ES2307400B1 - Sensor optico de glucosa basado en la deposicion de la enzima gdh (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima nad+ (nicotinamida adenina dinucleotico) en un soporte de fibra optica estrechada. - Google Patents
Sensor optico de glucosa basado en la deposicion de la enzima gdh (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima nad+ (nicotinamida adenina dinucleotico) en un soporte de fibra optica estrechada. Download PDFInfo
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Abstract
Sensor óptico de glucosa basado en la deposición
de la enzima GDH (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima NAD+
(nicotinamida adenina dinucleótido) en un soporte de fibra óptica
estrechada. El sensor de glucosa presentado consiste en la
deposición de la enzima GDH y NAD en el extremo de una fibra óptica
estándar mediante el método ESA. El extremo de la fibra óptica
puede estar estrechado para mejorar la sensibilidad del sensor.
Su funcionamiento se basa en la variación de la
potencia óptica a la salida de la fibra óptica cuando se produce
una reacción bioquímica originada por la presencia de glucosa en
disolución. Dicha variación puede provocar un aumento de absorbancia
o de fluorescencia según el rango de longitud de onda del
detector.
Description
Sensor óptico de glucosa basado en la deposición
de la enzima GDH (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima NAD+
(nicotinamida adenina dinucleótido) en un soporte de fibra óptica
estrechada.
La presente invención se puede incluir en el
sector de los sensores ópticos para la medida de glucosa, tanto
para su detección como para su cuantificación en disoluciones o
fluidos.
La fabricación y el desarrollo de sensores de
fibra óptica ha sido objeto de especial atención en los últimos
veinte años ["Optical Fiber Sensor Technology", K.T.V. Grattan
and B.T. Meggitt, Chapman & Hall Ed. 1-9, 1995;
"Optical Fiber Sensor Technology. Vol. 2: Devices and
Technology", K.T.V. Grattan and B.T. Meggitt, Chapman & Hall
Ed. 1-35, 1998; "Optical Fiber Sensor Technology.
Vol. 3: Applications and Systems", K.T.V. Grattan and B.T.
Meggitt, Kluwer Academic Publishers Ed. Pp 257-305,
1999; "Optical Fiber Sensor Technology. Vol. 4: Chemical and
Environmental Sensing", K.T.V. Grattan and B.T. Meggitt].
Los sensores basados en fibra óptica tienen la
ventaja de un pequeño tamaño, incluso por debajo de una micra
cuando se usa fibra estrechada, lo que permite realizar medidas
usando un volumen de muestra muy pequeño. Esto abre la posibilidad
de la medida de glucosa intracelular. ["Optochemical Glucose
Sensing in Volume Limited Samples", IEEE-LEOS
Vol. 12 Nr. 2 April 1998, Kerry P. McNamara and Zeev Rosenzweig].
También pueden ser aptos para la medida continua de glucosa en el
desarrollo de un páncreas artificial ["Continuous Subcutaneous
Glucose Monitoring in Diabetic Patients: A multicenter analysis"
Diabetes Care, Vol. 25, Nr. 2, Feb. 2002, 347-52,
Alberto Maran et al.].
Los sensores de glucosa construidos con fibra
óptica suelen estar basados en la deposición de una enzima sobre la
superficie de dicha fibra. Dicha enzima produce una reacción
bioquímica únicamente en presencia de glucosa y los cambios en la
absorbancia o fluorescencia generados por los productos de dicha
reacción sirven para medir la concentración de glucosa.
[Fluorescence-based glucose sensors, Biosensors and
Bioelectronics Volume 20, Issue 12, John C. Pickupa, Faeiza
Hussaina, Nicholas D. Evansa, Olaf J. Rolinskib and David J.S.
Birchb]. Generalmente se ha empleado la enzima glucosa oxidasa
(GOD) debido a sus buenas características en cuanto a estabilidad.
["Optochemical Glucose Sensing in Volume Limited Samples",
IEEE-LEOS Vol. 12 Nr. 2 April 1998, Kerry P.
McNamara and Zeev Rosenzweig]. Sin embargo, los sensores basados en
GOD pueden presentar sensibilidad cruzada con la concentración de
Oxígeno. ["A fast responding fibre optic glucose biosensor based
on an oxygen optrode". Biosens. Bioelectron.
1990;5(2):137-48. Schaffar BP, Wolfbeis
OS].
