TW584723B - Biosensor electrode mediators for regeneration of cofactors - Google Patents

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Gurdial S Sanghera
Jared L Watkin
Stephen Walters
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Description

584723 五、發明說明（l) 發明背景： 本發明係在電流分析之生物感測器之電極的共同範圍 内。更特定而言，本發明係在為了在這些電極中使用輔因 子的再循環，用來當作中介體之化合物的範圍内。 在許多具有臨床價值之受酶質，像是葡萄糖、D — 3_羥基 丁酸鹽、乳酸鹽、乙醇和膽固醇中，NAD—和nadp—依賴性 酵素是相當任人感興趣的。可藉著合併該類酵素，來設計 用來檢測這些受酶質和其他分析物的電流分析之電極，並 利用該電極經由還原之輔因居間的氧化作 用，來建立電的傳導。 NAD-和NADP-依賴性酵素通^是細胞内的氧化還原酶（EC 1· Χ· χ· X)。再根據該氧化還原酶在其上作用之受酶質捐贈 者的身份將其分類。例如，在受酶質内之⑶―〇H基團上作 用的氧化還原酶，被歸類為EC lel.x.x，而在受酶質之醛 或酮基團上作用的那些，則被歸類為EC i 2 χ χ。有些重 ，的分析物（例如葡萄糖、D —3—羥基丁酸鹽、乳酸鹽、乙 醇，膽固醇），是EC 1·ΐ·χ·χ酵素的受酶質。 ，化還原酶的種類1可根據該酵素所使用之受體的種 :員::。與本發明有關之酵素，有NAD+或NADp+作為受體， 並將其分類為EC 1·χ 1 x。产此祕a π ^ ^ m L ·Α·Χ ι^些酵素通常在其活性部位具 有硫氫基，並因此可被呈右於辟 」饭具有硫知-反應性、諸如碘乙酸鹽 之類的試劑不可逆地抑制。 人铷^^ 不可逆之抑制劑形成穩定的化 带Λ丘π社人甘&又妝暴酸殘基（例如半脱胺酸或Cys)
开/成/、^貝、，’口 σ ’其為酵辛竹爾I 哔京作用不可或缺的。例如，藉著碘
584723 五、發明說明（3) ________ 基、芳基、雜芳基威 是宫能基阶，其^和土電在一些案例令，X或γ可以 上。可以三ί墨底層之方式，將試驗試劑放置在带箱 該將試驗試劑網印在工作電極” 電絕緣载體，：！：m條感測器，其包括延長的 執道，以及-對電：具：；==:大體上平行的導電 迢上，一個電極可以是束考/反，以電連接到不同的軌 是工作電極。該元件亦可包括，而另一個電極可以 以包括放置在適當之處，^ 。再者，該元件更< 樣的獏。 樣^入電極之前過濾該試 感列器可額外地包括電絕新 成的聚合物，像是聚乙悚1、’ 、材貝的支撐條（例如合 中介體化合物可以是笨S:以^物的混合物）。 1，1 〇-啡啉苯醌、1，厂啡_ — 田、本g比的實例包括 在其他的具體實施例中，本太1 4,7〜啡啉笨醌。
器之電極條具有讀出。誃你二明的特徵為電流分析感測 式的支撐物，第一個導S讀出之可釋放附件形 元件以便與讀出連接；“ > 物延伸，並包括導電 在可與試樣混合物接觸之電^與2 一個導體接觸，並付 伸，並包括導電元件以便心：：導體沿著該支撐物延 二個導體接觸，並位在可斑二，，，參考/反電極與第 該條之活性電極包括具有ϋI二第二個導體接觸之處。 、 彳/、中之一的中介體化合物：
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五、發明說明（4) 本發明其他的具體實施例， 辅因子之間轉移居間電㈣方：特：二電極和终驗醢胺 輔因子依賴性酵素的存在下，使 雜匕括在菸鹼醯胺 其中該中介體化合物為醒型的化合物^合物的方法， 式與硫醇基團結合。該中介體北合物可，^以不可逆之方 香族壞中具有反應性之不飽和鍵結。^ 如，在相鄰芳 包括具有下式的那些： 心疋之中介體化合物
-啡啉 墨水包 ，以及 例如，該中介體化合物可以是〗，1〇〜啡啉笨 苯醌和4，7 -啡咐苯醌。 I、 在另外的具體實施例中，本發明之特徵 括菸鹼醯胺輔因子-依賴性酵素，菸驗^胺' Ep 具有下式其中之一的中介體化合物： g
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該中”體化合物可以是1，10i，L 笨醌和4, 7-啡啉苯醌。該3 ’本鼪’ 1，· ^以酵素可以疋例如酒精脫氫酶、乳 氫；播 丁酸鹽脫氫酶、葡萄糖~6_磷酸鹽脫
=類酶、曱駿脫氮酶、頻果酸脫氮酶，或I ^^基類固醇脫風酶。 ::另行定#，所有在本文±使用的技術和科學名詞， 句八有與热諳本發明所屬之技藝者一般瞭解的相同竟 雖然在實行或試驗本發明時可使用類似或與在本文^描成 的那些相同的方法和材料，但是在下文中將描述較佳^ ^ 法和材料。所有在本文中提及的出版物、專利申請案、 利、技術手冊和其他參考文獻，均合併於此以作為^考。 在有牴觸時，將對照本發明申請案，包括其定義。此外， 材料、方法和實例僅作為解釋之用，並非企圖加以限制。 新穎之中介體的優點，是它們在酵素中對活性部位之炉 醇基團無反應性。這改善了生物感測器電極的穩定性和^ 存壽命至料想不到的程度。再者，由於穩定性的結果，可 將酵素與該中介體一起併入印墨或劑量溶液中，有利於該 生物感測器的建構。使用不是酵素之不可逆抑制劑的中介 體’將導致在生物感測器製造期間，保留大部份的酵素^
