JPH0695955B2 - 酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサ - Google Patents
酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサInfo
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- JPH0695955B2 JPH0695955B2 JP1218411A JP21841189A JPH0695955B2 JP H0695955 B2 JPH0695955 B2 JP H0695955B2 JP 1218411 A JP1218411 A JP 1218411A JP 21841189 A JP21841189 A JP 21841189A JP H0695955 B2 JPH0695955 B2 JP H0695955B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、試料を所定の酵素と接触させ、その蛍光スペ
クトルを蛍光励起の後に測定することにより、試料中の
酵素基質の濃度を測定する方法、及びその方法に用いる
光学センサに関する。
クトルを蛍光励起の後に測定することにより、試料中の
酵素基質の濃度を測定する方法、及びその方法に用いる
光学センサに関する。
酵素基質、例えばグルコースの測定は、これが糖代謝障
害（例えば糖尿病）の有無の判断に有益なことから、医
療診断における重要な役割を有している。また、グルコ
ースはバイオテクノロジーや食品産業の品質管理におい
てもしばしば測定される。現在のバイオリアクタは栄養
素、特にグルコースの連続的供給を必要とするからであ
る。このようにグルコースや他の酵素基質の濃度を連続
的かつ可逆的に測定するために、酵素基質センサが重要
な役割を果たす。例えば、信頼できるグルコースセンサ
は、人工膵臓の開発の成否にとっても大きな因子とな
る。
害（例えば糖尿病）の有無の判断に有益なことから、医
療診断における重要な役割を有している。また、グルコ
ースはバイオテクノロジーや食品産業の品質管理におい
てもしばしば測定される。現在のバイオリアクタは栄養
素、特にグルコースの連続的供給を必要とするからであ
る。このようにグルコースや他の酵素基質の濃度を連続
的かつ可逆的に測定するために、酵素基質センサが重要
な役割を果たす。例えば、信頼できるグルコースセンサ
は、人工膵臓の開発の成否にとっても大きな因子とな
る。
この種の測定方法は種々のものが公知であり、これらは
連続的な方法と非連続的な方法とに分けられる。非連続
的な方法は、試料を破壊して行われなければならず、生
体内での使用には適していない（強い酸またはアルカリ
の影響がある）といった欠点を有する。他の欠点とし
て、継続的なモニタを行うためには短い間隔毎に試料を
採取する必要がある。このような理由から、グルコース
濃度の連続的な測定が可能なセンサの開発の優先度が高
くなっている。かかるセンサは、大きくは、２つのグル
ープに分類される。つまり、電気化学的センサと光学バ
イオセンサである。
連続的な方法と非連続的な方法とに分けられる。非連続
的な方法は、試料を破壊して行われなければならず、生
体内での使用には適していない（強い酸またはアルカリ
の影響がある）といった欠点を有する。他の欠点とし
て、継続的なモニタを行うためには短い間隔毎に試料を
採取する必要がある。このような理由から、グルコース
濃度の連続的な測定が可能なセンサの開発の優先度が高
くなっている。かかるセンサは、大きくは、２つのグル
ープに分類される。つまり、電気化学的センサと光学バ
イオセンサである。
従来技術の概略は、H.D.F.ターナ、I.カループ、そして
G.ウィルソンによる「バイオセンサ：基礎と応用」（オ
ックスフォード大学出版、1987）に記載されている。こ
の文献から、グルコース（及び医療に関係する他の酵素
基質）のためのセンサが高い技術段階に達していること
がわかる。もちろん、電気化学バイオセンサは種々の欠
点を有する。最大の欠点の１つは、電解架橋が大変弱
く、これが継続的なドリフトの誘因となることである。
電気化学センサは試料室への電気接続を有するので、短
い距離でしか動作させることができない。又、生体内で
の測定においてリスクを伴う。バイオリアクタに用いる
場合の欠点として、電気化学センサは殺菌するのが難し
いという点もある。
G.ウィルソンによる「バイオセンサ：基礎と応用」（オ
ックスフォード大学出版、1987）に記載されている。こ
の文献から、グルコース（及び医療に関係する他の酵素
基質）のためのセンサが高い技術段階に達していること
がわかる。もちろん、電気化学バイオセンサは種々の欠
点を有する。最大の欠点の１つは、電解架橋が大変弱
く、これが継続的なドリフトの誘因となることである。
電気化学センサは試料室への電気接続を有するので、短
い距離でしか動作させることができない。又、生体内で
の測定においてリスクを伴う。バイオリアクタに用いる
場合の欠点として、電気化学センサは殺菌するのが難し
いという点もある。
近年、電気化学センサに代わるセンサが捜し求められ、
光学センサ、特に光ファイバを用いたセンサが注目され
ている。光学センサは、電気化学センサと異なり電極を
必要とせず、長い距離での光の伝達が可能であり、試料
対象との電気接続を行う必要がない。又、静電界や人体
の電位の影響を受けない。グルコースや他の酵素基質の