Mediante el uso de la enzima Glucosa
Deshidrogenasa se minimiza la sensibilidad cruzada con el oxígeno,
lo que da sensores más específicos. Varios sensores de fibra óptica
se han fabricado usando esta enzima ["Fiber-optic
biosensors - an overview" Anal. Bioanal. Chem. (2002)
372:664-682, María Dolores Marazuela, María Cruz
Moreno-Bondi; "A thermophilic apoglucose
dehydrogenase as a nonconsuming glucose sensor". Biochem.
Biophys. Res. Commun. 274, 727-731 D'Auria, S., Di
Cesare, N., Gryczynski, Z., Rossi, M., Lakowicz, J.R., 2000;
"Optical chemo- and biosensors for use in clinical
applications" Sensors and Actuators B 40 (1997)
71-77, C. Müller, B. Hitzmann, F. Schubert, T.
Scheper].
Los biosensores de segunda generación ["Second
generation biosensors", "Biosensors and Bioelectronics"
Volume 6, Issue 3, 1991, Pages 245-253. Frieder W.
Scheller, Florian Schubert, Barbara Neumann, Dorothea Pfeiffer,
Rainer Hintsche, Ina Dransfeld, Ulla Wollenberger, Reinhard
Renneberg and Axel Warsinke] consisten en dispositivos en los
cuales dentro de la capa sensible se depositan coenzimas y otros
reactivos junto a las propias enzimas. En este sentido, se han
construido sensores de segunda generación basados en tecnología
electrónica (sensores amperométricos) mediante la deposición de
capas finas sobre láminas de silicio o de otros metales
["Amperometric thin film biosensors based on glucose
dehydrogenase and Toluidine Blue O as catalyst for NADH
electrooxidation". Biosensors & Bioelectronics 10 (1995)
693-704 L.I. Boguslavsky, L. Geng, I.P. Kovalev,
S.K. Salmi, Z. Xu & T.A. Skotheim; "Amperometric biosensors
based on dehydrogenase/NAD and heterocyclic quinones",
Biosensors & Bioelectronics Vol. 11, No. 12, pp.
1267-1275, 1996, L. Geng, L. I. Boguslavskytt, I.
P. Kovalevt, S. K. Sahni, H. Kalash & T.A. Skotheimt;
"Polymeric biosensors based on oxidation of NADH" Biomedical
Engineering, Applications Basis Communications, vol. 4, n. 4, 25
Aug. 1992, p 384-8 Lan, H.L. Okamoto, Y.; Karan,
H.I.; Skotheim, T.A.].
La presente invención se refiere a sensores de
segunda generación, útiles para la detección y/o cuantificación del
nivel de glucosa en diversas disoluciones o fluidos, incluido
sangre, que consisten en dispositivos cuya composición está
comprendida por fibra óptica estrechada y una capa sensible donde
se depositan coenzimas (NAD^{+}) y otros reactivos junto a las
propias enzimas (GDH). Por lo tanto, los sensores de glucosa
referidos en la presente invención son sensores ópticos de segunda
generación a diferencia de los sensores de segunda generación
conocidos los cuales están basados en tecnología electrónica, es
decir, son sensores amperométricos.
El sensor de glucosa de la invención es un
sensor óptico en reflexión de segunda generación, no amperométrico,
basado en la disminución que experimenta la potencia óptica a la
salida de la fibra óptica cuando la coenzima depositada NAD+ se
reduce y se convierte en NADH. El NADH presenta alta absorbancia en
la parte ultravioleta del espectro, presentando un máximo a 340 nm
y fluorescencia con un máximo a 450 nm.
El sensor consiste en una fibra óptica,
recubierta de una capa sensible, la cual ofrece ventajas respecto a
los sensores amperométricos existentes en el estado de la técnica ya
que son inmunes a interferencias electromagnéticas, son seguros en
su uso "in vivo" porque son de naturaleza pasiva (no
conduce corriente eléctrica), la señal puede recorrer largas
distancias con muy bajas pérdidas, permite analizar volúmenes de
muestra extremadamente pequeños y muy localizados (se mide en la
punta de la fibra con un diámetro de micras). Sobre el extremo de
la fibra óptica se deposita mediante la técnica de
auto-ensamblado electrostático (ESA) [Multilayer
Thin Films, Wiley-VCH, 2003, G. Decher, J. B.
Schlenoff] una combinación de polianiones, policationes, enzima
(GDH) y coenzima (NAD+) (figura 1). El método ESA permite depositar
múltiples capas de espesores nanométricos optimizando el sensado
(sensibilidad o tiempo en respuestas), a diferencia de los métodos
utilizados en el estado de la técnica para el mismo propósito donde
solo se deposita una capa y, por lo tanto, no son tan sensibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
Representa el esquema de la cabeza sensora
utilizando fibra óptica estrechada con los parámetros de
interés.