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584723 五、發明說明（6) ------- 性。NAD-和NADP-依賴性脫氫酶酵素通常是昂貴和不穩 的，因此其穩定性的改善是非常令人想要的。 ^ 有利的是，在本文中揭示的化合物亦可用來當作中介 體，使辅因子NADH和NADPH與各式各樣的^㉑―或nadp— 2 性酵素偶聯；在免疫化學程序中作為抗原或抗體的標記；、 =及在其，電化學和生物電化學範圍中的應用。該^介體 需要低的氧化電位，以便在與NADH *NADPH反應之後再氧 化。當以全血測試時是特別有利的，其中來自卜源性電、、舌 化粒種（例如抗壞血酸、尿酸）之干擾的電位是特別高的 低電位是有利的，因為它可能免除了需要假電極以便移除 試，中的電活化粒種。再者，土介體的氧化天然形式可能 使月厅、電流降低，利用還原該中介體將可使其出現。 從下列的詳細說明中，本發明的其他特徵和優點將是 而易見的。 圖片簡述： 圖1為根據本發明一個具體實施例之電極條的剖視圖。 圖2為裝配好之電極條的代表。 圖3為關於印刷含有1，丨〇 —啡啉苯醌之電極，以微安培計 之電流對以mM計之NADH濃度的作圖。 圖4為關於印刷含有麥爾多拉（Meld〇la，s)藍之電極，以 微安培計之電流對以mM計之MADH濃度的作圖。 圖5為顯示在將H BDH與各種中介體一起培養之後，剩餘 之酵素活性（也就是按最初活性的百分比計）的柱狀圖。 圖6為關於印刷含有1，1 〇 —啡啉苯醌之電極，以微安培計
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第9頁 584723 五、發明說明（7) 之電流對以mM計之D-3-羥基丁酸鹽濃度的作圖，在4、14 和26週之後測試D-3-羥基丁酸鹽脫氫酶和NAy。 圖7為關於印刷含有麥爾多拉藍之電極，以微安择 電流對以mM計D-3-羥基丁酸鹽濃度的作圖，分別 週之後測試D-3-羥基丁酸鹽脫氫酶和NAy。 圖8為關於印刷含有丨，10-啡啉苯醌、葡萄糖脫 NAD之電極，在全血中測定對葡萄糖之反應的作風酶 發明說明 揭示一類由於其不能與硫醇不可逆結合而被選並 可用來作為NADH或NADPH中介體的化合物。這些中八 結構、f子和空間特性，使得玄們幾乎無法與；反應。 因為實際上從與NAD-和NADP-依賴性脫氫酶之活性部位。硫 乱基的不可逆結合作用中排除了這些中介體，所以^遏了 該酵素的失活和後續生物感測器之穩定性的喪失。 NADH和NADPH中介體可佶用女+ ,01 „ ^ 篮』使用於分析物之電流分析酵素感 測器的衣u中，其中該分析物是出現在該感測器中之 和nadp-、依賴性酵素的受酶質，像是在歐洲專利 號中描述的那些種類。因此，可以製造用來 析物之存在的電流分析酵素感測$，尤其是含水m =该忒樣可以是複雜的生物試樣，像是生物體液（例 喻^ l、血我或血清），且該分析物可以是天然存在的代 =例如葡萄糖、卜3_經基丁酸鹽、乙醇、乳酸鹽或 膽固醇）’或是被導入的物質，像是藥物。 對於電流分析之酵素感測器的製造特別有用的是，本
584723 五、發明說明（8) :更提供了含有在本文中揭示之_丑和⑽卿令介體的墨 本發明亦包括上文之中介體的任何前驅物 原（無色）形式，苴可就妯益益^ ^ 口物或還 ^ ^ , 八 就地精者乳化或分解作用，Μ燧岌知 對應的活性中介體。這類前 轉變為相 半硫代缩醛、m狀縮裕包括半縮醛、 ::代：除％狀縮醛、金屬鄰_苯醌複合物 形式、丙嗣加合物等等。 貝子化的 在表1中提供了可與新穎中介 制一覽表。 起便用之酵素的非限 表1 酒精脫氫酶 1.1.1.27 1.1.1.31 1.1.1.49 1.1.1.47 1.2.1.46 --—-- 1· 1· 1.37 .1.1.209 乳酸鹽脫 麵兔氫酶 參果酸鹽脫 氫酶 採用本發明之中介體的電漭八 驗元件，例如單_用、> 爪刀斤酵素感湏丨丨器a 工作電極，例：·=長條。可抛棄之4 1使用試 例如▼有式驗試劑，包括酵素，件可帶有 ' 於鹼醯胺辅因 Φ s 苐11頁 C:\1234\55406.ptd 584723 五、發明說明（9) 子（也就是，產生代表分析物含量之電流的本 發明中介體，以及參以/反電極。試驗試劑可以是在試驗 2件中與工作電極聯合的一或多層墨底層。因此，感測器 電極可以包括，例如藉著印刷、喷霧或其他適當的沉積技 術所形成的電極。 匕參照圖1和2，電極支撐物i，通常apvc、聚碳酸酯或聚 酯，或聚合物的混合物（例如瓦龍（Val〇x)，聚碳酸酯和聚 §旨的混合物）製成，支持三個導電碳墨印刷的執道2、3和 。印刷執道限定了工作電極5的位置，在其上沉積工作電 極墨水16，參考/反電極6、裝滿指示劑之電極7，以 觸器8、9和10。 一 ^別以銀/氣化銀顆粒執道u、12和13覆蓋導電執道的 、，長部份（增加執道12與參考電極6重疊的暴露面積14)， :利用一層忌水性的電絕緣材料“再覆蓋<
