone, polypropylene, cellulose acetate, and polycarbonate.
  • Vivid Plasma Separation Membrane manufactured by Paul Co., Ltd.
  • blood cell components of about 7 ⁇ m contained in blood can be quickly separated, and free diffusion of reaction reagents Is also preferable.
  • this blood cell separation membrane it is preferable to use it so that a high-density surface may contact
  • the material of the second membrane is not particularly limited as long as it has a rough structure that allows easy passage of the specimen, but a flexible non-woven fabric formed from fibers has a rough structure and the specimen is It is preferable because it is easy to enter.
  • a flexible non-woven fabric formed from fibers has a rough structure and the specimen is It is preferable because it is easy to enter.
  • the forming fiber polyester fiber, rayon fiber, polyolefin fiber, polypropylene fiber, nylon, cotton, glass fiber, cellulose fiber, and synthetic fibers thereof can be used.
  • a nonwoven fabric formed from rayon fibers is preferable because it easily penetrates even a specimen having a high viscosity.
  • the fiber density (weight per unit area) of the nonwoven fabric is preferably 20 to 90 g / m 2 , more preferably 40 to 60 g / m 2 .
  • the first membrane includes an electron mediator.
  • the electron mediator contained in the first membrane is not particularly limited as long as it is a substance that promptly performs a redox reaction with a reduced coenzyme alone or with a reduced coenzyme and diaphorase. Examples include cytochromes, phenazines, phenoxazines, phenothiazines, ferricyanides, ferredoxins, ferrocene and tetrazolium salts.
  • monosodium (WST) is particularly preferred.
  • -1) is preferable as an electron mediator in the present invention because the formazan produced upon reduction is water-soluble and chemically stable, and the produced formazan shows a specific response in the electrode system.
  • WST-1 as the electron mediator, impregnated with the first membrane, may be included by dry, the amount is first membrane 1 m 2 per 0.5 ⁇ 2.0 g are preferred .
  • the second membrane may contain a buffer component.
  • the buffer component it is necessary to select a component that does not affect the pH activity of the dehydrogenase to be used, the optimum buffer, the buffer capacity, and the electrode reaction.
  • the pH activity is expressed at pH 10 or higher, for example, carbonate buffer or chaps buffer, etc.
  • pH 8-10 for example, Tris buffer, chess buffer or tricine buffer, etc.
  • a phosphate buffer or a Hepes buffer can be used.
  • the working electrode and the blank electrode constituting the electrode unit are made of the same conductive material.
  • the working electrode and the blank electrode preferably have the same electrode area.
  • the material for forming the working electrode and the blank electrode is a conductive material and is not particularly limited as long as it is electrically stable, and carbon, gold, platinum, platinum black, palladium, etc., and alloys thereof should be used. Can do. Among these, carbon materials are particularly preferable because they are inexpensive and chemically stable.
  • the material for forming the counter electrode is not particularly limited as long as it is a conductive material and is stable even when a potential is applied, and carbon, silver / silver chloride, gold, platinum, platinum black and palladium are used. Among them, silver / silver chloride is particularly preferable because a potential can be stably applied.
  • the dehydrogenase immobilized on the working electrode is not particularly limited as long as it is an enzyme that reacts with a substrate to be measured and generates a reduced coenzyme, and the origin is also particularly limited. There is no.
  • alanine dehydrogenase alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, uridine-5 ′ diphosphoglucose dehydrogenase, galactose dehydrogenase, formate dehydrogenase, glyceraldehyde-3 -Phosphate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, glucose dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, sarcosine dehydrogenase Enzyme, sorbitol
  • the coenzyme is not particularly limited as long as it is a coenzyme having a good reactivity with a dehydrogenase that reacts with a measurement substrate.
  • oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ), oxidized thionicotinamide adenine dinucleotide (Thio-NAD + ), oxidized thionicotinamide adenine dinucleotide
  • Examples thereof include nucleotide phosphate (Thio-NADP + ), pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD), and flavin mononucleotide (FMN).
  • diaphorase may be immobilized on the working electrode and the blank electrode in addition to the above-described dehydrogenase and coenzyme.
  • the lead wire forming material is a conductive material and is not particularly limited as long as it is electrically stable. Carbon, silver, silver / silver chloride, copper, gold, platinum, platinum black, palladium, etc. and their alloys can be used. Can be used. In the present invention, silver is particularly preferable as a lead wire because it is inexpensive and exhibits good conductivity.
  • the insulating material used in the present invention is made of an insulating material and is not particularly limited as long as it is a stable material, and an acrylic resin, an acrylic urethane resin, a polyester resin, or the like can be used.
  • Examples of the material for forming the insulating support used in the present invention include glass, glass epoxy, ceramic, plastic, etc., but it is a substance that is not affected when printing and forming various electrodes or adding samples. If there is no particular limitation. Specifically, for example, a plastic film such as polyester, polyethylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polypropylene, and polyvinyl chloride is preferable because it is inexpensive, and a polyester film is desirable because of its good adhesion to conductive ink and good workability.
  • a plastic film such as polyester, polyethylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, polypropylene, and polyvinyl chloride is preferable because it is inexpensive, and a polyester film is desirable because of its good adhesion to conductive ink and good workability.
  • the material for forming the spacer and the cover used in the present invention is not particularly limited as long as it is a single-sided or double-sided pressure-sensitive adhesive tape using a substance that does not erode the base material and the adhesive.
  • the base material include polyester, polyethylene, acrylic, urethane, and synthetic rubber.
  • the adhesive include acrylic adhesive, rubber adhesive, polyester adhesive, and epoxy. In the present invention, an adhesive tape using an acrylic adhesive for polyester can be used.
  • the present invention is a method for measuring a substrate concentration using the biosensor of the present invention, and from the response current generated by applying a potential between the working electrode and the counter electrode, the blank electrode and the counter electrode
  • a substrate concentration measurement method is provided by measuring a substrate concentration by subtracting a response current generated by applying a potential between the two.
  • the potential applied between the working electrode and the counter electrode and the potential applied between the blank electrode and the counter electrode are preferably the same potential.
  • the substrate contained in various specimens such as living organisms, foods and environmental specimens can be measured easily and quickly without requiring complicated pretreatment, and the influence contained in the specimen.
  • the substance can be removed and stable measurement can be performed.
  • the biosensor of the present invention has an electrode unit comprising a working electrode, a counter electrode, and a blank electrode on the same insulating support, and further has a structure in which the first membrane is adhered to the electrode unit, so that it is immobilized on the working electrode. Measurement of the substrate concentration in which the product generated by the enzyme reaction and redox reaction occurring in the selected enzyme is retained in the first membrane to inhibit free diffusion and to remove noise caused by the influence substance contained in the specimen Can do.