ための公知の光学センサは次の２つのタイプに分けられ
る。
光学センサ、特に光ファイバを用いたセンサが注目され
ている。光学センサは、電気化学センサと異なり電極を
必要とせず、長い距離での光の伝達が可能であり、試料
対象との電気接続を行う必要がない。又、静電界や人体
の電位の影響を受けない。グルコースや他の酵素基質の
ための公知の光学センサは次の２つのタイプに分けられ
る。
第１のタイプは、酵素による反応によってある種の物質
が生成され、これを変換素子によって検出するものであ
る。例えば、グルコースの酸化はグルコース酸化酵素
（GOD）によって次の化学反応で行われる。
が生成され、これを変換素子によって検出するものであ
る。例えば、グルコースの酸化はグルコース酸化酵素
（GOD）によって次の化学反応で行われる。
従って、酸素の消費、H2O2の生成、又はpH値の低下を測
定することによって、グルコース濃度を推定することが
できる。これらのパラメータは全てグルコース濃度の変
化に応じて変化するからである。消費された酸素を調べ
ることによるグルコースの測定のための理想的な構成
は、“Adv.Exp.Med.Biol.75,65"（1976）又はドイツ特
許公報第2,948,904号に記載されている。添加されたpH
指示薬の色変化の追跡による生成された酸（H+）の測定
に基づくグルコースセンサは、「分析生化学138,430」
（1984）に開示されている。生成されたH2O2の測定に基
づくグルコース連続測定センサは現在のところ知られて
いい。
定することによって、グルコース濃度を推定することが
できる。これらのパラメータは全てグルコース濃度の変
化に応じて変化するからである。消費された酸素を調べ
ることによるグルコースの測定のための理想的な構成
は、“Adv.Exp.Med.Biol.75,65"（1976）又はドイツ特
許公報第2,948,904号に記載されている。添加されたpH
指示薬の色変化の追跡による生成された酸（H+）の測定
に基づくグルコースセンサは、「分析生化学138,430」
（1984）に開示されている。生成されたH2O2の測定に基
づくグルコース連続測定センサは現在のところ知られて
いい。
グルコース濃度を測定するための他の原理は、アメリカ
特許公報第4,343,438号に記載された親和性センサによ
って示されている。これは、全種類の血しょう構成物の
ための光学センサであって、光ファイバの端部において
測定室のレセプタ側に拮抗結合した状態となっている。
拮抗配位子は蛍光試薬で標識付けられ（is labelle
d）、配位子の量に応じてこの室へ入り、これによって
光の吸収または蛍光放射が光ファイバを介して観察され
る。典型的な例として、コンカナバリンが固定化され、
蛍光試薬で標識付けられたデキストランがコンカナバリ
ンに結合される。グルコースが、標識付けられたデキス
トランを置換する状態になり、蛍光試薬で標識付けられ
たデキストランは光ファイバを介して検出され、蛍光強
度の上昇が観察される。
特許公報第4,343,438号に記載された親和性センサによ
って示されている。これは、全種類の血しょう構成物の
ための光学センサであって、光ファイバの端部において
測定室のレセプタ側に拮抗結合した状態となっている。
拮抗配位子は蛍光試薬で標識付けられ（is labelle
d）、配位子の量に応じてこの室へ入り、これによって
光の吸収または蛍光放射が光ファイバを介して観察され
る。典型的な例として、コンカナバリンが固定化され、
蛍光試薬で標識付けられたデキストランがコンカナバリ
ンに結合される。グルコースが、標識付けられたデキス
トランを置換する状態になり、蛍光試薬で標識付けられ
たデキストランは光ファイバを介して検出され、蛍光強
度の上昇が観察される。
上述した測定方法は、ワングサとアーノルドによって
「分析化学60,1080」（1988）に記載されており、特に
乳酸塩を測定するためのものである。乳酸塩は、乳酸塩
脱水酵素によりピルビン酸塩に変わり、酵素の結合して
いないNAD+は強蛍光性NADHに変わる。NADHの蛍光の増大
を測定することによって乳酸塩の濃度が測定される。も
ちろん、このセンサは種々の欠点を有する。最大の欠点
は、全てのNADが消費されると反応が完結するので、可
逆的でないことである。このため、常に新しいNAD+を供
給する必要がある。これはNADH固有の蛍光の測定に基づ
く全てのバイオセンサに共通する欠点である。
「分析化学60,1080」（1988）に記載されており、特に
乳酸塩を測定するためのものである。乳酸塩は、乳酸塩
脱水酵素によりピルビン酸塩に変わり、酵素の結合して
いないNAD+は強蛍光性NADHに変わる。NADHの蛍光の増大
を測定することによって乳酸塩の濃度が測定される。も
ちろん、このセンサは種々の欠点を有する。最大の欠点
は、全てのNADが消費されると反応が完結するので、可
逆的でないことである。このため、常に新しいNAD+を供
給する必要がある。これはNADH固有の蛍光の測定に基づ
く全てのバイオセンサに共通する欠点である。
さらに別な欠点として、NADHの蛍光を励起するためには
波長が350nmの紫外線が必要であり、グラスファイバや
プラスチックファイバがこの紫外線を十分に通さない。
そして、これに必要な光源は比較的高価である。
波長が350nmの紫外線が必要であり、グラスファイバや
プラスチックファイバがこの紫外線を十分に通さない。
そして、これに必要な光源は比較的高価である。
これまで述べた方法及びセンサは、非可逆的であるこ