位置暴露出來，工作電極5、裝滿指示L ΙΓ/ Λ區8'9和1G°該忌水性的絕緣材制用來防 止紐路。因為該絕緣材料是忌水性的，其可用來限制 使其僅暴露在電極下。適當的絕緣 .· * 7 ^Sericol ϊ rp ^田旧七緣材枓為Ser i c ard，可購 ^Sencol Ltd. (Br0adstalrs，Kent，ϋκ)。 第個網層1 7、第二個絕緣層j 8、第二 個 絕緣層20和峨重疊在該忌水性絕緣 可將個別的墨水混合物塗抹在 如，非常接近連接第二個以 產生感測器，其能夠對少量的血液試樣，或其二ίί; 584723 五、發明說明（ίο) 效電極區5上的液體產生功能。該混合物最好是，但並非 絕對地，藉著網印塗抹在載體上。 一般而言，iNAD(P)-依賴性脫氫酶根據下式來催化反 應· M2+NAD(P)+ —R + NAD(P)H + H+ 其中RH2代表受酶質（分析物）且R為產物。在前進的反應過 程中，NAD(P)+(也就是NAD+或NADP+)被還原成NAD(p)H :適 當的電流分析感測器提供電化學中介體，其可再氧化 NAD(P)H ’藉此使NAD(P)再產生發生在電極處的再氧化 作用產生電流，其指示受酶質的濃度。 在一個具體貝施例中，提供乾式的感測器。該感測器包 括延長的電絕緣載體，在其上具有一對縱走的、^體i平 行的導電軌道，對每個軌道提供相同的末端，利用電連接 之方式讀出並供給電極，其中一個電極為參考/反電極， 而另-個是與試驗試劑在一起之工作電極：感測器可以電 絕緣載體材料的支撑條之形式建構，像是合成的聚合 (例如PVC、聚碳酸醋或聚醋，或聚合物的混合物，二瓦 ^ ’帶m極’在其末端之間切著導電軌道 如，电極可在載體條上，採用兩個並排的長 圖2所不（也就是電極14和16)。可將這類^ °° 3 滴試樣，像是全血覆蓋的目標區，；由- 需要，可使用非-長方形的區域（例如菱_ 1 :斤 如果 J如曼形、半圓形、圓形
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或三角形區域） 標區。 為了與液態試樣最適當地接觸而提供目 極載個電極，稱為參考/反電極和工作電 可像工作電極1描=電極，如假電極。這些其他的電極， 缺少一或多籍裘地調製（也就是與試驗試劑聯合），但是 提供更可靠的：：電=活性成份。M電極，例如，可以 電極之電荷，過工作電極之電荷減去通過假 反應。 時所传的電荷可能被認定是因為感興趣之 可在目標處或之卜担瓜Α 、 卢4 f ▲、 心供膜，以便完成過渡功能。例如， ^ 2 余之别從或邊中過濾血球細胞的膜。可 = 〗之/的可用實例包括Hemasep v，Cytosep和Hemadyne + a — 1〇rupp〇rt，Fort Washington，ΝΥ 11〇5〇)。另外 二可就地鑄造過濾或細胞分離膜。可藉著鑄造忌水性聚合 、像疋乙酸纖維素、聚乙烯醇縮丁醛和聚苯乙烯，及/ 或親水丨生聚σ物，像是羥丙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯醇和聚乙酸乙稀s旨。 在其他的具體實施例中，提供單獨使用的可抛棄式電極 條，以便附接在感測器系統之單獨讀出的電路組件上。該 條可檢測在液態混合物中代表分析物的電流。該條包括延 長的支撐物，適合以可釋放之方式附接在讀出的電路組件 上，第一個導線，沿著該支撐物延伸，並包括連接讀出電 路組件之導電70件；在該條上的工作電極，與第一個導線 接觸，並置於可接觸該混合物之處；第二個導線，沿著該
C:\1234\55406.ptd 第14頁 ^4723 五、發明說明（12) i樓Λ延：？括連接讀出電路組件之導電元件；以及來 Γ接觸之虑Λ第二個導電元件接觸，並置於與該混合 物接觸之處，且第二個導線如圖丨所示。 工作電極可包括在支撑物上的印刷層，而 2，二或=依賴性脫氯酶酵素，能夠催心 Ϊ 該：亦可包括相對應的於驗酿胺輔因 刪來轉移電子的本發明中介體表Ϊ 素和分析物1兩者之活性的電流。 代表酵 可將第一個導電元件和活性電極與 考/反電，關，出現在有H合區之電極個;;電广件和參 置，小侍足以被一滴血液或其他受^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 反應帶為5毫米平方，但亦可像2 5毫米=-那王 樣覆大盍’通㊉ 以電流分析檢測該酵素之活性 7 為 電極和參考/反電極的電路。 44樣Si k過活性 在本發明較佳的具體實施 素、於驗酿胺輔因子和中介使用番不僅包含酵 合劑之成份，並可引起工二配物，·包括填料和黏 中介體之氧化^ #周於作電極在以其中在測定期間發生 之感興趣的分析物濃度得 J:%對感測到 :極。這個概念在應用試“強表作 層穩定的反瘅層。e空致& 邗電極表面上提供一 體。因為該中介體萨荖：使用在試樣中屬於微溶性的中介 被還原，它：;;：：：：：：電=子和分析物的… 书接近電極表面之處，使得它能夠
584723 五、發明說明（13) 輕易地再氧化，而沒有明顯的沉澱喪失。該薄反應層的維 持亦容許在少量體積之全部試樣中發生全面的分析反應， 所以事實上所測得的是得自大量樣本之分析物流到該反應 層上的通量。 該反應層需要至少在經營可再現之動力測量的時間内維 持穩定。通常這類測定的時間範圍在大約5到6 〇秒之間， 雖然較長時間的穩定性是較佳的。通常，感興趣之可拋棄 式電極條是大量生產的，並因此想要與任何需要之特性有 關的女全界限，以便解釋在任何大量製造過程中的固有變 化。 可藉著填料和黏合劑的適當區合，來改良反應層的穩定 性。該層最好是充份地穩定，以便在感興趣之特定分析物 的整個濃度範圍内’在動力學測量中，得到接近直線的可 再現反應。例如，就酮體（以羥基丁酸鹽來測定）而言，將 是在大約1到8 mM之間，而就葡萄糖而言，將是在大約2到 4 0mM之間。 動力學的測量涉及該中介體在氧化狀態到還原狀態之間 的循環。該循環的速率，反映出在該試驗過程中觀察到的 電流’係依賴在試樣中分析物的濃度。分析物的濃度越 高’則在酵素氧化該分析物的過程中被還原的酵素輔因子 就越多。在再氧化辅因子時，中介體變成還原狀態，然後 在電極表面上再將其氧化。然而，因為它的溶解度非常 低’僅有少量的中介體立刻用來還原的輔因子反應。結 果’與還原辅因子反應，並在電極上再氧化的中介體，然