  • the biosensor of the present invention inhibits the free diffusion of the affected substance by the membrane laminate, particularly the first membrane, it can be measured without problems even if an enzyme that takes several minutes for the substrate-enzyme reaction is used, and more accurately. Can stably measure the substrate concentration in the specimen.
  • the first membrane contains the electron mediator and the second membrane is impregnated with the buffer component, the influence caused by the reaction between the electron mediator and the buffer component and the influential substance in the specimen is also opposite to the blank electrode. Since it can cancel out in between, more stable measurement becomes possible.
  • a blood cell separation membrane is used as the first membrane, so that only plasma components can be contributed to the reaction on the electrode. It becomes possible.
  • FIG. 1 is an exploded view of an electrode structure used in a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing an electrode unit used in the biosensor of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an exploded view of a biosensor using the electrode unit shown in FIG.
  • FIG. 4 is a plan view showing a biosensor using the electrode unit shown in FIG.
  • FIG. 5 is a graph showing a result of measuring a specimen containing uric acid using a biosensor including a working electrode and a counter electrode.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring a specimen containing uric acid using the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 1 is an exploded view of an electrode structure used in a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing an electrode unit used in the biosensor of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an exploded view of a biosensor using the electrode unit shown in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring a sample containing ascorbic acid using a biosensor composed of a working electrode and a counter electrode.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measuring a specimen containing ascorbic acid using the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing a measurement result between the working electrode and the counter electrode of the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing measurement results between the blank electrode and the counter electrode of the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 11 is a graph showing a measurement result of the biosensor according to this embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing a measurement result when the membrane is removed from the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing measurement results when the dense membrane is changed to a rough membrane from the biosensor in one example of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing measurement results when the spacer thickness of the biosensor in one example of the present invention is increased and the adhesion between the electrode and the membrane is changed.
  • Insulating support 2 Lead wire 3: Insulating layer 4: Counter electrode 5: Working electrode 6: Blank electrode 7: Measuring device connection part 8: Spacer 9: Enzyme layer 10: Blood cell separation membrane 11: Nonwoven fabric 12: Cover 13 : Sample inlet
  • FIG. 1 is an exploded view of an electrode structure used in a biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view showing an electrode unit used in the biosensor of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is an exploded view of a biosensor using the electrode unit shown in FIG.
  • FIG. 4 is a plan view showing a biosensor using the electrode unit shown in FIG.
  • the biosensor A of the present invention is connected to the insulating support 1, the plurality of lead wires 2 formed on the insulating support 1, and the lead wires 2, respectively.
  • Electrode unit B comprising working electrode 5, counter electrode 4 and blank electrode 6, membrane laminate C laminated to be in close contact with electrode unit B, and insulation so as to sandwich membrane laminate C
  • the membrane laminate C includes a first membrane 10 having a dense structure including an electron mediator and the first membrane.
  • the sample inlet 13 is provided at a position corresponding to the membrane stack C in the cover 12.
  • the electrode unit B used in the biosensor of the present invention includes a rectangular insulating support 1, three lead wires 2 disposed on the insulating support 1, A rectangular insulating layer 3 having an opening 3a provided on the insulating support 1 so as to sandwich the lead wire 2, two counter electrodes 4 provided in accordance with the opening of the insulating layer 3, a working electrode 5, It consists of a blank pole 6.
  • the insulating layer 3 is configured to be shorter than the insulating support 1, and the three lead wires 2 are exposed at one end from the insulating layer 3 to form a wide measuring portion connection portion 7.
  • the central lead wire 2b is connected to the counter electrode 4
  • one side lead wire 2a is connected to the working electrode 5
  • the other lead wire 2c is connected to the blank electrode 6. Yes.
  • the working electrode 5 is provided with an enzyme layer 9 on which an enzyme that reacts with a substrate and a coenzyme are fixed.
  • An enzyme and a coenzyme that do not react with the substrate may be fixed to the blank electrode 6.
  • the biosensor of the present invention can be obtained by assembling according to the procedure described in Examples 1 and 2 to be described later, but the lead wire and each electrode can be formed by printing on a support.
  • the printing method is not particularly limited to screen printing, and other gravure printing, offset printing, inkjet printing, and the like can be used.
  • the biosensor of the present invention can be used for measurement of substrate concentration. Specifically, after the sample is input from the sample input port (13 in FIG. 4), a response current generated by applying a potential between the working electrode and the counter electrode is used to determine whether the blank electrode and the counter electrode are Substrate concentration can be measured by measuring the concentration of the substrate by subtracting the response current generated by applying a potential between them.
  • a response current generated by applying a potential between the working electrode and the counter electrode is measured. Is preferred.
  • the potential applied between the working electrode and the counter electrode is the same as the potential applied between the blank electrode and the counter electrode.
  • the applied potential is arbitrary depending on the electron mediator to be used, but the applied potential when using formazan produced from WST-1 of the example is preferably 350 to 500 mV.
  • Example 1 Production of Electrode Unit An electrode unit B shown in FIG. 1 was produced as follows.
  • Conductive silver ink (trade name “Electrodag PF-836”, Henkel Technologies Japan Co., Ltd.) by screen printing on an insulating support 1 made of a polyester film (trade name “Polyester Film Diafoil” manufactured by Mitsubishi Chemical Polyester Film Co., Ltd.) Made into a predetermined shape by screen printing and cured by heating at 80 ° C. for 30 minutes to form a lead wire 2.
  • an insulating ink (trade name “JE-1000G” manufactured by Henkel Technologies Japan Co., Ltd.) is applied to a predetermined shape by screen printing, cured by UV irradiation of about 500 mJ / cm 2 , An insulating layer 3 was formed.
  • silver / silver chloride ink (trade name “Electrodag PE-409” manufactured by Henkel Technologies Japan Co., Ltd.) was screen-printed and heated and cured at 80 ° C. for 30 minutes to form the counter electrode 4.
  • a spacer 8 (trade name “TL-85 series” manufactured by Lintec Co., Ltd.) having a thickness of 0.45 mm and having an adhesive on one side was attached so as to expose the electrode unit B produced in Example 1.
  • a blood cell separation membrane 10 (trade name “Vivid Plasma Separation Membrane” manufactured by Pall Co., Ltd.) containing WST-1 (manufactured by Dojindo Laboratories) and a second membrane as carbonic acid Non-woven fabric 11 (trade name “T-250” manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.), fiber, containing buffering agents (potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and potassium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))
  • buffering agents potassium carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and potassium hydrogen carbonate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a membrane laminate having a density of 50 g / m 2 ) was prepared.