- (1)
- Longitud del estrechamiento de la fibra óptica.
- (2)
- Capa sensible con GDH y NAD.
- (3)
- Fibra óptica.
- (4)
- Diámetro de la cintura de la fibra óptica estrechada.
- (5)
- Ampliación de la capa sensible.
- (6)
- Superficie de la fibra tratada.
- (7)
- PEI (Polietilenimina)
- (8)
- PSS (Poliestireno sulfonato)
- (9)
- GDH.
- (10)
- NAD+.
- (11)
- Espesor de la capa sensible.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Representa la estructura del sensor de glucosa
diseñado.
- (1)
- Zona estrechada de la fibra óptica.
- (2)
- Fibra óptica.
- (3)
- Acoplador UV 2x1.
- (4)
- Fuente de luz ultravioleta.
- (5)
- Detector óptico.
- (6)
- Procesador de señal.
- (7)
- Cubeta con solución de Glucosa.
\newpage
Figura
3
Representa la variación de la potencia óptica
recibida en el detector cuando se introduce en una cubeta con
glucosa en disolución 5 mM de un sensor típico: [PEI/PSS]5 +
[PEI/GDH+PEIINAD] 15.
- (1)
- Potencia óptica recibida (cuentas).
- (2)
- Tiempo (segundos).
- (3)
- Instante en que se produce la inyección de glucosa.
Puede observarse el cambio que experimenta la
potencia óptica a la salida de la fibra óptica cuando se inyecta
glucosa en una cubeta con una concentración de 5 mM.
El sensor de glucosa de la invención es un
sensor óptico en reflexión de segunda generación, no amperométrico,
basado en la disminución que experimenta la potencia óptica a la
salida de la fibra óptica cuando la coenzima depositada NAD+ se
reduce y se convierte en NADH. El NADH presenta alta absorbancia en
la parte ultravioleta del espectro, presentando un máximo a 340 nm
y fluorescencia con un máximo a 450 nm.
El sensor consiste en una fibra óptica,
recubierta de una capa sensible, la cual ofrece ventajas respecto a
los sensores amperométricos existentes en el estado de la técnica ya
que son inmunes a interferencias electromagnéticas, son seguros en
su uso "in vivo" porque son de naturaleza pasiva (no
conduce corriente eléctrica), la señal puede recorrer largas
distancias con muy bajas pérdidas, permite analizar volúmenes de
muestra extremadamente pequeños y muy localizados (se mide en la
punta de la fibra con un diámetro de micras). Sobre el extremo de
la fibra óptica se deposita mediante la técnica de
auto-ensamblado electrostático (ESA) [Multilayer
Thin Films, Wiley-VCH, 2003, G. Decher, J. B.
Schlenoff] una combinación de polianiones, policationes, enzima
(GDH) y coenzima (NAD+) (figura 1). El método ESA permite depositar
múltiples capas de espesores nanométricos optimizando el sensado
(sensibilidad o tiempo en respuestas), a diferencia de los métodos
utilizados en el estado de la técnica para el mismo propósito donde
solo se deposita una capa y, por lo tanto, no son tan sensibles.
El espesor de la capa sensible, figura 1 (11), y
por tanto de la cantidad de NAD+ y GDH depositadas, depende del
número de iteraciones del proceso de deposición. Dicho espesor está
en el rango de magnitud de nanómetros (10 nm-1000
nm) y éste depende de distintos parámetros fácilmente controlables
como la temperatura, PH, tiempos de inmersión, etc.
En la figura 2 se muestra el montaje
experimental en reflexión necesario para la medida de glucosa en
disolución, figura 2 (7), en la punta de fibra óptica, figura 2 (1).
La luz ultravioleta en el rango de 300-400 nm
necesaria para excitar el sensor se lanza desde una fuente UV
acoplada a fibra óptica, figura 2 (4). Esta fibra se conecta a uno
de los brazos de un acoplador UV 2x1 figura 2 (3). Dicha luz sale
por otro de los brazos del acoplador y llega a la cabeza sensora
figura 2 (1). Cuando tiene lugar la reacción enzimática se produce
un cambio en la potencia que retorna por la fibra figura 2 (2) y
que se puede medir con un detector óptico figura 2 (5). El detector
transforma la potencia óptica en una magnitud eléctrica que es
procesada mediante un computador, figura 2 (6).
La ecuación de Lambert-Beer se
emplea para cuantificar la concentración de glucosa ya que la
absorbancia que se produce en un determinado medio es proporcional a
la concentración. Tanto el rango como la sensibilidad pueden
modificarse estrechando el extremo de la fibra óptica así como
variando el número de capas de material sensible depositado.