と、比較的複雑なセンサ構造を必要とすること、酵素活
性層とpHオプトーデのような変換素子を備える必要があ
ること、そして、拮抗結合に基づくグルコースセンサの
ように複数種類の固定化を有する小さいが比較的複雑な
測定室を必要とすること等の欠点を有している。
と、比較的複雑なセンサ構造を必要とすること、酵素活
性層とpHオプトーデのような変換素子を備える必要があ
ること、そして、拮抗結合に基づくグルコースセンサの
ように複数種類の固定化を有する小さいが比較的複雑な
測定室を必要とすること等の欠点を有している。
そこで、本発明の目的は、試料中の酵素基質の濃度を測
定するための簡単な方法とその方法に用いる光学センサ
を提供することにあり、特に連続的にグルコースを測定
するための可逆的なセンサを提供することにある。
定するための簡単な方法とその方法に用いる光学センサ
を提供することにあり、特に連続的にグルコースを測定
するための可逆的なセンサを提供することにある。
上記目的を達成するために、本発明によれば、酵素基質
の濃度を連続的にそして可逆的に測定するためにフラビ
ン補酵素（FMN,FAD）を結合している酸素化酵素と酸化
酵素からなるグループから選択された酵素が用いられ、
このフラビン補酵素は、酵素基質によって還元され、且
つ、試料中に溶けている酸素分子によって酸化され、フ
ラビン補酵素の還元によって生じる固有の蛍光特性の変
化が測定される。
の濃度を連続的にそして可逆的に測定するためにフラビ
ン補酵素（FMN,FAD）を結合している酸素化酵素と酸化
酵素からなるグループから選択された酵素が用いられ、
このフラビン補酵素は、酵素基質によって還元され、且
つ、試料中に溶けている酸素分子によって酸化され、フ
ラビン補酵素の還元によって生じる固有の蛍光特性の変
化が測定される。
本発明による測定方法は、補助因子としてフラビンのグ
ループから選択された補酵素を有する酵素の蛍光が、酵
素反応の間に従来の学説とは異なる様子で変化し、これ
によってGODが蛍光を発しない、つまり酵素内のFADの蛍
光がタンパク質によって消されるという意外な観測結果
に基づいている。本発明による測定方法では蛍光強度の
減少または増大が起こる。この蛍光の変化は酵素の存在
下において完全に可逆性を有し、従って光学バイオセン
サのための直接的な光学的情報として利用することがで
きる。それゆえ酵素センサやpHセンサなどの変換素子を
用いる必要はない。さらにフラボタンパク質の励起波長
は一般に400〜500nmの範囲にあるので、通常のグラスフ
ァイバやプラスチックファイバを使用することができ
る。さらに、500nmを越える波長の放射により大きな変
位が得られるので、励起光と蛍光との光学的な分離が簡
単になる。
ループから選択された補酵素を有する酵素の蛍光が、酵
素反応の間に従来の学説とは異なる様子で変化し、これ
によってGODが蛍光を発しない、つまり酵素内のFADの蛍
光がタンパク質によって消されるという意外な観測結果
に基づいている。本発明による測定方法では蛍光強度の
減少または増大が起こる。この蛍光の変化は酵素の存在
下において完全に可逆性を有し、従って光学バイオセン
サのための直接的な光学的情報として利用することがで
きる。それゆえ酵素センサやpHセンサなどの変換素子を
用いる必要はない。さらにフラボタンパク質の励起波長
は一般に400〜500nmの範囲にあるので、通常のグラスフ
ァイバやプラスチックファイバを使用することができ
る。さらに、500nmを越える波長の放射により大きな変
位が得られるので、励起光と蛍光との光学的な分離が簡
単になる。
フラボ酵素の場合に酸化還元反応がフラビン補酵素に起
こることが知られている。フラビン補酵素としてフラビ
ンモノヌクレオチド（FMN）やフラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）を有する補酵素が挙げられる。酵素に
よる酸化の場合は補助因子が同時に還元された形に変化
し、この形は酸素（第２の基質）によって再び酸化され
た形に変化する。酸化された形から還元された形への変
化は蛍光特性の変化を伴い、これが分析情報として利用
される。
こることが知られている。フラビン補酵素としてフラビ
ンモノヌクレオチド（FMN）やフラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）を有する補酵素が挙げられる。酵素に
よる酸化の場合は補助因子が同時に還元された形に変化
し、この形は酸素（第２の基質）によって再び酸化され
た形に変化する。酸化された形から還元された形への変
化は蛍光特性の変化を伴い、これが分析情報として利用
される。
本発明の１つの実施態様として、グルコース濃度を測定
するためにフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を
有するグルコース酸化酵素が用いられる。
するためにフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を
有するグルコース酸化酵素が用いられる。
次の２つの化学反応式が２段階の反応を示している。
グルコース＋GOD−FAD → グルコノラクトン＋GOD−FADH2 GOD−FADH2＋O2 → GOD−FAD＋H2O2 さらに、本発明によれば、アルコール濃度を測定するた
めにフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を有する