  • the obtained membrane laminate C is arranged so that the first membrane is in close contact with each electrode exposed between the spacers 8, and the cover 12 (trade name “TL-85 series”) is placed on the spacer and the membrane laminate C. Placed so that the specimen inlet 13 of Lintec Co., Ltd. is located, pressurized with a roller, and attached in a state where the thickness of the membrane laminate C is compressed to about 80% to obtain the biosensor A shown in FIG. It was.
  • Example 3 Measurement result of specimen containing influential substance by biosensor of the present invention (3-1) When the influential substance is uric acid Conventional biosensor comprising a working electrode and a counter electrode using a specimen containing uric acid FIG. 5 shows the results measured by (described in WO02 / 18924), and FIG. 6 shows the results measured by the biosensor of the present invention produced in Example 2.
  • a specimen containing uric acid was inserted into a conventional biosensor, and after 297 seconds, a potential of +400 mV was applied between the working electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured. .
  • a specimen containing uric acid is inserted into the biosensor of the present invention, and after 290 seconds, a potential of +400 mV is applied between the working electrode and the counter electrode with reference to the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds is obtained. It was measured. Further, after 4 seconds, a potential of +400 mV was applied between the blank electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured.
  • the response current value of the biosensor of the present invention was determined by subtracting the response current value obtained by applying the potential between the blank electrode and the counter electrode from the response current value obtained by applying the potential between the working electrode and the counter electrode.
  • the value of the response current value increases as the uric acid concentration increases.
  • the response current value is constant even when the uric acid concentration increases, and can be measured stably.
  • the conventional biosensor increases the ascorbic acid concentration as the uric acid, and the response current value increases as the ascorbic acid concentration increases. It can be seen that the response current value was constant even when the acid concentration was increased, and the measurement was stable.
  • FIG. 9 shows the result of the response current value between the working electrode and the counter electrode at each substrate concentration of the biosensor of the present invention prepared in Example 2, and the blank electrode. 10 shows the result of the response current value between the counter electrode and the counter electrode, and FIG. 11 shows the result of subtracting the response current value between the blank electrode and the counter electrode from the response current value between the working electrode and the counter electrode.
  • the specimen was inserted into the biosensor of the present invention, and after 290 seconds, a potential of +400 mV was applied between the working electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured. Further, after 4 seconds, a potential of +400 mV was applied between the blank electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured.
  • the response current value between the working electrode and the counter electrode increased as the substrate concentration increased, but the response current value between the blank electrode and the counter electrode remained constant as the substrate concentration increased.
  • the biosensor of the present invention was used, it was confirmed that the response current value with respect to the substrate concentration had a proportional relationship.
  • Specimens containing various substrate concentrations were inserted into the biosensor for comparison. After 290 seconds, a potential of +400 mV was applied between the working electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds. Was measured. Further, after 4 seconds, a potential of +400 mV was applied between the blank electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured.
  • the response current value between the blank electrode and the counter electrode was constant when the substrate concentration was low, but was clearly very high when the substrate concentration was high. This is presumably because in the case where there was no membrane, the reaction product moved to the blank electrode due to free diffusion of the reaction product, and thus the response current value between the blank electrode and the counter electrode increased.
  • Measurement result when the second membrane was brought into close contact with the electrode The first membrane and the second membrane in the biosensor produced in Example 2 were reversed, and the second membrane was FIG. 13 shows a result of measuring a response current value between a blank electrode and a counter electrode at each substrate concentration by preparing a comparative biosensor in close contact with the electrode.
  • Specimens containing various substrate concentrations were inserted into the biosensor for comparison. After 290 seconds, a potential of +400 mV was applied between the working electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds. Was measured. Further, after 4 seconds, a potential of +400 mV was applied between the blank electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured.
  • Example 5 Examination results on adhesion of membrane having a dense structure to electrodes The thickness of the spacer in the biosensor produced in Example 2 was changed to 0.55 mm, and the adhesion to each member of the membrane laminate was improved.
  • FIG. 14 shows the results of measurement of the response current value between the working electrode and the counter electrode and the response current value between the blank electrode and the counter electrode for each of the substrate concentrations.
  • Samples containing various substrate concentrations were inserted into the biosensor of this example, and after 290 seconds, a potential of +400 mV was applied between the working electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response after 3 seconds. The current value was measured. Further, after 4 seconds, a potential of +400 mV was applied between the blank electrode and the counter electrode based on the counter electrode (silver / silver chloride), and the response current value after 3 seconds was measured.
  • the biosensor of the present invention uses a membrane on the electrode, so that free diffusion of the reactant can be suppressed. Furthermore, since the first membrane having a dense structure is in close contact with the electrode, it can be seen that free diffusion of the reactant can be further suppressed. In addition, it was confirmed that by measuring the response current value between the blank electrode and the counter electrode from the response current value between the working electrode and the counter electrode, measurement that is not affected by the influence substance in the specimen is possible. .