C:\1234\55406.ptd 第16頁 584723 五、發明說明（14) 後將會與進一步還原的辅因子反應，而這持續通過動力學 測量的過程。因此，還原辅因子之濃度越高（反映在試樣 中分析物的遭度越高），中介體循環的推動力就越大，因 此使該循環的速率就越高。 在:些案例中’輔因子亦可在動力學測量期間參與在氧 化狀怨和還原狀態之間的循環。這依賴是否一開始有足量 的輔因子出現，轉變所有在反應層中出現的分析物。如果 一，，只有不充份的辅因子存在，使氧化輔因子再生，它 將藉著再度變成還原&態而促進殘留在反應^令之任何分 析物的氧化作用。 而重要的特疋浪度之分数物，可再現地導致在動力 感興趣的濃度範圍内；；以=”，並在整個 .县拉a技ω L t號心者分析物之濃度單調地增 加，最好疋線性地增加（換句換說，信號是 的真函數）。這容許電極條的製 二析物展度 建立全面性的刻度校正，以、9疋的一批電極條 條中獲得任何的指定庐號，盥4在ί準试驗條件下，從指定 關連二因此、:在感興趣的濃度】；特= 號之分析物濃度以外的無法控制之變數B: 響信 信號可以是在試驗開始之後， =偎重要的。 流，或可以是在試驗開始之後，在一疋捋間内觀察到的電 的電流積分（本質上是在這樣一’段—^固定的期間内發生 著以試樣覆蓋工作電極和參考/反電 轉移的電荷）。藉 施加電位，來經營該試驗〔然後在一’然後在它們之間 又功間内觀察到流過 584723 五、發明說明（15) =電机。一旦將試樣覆蓋在電極上就強加電位，或是在短 的延遲之後強加，通常是大約3秒，以便確保藉著試樣 ，底地，潤電極。直到取得作為信號的電流或電流積分為 ^固疋時間，應該長得足以確保影響所觀察到之電流的 主要變數’是分析物之濃度。 J考電極/反電極可以是傳統的銀/氣化銀電帛，但也可 上像工作電極一樣。在—個具體實施例中，可利 和中水媒劑之黏合劑和填料中的適當酵素、辅因子 配物，來塗覆兩個分開的導電㈣，而產生 2時在：二塗膜不導電的這些案例t，例如當填料為非 脖覆蓋兩個魅。當將電位施加在-個 呈有像夫考收在另一個工作電極處釋放的電子，將 電田樣的功能。由於利用在其電極處之 單地變成還原狀態。， >考反電極的中介體將簡 劑和填料成份來調配工作電極，獲得產生 試樣與酵素、輔因… 依然與電極的緊;—亦活性的成份 並促進薄膜或薄層形二ΐ 代表為夕醣類，像是瓜耳樹膠、乂樣物貝的 ⑽)、聚乙稀::、乙= 纖維素叫乙稀基…_)。填料成份應為素顆二基
η十r? 第18頁 菜踢和黃色素。也有幫助的是通二:槐豆膠、角叉 M4723 五、發明說明（16) ::二對在測量中涉及的氧化還原反應在化學上是惰性 代矣W：且不溶於含水介f °它可以是導電的或不導電的。 ^的物質包括碳，$ f是以石墨、二氧化欽、石夕 戴土之形式。 生電極可藉著在含水媒劑中調配酵素、輔因子、中介 雷口劑及填料，並將其塗抹在具有導電執道之延長、 、，之載體上而便利地產生。可藉著諸如網印之類的印 发或其他適當的技術來應用該調配物。該調配物亦可包 他成份，如緩衝溶液，以便在加工期間保護酵辛，蛋 、古質穩定劑，以便保護酵素對抗變性作用，以及去沫劑。 這二額外的成份亦可對反應層致特性有影響。 估t ^電極通常具有在大約2到5 〇微来之間的乾厚度，較 劍、土疋在大約10到25微米之間。確實的乾厚度將依據塗抹 衣造工作電極之成份所使用的應用技術，而到某種的程 #。例如在大約1 Q到2 5微米之間的厚度，通常是使用網 然而，反應層的厚度不僅是工作電極之乾厚度的函數， 亦依賴該試樣對工作電極的影響。在含水試樣的案例中， 工作電極成份的調配物將影響該層表現之水攝取的程度i 、填=通常構成在大約20到30重量％的含水媒劑。其他^ ° 份的量通常低於大約1重量％的含水媒劑’並憑經驗調整， 以，達到想要的最終性質。例如，調整缓衝溶液和蛋白質 穩定劑的量’達到想要程度的殘餘酵素活性。關於此點，、 可使用較多的酵素和較少的穩定劑，或是較少的酵素和梦
C:\1234\55406.ptd 第19頁 584723 五、發明說明（17) 多的穩定劑，以便達到相同的最終程度之酵素活性。應調 整黏合劑和去沫劑的含量，得到就應用方法而言最適當的 黏度，較高的黏度適合網印，而較低的黏度適合凹版印 刷。 可根據表2來調製適當的含水墨水調配物，使去沫劑、 緩衝溶液、酵素活性促進劑和水保持平衡，調合1克的調 配墨水。 表2 酵素(像是葡萄糖脫氫酶或3-羥基丁酸鹽脫氫酶） 200至4000單位 菸鹼醯胺輔因子(像是NAD) 二 5至30重量％ 中介體(像是1，10-啡琳苯醌） 0.1至1.5重量％ 填料(像是超細的碳或二氧化鈦） 10至30重量°/〇 黏合劑（像是藻酸鹽或瓜耳樹膠） 0.01至0.5重量％ 蛋白質穩定劑（像是海藻糖或牛血清白蛋白） 0.01至2重量％ 可利用帶有各種時間延遲的循環伏安法，輕易地評估反 應層的穩定性。藉著將工作電極調配物暴露在含有相對上 較高濃度之分析物的試樣下，並使其接受度斷增加之電位 至最大值，然後不斷地降低電位至回到未施加電位，來評 估之。所得的電流增加至高峰值，然後減少，如同電壓連 續掃描。在將工作電極暴露於試樣下後，在各種延遲的期 間之後，經營這類的循環伏安法評估。在逐漸延長延遲時
