JPH02113897A - 酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサ - Google Patents
酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、試料中の酵素基質の濃度を検定するための方
法であって、試料が相応な酵素と接触させられて蛍光励
起の後その蛍光スペクトルが測定され、蛍光スペクトル
の変化が酵素基質の1fKrtの変化のための値として
利用される方法、及びその方法を実施するための光学セ
ンサに関する。
法であって、試料が相応な酵素と接触させられて蛍光励
起の後その蛍光スペクトルが測定され、蛍光スペクトル
の変化が酵素基質の1fKrtの変化のための値として
利用される方法、及びその方法を実施するための光学セ
ンサに関する。
[従来の技術]
酵素基質、例えばグルコーゼの検定は、このことが物質
交換障害(例えば糖尿病肝LLITUSの場合)の有無
の包括的な検証を行うので、医療診断における重要な役
割をもっている。これとともに、またグルコーゼは、通
常のバイオ反応器が栄養素、特にグルコーゼの連続的供
給を必要とするので、バイオテクノロジーや食品産業の
品質管理においてしばしば決定的な役割を果たす。酵素
基質濃度の連続的で可逆的な検定が要望されるので、グ
ルコーゼ及びその他の酵素基質センサが重要な役割を果
たす。信頼できるグルコーゼセンサは、例えば、現在に
おいて人工膵臓の開発の場合の制限となっている大きさ
である。
交換障害(例えば糖尿病肝LLITUSの場合)の有無
の包括的な検証を行うので、医療診断における重要な役
割をもっている。これとともに、またグルコーゼは、通
常のバイオ反応器が栄養素、特にグルコーゼの連続的供
給を必要とするので、バイオテクノロジーや食品産業の
品質管理においてしばしば決定的な役割を果たす。酵素
基質濃度の連続的で可逆的な検定が要望されるので、グ
ルコーゼ及びその他の酵素基質センサが重要な役割を果
たす。信頼できるグルコーゼセンサは、例えば、現在に
おいて人工膵臓の開発の場合の制限となっている大きさ
である。
この関係での検定方法はいろいろなものがこれまでに知
られており、連続的な方法と非連続的な方法に分けるこ
とができる。非連続的な方法は、試t4が破壊されなが
ら行われなければならないし、例えば生体内での通用に
不適当である(強い酸またはアルカリの存在による作用
、拒絶反応が生じること)という経験的な条件を必要と
するといった欠点を持っている。非連続的な方法のさら
に別な欠点としては、継続的な監視を行うために適当な
短い間隔で常時試料を採取する必要があることである。
られており、連続的な方法と非連続的な方法に分けるこ
とができる。非連続的な方法は、試t4が破壊されなが
ら行われなければならないし、例えば生体内での通用に
不適当である(強い酸またはアルカリの存在による作用
、拒絶反応が生じること)という経験的な条件を必要と
するといった欠点を持っている。非連続的な方法のさら
に別な欠点としては、継続的な監視を行うために適当な
短い間隔で常時試料を採取する必要があることである。
この理由のために近年グルコーゼのだめの連続的に用い
るセンサの開発が待ち望まれている。その際、このセン
サは電気化学的センサと光学バイオセンサの2つのタイ
プに分けられる。
るセンサの開発が待ち望まれている。その際、このセン
サは電気化学的センサと光学バイオセンサの2つのタイ
プに分けられる。
従来技術については、H,D、 F、ターナ、1、カ
ルーブ、G、ウィルソンによる゛バイオセンサー基礎と
応用パ、オックスフォード大学出版(1987)に詳し
い。この文献からは、グルコーゼ(及び他の医療に関係
する酵素基質)のためのセンサが高い技術段階に達して