アルコール酸化酵素を用いる方法やグルタミン酸濃度を
測定するためにフラビン補酵素を有するグルタミン酸酸
化酵素を用いる方法も可能である。
めにフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を有する
アルコール酸化酵素を用いる方法やグルタミン酸濃度を
測定するためにフラビン補酵素を有するグルタミン酸酸
化酵素を用いる方法も可能である。
本発明の測定方法は、FMNやFADが補酵素として生じ、試
料中に酸素があるような全ての酵素反応に適用すること
ができる。FMNとFADは、酸化酵素と酸素化酵素のグルー
プからなる酵素に存在していることが好ましい。このよ
うな酵素の典型的な例を以下に挙げる（酵素分類も付記
する）。
料中に酸素があるような全ての酵素反応に適用すること
ができる。FMNとFADは、酸化酵素と酸素化酵素のグルー
プからなる酵素に存在していることが好ましい。このよ
うな酵素の典型的な例を以下に挙げる（酵素分類も付記
する）。
グルコース酸化酵素（EC1.1.3.4） ガラクトーゼ酸化酵素（EC1.1.3.9） 乳酸塩酸化酵素（EC1.1.3.2） 乳酸塩モノ酸素化酵素（EC1.13.12.4） キサンチン酸素化酵素（EC1.2.3.2） アスパルテート酸化酵素（EC1.4.3.1） L-アミノ酸酸化酵素（EC1.4.3.2） ビリルビン酸化酵素（EC1.3.3.5） コレステロール酸化酵素（EC1.1.3.6） モノアミン酸化酵素（EC1.4.3.4） チアミン酸化酵素（EC1.4.3.6） 尿酸塩酸化酵素（EC1.7.3.3） 亜硝酸塩酸化酵素（EC1.8.3.1） チトクロム酸化酵素（EC1.9.3.1） リボ酸素化酵素（EC1.13.1.13） アルコール酸化酵素（EC1.1.3.13） そして、上記と同類の酸化酵素である。
酵素基質の濃度と蛍光強度との関係をプロットするとと
（第５図参照）、濃度がわずかに増えるだけで蛍光強度
が大幅に上昇する領域が認められる。従ってセンサはこ
の領域において感度が良い。本発明によれば、測定前に
試料に酸素を供給して酵素基質のわずかな濃度変化によ
って蛍光強度が大きく変化するような酸素濃度に設定さ
れる。この方法は、例えば、所定の濃度範囲において正
確な測定が必要であるバイオリアクタに応用することが
できる。
（第５図参照）、濃度がわずかに増えるだけで蛍光強度
が大幅に上昇する領域が認められる。従ってセンサはこ
の領域において感度が良い。本発明によれば、測定前に
試料に酸素を供給して酵素基質のわずかな濃度変化によ
って蛍光強度が大きく変化するような酸素濃度に設定さ
れる。この方法は、例えば、所定の濃度範囲において正
確な測定が必要であるバイオリアクタに応用することが
できる。
測定感度を制御するための別の方法として、センサの前
にいわゆる拡散フィルタを取り付けることができる。こ
うすれば、センサ内部では外部より小さい基質濃度にな
る。測定のための反応曲線の適切な領域の拡大がこれに
よって可能となる。
にいわゆる拡散フィルタを取り付けることができる。こ
うすれば、センサ内部では外部より小さい基質濃度にな
る。測定のための反応曲線の適切な領域の拡大がこれに
よって可能となる。
次に、本発明による酵素基質濃度の測定に用いる光学セ
ンサは、励起光及び蛍光を透過させる媒質部材の試料側
にセンサ層を固定化したものであって、その特徴は、前
記センサ層がフラビン補酵素と結合している酸素化酵素
と酸化酵素とからなるグループから選択された酵素を備
えることにある。
ンサは、励起光及び蛍光を透過させる媒質部材の試料側
にセンサ層を固定化したものであって、その特徴は、前
記センサ層がフラビン補酵素と結合している酸素化酵素
と酸化酵素とからなるグループから選択された酵素を備
えることにある。
この光学センサは種々の実施態様が考えられる。例え
ば、前記酵素を、分子量30,000以下の分子のみが通過可
能な膜により媒質部材に機械的に固定化された酵素ゲル
又は酵素溶液として備えることができる。機械的な固定
化は、ほとんどの酵素の分子量は60,000以上であるの
で、例えば、分子量30,000以下の分子のみが通過可能な
セルロース膜を用いて酵素を留めることによって可能と
なる。
ば、前記酵素を、分子量30,000以下の分子のみが通過可
能な膜により媒質部材に機械的に固定化された酵素ゲル
又は酵素溶液として備えることができる。機械的な固定
化は、ほとんどの酵素の分子量は60,000以上であるの
で、例えば、分子量30,000以下の分子のみが通過可能な
セルロース膜を用いて酵素を留めることによって可能と
なる。
他の実施態様として、前記酵素をヒドロゲルまたはポリ
アクリルアミドからなるセンサ層に供えさせることがで
きる。この場合、酵素はゲル内に埋設されて物理的に固
定化される。
アクリルアミドからなるセンサ層に供えさせることがで
きる。この場合、酵素はゲル内に埋設されて物理的に固
定化される。
又、酵素を媒質部材の表面に化学的な固定化により結合
することも可能である。化学的な固定化は、例えばイオ
ン内在膜への結合により、あるいは交差架橋された血清
アルブミンのような物質やセルロース又はポリアミドの
ような膜への共有結合により静電的方法によって行うこ
とができる。
することも可能である。化学的な固定化は、例えばイオ
ン内在膜への結合により、あるいは交差架橋された血清
アルブミンのような物質やセルロース又はポリアミドの
ような膜への共有結合により静電的方法によって行うこ
とができる。