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Abstract

　本発明は、生体・食品および環境検体中に含まれる基質を煩雑な前処理を必要とせず、簡便でしかも迅速且つ安定的に測定できるバイオセンサに関する。本発明のバイオセンサは、絶縁性支持体１と、絶縁性支持体１上に形成された複数のリード線２と、リード線２にそれぞれ接続されている作用極５、対極４およびブランク極６からなる電極ユニットＢと、電極ユニットＢに密着するように積層されているメンブレン積層体Ｃと、メンブレン積層体Ｃを挟持するように絶縁性支持体１及びリード線２上に載置されているスペーサ８と、スペーサ８及びメンブレン積層体Ｃを覆って載置されているカバー１２と、を具備し、作用極５上には、少なくとも被測定基質と反応する脱水素酵素および補酵素が固定化されており、メンブレン積層体Ｃは、電子メディエータを含む密な構造を有する第１のメンブレン１０及び第１のメンブレン１０に密着して積層された緩衝成分を含む粗の構造を有する第２のメンブレン１１からなり、カバー１２にはメンブレン積層体Ｃに対応する位置に検体投入口１３が設けられている。

Description

バイオセンサおよび基質濃度の測定方法
　本発明は、生体、食品および環境検体等の種々の検体中に含まれる基質を煩雑な前処理を必要とせず、簡便でしかも迅速に測定できるバイオセンサに関する。詳細には、該検体中に含まれる影響物質を除去して安定した基質濃度測定を行うことが可能なバイオセンサおよび基質濃度の測定方法に関する。
　現在、糖尿病患者の治療のため、血液中のグルコース濃度を簡単で短時間に測定できるグルコースセンサが開発され、インシュリン治療を行っている患者にとって、必要不可欠なものとなっている。
　このセンサは、酸化酵素および脱水素酵素から生成された反応物質、例えば脱水素酵素から生成された還元型ニコチンアミドアデニンジヌキレオチド（ＮＡＤＨ）など、が電子メディエータと反応して還元性電子メディエータに変換し、少なくとも作用極および対極からなる電極から電位印加を行うことで生じる応答電流を測定することにより、検体中にある基質濃度を測定することを可能とするものである。
　バイオセンサに用いられる電子メディエータとしては、フェナジン類の１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－メトキシ　ＰＭＳ）（Analyst, Vol.119, p.253 (1994)）やメルドラブルー（Analytica Chimica Acta, Vol.329 p.215 (1996)）、フェリシアン化物（Analytical Chemistry, Vol.59, p.2111 (1987)）、フェロセン（Analytical Chemistry, Vol.70, p.4320 (1998)）、キノン類（Biosensers & Bioelectrnics, Vol.11, p.1267(1996)）などがあり、各々特徴を有するバイオセンサが開発されている。
　一方、本発明者らも、これまでに種々のバイオセンサの開発を行っており、脱水素酵素と補酵素の酸化型ニコチンアミドアデニンジヌキレオチド（ＮＡＤ＋）および電子メディエータとして１－メトキシ　ＰＭＳを用いて、電極と一体化させたバイオセンサ（特開２０００－３５４１３号公報、ＷＯ００／０４３７８）、さらにテトラゾリウム塩を付加させることで、より高感度・高精度に測定ができるようになったバイオセンサ（ＷＯ００／５７１６６、ＷＯ０２／１８９２４）を考案し、種々の基質に対して簡便でしかも迅速な定量が可能なバイオセンサを構築してきた。
　これらのバイオセンサは、導電性インクを用いる印刷手法により形成した電極の作用極上に緩衝成分を、対極上に１－メトキシ　ＰＭＳを、セルロース繊維からなる吸収性担体内に脱水素酵素、補酵素およびテトラゾリウム塩をそれぞれ固定化し、作用極および対極間に吸収性担体を配置させた構造を有している。このバイオセンサで測定することにより、基質の低濃度領域においても基質濃度に依存した直線的できわめて良好な電流応答が得られることを確認している。しかし、その後の検討から、検体中に含まれる酸化還元物質、例えば、尿酸、アスコルビン酸等が測定に影響を与え、基質の低濃度領域において多大な影響が出る可能性があることが確認された。
　通常、バイオセンサは少なくとも２種類以上の電極で構成されており、作用極および対極の構造を有するバイオセンサ（例えば、ＷＯ００／５７１６６、ＷＯ０２－１８９２４、ＷＯ０２／０５７７６７など）、さらに安定な電位を印加するために参照極を含む構造を有するバイオセンサ（例えば、特開昭６３－１４４２４５号公報、特開平１０－４８１７７号公報など）、検体の挿入状況を確認するための電極を有するバイオセンサ（例えば、ＷＯ０３／０９１７１７、特開２００１－３３０５８１号公報、特開２００６－２１５０３４号公報など）、様々な働きの電極を有するバイオセンサがある。これらのセンサは、本発明のバイオセンサと類似で３種の電極で構成されているものもあるが、検体中に含まれる影響物質による基質濃度測定に対する影響を十分に排除できていない。
　そこで、このような影響を除去する方法として、ＷＯ０５／０４５４１６、ＷＯ０５／０４５４１４、特開平２－１２９５４１号公報、特開平６－１０９６９２号公報、特開平１０－１７０４７１号公報、ＷＯ００／０７３７８５などが提案されている。
　これらの方法は、安価であるため大量に使用できるアルコール脱水素酵素、グルコース酸化酵素もしくはグルコース脱水素酵素を用いている。アルコールやグルコースの基質は検体中に大量に存在し、酵素のＫｍ（ミカエリス定数）よりも高いので酵素反応は迅速に進行し、測定は検体を挿入後１分以内で完了するものであるため、自由拡散が問題にならない。一方、アミノ酸などでは基質濃度が低く、酵素のＫｍ（ミカエリス定数）よりも低いために酵素反応が遅く、大変高価な酵素を使用する場合は、測定に数分間を要するため、反応生成物の自由拡散が起こり、基質濃度の正確な測定に影響を与える可能性がある。さらに、これらの特許はすべてポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のポリマー、ＢＳＡのタンパクを含めることにより反応生成物の保持を行っており、これらの物質自体が水溶性の検体に溶け出すものであるため、反応生成物の保持などは考慮されておらず、反応生成物の自由拡散の影響を考慮したセンサはない。また、これらの物質は酵素固定および電子メディエータを電極上に固定化する際に用いられるもので、検体に溶け出すため、検体挿入での溶解後の保持を完全に行うことは不可能である。
特開２０００－３５４１３号公報 ＷＯ００／０４３７８ ＷＯ００／５７１６６ ＷＯ０２／１８９２４ ＷＯ０２／０５７７６７ 特開昭６３－１４４２４５号公報 特開平１０－４８１７７号公報 ＷＯ０３／０９１７１７ 特開２００１－３３０５８１号公報 特開２００６－２１５０３４号公報 ＷＯ０５／０４５４１６ ＷＯ０５／０４５４１４ 特開平２－１２９５４１号公報 特開平６－１０９６９２号公報 特開平１０－１７０４７１号公報 ＷＯ００／０７３７８５
