JP2012078338A - フェニルアラニンまたはアラニンの電気化学的測定方法 - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
【解決手段】フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを固定化した作用極及び対極を有する電極系を含むPheまたはAlaセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法。以下の(1)〜(6)の工程を含む。
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターを酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する
【選択図】なし
Description
[1]
フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを固定化した作用極及び対極を有する電極系を含むフェニルアラニンまたはアラニンセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法であって、
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターを酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する
ことを含む前記測定方法。
[2]
工程(3)におけるプラス電位の印加は、前記測定液に含有されるアスコルビン酸の全量が酸化される条件で実施する、[1]に記載の方法。
[3]
工程(3)におけるプラス電位は、0.3〜0.5Vである、[1]に記載の方法。
[4]
酵素反応のための所定時間は、10〜60秒間である、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
工程(5)におけるプラス電位は、電子メディエーターの還元体を酸化するに適した電位から選択する、[1]に記載の方法。
[6]
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後0.1〜60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、[1]に記載の方法。
[7]
工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、[1]に記載の方法。
[8]
被検体である血液の量は0.2〜4μLの範囲であり、試薬液の量は0.3〜12μLの範囲である[1]〜[8]のいずれかに記載の製造方法。
被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製する。
前記測定液を前記電極系に供給する。測定液の電極系への供給方法は特に制限されていない。微量の血液サンプルでの測定が可能なセンサチップを用いる場合には、センサチップの先端に設けられた電極系に通じる導管に測定液を接触させることにより毛細管現象で、測定液がセンサチップ内部の電極系に導かれる。被検体である血液の量は、例えば、0.2〜4μLの範囲であり、試薬液の量は、例えば、0.3〜12μLの範囲とすることができる。
前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターを酸化する。この工程でのプラス電位の印加は、測定液に含有される血液に由来するアスコルビン酸の全量が酸化される条件で実施することが、フェニルアラニン濃度またはアラニン濃度を精度良く測定するという観点から適当である。プラス電位は、アスコルビン酸を酸化するという観点から0.3〜0.5Vの範囲であることが適当である。ここでのプラス電位は、対極に対する電位である。また、0.3〜0.5Vであれば、フェロセンメタノールなどの電子メディエーターも酸化されて酸化体とすることができる。酸化時間は、作用極の電極面積、測定液量、使用した血液量(アスコルビン酸量)等に応じて適宜決定できるが、例えば、20〜100秒間の範囲とすることができる。但し、この範囲に限定される意図ではなく、測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターのほぼ全量が酸化される条件であればよい。尚、アスコルビン酸及び電子メディエーターのほぼ全量の酸化とは、後の測定に大きな誤差を生じない範囲で、アスコルビン酸及び還元型の電子メディエーターが残存する場合を含むものである。
プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施する。酵素反応のための所定時間は、電極に固定化されている2つの酵素の量や比活性、さらには反応温度などを考慮して適宜決定できるが、例えば、10〜60秒間の範囲とすることができる。但し、この範囲に限定される意図ではない。
酵素反応のための所定時間経過後、電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定する。工程(5)におけるプラス電位は、電子メディエーターの還元体を酸化するに適した電位から選択する。上記のように酵素反応において、還元型の電子メディエーターが測定液中に蓄積する。また、メディエーターの還元に使用されなかった還元型ニコチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸も測定液中に蓄積(残存)する場合がある。
測定した電流値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニン濃度またはアラニン濃度を算出する。フェニルアラニン濃度またはアラニン濃度の算出は、電流値から直接求めることもできるが、電流値を積分して求めた電気量から求めることもできる。電流値から直接求める場合には、フェニルアラニン濃度またはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後0.1〜60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行うことが好ましい。前電解が例えば0.4V、60秒間のように十分であれば夾雑するアスコルビン酸の影響を受けることなく、プラス電位印加開始後0.1〜0.5秒の間に計測された電流値に基づくことで、速やかに精度良くフェニルアラニン濃度またはアラニン濃度を算出できる。また、例えばプラス電位印加開始後5秒後に計測された電流値に基づくことで、より広い濃度範囲で直線性の良い検量線を作成でき、さらに高精度にフェニルアラニン濃度またはアラニン濃度を算出できることからより好ましい。