このようにして、FMNやFADを含有する酵素は固体媒質部
材の表面に塗布され、又は物理的・化学的に固定化され
る。酵素層が試料に面し、蛍光の励起や吸収はこの透明
な固体媒質部材の背面から検出される。試料の自己蛍光
による干渉を避けるために、酵素を含有するセンサ層の
表面を光学的に不透明で且つ測定する基質に対しては透
過な物質で覆うこともできる。このような物質として、
例えば、活性炭で黒く染色されたヒドロゲルがある。例
えばアルコールのような揮発性の酵素基質の場合は、黒
いテフロンやシリコーンのような疎水性の膜で覆うこと
も可能である。
材の表面に塗布され、又は物理的・化学的に固定化され
る。酵素層が試料に面し、蛍光の励起や吸収はこの透明
な固体媒質部材の背面から検出される。試料の自己蛍光
による干渉を避けるために、酵素を含有するセンサ層の
表面を光学的に不透明で且つ測定する基質に対しては透
過な物質で覆うこともできる。このような物質として、
例えば、活性炭で黒く染色されたヒドロゲルがある。例
えばアルコールのような揮発性の酵素基質の場合は、黒
いテフロンやシリコーンのような疎水性の膜で覆うこと
も可能である。
最後に、酵素を光ファイバの端部に直接的に固定化して
もよい。
もよい。
〔実施例〕 以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
第１図及び第２図は本発明に係る光学センサの２つの典
型的な実施例を示している。これらの図において、１は
担体部材としてのアクリル板、２は励起光、３は螢光を
それぞれ示している。
型的な実施例を示している。これらの図において、１は
担体部材としてのアクリル板、２は励起光、３は螢光を
それぞれ示している。
第１図に示した実施例ではセンサ層４は担体部材１の試
料側の凹部５に酵素Ｅと共に配置され、酵素を通過させ
ない膜６によって機械的に固定化された酵素溶液または
酵素ゲルとして構成されている。膜６は担体部材１の側
面９に形成された溝８に係合するオーリング７によって
担体部材１に固定されている。
料側の凹部５に酵素Ｅと共に配置され、酵素を通過させ
ない膜６によって機械的に固定化された酵素溶液または
酵素ゲルとして構成されている。膜６は担体部材１の側
面９に形成された溝８に係合するオーリング７によって
担体部材１に固定されている。
第２図に示した光学センサは担体部材１の試料側の面10
に酵素膜11からなるセンサ層４を備えており、この膜11
は第１図と同様の方法で担体部材１に固定されている。
酵素Ｅは膜11の表面または内部に固定化されている。
に酵素膜11からなるセンサ層４を備えており、この膜11
は第１図と同様の方法で担体部材１に固定されている。
酵素Ｅは膜11の表面または内部に固定化されている。
第３図ａ〜ｂは光ファイバの端部12を担体部材１として
利用した光学センサの３種類の構成例を示している。図
中、13は光ファイバのコア、14はその被覆層を示す。第
3a図の構成では、酵素はオーリング７で光ファイバの端
部に固定された酵素膜11に存在する。第3b図の構成では
酵素溶液または酵素ゲルが光ファイバ端部に形成された
凹部５に透析膜６及びオーリング７を用いて固定されて
いる。第3c図の構成では酵素Ｅは光ファイバの端部15に
直接固定化されている。
利用した光学センサの３種類の構成例を示している。図
中、13は光ファイバのコア、14はその被覆層を示す。第
3a図の構成では、酵素はオーリング７で光ファイバの端
部に固定された酵素膜11に存在する。第3b図の構成では
酵素溶液または酵素ゲルが光ファイバ端部に形成された
凹部５に透析膜６及びオーリング７を用いて固定されて
いる。第3c図の構成では酵素Ｅは光ファイバの端部15に
直接固定化されている。
他の実施態様として、酵素を光ファイバの端面に固定化
するのではなく、光ファイバ端部領域の保護層及び被覆
14を取り除いてからコアの外周面に固定化してもよい。
この場合、いわゆるエバネッセント波が利用される。つ
まり、光ファイバの境界面で全反射が起こるときに、屈
折率が小さい媒質側に僅かに進入して境界面に沿って進
み急激に減衰する電磁波を用いて測定される。この電磁
波の侵入領域内で酵素の螢光が励起される。その螢光が
光ファイバを介して反対側の端部で検出される。
するのではなく、光ファイバ端部領域の保護層及び被覆
14を取り除いてからコアの外周面に固定化してもよい。
この場合、いわゆるエバネッセント波が利用される。つ
まり、光ファイバの境界面で全反射が起こるときに、屈
折率が小さい媒質側に僅かに進入して境界面に沿って進
み急激に減衰する電磁波を用いて測定される。この電磁
波の侵入領域内で酵素の螢光が励起される。その螢光が
光ファイバを介して反対側の端部で検出される。
第４図に示された測定システムにおいて、テストポイン
トＰには第３図に示した光学センサが備えられている。
一端側12に光学センサを備える光ファイバの他端側は二
股状に分岐している。分岐した一方の第１光ファイバ18
は、波長が350〜500nmの励起光を供給する光源16及び励
起光の帯域を制限する光学フィルタ又はモノクロメータ
17に接続されて光学センサに励起光を伝える。他方の第
２光ファイバ19は、モノクロメータ20及び光検出器21に
接続され、光学センサの酵素から放射された螢光を光検
出器21に送る。さらに、光検出器21の出力信号の増幅器
22と、これに接続される表示ユニット23または評価装置
とが設けられて測定システムが構成されている。
トＰには第３図に示した光学センサが備えられている。