いることが明かである。いずれにせよ電気化学バイオセ
ンサは種々の欠点をもっている。電気化学センサの最大
の欠点の1つは、必要な電解架橋が大変弱く、継続的な
ドリフトの誘因となることである。電気化学センサは試
料室への電気的接続を構成しているので、短い距離でし
か動作させることができなく、このことは特に生体内調
査において危険性を生じる。バイオ反応器の場合では、
電気化学センサが殺菌しにくいということが不利となる
。
ルーブ、G、ウィルソンによる゛バイオセンサー基礎と
応用パ、オックスフォード大学出版(1987)に詳し
い。この文献からは、グルコーゼ(及び他の医療に関係
する酵素基質)のためのセンサが高い技術段階に達して
いることが明かである。いずれにせよ電気化学バイオセ
ンサは種々の欠点をもっている。電気化学センサの最大
の欠点の1つは、必要な電解架橋が大変弱く、継続的な
ドリフトの誘因となることである。電気化学センサは試
料室への電気的接続を構成しているので、短い距離でし
か動作させることができなく、このことは特に生体内調
査において危険性を生じる。バイオ反応器の場合では、
電気化学センサが殺菌しにくいということが不利となる
。
近年、電気化学センサに変わるものが捜し求められ、光
学的、特に光ファイバを用いたセンサが注目されている
。光学センサは、電気化学センサとは違って参照電極を
必要とせず、長い距離を隔てての光の伝達が可能であり
、試料対象との電気的接続を構成しな(でもよいので、
静ポテンシャルまたは人体ポテンシャルによって影響さ
れない、公知のグルコーゼや類似の酵素によって構成さ
れる基質のための光学センサは次の2つのタイプに分け
られる: 第1のタイプは、酵素による反応が行われ、その間にト
ランスジューサによって検出することができる種が作ら
れるものである。例えば、グルコーゼの酸化が酵素グル
コーゼ酸化酵素二CODを通じて次の化学反応で行われ
る;従って、酸素の消費、H,O□の形成、あるいはp
H−値の減少を測定することによって、これらの全ての
パラメータがグルコーゼ濃度の変化と同様に変化するの
で、そこでのグルコーゼ濃度を推定することができる。
学的、特に光ファイバを用いたセンサが注目されている
。光学センサは、電気化学センサとは違って参照電極を
必要とせず、長い距離を隔てての光の伝達が可能であり
、試料対象との電気的接続を構成しな(でもよいので、
静ポテンシャルまたは人体ポテンシャルによって影響さ
れない、公知のグルコーゼや類似の酵素によって構成さ
れる基質のための光学センサは次の2つのタイプに分け
られる: 第1のタイプは、酵素による反応が行われ、その間にト
ランスジューサによって検出することができる種が作ら
れるものである。例えば、グルコーゼの酸化が酵素グル
コーゼ酸化酵素二CODを通じて次の化学反応で行われ
る;従って、酸素の消費、H,O□の形成、あるいはp
H−値の減少を測定することによって、これらの全ての
パラメータがグルコーゼ濃度の変化と同様に変化するの
で、そこでのグルコーゼ濃度を推定することができる。
消費された酸素を調べることによるグルコーゼの測定の
ための理想的な構成は、”Adv、Exp、Mecl、
Biol、’、75.65(1976)ないしはドイツ
特許公報2,948.904号に記載されている。′分
析生化学” 、138,430(1984)には添加さ
れたpH−指示薬の色変化の追跡による生成酸(H’)
の測定に基づくグルコーゼセンサが開示されている。生
成H、O□の測定に基づくグルコーゼ用連続測定センサ
はこれまで知られていなかった。
ための理想的な構成は、”Adv、Exp、Mecl、
Biol、’、75.65(1976)ないしはドイツ
特許公報2,948.904号に記載されている。′分