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五、發明說明（18) 間的高峰電流中的變化，為反應層之穩定性的測量值。反 應層越穩定則高峰電流的降低就越少。 經營評估來比較根據本發明之教導來調製的工作電極， 和根據Geng等人，在Biosensors and Bi〇eiectr〇nics 第 II冊，第12號（1996)的第1267至1275頁之教導調製的„卫 作電極”。按照上文的教導，將代表本發明之工作電極調 製成帶有大約2 5重量％的填料（超細的碳）、黏合蛋白質 定劑和去沫劑，並按照Geng論文第1 2 67頁中的描迷來 '調%製 帶有高分子量聚（環氧乙燒）之代表Geng的工作電植。 個案例中，係在將工作電極暴露在2 OmM葡萄糖水溶液中^ 秒和6 0秒之後，以每秒5 0毫伏鞋之掃描速率昇高至 40 OmV，對銀/氯化銀參考電極，來施加電位。根據本發明 之調配物產生穩定的反應層，其中在60秒之後的高峰φ & 為在3秒後的6 0%，而根據Geng論文的調配物產生不穩定的 反應層，其中在60秒的暴露之後沒有可觀察的高峰電流。 這係歸因於電極的溶解，喪失試劑在大量的溶液中。個 別的伏安圖如下： 一應40一--------- 1 { I ! — 3s |； i -30 J /"X L—60s ! -20 j 1 ’ \ L 丨 ! -2b〇 ! r··· _ 一 ^=^200 400 600 帶有黏合劑和填料的調配物（本發明）
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计量器之特徵亦可以是自動 條的工具。例％，這 :、：疋不同分析物之試驗 路環來完成；每個環可“上夕個可印在試樣條上的電 如同在美國專利第5，1 26 03d:特徵來提供電阻， 描述。另外，亦弟4冊，第3至17行中的 他形狀；在該t的近端内切#JV字形刻痕或其 字形刻痕的：頻二#開關或光學檢測器可檢測每個v 改變12#的箱1、、'。其他的試驗條—類型辨認技術包括 光檢測器；並對試驗㈣i = 夠區別顏色範圍的 叶晋秀裎徂條磁條或其他標記，並對 Η ΐ器k供適當的讀取計劃。 個ΐ:=模產製試驗條的£例中，試驗條電極具有兩 聖，包括參考/反電極和工作電極。可由任何 緣表面的材料來製造載體’包括聚（乙稀氯）、聚 石:酸酯：聚酯、紙、卡紙紙板、陶瓷、陶瓷塗覆的金屬、 k些材料的混合物（例如聚碳酸酯和聚酯的混合物），或其 他絕緣的物質。 藉著諸如網印之類的沉積法，將導電墨水塗抹在載體 上。該層形成接觸區，其容許計量器與試驗條形成界面， 並在接觸點和出現在該條上的活性化學物質之間提供電 路。例如，該墨水可以是風乾的、以有機物為基底的碳混 合物。其他可供選擇的調配物包括以水為基底的碳墨水， 以及金屬墨水，如銀、金、鉑和把。其他乾燥或固化的方 法包括使用紅外線、紫外線和放射線-頻率的照射。 以含有銀/氣化銀混合物之有機溶劑為基底的墨水，來
C:\1234\55406.ptd 第23頁 584723 五、發明說明（21) 印刷形成參考/反電極的層。另外的參考配對包括Ag/AgBr 、Ag/Ag I和Ag/Ag20。印刷部份延伸至覆蓋延伸進入反應 帶之破印刷的中間執道。如果使該印刷的分離.部份延伸至 覆蓋另一個在反應帶以外之碳執道的部份，可用來降低每 個執道的總電阻。 可視需要印刷一層介電墨水，覆蓋大部份已經印好的碳 和銀/氯化銀層。在該案例中，兩區保持無遮蔽的，那就 是電接觸區和感測區，其將位於反應帶之下，如圖1和2中 所示。該印刷限定了反應帶的範圍，並保護暴露執道免於 短路。 關於工作電極，在反應帶中匕個導電執道的頂部上的限 定區中，沉積一或多種墨水至正確的厚度，以便沉積酵 素、輔因子和本發明之中介體。藉著網印可便利地進行 之。其他放置該墨水的方法包括注墨印刷、體積分配、照 相凹版印刷、苯胺印刷（f lexography)和凸版印刷。可視 需要將第二個部份具有活性的墨水沉積在第二個導電執道 上，形成假電極。 可視需要在墨水調配物中含有多醣類。適當的多醣類包 括瓜耳樹膠、藻酸鹽、刺槐豆膠、角叉菜膠和黃色素。墨 2亦可包括成膜劑；適當的成膜聚合物包括聚乙烯醇 VA)、聚乙烯吡咯、乙酸纖維素、cMC和聚（ 咬填料包括二氧化鈦、以1 土 j基〇 下列的疋實行本發明之解釋、而非限制的實例。 實例1 、