一端側12に光学センサを備える光ファイバの他端側は二
股状に分岐している。分岐した一方の第１光ファイバ18
は、波長が350〜500nmの励起光を供給する光源16及び励
起光の帯域を制限する光学フィルタ又はモノクロメータ
17に接続されて光学センサに励起光を伝える。他方の第
２光ファイバ19は、モノクロメータ20及び光検出器21に
接続され、光学センサの酵素から放射された螢光を光検
出器21に送る。さらに、光検出器21の出力信号の増幅器
22と、これに接続される表示ユニット23または評価装置
とが設けられて測定システムが構成されている。
光源としては、ハロゲンランプ、キセノンランプ（パル
ス駆動又は連続駆動される）、発光ダイオード、レー
ザ、金属蒸気ランプが挙げられる。光学フィルタとして
は、干渉フィルタ、エッジフィルタ、プリズム、あるい
は格子モノクロメータが適している。光ファイバとして
は、破損の危険が少ない点からはプラスチック製のもの
が好ましいが、ガラス製のものも用いられる。一本のフ
アイバに限らず、複数のファイバの束を用いることもで
きる。励起光と螢光との分離は公知の方法で行われる。
ス駆動又は連続駆動される）、発光ダイオード、レー
ザ、金属蒸気ランプが挙げられる。光学フィルタとして
は、干渉フィルタ、エッジフィルタ、プリズム、あるい
は格子モノクロメータが適している。光ファイバとして
は、破損の危険が少ない点からはプラスチック製のもの
が好ましいが、ガラス製のものも用いられる。一本のフ
アイバに限らず、複数のファイバの束を用いることもで
きる。励起光と螢光との分離は公知の方法で行われる。
センサから放射された光は、本来の螢光のみならず励起
光（散乱光）をも含んでいる。何ら有益な分析情報を含
まない散乱光と測定すべき螢光とを分離するために適当
なフィルタが用いられる。例えばモノクロメータ、２色
フィルタ、または急勾配エッジフィルタである。光検出
器としてはフォトダイオード、フォトトランジスタ又は
フォトマルチプライヤが挙げられる。
光（散乱光）をも含んでいる。何ら有益な分析情報を含
まない散乱光と測定すべき螢光とを分離するために適当
なフィルタが用いられる。例えばモノクロメータ、２色
フィルタ、または急勾配エッジフィルタである。光検出
器としてはフォトダイオード、フォトトランジスタ又は
フォトマルチプライヤが挙げられる。
第５図はグルコース濃度〔mM〕に対する螢光強度Ｉを示
しており、この関係は第１図によるセンサを用いて、pH
＝７、温度22.5℃の条件で測定された。二種類の酸素濃
度について測定され、曲線ａは試料溶液が空気で飽和さ
れた状態、曲線ｂは酸素7.88％を含む窒素との混合ガス
で飽和された状態を示す。
しており、この関係は第１図によるセンサを用いて、pH
＝７、温度22.5℃の条件で測定された。二種類の酸素濃
度について測定され、曲線ａは試料溶液が空気で飽和さ
れた状態、曲線ｂは酸素7.88％を含む窒素との混合ガス
で飽和された状態を示す。
第６図は、図１に示した構造を有するグルコースセンサ
の時間と共に変化するグルコース濃度に対する典型的な
応答を示している。この測定はpH＝７、温度22.5℃、空
気による飽和の条件で行われた。
の時間と共に変化するグルコース濃度に対する典型的な
応答を示している。この測定はpH＝７、温度22.5℃、空
気による飽和の条件で行われた。
第７図は、グルコース濃度〔mM〕に対するグルコースセ
ンサの出力ピーク積分（ピークインテグラル）PIを示し
ている。測定は、第１図の構造のセンサを用いて試料溶
液を試料室に65秒貫流させ、pH＝７、温度22.5℃、空気
飽和の条件で行われた。
ンサの出力ピーク積分（ピークインテグラル）PIを示し
ている。測定は、第１図の構造のセンサを用いて試料溶
液を試料室に65秒貫流させ、pH＝７、温度22.5℃、空気
飽和の条件で行われた。
以上のまとめとして、本発明による光学バイオセンサは
以下の点で従来の光学バイオセンサと異なっている。
以下の点で従来の光学バイオセンサと異なっている。
１）付加的な指示薬をセンサ層に加える必要がなく、従
って変換素子を必要としないので直接的な測定が可能で
ある。
って変換素子を必要としないので直接的な測定が可能で
ある。
２）多くの公知の光学バイオセンサと対照的に、本発明
によるセンサはただ１つの反応室を備えるだけである。
従って、指示薬室から反応室への移動は必要ない。
によるセンサはただ１つの反応室を備えるだけである。
従って、指示薬室から反応室への移動は必要ない。
３）化学反応によって生成又は消費されるものを測定す
るのではなく、酵素自体が測定される。
るのではなく、酵素自体が測定される。
４）NADHを基本とするセンサと対照的に、本発明による
センサは完全可逆的に反応し、しかもバイオ医療の分野
において用いられるプラスチック光ファイバとの相性が
よい。
センサは完全可逆的に反応し、しかもバイオ医療の分野
において用いられるプラスチック光ファイバとの相性が
よい。
第１図及び第２図は本発明による光学センサの二種類の
実施例を示す断面図、第３図ａ〜ｃは光ファイバの端部
に形成した光学センサの三種類の実施例を示す概略断面
図、第４図は本発明によるセンサを用いた測定システム
の構成図、第５図〜第７図は測定結果の例を示すグラフ
である。 １……担体部材、２……励起光、３……螢光、６……
膜、Ｅ……酵素。
実施例を示す断面図、第３図ａ〜ｃは光ファイバの端部
に形成した光学センサの三種類の実施例を示す概略断面
図、第４図は本発明によるセンサを用いた測定システム