　したがって、本発明の目的は、生体、食品および環境検体等の種々の検体中に含まれる基質を煩雑な前処理を必要とせず簡便でしかも迅速に測定でき、該検体中に含まれる影響物質による基質濃度測定への影響を除去して安定した基質濃度測定を行うことが可能なバイオセンサおよび基質濃度の測定方法を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、検体中に含まれる酸化還元物質、例えば、尿酸、アスコルビン酸等が測定に影響を与え、基質の低濃度領域において多大な影響が出る可能性があることを確認した。これは、酵素反応および酸化還元反応による反応生成物への影響ではなく、電位印加により尿酸、アスコルビン酸等の酸化還元物質が酸化されることで生じる応答電流が測定値に含まれてしまうことで、測定される応答電流が上昇してしまうために起きたものであることを見いだした。そこで、検体中に含まれる基質と酵素反応および酸化還元反応により生成された反応生成物および検体中に含まれる酸化還元物質に起因する作用極と対極から得られる応答電流から、検体中に含まれる酸化還元物質に起因する電極上に酵素が固定化されていない電極（ブランク極）と対極から得られる応答電流を差し引くことで、検体中に含まれる酸化還元物質の影響を除くことができるものと考え、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、同一絶縁性支持体上に作用極、対極およびブランク電極を設け、さらに各々の電極上に固定化された酵素類が溶出して反応生成物の自由拡散を起こさない構成とすることにより上記目的を達成しうることを知見し、本発明を完成するに至った。
　本発明によれば、絶縁性支持体と、該絶縁性支持体上に形成された複数のリード線と、該リード線にそれぞれ接続されている作用極、対極およびブランク極からなる電極ユニットと、該電極ユニットに密着するように積層されているメンブレン積層体と、該メンブレン積層体を挟持するように該絶縁性支持体及び該リード線に載置されているスペーサと、該スペーサ及び該メンブレン積層体を覆って載置されているカバーと、を具備し、前記作用極上には少なくとも被測定基質と反応する脱水素酵素および補酵素が固定化されており、前記メンブレン積層体は電子メディエータを含む密な構造を有する第１のメンブレン及び該第１のメンブレンに密着して積層された緩衝成分を含む粗の構造を有する第２のメンブレンからなり、前記カバーには前記メンブレン積層体に対応する位置に検体投入口が設けられている、バイオセンサが提供される。前記メンブレン積層体は、前記絶縁性支持体と前記カバーとの間に圧縮された状態で挿入されており、反応物質の自由拡散を防止するようになされている。
　前記第１のメンブレンは、密な構造を有するメンブレンであり、具体的には、検体中に含まれる、反応に寄与しない固形物などを除去することが可能な中程度の細孔径（典型的には２μｍ前後）を有する多孔質メンブレンが望ましい。多孔質メンブレンの平均孔径は１０μｍ以下が好ましい。特に、細孔密度が異なる非対称構造の多孔質メンブレンが好適である。検体として血液を用いる場合には、血球成分の通過を妨げるため、多孔質メンブレンの平均孔径は７μｍ以下であることが好ましい。
　第１のメンブレンの素材としては、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステルスルホン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、ポリカーボネートなどが挙げられる。例えば、ポリスルホンからなる非対称の構造を有する「Vivid Plasma Separation Membrane」（ポール（株）製）を用いることで、血液中に含まれる約７μｍの血球成分をすみやかに分離し、さらに反応試薬の自由拡散も抑えることができるので好ましい。この血球分離膜を用いる場合には、密度の高い面を電極と接するように使用することが好ましい。
　第２のメンブレンの素材としては、検体が透過しやすい粗な構造を有していれば特に制限はないが、繊維から形成された柔軟性を有する不織布が、粗な構造を有し、検体が入りやすいので好ましい。その形成繊維としては、ポリエステル繊維、レーヨン繊維、ポリオレフィン繊維、ポリプロピレン繊維、ナイロン、コットン、ガラス繊維、セルロース繊維およびそれらの合成繊維などを使用することができる。中でもレーヨン繊維から形成された不織布は粘度が高い検体でも透過しやすいので好ましい。また、不織布の繊維密度（目付）は、好ましくは２０～９０ｇ／ｍ２、より好ましくは４０～６０ｇ／ｍ２である。
　本発明で用いるメンブレン積層体のうち、第１のメンブレンは電子メディエータを含む。第１のメンブレンに含まれる前記電子メディエータとしては、還元型補酵素単独もしくは還元型補酵素およびジアホラーゼによりすみやかに酸化還元反応を行う物質であれば特に制限はない。たとえば、シトクロム類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびテトラゾリウム塩類を挙げることができる。中でもテトラゾリウム塩が好ましく、該テトラゾリウム塩の中でも特に２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム，１ナトリウム（ＷＳＴ－１）は還元したときに生成されるホルマザンが水溶性で化学的に安定であり、また生成したホルマザンが電極系において特異的な応答を示すことから、本発明における電子メディエータとして好ましい。電子メディエータとしてＷＳＴ－１を使用する場合は、第１のメンブレンに含浸し、乾燥させることにより含ませることができ、その量は、第１のメンブレン１ｍ２当たり０．５～２．０ｇが好ましい。
　本発明で用いるメンブレン積層体のうち、第２のメンブレンは緩衝成分を含んでいてもよい。緩衝成分としては、使用する脱水素酵素のｐＨ活性、至適緩衝剤、緩衝能および電極反応に影響のない成分を選択する必要がある。例えば、ｐＨ活性がｐＨ１０以上で発現する場合には、例えば、炭酸緩衝剤もしくはチャップス緩衝剤等、ｐＨ８～１０で発現する場合には、例えば、トリス緩衝剤、チェス緩衝剤もしくはトリシン緩衝剤等、ｐＨ６～８で発現する場合には、例えば、リン酸緩衝剤もしくはヘペス緩衝剤等を使用することができる。
　前記電極ユニットを構成する前記作用極および前記ブランク極は、同一の導電性物質により構成されていることが好ましい。また、前記作用極および前記ブランク極は同一の電極面積を有することが好ましい。
　前記作用極および前記ブランク極の形成材料としては、導電性物質であり、電気的に安定であれば特に制限はなく、カーボン、金、白金、白金黒およびパラジウム等ならびにそれらの合金を使用することができる。その中でもカーボン材料が安価で化学的に安定していることから特に好ましい。前記対極の形成材料としては、導電性物質であり、電位印加を行っても安定した材料であれば特に制限はなく、カーボン、銀/塩化銀，金、白金、白金黒およびパラジウム等を使用することができ、中でも銀/塩化銀が安定に電位印加できるので特に好ましい。
　前記作用極上に固定化される前記脱水素酵素としては、被測定基質と反応する酵素であり、還元型補酵素を生成する酵素であれば特に制限はなく、また由来についても特に制限されることはない。例えば、アラニン脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、ウリジン－５’ジホスフォーグルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、グリセロール－３－リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、コレステロール脱水素酵素、サルコシン脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、６－ホスフォグルコン酸、ホルムアルデヒド脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール－６－リン酸脱水素酵素、１，５－アンヒドロ－Ｄ－グルシトール脱水素酵素等を挙げることができる。
　前記補酵素としては、測定基質と反応する脱水素酵素と良好な反応性を有する補酵素であれば特に制限されることはない。例えば、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｔｈｉｏ-ＮＡＤ＋）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｔｈｉｏ-ＮＡＤP＋）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）などを挙げることができる。