析生化学” 、138,430(1984)には添加さ
れたpH−指示薬の色変化の追跡による生成酸(H’)
の測定に基づくグルコーゼセンサが開示されている。生
成H、O□の測定に基づくグルコーゼ用連続測定センサ
はこれまで知られていなかった。
グルコーゼ濃度を検定するための他の原理は、アメリカ
特許公報4,343,438号に記載の親和性センサで
示されている。そこでは、光ケーブルの端部のところの
測定室の受容体に1古抗結合した状態となっている全て
の種類は血しょう1g成物のための光学センサが取り扱
われている。拮抗配位子は蛍光でマーキングされ、配位
子の量に応じてこの室へ排除され、そのために吸光また
は放射光が光ケーブルにより観察される。典型的な例は
、マーキングされたデキストランをコンカナバリンに結
合させることである。グルコーゼはマーキングされたデ
キストランが光ケーブルによって観察され結果として蛍
光強度の上昇が検知される。
特許公報4,343,438号に記載の親和性センサで
示されている。そこでは、光ケーブルの端部のところの
測定室の受容体に1古抗結合した状態となっている全て
の種類は血しょう1g成物のための光学センサが取り扱
われている。拮抗配位子は蛍光でマーキングされ、配位
子の量に応じてこの室へ排除され、そのために吸光また
は放射光が光ケーブルにより観察される。典型的な例は
、マーキングされたデキストランをコンカナバリンに結
合させることである。グルコーゼはマーキングされたデ
キストランが光ケーブルによって観察され結果として蛍
光強度の上昇が検知される。
冒頭部で述べた形式の方法は、ワングサとアーノルドに
よる“分析化学”、60 、1,080(1988)に
記載されており、これは特に乳酸塩を検定するものであ
る。乳酸塩は、その際酵素乳酸塩脱水素酵素によりビル
バートに変えられ、同時に酵素の結合していないNAD
’は強蛍光性NADHに変えられる。NADHの蛍光の
増大を;測定することによりそこにおける乳酸塩の濃度
が推定される。このセンサは、いずれにしても種々の欠
点をもっている。最大の欠点は、全てのNADが消費さ
れる場合反応が完結するので、可逆的でないことである
。この理由から、この反応は常に新しいNAD”を供給
してやらなければならない、このことは、NADHの固
をの蛍光の測定に基づく全てのバイオセンサの共通した
欠点である。従って、これは完全な可逆性の条件を満た
さないので、狭い意味においてセンサとして扱われない
。
よる“分析化学”、60 、1,080(1988)に
記載されており、これは特に乳酸塩を検定するものであ
る。乳酸塩は、その際酵素乳酸塩脱水素酵素によりビル
バートに変えられ、同時に酵素の結合していないNAD
’は強蛍光性NADHに変えられる。NADHの蛍光の
増大を;測定することによりそこにおける乳酸塩の濃度
が推定される。このセンサは、いずれにしても種々の欠
点をもっている。最大の欠点は、全てのNADが消費さ
れる場合反応が完結するので、可逆的でないことである
。この理由から、この反応は常に新しいNAD”を供給
してやらなければならない、このことは、NADHの固
をの蛍光の測定に基づく全てのバイオセンサの共通した
欠点である。従って、これは完全な可逆性の条件を満た
さないので、狭い意味においてセンサとして扱われない
。
さらに別な欠点としては、N A D Hの蛍光励起の
ために必要な紫外線波長が350nmであり、グラスフ
ァイバ及びプラスチックファイバがこの光を通さないか
あるいはわずかじか通さないので、必要な光源が比較的
高くつくことである。
ために必要な紫外線波長が350nmであり、グラスフ
ァイバ及びプラスチックファイバがこの光を通さないか
あるいはわずかじか通さないので、必要な光源が比較的
高くつくことである。
これまで述べた方法及びセンサは、非可逆的に動作する