Por lo tanto la presente invención se refiere,
en un primer aspecto, a un sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica y una capa sensible donde se deposita la
enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el método ESA.
En una realización preferida de la presente
invención se refiere a un sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica estrechada y una capa sensible donde de
deposita la enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el método ESA
donde el estrechamiento conseguido en la cintura de la fibra óptica
es menor a 200 micras.
Otro modo de realización de la presente
invención se refiere a un sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica estrechada y una capa sensible donde de
deposita la enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el método ESA
donde el estrechamiento conseguido en la cintura de la fibra óptica
está dentro del rango de 10-20 micras.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere al uso del sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica y una capa sensible donde se deposita la
enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el método ESA, para la
detección y/o cuantificación de los niveles de glucosa en una
disolución o fluido.
\newpage
Una forma preferida de realización de la
presente invención se refiere a un sensor óptico de glucosa, cuya
estructura comprende fibra óptica estrechada y una capa sensible
donde se deposita la enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el
método ESA para la detección y/o cuantificación de los niveles de
glucosa en una disolución o fluido donde el estrechamiento
conseguido en la cintura de la fibra óptica es menor a 200
micras.
Otro modo preferido de realización de la
presente invención se refiere al uso del sensor óptico de glucosa
cuya estructura comprende fibra óptica estrechada y una capa
sensible donde se deposita la enzima GHD y la coenzima NAD+
mediante el método ESA para la detección y/o cuantificación de los
niveles de glucosa en una disolución o fluido donde el
estrechamiento conseguido en la cintura de la fibra óptica está
dentro del rango de 10-20 micras.
Un tercer aspecto de la presente invención se
refiere a un método de detección y/o cuantificación de los niveles
de glucosa que comprende la aplicación de la fibra óptica,
correspondiente a un sensor óptico cuya estructura comprende fibra
óptica y una capa sensible donde se deposita la enzima GHD y la
coenzima NAD+ mediante el método ESA, en una disolución o
fluido.
Una forma preferida de realización de la
presente invención se refiere a un método de detección y/o
cuantificación de los niveles de glucosa que comprende la aplicación
de la fibra óptica, correspondiente a un sensor óptico cuya
estructura comprende fibra óptica estrechada en un rango inferior a
200 micras y una capa sensible donde se deposita la enzima GHD y la
coenzima NAD+ mediante el método ESA, en una disolución o
fluido.
El cuarto y último aspecto preferido de la
presente invención se refiere a un método de detección y/o
cuantificación de los niveles de glucosa que comprende la aplicación
de la fibra óptica, correspondiente a un sensor óptico cuya
estructura comprende fibra óptica estrechada donde el
estrechamiento conseguido en la cintura de la fibra óptica está
dentro del rango de 10-20 micras y una capa sensible
donde se deposita la enzima GHD y la coenzima NAD+ mediante el
método ESA, en una disolución o fluido.
En una realización preferida de la presente
invención el fluido en el que se realiza la detección y/o
cuantificación de los niveles de glucosa es un fluido biológico,
particularmente sangre.
Los ejemplos siguientes ilustran y apoyan la
invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la
misma.
La construcción del sensor de presión de fibra
óptica se lleva a cabo en cuatro etapas. Primero se realiza el
estrechamiento o adelgazamiento de una fibra óptica multimodo de
200 micras, figura 1 (1) y figura 2 (3). Para ello, se utiliza una
máquina empalmadora de fibra óptica Ericsson FSU 900 programada de
manera que las corrientes de fusión sean lentas y los tiempos de
fusión largos. Con ello se consigue que la fibra sea maleable y que
no se degrade por el calor. En este punto se procede al estiramiento
mecánico de la fibra para conseguir un adelgazamiento figura 1 (3).
La fibra óptica se estrecha desde su estado normal (200 micras)
hasta un diámetro en el rango de 10 - 20 micras. con un diámetro de
cintura entre 10 mm y 20 mm figura 1 (4). En segundo lugar se limpia
usando una solución de Acido sulfúrico y peroxido de hidrógeno
(70%/30%). En tercer lugar se deposita la capa de material sensible
usando la técnica de auto-ensamblado electrostático
(ESA). El número de iteraciones del proceso y los parámetros
característicos de las disoluciones (concentración, pH, temperatura)
determinan la cantidad de enzima y coenzima depositadas y por lo
tanto la sensibilidad y velocidad de respuesta del sensor. Por
último, la fibra se conecta a un espectrómetro comercial en el
rango espectral adecuado (figura 2).