の構成図、第５図〜第７図は測定結果の例を示すグラフ
である。 １……担体部材、２……励起光、３……螢光、６……
膜、Ｅ……酵素。
Claims (10)
- 【請求項１】試料を所定の酵素と接触させ、その蛍光ス
ペクトルを蛍光励起の後に測定することにより、試料中
の酵素基質の濃度を測定する方法であって、 酵素基質の濃度を連続的に且つ可逆的に測定するために
フラビン補酵素（FMN,FAD）と結合している酸素化酵素
と酸化酵素とからなるグループから選択された酵素を用
い、 前記フラビン補酵素は、酵素基質によって還元され、且
つ、試料中に溶けている酸素分子によって酸化され、 前記フラビン補酵素の還元によって生じる固有の蛍光特
性の変化を測定することを特徴とする酵素基質濃度の測
定方法。 - 【請求項２】測定の前に試料に酸素を与え、酵素基質の
わずかな濃度変化によって蛍光強度の大きな変化が生ず
るような酸素濃度に設定することを特徴とする請求項１
記載の測定方法。 - 【請求項３】グルコース濃度を測定するためフラビンア
デニンジヌクレオチド（FAD）を有するグルコース酸化
酵素を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の測
定方法。 - 【請求項４】アルコール濃度を測定するためフラビンア
デニンジヌクレオチド（FAD）を有するアルコール酸化
酵素を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の測
定方法。 - 【請求項５】グルタミン酸濃度を測定するためフラビン
補酵素を有するグルタミン酸酸化酵素を用いることを特
徴とする請求項１又は２記載の測定方法。 - 【請求項６】励起光及び蛍光を透過させる媒質部材の試
料側にセンサ層を固定化した光学センサであって、 前記センサ層がフラビン補酵素と結合している酸素化酵
素と酸化酵素とからなるグループから選択された酵素を
備えていることを特徴とする酵素基質濃度を測定するた
めの光学センサ。 - 【請求項７】前記酵素が、分子量30,000以下の分子のみ
通過可能な膜によって前記媒質部材に機械的に固定化さ
れている酵素ゲルまたは酵素溶液として備えられている
ことを特徴とする請求項６記載の光学センサ。 - 【請求項８】前記酵素がヒドロゲルまたはポリアクリル
アミドからなるセンサ層に存在していることを特徴とす
る請求項６記載の光学センサ。 - 【請求項９】前記酵素が前記媒質部材の表面に化学的な
固定化により結合していることを特徴とする請求項６記
載の光学センサ。 - 【請求項１０】前記酵素が光ファイバの端部に固定化さ
れていることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項
記載の光学センサ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0209388A AT390803B (de) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Verfahren zur bestimmung der konzentration eines enzymsubstrates und sensor zur durchfuehrung des verfahrens |
| AT2093/88 | 1988-08-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02113897A JPH02113897A (ja) | 1990-04-26 |
| JPH0695955B2 true JPH0695955B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=3527597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1218411A Expired - Fee Related JPH0695955B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | 酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0356418A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0695955B2 (ja) |
| AT (1) | AT390803B (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5246867A (en) * | 1992-01-17 | 1993-09-21 | University Of Maryland At Baltimore | Determination and quantification of saccharides by luminescence lifetimes and energy transfer |
| US20060281187A1 (en) | 2005-06-13 | 2006-12-14 | Rosedale Medical, Inc. | Analyte detection devices and methods with hematocrit/volume correction and feedback control |