　また前記ブランク極上に、前記作用極上で固定化される脱水素酵素とは異なる、前記基質と反応しない脱水素酵素および補酵素を固定化することにより酵素特異性による影響の除去も可能となる。
　また、前記作用極及びブランク極上には、上述の脱水素酵素及び補酵素に加えてジアホラーゼを固定してもよい。
　リード線の形成材料としては導電性物質であり、電気的に安定であれば特に制限はなく、カーボン、銀、銀/塩化銀、銅、金、白金、白金黒およびパラジウム等ならびにそれらの合金を使用することができる。本発明においては、銀が安価で良好な導電性を示すことから、リード線として特に好ましい。
　本発明に用いられる絶縁材の形成材料としては絶縁性物質で構成されており、安定な物質であれば特に制限はなく、アクリル樹脂、アクリルウレタン樹脂、ポリエステル樹脂等を使用することができる。
　本発明に用いられる絶縁性支持体の形成材料としては、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、プラスチック等が挙げられるが、種々の電極を印刷して形成する際や試料の添加の際に侵されない物質であれば特に制限はない。具体的には例えばポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等のプラスチックフィルムが安価で好ましく、さらに導電性インクとの密着性や加工性の良さから、ポリエステルフィルムが望ましい。
　本発明に用いられるスペーサおよびカバーの形成材料としては、基材および粘着剤が検体に浸食されない物質を使用した片面もしくは両面粘着テープであれば、特に制限はない。基材としてはポリエステル、ポリエチレン、アクリル、ウレタン、合成ゴムなどがあり、粘着剤としては、アクリル系粘着剤、ゴム系粘着剤、ポリエステル系粘着剤、エポキシなどがある。本発明においては、ポリエステルにアクリル系粘着剤を使用した粘着テープを使用することができる。
　また、本発明は、本発明のバイオセンサを用いる基質濃度の測定方法であって、前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流から、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を引いて、基質濃度を測定することを特徴とする基質濃度の測定方法を提供するものである。
　前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定した後に、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定するのが好ましい。前記作用極と前記対極との間に印加する電位、及び前記ブランク極と前記対極との間に印加する電位は同じ電位であることが好ましい。
　本発明のバイオセンサによれば、生体、食品および環境検体等の種々の検体中に含まれる基質を煩雑な前処理を必要とせず、簡便でしかも迅速に測定でき、該検体中に含まれる影響物質を除去して安定した測定を行うことができる。
　本発明のバイオセンサは、同一絶縁性支持体上に作用極、対極およびブランク電極からなる電極ユニットと、さらにこの電極ユニットに第１のメンブレンを密着させた構造を有するので、作用極上に固定化された酵素で起こる酵素反応および酸化還元反応により生成された生成物を第１のメンブレンに保持して自由拡散を阻害し、検体中に含まれる影響物質に起因するノイズを除去した基質濃度の測定ができる。
　また、本発明のバイオセンサは、メンブレン積層体、特に第１のメンブレンによって影響物質の自由拡散を阻害するので、基質－酵素反応に数分間を要する酵素を用いても問題なく測定でき、より正確で安定に検体中の基質濃度を測定することができる。
　また、第１のメンブレンに電子メディエータを含有させ、さらに第２のメンブレンに緩衝成分を含浸させているので、電子メディエータおよび緩衝成分と検体中の影響物質との反応により生じる影響もブランク電極と対極間で打ち消すことができるので、より安定な測定が可能となる。
　さらに、検体として全血を使用する際、第１のメンブレンに血球分離膜を使用することで、電極上には血漿成分のみを反応に寄与させることが可能となることから、より安定な測定が可能となる。
図１は、本発明の一実施例のバイオセンサに用いられる電極構造の分解図である。 図２は、本発明の一実施例のバイオセンサに用いられる電極ユニットを示す平面図である。 図３は、図２に示す電極ユニットを用いたバイオセンサの分解図である。 図４は、図２に示す電極ユニットを用いたバイオセンサを示す平面図である。 図５は、作用極および対極からなるバイオセンサを用いて、尿酸を含む検体を測定した結果を示すグラフである。 図６は、本発明の一実施例におけるバイオセンサを用いて、尿酸を含む検体を測定した結果を示すグラフである。 図７は、作用極および対極からなるバイオセンサを用いて、アスコルビン酸を含む検体を測定した結果を示すグラフである。 図８は、本発明の一実施例におけるバイオセンサを用いて、アスコルビン酸を含む検体を測定した結果を示すグラフである。 図９は、本発明の一実施例におけるバイオセンサの作用極と対極間の測定結果を示すグラフである。 図１０は、本発明の一実施例におけるバイオセンサのブランク極と対極間の測定結果を示すグラフである。 図１１は、本発明の一実施例におけるバイオセンサの本測定方法による測定結果を示すグラフである。 図１２は、本発明の一実施例におけるバイオセンサからメンブレンを取り除いた際の測定結果を示すグラフである。 図１３は、本発明の一実施例におけるバイオセンサから密なメンブレンを粗のメンブレンに変更した際の測定結果を示すグラフである。 図１４は、本発明の一実施例におけるバイオセンサのスペーサ厚を大きくし、電極上とメンブレンの密着性を替えた際の測定結果を示すグラフである。
符号の説明
１：絶縁性支持体
２：リード線
３：絶縁層
４：対極
５：作用極
６：ブランク極
７：測定器接続部
８：スペーサ
９：酵素層
１０：血球分離膜
１１：不織布
１２：カバー
１３：検体投入口
実施形態
　以下、本発明のバイオセンサについて図面を参照して説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　図１は、本発明の一実施例のバイオセンサに用いられる電極構造の分解図である。図２は、本発明の一実施例のバイオセンサに用いられる電極ユニットを示す平面図である。図３は、図２に示す電極ユニットを用いたバイオセンサの分解図である。図４は、図２に示す電極ユニットを用いたバイオセンサを示す平面図である。
　本発明のバイオセンサＡは、図３及び４に示すように、絶縁性支持体１と、該絶縁性支持体１上に形成された複数のリード線２と、該リード線２にそれぞれ接続されている作用極５、対極４およびブランク極６からなる電極ユニットＢと、該電極ユニットＢに密着するように積層されているメンブレン積層体Ｃと、該メンブレン積層体Ｃを挟持するように該絶縁性支持体１０及び該リード線２上に載置されているスペーサ８と、該スペーサ８及び該メンブレン積層体Ｃを覆って載置されているカバー１２と、を具備し、前記作用極５上には、少なくとも被測定基質と反応する脱水素酵素および補酵素が固定化されており、前記メンブレン積層体Ｃは、電子メディエータを含む密な構造を有する第１のメンブレン１０及び該第１のメンブレン１０に密着して積層された緩衝成分を含む粗の構造を有する第２のメンブレン１１からなり、前記カバー１２には前記メンブレン積層体Ｃに対応する位置に検体投入口１３が設けられている。
　図１及び２に示すように、本発明のバイオセンサに用いられる電極ユニットＢは、長方形状の絶縁性支持体１、絶縁性支持体１の上に配設された３本のリード線２、リード線２を挟むように絶縁性支持体１上に設けられた、開口部３ａを有する長方形状の絶縁層３、絶縁層３の開口に合わせて設けられた２つの対極４、作用極５、ブランク極６とからなる。