En el presente ejemplo se procedió a la medición
en una cubeta, mediante un sensor típico: [PEI/PSS]5 +
[PEI/
GDH+PEI/NAD]15, de la variación de la potencia óptica recibida en el detector cuando se introduce en una cubeta glucosa en disolución 5 mM. La figura 3 ilustra este ejemplo y en ella se puede observar el cambio que experimenta la potencia óptica a la salida de la fibra óptica cuando se inyecta glucosa en una cubeta con una concentración de 5 mM.
GDH+PEI/NAD]15, de la variación de la potencia óptica recibida en el detector cuando se introduce en una cubeta glucosa en disolución 5 mM. La figura 3 ilustra este ejemplo y en ella se puede observar el cambio que experimenta la potencia óptica a la salida de la fibra óptica cuando se inyecta glucosa en una cubeta con una concentración de 5 mM.
Claims (10)
1. Sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica y una capa sensible donde se deposita la
enzima GHD y la coenzima NAD^{+}.
2. Sensor óptico de glucosa cuya estructura
comprende fibra óptica y una capa sensible donde se deposita la
enzima GHD y la coenzima NAD^{+}, según la reivindicación 1,
donde el depósito de la enzima GHD y la coenzima NAD^{+} se
realiza mediante el método ESA.
3. Sensor óptico de glucosa, según la
reivindicación 1 ó 2, cuya estructura comprende fibra óptica
estrechada donde el estrechamiento de la fibra óptica es menor a
200 micras.
4. Sensor óptico de glucosa, según la
reivindicación 3, cuya estructura comprende fibra óptica estrechada
donde el estrechamiento de la fibra óptica está dentro del rango de
10-20 micras.
5. Uso de un sensor óptico de glucosa cuya
estructura comprende fibra óptica y una capa sensible donde se
deposita la enzima GHD y la coenzima NAD^{+} para la detección
y/o cuantificación de los niveles de glucosa en una disolución o
fluido.
6. Uso de un sensor óptico de glucosa, según la
reivindicación 5, cuya estructura comprende fibra óptica estrechada
donde el estrechamiento de la fibra óptica es menor a 200
micras.
7. Uso de un sensor óptico de glucosa, según la
reivindicación 6, cuya estructura comprende fibra óptica estrechada
donde el estrechamiento de la fibra óptica está dentro del rango de
10-20 micras.
8. Método de detección y/o cuantificación de los
niveles de glucosa que comprende la aplicación de un sensor óptico
cuya estructura comprende fibra óptica y una capa sensible donde se
deposita la enzima GHD y la coenzima NAD^{+}, en una disolución o
fluido.
9. Método de detección y/o cuantificación de los
niveles de glucosa, según la reivindicación 8, que comprende la
aplicación de un sensor óptico cuya estructura comprende fibra
óptica estrechada donde el estrechamiento de la fibra óptica es
inferior a 200 micras.
10. Método de detección y/o cuantificación de
los niveles de glucosa, según la reivindicación 9, que comprende la
aplicación de un sensor óptico cuya estructura comprende fibra
óptica estrechada donde el estrechamiento de la fibra óptica está
dentro del rango de 10-20 micras.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602514A ES2307400B1 (es) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Sensor optico de glucosa basado en la deposicion de la enzima gdh (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima nad+ (nicotinamida adenina dinucleotico) en un soporte de fibra optica estrechada. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602514A ES2307400B1 (es) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Sensor optico de glucosa basado en la deposicion de la enzima gdh (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima nad+ (nicotinamida adenina dinucleotico) en un soporte de fibra optica estrechada. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2307400A1 ES2307400A1 (es) | 2008-11-16 |
| ES2307400B1 true ES2307400B1 (es) | 2009-09-30 |
Family
ID=39926839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200602514A Expired - Fee Related ES2307400B1 (es) | 2006-10-03 | 2006-10-03 | Sensor optico de glucosa basado en la deposicion de la enzima gdh (glucosa deshidrogenasa) y su coenzima nad+ (nicotinamida adenina dinucleotico) en un soporte de fibra optica estrechada. |
Country Status (1)
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|---|---|
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| US6736957B1 (en) * | 1997-10-16 | 2004-05-18 | Abbott Laboratories | Biosensor electrode mediators for regeneration of cofactors and process for using |
| RU2413002C2 (ru) * | 2004-12-13 | 2011-02-27 | Байер Хелткэр Ллк | Самостоятельно ограничивающие размер композиции и тестирующие устройства для измерения содержания анализируемых веществ в биологических жидкостях |
-
2006
- 2006-10-03 ES ES200602514A patent/ES2307400B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
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|---|---|
| ES2307400A1 (es) | 2008-11-16 |
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