584723 五、發明說明（22) 中介體： 從Poly sciences, Inc·獲得半-ZnCl2鹽形式的麥爾多拉 監（Meldola s Blue)。從 Sigma 購得 2，6-二氯彀紛（1)(^1?) 和Tris緩衝溶液。從ICN Biomedicals, Ltd·提供的旋劑 來製備填酸緩衝之生理鹽水（PBS)溶液（Dulbecco，s配 方）。 從Toyobo Co·，Ltd·購得得自假單胞菌屬（pseud omonas sp·)之 D-3-羥基丁酸鹽脫氫酶;EC 1.1.1.30)。由 Boehringer Mannheim提供對-菸鹼醯胺腺嘌呤核苷酸 (NAD+)和D，L-3 -羥基 丁酸。 根據 Gillard 等人的方法（J·丕 hem. Soc. A，1 44 7-1 45 1 ，1 970 )來製備1，10-啡啉苯醌（i，10_Pq)。利用由Eckert 等人描述的程序（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 : 2533-2 536，1 98 2 )來合成1，7 -啡啉笨醌（1，7-PQ)。按照 Mullins 4 人的揭示（J. Chem. Soc·，Perkin Trans. 1， 7 5 - 8 1， 1 9 9 6 )，以新亞銅試劑之硝化作用副產物的形式來 合成2, 9 -二曱基-1，10 -啡啉苯醌（2, 9-Me2-l，10-PQ)。經 由改編自Surrey描述的方法（〇rg，Synth· Coll.第3冊， 編輯E.C· Horning, Wiley, New York，753-75 6 )的 1-甲 氧基啡啡之曱基化作用，來製備1 -曱氧基啡啡甲基硫酸酯 (Ι-MeO-PMS)。藉著按照 Yoshioka (Yakugaku Zasshi， 73 .23-25， 1953)之報告來修改的Wohl-Aue反應，合成i — 曱氧基啡哄。根據Car Is on的共同程序（J. Am. Che m.
Soc· 1 07 :479-48 5， 1 9 85)，經由4-甲基兒茶紛與鄰一四
D:\1234\55406.ptd 第25頁 584723 五、發明說明（23) 氣醌的氧化作用，來製備4-甲基-1,2 -苯醌（4 _Me-BQ)。按 照Goss 等人的報告（inorg· Chem· 24 : 4263-4267， 1985) ’從[Ru(bpy)2Cl2] (Strem Chemicals. Inc)獲得 1，10-PQ 複合物[Ru(bpy)2(l，i〇-pQ)](PF6)2。 製備卜Me-1，10-啡啉苯醌三氟曱烷磺酸酯— ι 1〇_pQ+ ): ? 在氮氣下’將三氟甲烧績酸酯（Aldrich)(l.〇毫升）加至 在無水二氯甲烧（25毫升）中之l，l〇-PQ(〇.5〇克，2.38毫莫 耳）溶液中。立刻發生沉澱，並攪拌所得的混合物2 4小 時。過濾接著以二氯甲烷沖洗，得到細粒黃色粉末狀之 l-Me-1，l〇-PQ+(〇· 65 克，73%)匕 在乾式條中評估作為NADH中介體之麥爾多拉藍和 1, 10-PQ ： 以3.5毫克/克的量’從含有nad(p)h中介體之有機碳墨 水來產製合併有1，1 0 — PQ和MB的網印電極。將固體中介體 作匕合到商業處理的碳墨水（Gwent Electronic Materials) 中。 在圖3中顯示在對抗印刷Ag/AgCl參考電極之+ 400 mV的平 衡電位下，利用在PBS中之含水NADH溶液（0-16. 7 mM)，來 測^含有1，1 〇 -p q之電極的劑量反應曲線。記錄〇 . 5 8 A mM NADH之斜率。在圖4中顯示在對抗印刷Ag/AgCl參考電 極之+1 OOmV的平衡電位f，利用含水的NADH溶液（〇 - 1 2. 4 )’來測試含有ΜB之電極的劑量反應曲線。觀察到增加 的 8. 48 A NADH 之斜率。
C:\1234\55406.ptd 第26頁 584723 五 、發明說明（24) 評估中介體對D-3-羥基丁酸鹽脫氫酶的抑制作用： 製備一系列共1 8種溶液（各2 · 5毫升），分別含有5 0單位/ I升HBDH，以及在Tris緩衝溶液（50 miM，ρΗ8·2)中之1·29 或2· 58毫克下列的NAD(P)H中介體·· ΜΒ、4 —Me-BQ、 1-MeO-PMS ^DCIP M,10-PQ M,7-PQ ^ 2, 9-Me2-1, 1 〇~PQ 、l-Me-l，l〇-PQ+和[Ru(bpy)2(l，i〇-pQ)](PF6)2。亦製備含 有酵素但沒有中介體的對照組溶液。在37 t下培養該溶液 〇,5小時，然後利用sigma Diagnostics D-3-羥基丁酸睦 工具組，在340毫微米處測定NADH(作成一式三份）。與^ =組相比較，加入中介體對測定速率的干擾程度，提供 中介體作為NADH之氧化劑之效边的定量測量。 '、 然^藉著在微量離dn(MillipQre)上， (名義上切開的分子量為：3 0,0 0 0 )過濾’再從n 中分離出酵素。將保留在濾器上的^ g '合文 液（"毫升）中，再利用緩衝溶 成一式三份）。藉著比較在過滹 知、 于、/合液（作 可定出任何共價及/或不可；= ;的測定結果， 影響。 」^口之中介體對酵素活性的 將在過濾之前和之後，對每插、、交 收集在表3中。 對母種-液之兩種測定的結果，