　絶縁層３は絶縁性支持体１よりも短く構成されており、３本のリード線２は一方の端部を絶縁層３から露出させて幅広の測定部接続部７を形成している。３本のリード線のうち、中央のリード線２ｂは対極４に接続し、側方にある一方のリード線２ａは作用極５に接続し、他方のリード線２ｃはブランク極６に接続している。
　作用極５には基質と反応する酵素および補酵素が固定された酵素層９が設けられている。ブランク極６には基質と反応しない酵素および補酵素が固定されていてもよい。
　本発明のバイオセンサは、後述する実施例１及び２に記載の手順で組み立てることにより得ることができるが、リード線及び各電極は支持体上に印刷することにより形成することができる。ここで、印刷方法としては、スクリーン印刷に限定されることは特になく、その他グラビア印刷、オフセット印刷、インクジェット印刷等を用いることができる。
　本発明のバイオセンサは、基質濃度の測定に用いることができる。具体的には、検体投入口（図４の１３）から検体を投入した後、前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流から、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を引いて、基質の濃度を測定することにより基質濃度の測定を実施することができる。
　この際、前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定した後に、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定するのが好ましい。
　また、前記作用極と前記対極との間に印加する電位、及び前記ブランク極と前記対極との間に印加する電位は同じである。印加する電位は使用する電子メディエータにより任意であるが、実施例のＷＳＴ－１から生成されたホルマザンを使用した場合の印加電位は、３５０～５００ｍVが好ましい。
　以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］電極ユニットの作製
　以下のようにして図１に示す電極ユニットＢを作製した。
　ポリエステルフィルム（商品名「ポリエステルフィルムダイヤホイル」三菱化学ポリエステルフィルム（株）製）からなる絶縁性支持体１にスクリーン印刷により導電性銀インク（商品名「Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ　ＰＦ－８３６」ヘンケルテクノロジーズジャパン（株）製）をスクリーン印刷により所定形状に塗工し、８０℃で３０分加熱し硬化させてリード線２を形成した。
　リード線を形成した上から絶縁インク（商品名「ＪＥ－１０００Ｇ」ヘンケルテクノロジーズジャパン（株）製）をスクリーン印刷により所定形状に塗工し、約５００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ照射を行い硬化させて、絶縁層３を形成した。
　次に、銀／塩化銀インク（商品名「Ｅｌｅｃｔｒｏｄａｇ　ＰＥ－４０９」ヘンケルテクノロジーズジャパン（株）製）をスクリーン印刷し、８０℃で３０分加熱し硬化させて、対極４を形成した。
　さらに、カーボンインク（商品名「ＸＣ－３０５０」藤倉化成（株）製）をスクリーン印刷により塗工し、８０℃で３０分加熱し硬化させて、作用極５およびブランク極６を形成し、図２に示す電極ユニットＢを得た。
［実施例２］バイオセンサの作製
　次いで図３に示すバイオセンサを作製した。
　実施例１で作製した電極ユニットＢを露出させるように片面に粘着剤を有する厚みが０．４５ｍｍのスペーサ８（商品名「ＴＬ－８５シリーズ」リンテック（株）製）を貼り付けた。
　次に、作用極５上のみフェニルアラニン脱水素酵素：５０Ｕ／ｍＬ、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋）：１ｍＭ、ジアホラーゼ：５０Ｕ／ｍＬを混合した溶液を０．８μＬ滴下し、５０℃で５分間乾燥させ、酵素層９を形成した。
　別に、第１のメンブレンとして、ＷＳＴ－１（(株)同仁化学研究所製）を含む血球分離膜１０（商品名「Vivid Plasma Separation Membrane」ポール（株）製）と第２のメンブレンとして、炭酸緩衝剤（炭酸カリウム（和光純薬工業(株)製）および炭酸水素カリウム（和光純薬工業(株)製））を含む不織布１１（商品名「Ｔ－２５０」アドバンテック東洋（株）製、繊維密度５０ｇ／ｍ２）とからなるメンブレン積層体を作成した。得られたメンブレン積層体Ｃの第１のメンブレンがスペーサ８間に露出する各電極上に密着するように配置し、さらにスペーサおよびメンブレン積層体Ｃ上にカバー１２（商品名「ＴＬ－８５シリーズ」リンテック（株）製）の検体投入口１３が位置するように置き、ローラにより加圧して、メンブレン積層体Ｃの厚みを約８０％まで圧縮した状態で取り付け、図４に示すバイオセンサＡを得た。
　得られたバイオセンサを用いて種々測定を行った。以下に示す。
［実施例３］本発明のバイオセンサによる影響物質を含む検体での測定結果
（３－１）影響物質が尿酸である場合
　尿酸を含む検体を用いて、作用極および対極からなる従来のバイオセンサ（ＷＯ０２／１８９２４に記載のもの）により測定した結果を図５に、実施例２で作製した本発明のバイオセンサにより測定した結果を図６に示す。
　従来のバイオセンサに尿酸を含む検体を挿入し、２９７秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加して、３秒後の応答電流値を測定した。
　また、本発明のバイオセンサに尿酸を含む検体を挿入し、２９０秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。さらに４秒後に対極（銀／塩化銀）を基準にブランク極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。作用極と対極間の電位印加で得られた応答電流値からブランク極と対極間の電位印加で得られた応答電流値を引くことにより、本発明のバイオセンサの応答電流値を求めた。
　従来のバイオセンサでは、尿酸濃度の増加と共に応答電流値の値が増える結果となったが、本発明のバイオセンサでは尿酸濃度が増加しても応答電流値は一定であり、安定して測定できたことが判る。
（３－２）影響物質がアスコルビン酸である場合
　さらに、同様な測定方法により、アスコルビン酸を含む検体を用いて測定を行った。従来のバイオセンサにより測定した結果を図７に、本発明のバイオセンサにより測定した結果を図８に示す。
　図７及び８に示す結果から明らかなように、尿酸の場合と同様に従来のバイオセンサではアスコルビン酸濃度の増加と共に応答電流値の値が増える結果となったが、本発明のバイオセンサではアスコルビン酸濃度が増加しても応答電流値は一定であり、安定して測定できたことが判る。
　以上の結果から、本発明のバイオセンサを用いた場合、検体中に含まれる影響物質による測定に対する影響が除去でき、安定した測定が行えたことが判る。
［実施例４］バイオセンサによる基質（フェニルアラニン）濃度の測定結果
　実施例２で作製した本発明のバイオセンサの各基質濃度における作用極と対極間の応答電流値の結果を図９に、ブランク極と対極間の応答電流値の結果を図１０に、および作用極と対極間の応答電流値からブランク極と対極間の応答電流値を引いた結果を図１１に示す。
　本発明のバイオセンサに検体を挿入し、２９０秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。さらに４秒後に対極（銀／塩化銀）を基準にブランク極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。
　作用極と対極間の応答電流値は基質濃度の増加と共に応答電流値の値が増える結果が得られたが、ブランク極と対極間の応答電流値は基質濃度が増加しても一定となることが確認された。また、本発明のバイオセンサを用いた場合、基質濃度に対する応答電流値は比例関係があることが確認された。