(1)実験方法
酵素センサの試作のため、図1に示す作用極、対極、感知極をもつ新型金電極チップを用いた。先ず3.6mg/mLのPheDH/Tricine-KOH(pH8.9)溶液(PheDH)と3.6m/mLのDI/PB(pH 7.0)溶液(DI)の混合酵素溶液2μLを作用極上に滴下し、乾燥させることにより2つの酵素を物理吸着させた。次いで、この作用極が貼られた樹脂部(A)を、対極および感知極が貼られた樹脂部(B)に重ねて、35℃で加温し接合させることによって一体型の金電極酵素センサチップを作製した。
1)前電解時間の検討
前電解時間を10秒間とした場合及び前電解時間を60秒間とした場合について、AAを含有する場合としない場合について、電流値を図2-1に示す。ステップ後、0.1 秒後の電流値、0.2秒後の電流値、0.5秒後の電流値、20秒後の電流値をそれぞれ示す。また、各条件において、Pheを含まず、AAを含む測定溶液を用い、前電解時間を10秒間とした場合または前電解時間を60秒間とした場合の結果も併せて図2-1に示す。
ステップ後0〜5秒間の電流値を積分して、あるいはステップ後5〜35秒の間の電流値を積分した結果を図3に示す。前電解時間を60秒間とし、ステップ後0〜5秒間の電流値を積分した場合、AAの妨害を回避しつつPhe濃度を測定することができることが分かる。前電解時間を60秒間とし、ステップ後5〜35秒の間の電流値を積分した場合でも、AAの妨害を回避しつつPhe濃度を測定することができることが分かる。
種々の濃度のPhe(0〜1000μM)を含む擬似血漿サンプル(原液は200μMのアスコルビン酸と5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS溶液)に対する酵素センサチップのCA応答を図4に示す。図からわかるように、擬似血漿中のPhe濃度の増加に伴い酸化電流の増加が観測された。0.4 Vへの第2ステップ後0.5秒後における酸化電流値を読み取って作成したPheに対する検量線と第2ステップ後5秒後における酸化電流値を読み取って作成した検量線もあわせて示す。その結果、AA存在下においても50〜1000μMでフェニルアラニンの計測が可能であることが示された。
血液中のPheを実測した。実施例1における擬似血漿の代わりに血漿を用いて測定溶液を調製し、計測された電流値(ステップ後5秒で読み取り)あるいは電流積分値(ステップ後5〜10秒の間の電気量)の3回の測定結果の平均値から検量線によりPhe濃度を求めた。その結果、それぞれの検量線を用いた場合のサンプル血漿中のPhe濃度は、65μMおよび89μMと求められた。なお、同一血漿のPheをHPLC分析した結果は、69μMであった。
ヒト血漿サンプル(HS1と呼ぶ。コージンバイオより購入)を用いたPhe付加試験を行った。実験は、HPLC分析によりPhe濃度が既知のHS1溶液1mLに対してPhe 8.3 mgを加え混合し、HS1溶液を用いて100倍に希釈することでPheが500μM付加された血漿溶液を調製した(HS1+Pheと呼ぶ)。その後、NAD+、KCl、およびメディエーターである1-methoxy-PMSを溶かしたGlycine-KOH緩衝液 (pH 9.5)6μLに対して、限外ろ過フィルターを用いて遠心により除タンパク質処理をしたHS1+PheまたはHS1溶液を4μL取り、混合して測定溶液とした。この測定溶液を実施例1で用いたのと同様のセンサチップの先端から毛管現象により吸い上げ、感知極が通電により測定溶液の充填を感知したところで自動的に対極に対して作用極に0.4 Vの電圧を60秒間印加し、アスコルビン酸を完全に電解させると同時にメディエーターをすべて酸化状態にした。次いで0 Vで30秒間酵素反応を進行させた後、再度0.4 Vに電位ステップし5秒後の酸化電流を測定した。酸化電流の測定結果を図6に示す。
Claims (8)
- フェニルアラニン脱水素酵素またはアラニン脱水素酵素とジアホラーゼとを固定化した作用極及び対極を有する電極系を含むフェニルアラニンまたはアラニンセンサを用いて血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を測定する方法であって、
(1)被検体である血液を補酵素及び電子メディエーターを含有する試薬液と混合して測定液を調製し、
(2)前記測定液を前記電極系に供給し、
(3)前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、前記測定液に含有されるアスコルビン酸及び電子メディエーターを酸化し、
(4)プラス電位の印加を終了し、酵素反応を所定時間実施し、
(5)所定時間経過後、前記電極系の作用極にプラス電位を印加して、電流値を測定し、
(6)測定した電流値またはその積分値に基づいて前記被検体である血液中のフェニルアラニンまたはアラニン濃度を算出する
ことを含む前記測定方法。 - 工程(3)におけるプラス電位の印加は、前記測定液に含有されるアスコルビン酸の全量が酸化される条件で実施する、請求項1に記載の方法。
- 工程(3)におけるプラス電位は、0.3〜0.5Vである、請求項1に記載の方法。
- 酵素反応のための所定時間は、10〜60秒間である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 工程(5)におけるプラス電位は、電子メディエーターの還元体を酸化するに適した電位から選択する、請求項1に記載の方法。
- 工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後0.1〜60秒の範囲のいずれかの時間に計測される電流値に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。
- 工程(6)におけるフェニルアラニンまたはアラニン濃度の算出は、プラス電位印加開始後、60秒間に計測された全てまたは一部の電流値から求めた電気量に基づき、かつ予め作成した検量線を基準にして行う、請求項1に記載の方法。
- 被検体である血液の量は0.2〜4μLの範囲であり、試薬液の量は0.3〜12μLの範囲である請求項1〜8のいずれかに記載の製造方法。
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