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對照組（無中介體） 過濾之前 過滹之後 1，10-PQ 0.167 0.149 0 160(%%) 1，7-PQ 0.155 0.115 V/. ± \J\J \ / 0 150(97%) MB 0.167 0.008 0. 02606%) 4-Me-BQ 0.170 0.005 0.007(4%) 1-MeO-PMS 0.150 0.009 0.071(47%) DCIP 0.150 : 0.104 0.085(57%) 2，9_Me2-1，10-PQ 0.197 0.189 n/a l-Me-l,10-PQ+ 0.197 0.150 0.185(94%) [Ru(bpy)2(l，10-PQ)](pf6)2 0.197 0.114 0.193(98%) 雖然這些結果證實啡啉苯醌與麥爾多拉藍和丨_Me0_PMS 相比較’是相對上較無能的NADH中介體（也就是測定速率” 在過濾之前π被壓低至較少的程度），但是在”過濾之後"， 對於含有1，10-PQ、1，7-PQ、卜MeO-1，10-PQ 或 [Ru(bpy)2(l，10-PQ)](pf6)2 之溶液，歸還了 90% 以上的原 始酵素活性。這並不包括MB、1-Me0-PMS、DCIP或4-Me-BQ 之案例。確實，笨醒中介體4_Me-BQ證實是最有效的抑制 劑，在，，過濾之後π僅有4%的原始活性殘留。因此，後四個 中介體使HBDH部份失活，而新近描述的中介體對酵素活
C:\1234\55406.ptd 第28貢 584723 五、發明說明（26) 性，有利地僅有少量或沒有影響。 每種中介體之殘留酵素活性的百分比，在圖5中以柱狀 圖表示，其顯示本發明之中介體，以黑柱表示，並非HBDH 的強抑制劑。相反的，MB、4-Me-BQ、1-MeO-PMS和DCIP全 部不可逆地抑制HBDH，並伴隨著有從43到9 6%之範圍的活 性喪失；這些結果在圖5中以灰柱表示。 實例2
在含有HBDH之乾式條中，評估麥爾多拉藍和i，i〇—pQ 由分別併入2· 4或4. 3毫克/克墨水之1，1 〇_pq或仙的含水 碳墨水，與酵素HBDH(120單位/克墨水）和NAD+(11〇毫克/ 克墨水）一起，來產製網印的t極。該墨水亦含有多酶黏 合劑。 在圖6中提供含有1，1 0 -PQ之電極的劑量反應曲線。在儲 存（3 0 °C，脫水乾燥）4、1 4和2 6週之後，在對抗印刷
Ag/AgCl參考電極之+ 400mV的平衡電位下，利用在pbs中之 含水的D-3 -經基丁酸鹽溶液（〇 —25mM)，來測試含有 1，1 0 - P Q之電極的劑量反應曲線。三個劑量反應全都是非〜 線性的’並在24mM D-3-羥基丁酸鹽之處，記錄在對準之 外的8 · 5 A電流。這證實脫水電極的反應，在至少2 β週之尸 仍是穩定的。 & 在圖7中提供含有MB之電極的劑量反應曲線。在儲存 C ’脫水乾燥）2至14週之後，在對抗印刷Ag/AgC1參考電 極之+1 OOmV的平衡電位下，利用在pBs中之含水的D —3—夠 基丁酸鹽溶液（〇-28mM)，來測試該電極的劑量反應曲線二。
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^反應曲線類似在圖4中的那些。在儲存2週之後，關於 =些電，，在24mM D-3-羥基丁酸鹽之處，記錄到8 ^之 机。幾乎與從含有丨，丨〇 —PQ之脫水條中獲得的反應相 .=結?證實諸如MB之類化合物能夠利用nam非常有效地 調節，藉著其抑制HBDH之事實，更勝過1，1〇_?卩。而且， 經由藉著MB使HBDH失活，連累了電極對D_3-羥基丁酸鹽反 $的穩定性。圖7顯示在1 4週的儲存之後，藉著大約7%不 被接納的邊緣而降低了這些電極的反應。 總括而t ’含有本發明之中介體的生物感測器電極顯示 至少26週的儲存之後，反應仍是穩定的。相反的，那些 合併傳統中介體的電極，像是MB，其為不可逆的酵素抑制 劑，顯示反應僅在1 4週的儲存之後便會減退。 實例3 在含有葡萄糖脫氫酶（GDH)的乾式條中評估丨，]^—PQ : 山由分別併入2· 4或4· 3毫克/克墨水之丨，1〇 —pQ或仙的含水 碳墨f，與酵素葡萄糖脫氫酶（12〇單位/克墨水）*nad+ (Π0毫克/克墨水）一起，來產製網印的電極。該墨水亦含 有多醣黏合劑。 在圖8中提供該電極之校準劑量反應曲線。利用含有範 圍在3· 3至26mM葡萄糖之生理濃度的全血來測試電極。維 ，對抗印刷Ag/AgCl電極之+50mV的平衡電極。電極產生在 葡萄糖範圍之上的線性反應。因此，其證實可使用本發明 之中介體來建造以特低應用電位來操作之在臨床上有用的
C:\1234\55406.ptd 第30頁 π4723 五、發明說明（28) 葡萄糖感測器 實例4 利用在圖1和2中#3日# 構築體，以及㈣二'::9有銀^化銀之參考/反電極的 作電極，來製借1根據表2之調配物來網印所製備的工 之超細碳在一個案例中，填料為25重量％ 這兩個崇如Φ在另—個案例中，填料為25重量％的鈦。在 NAD，中介L為Λ素為葡萄糖脫氫酶(GM)，輔因子為 t... —為1，1 〇-PQ，黏合劑為瓜耳樹膠，蛋白質稃定 為牛血清白蛋白(BSA)，且缓衝溶液為Tri“蛋二？ 二、猎f在參考/反電極到工作電極之間施加20OmV電位，來 f估這些電極條，同時以含水的葡萄糖溶液覆蓋兩種電 j :將在施加電位之後丨5至2〇秒時觀察到電流積分，並對 觉試溶液的葡萄糖濃度作圖。填充碳的調配物得到每mM葡 萄糖2. 6,庫侖的斜率，且χ軸截取―丨微庫侖，而填充鈦的 調配物得到每mM葡萄糖1 · 5微庫侖的斜率，且X軸截取〇. 6 微庫侖。作圖如下：
C:\1234\55406.ptd 第31頁 584723 五、發明說明（29) τι〇2碳調配物 50 ΟΛ,Ο一 ε i— hi I -1^-1 ο ο 20 [葡萄糖]，mM |