かあるいは比較的複雑なセンサ構造を必要とすること、
実質的には酵素による活性層とそのために例えば酸素や
P H−オブトーデのようなトランスジューサを備える
こと、あるいは拮抗結合の基本とするグルコーゼセンサ
の場合のように複数の種類の固定化層を有する小さいが
比較的複雑な測定室を必要とすることといった欠点を有
している。
かあるいは比較的複雑なセンサ構造を必要とすること、
実質的には酵素による活性層とそのために例えば酸素や
P H−オブトーデのようなトランスジューサを備える
こと、あるいは拮抗結合の基本とするグルコーゼセンサ
の場合のように複数の種類の固定化層を有する小さいが
比較的複雑な測定室を必要とすることといった欠点を有
している。
[発明が解決しようとする課題]
本発明の課題は、試料中の酵素基質の4度を検定するた
めの簡単な方法とその方法を実施するための光学センサ
をIzすることであり、特に連続的にグルコーゼを検定
するための可逆的なセンサを提供することである。
めの簡単な方法とその方法を実施するための光学センサ
をIzすることであり、特に連続的にグルコーゼを検定
するための可逆的なセンサを提供することである。
[課題を解決するための手段]
上記課題は、本発明によれば、酵素基質の濃度を連続的
にそして可逆的に検定するためにフラヴィン補助酵素:
FMN、FADと結合されている酸素化酵素と酸化酵
素とからなるグループから選択された酵素が用いられ、
この補助酵素が酵素基質によって還元された形にそして
試料中に溶けている酸素分子によって酸化された形にな
るものであり、フラヴィン補助酵素の還元によって生じ
たフラヴィン補助酵素の固有蛍光の変化が測定されるこ
とによって解決される。
にそして可逆的に検定するためにフラヴィン補助酵素:
FMN、FADと結合されている酸素化酵素と酸化酵
素とからなるグループから選択された酵素が用いられ、
この補助酵素が酵素基質によって還元された形にそして
試料中に溶けている酸素分子によって酸化された形にな
るものであり、フラヴィン補助酵素の還元によって生じ
たフラヴィン補助酵素の固有蛍光の変化が測定されるこ
とによって解決される。
[作用・効果]
本発明の方法は、補助因子としてフラヴィンのグループ
から選択された補助酵素を有する酵素の自己蛍光が酵素
による活動の間特徴的な様子でつまり認められている学
説とは違って変化し、それによってCODが蛍光を発し
ない、つまり酵素内のFADの蛍光がタンパク質によっ
て消光されるという驚くべき観測に基づいている。本発
明による方法では蛍光強度の下降または増大が起こる。
から選択された補助酵素を有する酵素の自己蛍光が酵素
による活動の間特徴的な様子でつまり認められている学
説とは違って変化し、それによってCODが蛍光を発し
ない、つまり酵素内のFADの蛍光がタンパク質によっ
て消光されるという驚くべき観測に基づいている。本発
明による方法では蛍光強度の下降または増大が起こる。
この蛍光の変化は酸素の存在において完全に可逆性であ
り、従って光学バイオセンサのための直接的な光学的情
報として利用することができる。よって酸素センサやp
ri−センサなどのトランスジューサを用いる必要はな
い。さらにフラヴオタンパク質の励起波長は典型的には
400〜500nmのスペクトル範囲であり、このため
通常のグラスファイバやプラスチックファイバの使用に
都合がよい。さらに、500nm以上での長期間の放射
により大きなスト−りの変化が得られることで、励起ビ
ーム七蛍光ビームの光学的な分離が簡単となる。
り、従って光学バイオセンサのための直接的な光学的情
報として利用することができる。よって酸素センサやp
ri−センサなどのトランスジューサを用いる必要はな
い。さらにフラヴオタンパク質の励起波長は典型的には