　これは、作用極上で作製された反応生成物が作用極上の密なメンブレンに保持され、ブランク極上には移動していないためと考えられる。従って、ブランク極と対極間で得られる応答電流値は検体中に含まれる尿酸およびアスコルビン酸などの影響物質のみを測定しているため、安定に影響物質による影響の除去ができるものと考えられる。
［比較例１］メンブレンに関する検討結果
　検体に基質、ＷＳＴ－１および緩衝液を使用し、実施例２で作製した本発明のバイオセンサからメンブレン積層体Ｃを除いた比較用バイオセンサの各基質濃度におけるブランク極と対極間の応答電流値を測定した結果を図１２に示す。
　比較用バイオセンサに種々の基質濃度を含有する検体を挿入し、２９０秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。さらに４秒後に対極（銀／塩化銀）を基準にブランク極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。
　ブランク極と対極間の応答電流値は基質濃度が低い場合は、一定となったが、基質濃度が高い場合は、明らかに非常に高くなった。これは、メンブレンがない場合では、反応生成物の自由拡散によりブランク極にまで反応生成物が移動したため、ブランク極と対極間の応答電流値が上がったものと考えられる。
［比較例２］電極上に第２のメンブレンを密着させた際の測定結果
　実施例２で作製したバイオセンサにおける第１のメンブレンと第２のメンブレンとを逆転させて、第２のメンブレンを各電極に密着させた比較用バイオセンサを作成し、これに各基質濃度におけるブランク極と対極間の応答電流値を測定した結果を図１３に示す。
　比較用バイオセンサに種々の基質濃度を含有する検体を挿入し、２９０秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。さらに４秒後に対極（銀／塩化銀）を基準にブランク極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。
　ブランク極と対極間の応答電流値は基質濃度の増加と徐々に増えることを確認した。これよりメンブレンを使用することである程度までは自由拡散を抑えることができるが、密な構造を有する第１のメンブレンを密着させることにより、より反応物質の自由拡散を抑えることができることが判る。
［実施例５］密な構造を有するメンブレンの電極との密着性に関する検討結果
　実施例２で作製したバイオセンサにおけるスペーサの厚みを０．５５ｍｍに変更し、メンブレン積層体の各部材に対する密着性が低いバイオセンサを作製し、これの各基質濃度における作用極と対極間の応答電流値とブランク極と対極間の応答電流値を測定した結果を図１４に示す。
　本実施例のバイオセンサに種々の基質濃度を含有する検体を挿入し、２９０秒後に対極（銀／塩化銀）を基準に作用極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。さらに４秒後に対極（銀／塩化銀）を基準にブランク極と対極間に＋４００ｍＶの電位を印加し、３秒後の応答電流値を測定した。
　メンブレンを電極上に付着させることにより、自由拡散を抑えることができることを確認した。しかしながら、メンブレン積層体と他の部材との密着性を上げることで、より反応物質の自由拡散を抑えることができるものと考えられる。
　以上のことから、本発明のバイオセンサは、電極上にメンブレンを使用しているので、反応物質の自由拡散を抑えることができることが判る。さらに、電極上に密な構造を有する第１のメンブレンを密着させているので、より反応物質の自由拡散を抑えることができることが判る。また、作用極と対極との間の応答電流値からブランク極と対極との間の応答電流値をひくことにより、検体中の影響物質による影響も受けない測定が可能となることが確認された。

Claims (14)

  1. 　絶縁性支持体と、該絶縁性支持体上に形成された複数のリード線と、該リード線にそれぞれ接続されている作用極、対極およびブランク極からなる電極ユニットと、該電極ユニットに密着するように積層されているメンブレン積層体と、該メンブレン積層体を挟持するように該絶縁性支持体及び該リード線上に載置されているスペーサと、該スペーサ及び該メンブレン積層体を覆って載置されているカバーと、を具備し、前記作用極上には、少なくとも被測定基質と反応する脱水素酵素および補酵素が固定化されており、前記メンブレン積層体は、電子メディエータを含む密な構造を有する第１のメンブレン及び該第１のメンブレンに密着して積層された緩衝成分を含む粗の構造を有する第２のメンブレンからなり、前記カバーには前記メンブレン積層体に対応する位置に検体投入口が設けられている、バイオセンサ。
  2. 　前記の第１のメンブレンは平均孔径１０μｍ以下の孔径の細孔を有する多孔質メンブレンであり、前記の第２のメンブレンは繊維密度２０～９０ｇ／ｍ２の繊維系メンブレンである、請求項１記載のバイオセンサ。
  3. 　前記作用極および前記ブランク極が、同一の導電性物質により構成されている、請求項１又は２記載のバイオセンサ。
  4. 　前記作用極および前記ブランク極は、同一の電極面積を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  5. 　前記ブランク極上に、前記作用極上で固定化される脱水素酵素とは異なる、前記基質と反応しない脱水素酵素および補酵素が固定化されている、請求項１～４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  6. 　前記作用極及び前記ブランク極上に更にジアホラーゼを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  7. 　前記電子メディエータがテトラゾリウム塩である、請求項１～６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  8. 　前記テトラゾリウム塩が２－（４－ヨードフェニル）－３－（４－ニトロフェニル）－５－（２，４－ジスルホフェニル）－２H－テトラゾリウム，１ナトリウムである、請求項７に記載のバイオセンサ。
  9. 　前記第１のメンブレンは、細孔密度が異なる非対称の構造を有する血球分離膜である、請求項１～８のいずれか１項記載のバイオセンサ。
  10. 　前記第２のメンブレンは、柔軟性を有する不織布である、請求項１～９のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  11. 　前記メンブレン積層体は、前記絶縁性支持体及び前記カバーとの間に圧縮されて挿入されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項記載のバイオセンサを用いる基質濃度の測定方法であって、前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流から、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を引いて、基質の濃度を測定することを特徴とする基質濃度の測定方法。
  13. 　前記作用極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定した後に、前記ブランク極と前記対極との間に電位を印加することにより生じる応答電流を測定することを特徴とする、請求項１２記載の測定方法。
  14. 　前記作用極と前記対極との間に印加する電位、及び前記ブランク極と前記対極との間に印加する電位が同じであることを特徴とする、請求項１２もしくは１３のいずれかに記載の測定方法。
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