_ 一 - ···—·««·· ι· — · ·ι I- ······ ·ι— I ·· 1 .· ··—J 其他的具體實施例 “ 將明瞭已經描述本發明，連同其詳細說明一起，先前的 說明企圖解釋而非限制本發明之範圍。其他的觀點、優點 和修改亦在本發明的範圍内。
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584723 附頁 表3 中介體 測定速率（吸光度單位/分鐘） 對照組（無中介體） 過滤之前 過濾之後 1,10-PQ 0.167 0.149 0.160(96%) 1,7-PQ 0.155 0.115 0.150(97%) MB 0.167 0.008 0.026(16%) 4~M6~BQ 0.170 0.005 0.007(4%) 1-MeO-PMS 0.150 0.009 0.071(47%) DCIP 0.150 0.104 0.085(57%) 2, 9-Me2-1，10-PQ 0.197 0.189 n/a 1-Me-l，10-PQ+ 0.197 0.150 0.185(94%) [Ru(bpy)2(l,10-PQ)](PF6)2 0.197 0.114 0.193(98%) C:\1234\55406.ptd

Claims (1)

  1. 584723
    案號 87117181; / I*-- /φ 六、申請專利範圍 丨 1 · 一種單次使用極條，法附接崔1首器系 統的信號讀出電路組件上，以便檢測在含水試樣中代表分 析物的電流，該條包括： a) 延長的支撐物，具有大體上平坦的、平面的表面， 改裝成以可釋放之方式附接在該讀出電路組件上； b) 第一個導體，沿著該表面延伸，並包括連接該讀出 電路組件之導電元件； c )活性電極，在該表面上與該第一個導體接觸，該活 性電極包括菸鹼醯胺輔因子-依賴性酵素，菸鹼醯胺輔因 子，和具有下式之中介體化合物：
    其中X和Y可分別為氧、硫；Ri和R2可分別為具有1 個氮原子之6-員未經取代之苯基； 其中將該活性電極調製成帶有填料和黏合劑成 份，以便在以動力學模式進行測定時，使該電極對在1到 8mM之間的該分析物濃度得到單調的反應，其中在該測定 期間同時發生該中介體的氧化和還原作用； d)第二個導體，沿著該表面延伸，包括與該讀出電
    O:\55\55406-920314.ptc 第34頁 ^M723 案號 87117181
    六、申請專利範圍 路組件連接的導電元件； e)與該第二個導體接 f )將該導體分隔開， 含水試樣放置在該條上時 配置； 觸的參考/反電極； 使其不能以電接觸，並在將該 以不使其成為電接觸的方式來 反電極，使得兩者可 在該電極之間提供導 同 電 g )配置该活性電極和該參考/ 日f被一小滴遠含水試樣覆蓋，以便 通路。 2 · —種藉著N AD ( P )+依賴性酵素使在含水試樣中之分析物 接受氧化作用以測定其濃度之方法，包括： a)在NAD(P)+的存在下，利用NAD(P)+依賴性酵素將該 分析物氧化； b )利用具有下式之中介體，將藉著該分析物與 NAD(P)+依賴性酵素之反應所產生的NAD(P)H氧化：
    其中X和Y可分別為氧、硫；h和R2可分別為具有1 個氮原子之6 -員未經取代之苯基；且 c )在電極上施加電位，以便再氧化在氧化N A D ( P ) Η時
    O:\55\55406-920314.ptc 第35頁 584723 蠢 ι _案號87117181 f>年丫月曰 修正_ 六、申請專利範圍 被還原的中介體化合物，並觀察所得的電流， 其中有些中介體化合物藉著與NAD(P)H的反應而被還 原，而有些中介體化合物藉著在測量期間轉移電子至該電 極而被氧化，且在整個該測量期間該中介體化合物氧化的 速率，和結果觀察到所得的電流，與分析物在該試樣中的 濃度有單調的關係； 將該NAD (P)+依賴性酵素、NAD (P)+和中介體化合物， 與黏合劑和填料一起混合，已塗抹在該電極的表面上；及 在測量期間所觀察到的電流，與在試樣中之分析物 的濃度成線性關係。 3 .根據申請專利範圍第1項之電極條，其中該中介體化 · 合物為1，1 0 -啡啉苯醌。 4.根據申請專利範圍第3項之電極條，其中該辅因子-依 賴性酵素為葡萄糖脫氫酶。 5 .根據申請專利範圍第3項之電極條，其中該輔因子-依 ^ 賴性酵素為3 -羥基丁酸鹽脫氫酶。 - 6. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該中介體為 1，1 0 -啡啉苯醌。 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該輔因子-依賴 性酵素為葡萄糖脫氫酶。 8. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該輔因子-依賴4 性酵素為3 -羥基丁酸鹽脫氫酶。 9. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中所施加之電壓 為200mV或更低。
    O:\55\55406-920314.ptc 第36頁
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