| CA2624117C (en) | 2005-09-30 | 2014-06-17 | Intuity Medical, Inc. | Fully integrated wearable or handheld monitor |
| US8801631B2 (en) | 2005-09-30 | 2014-08-12 | Intuity Medical, Inc. | Devices and methods for facilitating fluid transport |
| JP5083768B2 (ja) * | 2008-01-17 | 2012-11-28 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | バイオセンサシステム |
| EP2293719B1 (en) | 2008-05-30 | 2015-09-09 | Intuity Medical, Inc. | Body fluid sampling device -- sampling site interface |
| JP5642066B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-12-17 | インテュイティ メディカル インコーポレイテッド | 体液の試料内に含まれている検体の存在または濃度を決定する検定を行う方法および装置 |
| ES2907152T3 (es) | 2008-06-06 | 2022-04-22 | Intuity Medical Inc | Medidor de glucosa en sangre y método de funcionamiento |
| WO2011065981A1 (en) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Intuity Medical, Inc. | Calibration material delivery devices and methods |
| CA2843945C (en) | 2011-08-03 | 2022-06-21 | Intuity Medical, Inc. | Devices and methods for body fluid sampling and analysis |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE382467C (de) * | 1921-04-30 | 1923-11-01 | Koeln Rottweil Akt Ges | Verfahren zur Behandlung von Kunstfasern aus Zellulose fuer eine weitere Verarbeitung in Kaemm- und Spinnprozessen |
| ZA76233B (en) * | 1976-01-15 | 1977-08-31 | Chembro Holdings Pty Ltd | Measurement of alcohol levels in body fluids |
| US4344438A (en) * | 1978-08-02 | 1982-08-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Optical sensor of plasma constituents |
| AT367796B (de) * | 1979-10-29 | 1982-07-26 | List Hans | Verfahren zur bestimmung einer stoffkonzentration in einer loesung |
| DE2948904C2 (de) * | 1979-12-05 | 1986-06-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Vorrichtung zur optischen Messung von Konzentrationen von Stoffen |
-
1988
- 1988-08-24 AT AT0209388A patent/AT390803B/de not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-07-31 EP EP19890890205 patent/EP0356418A3/de not_active Withdrawn
- 1989-08-24 JP JP1218411A patent/JPH0695955B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｅｔｔｅｒ，２１（７），Ｐ．１１６５−１１７５，１９８８ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（３），Ｐ．５８９−５９７，１９７４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02113897A (ja) | 1990-04-26 |
| EP0356418A3 (de) | 1991-01-02 |
| AT390803B (de) | 1990-07-10 |
| EP0356418A2 (de) | 1990-02-28 |
| ATA209388A (de) | 1989-12-15 |
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