400〜500nmのスペクトル範囲であり、このため
通常のグラスファイバやプラスチックファイバの使用に
都合がよい。さらに、500nm以上での長期間の放射
により大きなスト−りの変化が得られることで、励起ビ
ーム七蛍光ビームの光学的な分離が簡単となる。
フラヴオ酵素の場合フラヴィン補助酵素に酸化還元反応
が起こっていることは知られている。
が起こっていることは知られている。
フラヴィン補助酵素としてフラヴィンモノヌクレオチド
(F M N )やフラヴィンアデニンジヌクレオチド
を有するような補助酵素が挙げられる。酵素による酸化
の場合補助因子が同じに還元された形に変化し、この形
が酸素(第2の基質として)によって直接再び酸化され
た形に変化する。酸化形態から還元形態への変化は蛍光
の特性の変化をともなっており、これが分析情報として
利用される。
(F M N )やフラヴィンアデニンジヌクレオチド
を有するような補助酵素が挙げられる。酵素による酸化
の場合補助因子が同じに還元された形に変化し、この形
が酸素(第2の基質として)によって直接再び酸化され
た形に変化する。酸化形態から還元形態への変化は蛍光
の特性の変化をともなっており、これが分析情報として
利用される。
[その他の主な特徴]
本発明の1つの実施形態として、グルコーゼ濃度を検定
するためフラヴィンアデニンジヌクレオチド:F、AD
を有するグルコーゼ酸化酵素が用いろれる方法がある。
するためフラヴィンアデニンジヌクレオチド:F、AD
を有するグルコーゼ酸化酵素が用いろれる方法がある。
次の2つの化学反応式が2段階の反応を示している:
本発明によれば、さらに、アルコール濃度を検定するた
めフラヴィンアデニンジヌクレオチド: FADを有す
るアルコール酸化酵素が用いられる方法やグルタミン6
’bM度を検定するためフラヴィン補助酵素を有するグ
ルタミン酸酸化171層が用いられる方法も可能である
。 本発明の方法は、FMNやF A Dが補助酵
素として生じるとともに試料中に酸素が存在している全
ての酵素反応に適用することができる。FMNとFAD
は、好ましくは酸化酵素と酸素化酵素のグループからな
る酵素に存在しているとよい。そのような酵素の典型的
な例(酵素分類も付記する)は次の通りである; グルコーゼ酸化酵素(ECI、1.3.4)、ガラクト
ーゼ酸化酵素(EC1,1,3,9)、乳酸塩酸化酵素
(EC1,1,3,2)、乳酸塩モノ酸素化酵素(EC
I、1.3.12゜4)、 キサンチン酸素化酵素(EC1,2,3,2)、アスパ
ラタート酸化酵素(EC1,4,3,1,)、L−アミ
ノ酸酸化酵素(EC1,4,3,2)、ビリルビン酸化
酵素(ECI、3.3.5)、コレステリン酸化酵素(
EC1,1,3,6)、モノアミン酸化酵素(EC1,
,4,3,4)、チアミン酸化酵素(EC1,4,3,
6)、尿酸塩酸化酵素(EC1,7,3,3)、亜硫酸
塩酸化酵素(EC1,8,3,1)、チトクロム酸化酵
素(EC1,9,3,1)、リボ酸素化酵素(EC1,
13,1,13)、アルコール酸化酵素(EC1,1,
3,13)及びその他のこれらに同類の酸化酵素。
めフラヴィンアデニンジヌクレオチド: FADを有す
るアルコール酸化酵素が用いられる方法やグルタミン6
’bM度を検定するためフラヴィン補助酵素を有するグ
ルタミン酸酸化171層が用いられる方法も可能である
。 本発明の方法は、FMNやF A Dが補助酵
素として生じるとともに試料中に酸素が存在している全
ての酵素反応に適用することができる。FMNとFAD
は、好ましくは酸化酵素と酸素化酵素のグループからな
る酵素に存在しているとよい。そのような酵素の典型的
な例(酵素分類も付記する)は次の通りである; グルコーゼ酸化酵素(ECI、1.3.4)、ガラクト
ーゼ酸化酵素(EC1,1,3,9)、乳酸塩酸化酵素
(EC1,1,3,2)、乳酸塩モノ酸素化酵素(EC
I、1.3.12゜4)、 キサンチン酸素化酵素(EC1,2,3,2)、アスパ
ラタート酸化酵素(EC1,4,3,1,)、L−アミ
ノ酸酸化酵素(EC1,4,3,2)、ビリルビン酸化
酵素(ECI、3.3.5)、コレステリン酸化酵素(
EC1,1,3,6)、モノアミン酸化酵素(EC1,
,4,3,4)、チアミン酸化酵素(EC1,4,3,
6)、尿酸塩酸化酵素(EC1,7,3,3)、亜硫酸
塩酸化酵素(EC1,8,3,1)、チトクロム酸化酵
素(EC1,9,3,1)、リボ酸素化酵素(EC1,
13,1,13)、アルコール酸化酵素(EC1,1,
3,13)及びその他のこれらに同類の酸化酵素。
酵素基質の濃度との関係で蛍光強度をプロットしていく
と(第5図参照)、濃度かわずかに増えるだけで蛍光強
度が大幅に上昇する領域が確認される。従ってセンサは
この領域において大変感度がよい。本発明により、ここ
では、試料にその測定の前に酸素分子が既知の濃度で供
給されて酵素基質のわずかな濃度変化が蛍光強度の大き
な変化を導くところの応答領域が前もって設定された濃
度領域にシフトされることが提案される。この方法は、
例えば、所定の濃度範囲において正確な測定が必要であ
るバイオ反G2”rに応用することができる。
と(第5図参照)、濃度かわずかに増えるだけで蛍光強
度が大幅に上昇する領域が確認される。従ってセンサは
この領域において大変感度がよい。本発明により、ここ
では、試料にその測定の前に酸素分子が既知の濃度で供
給されて酵素基質のわずかな濃度変化が蛍光強度の大き
な変化を導くところの応答領域が前もって設定された濃
度領域にシフトされることが提案される。この方法は、
例えば、所定の濃度範囲において正確な測定が必要であ
るバイオ反G2”rに応用することができる。
この方法の感度領域をコントロールするためのさらに別
な可能性としては、センサ材料の前にいわゆる拡散しき
いを組み付けることである。
な可能性としては、センサ材料の前にいわゆる拡散しき
いを組み付けることである。
このことで、センサの内部では外部よりずっと小さい気
質濃度となる。応答曲線の測定に適したa域の拡大は、
このことによって可能となる。
質濃度となる。応答曲線の測定に適したa域の拡大は、
このことによって可能となる。
励起光と蛍光を透過させる担体部材の試料側にセンサ層
を固定化した酵素基質の濃度を定めるための光学センサ
においては、本発明により、前記センサーがフラヴィン
補助酵素と結合されている酸素化酵素と酸化酵素とから
なるグループから選択された酵素を備えることを特徴と
する。
を固定化した酵素基質の濃度を定めるための光学センサ
においては、本発明により、前記センサーがフラヴィン
補助酵素と結合されている酸素化酵素と酸化酵素とから
なるグループから選択された酵素を備えることを特徴と
する。
この光学センサは種々の実施形態が考えられる。例えば
、本発明では、前記酵素が30,000以下の除外分子
量を有する膜により担体部材例えばプラナ−担体に機械
的に固定化されている酵素ゲルまたは酵素?8液で存在
しているものがある。機械的固定化は、例えば、大多数
の酵素の分子量が60.000以上であることから酵素
を30.000以下の除夕(分子量を有するセルローゼ
膜を用いて引き留めることによって行うことができる。
、本発明では、前記酵素が30,000以下の除外分子
量を有する膜により担体部材例えばプラナ−担体に機械
的に固定化されている酵素ゲルまたは酵素?8液で存在
しているものがある。機械的固定化は、例えば、大多数
の酵素の分子量が60.000以上であることから酵素
を30.000以下の除夕(分子量を有するセルローゼ
膜を用いて引き留めることによって行うことができる。
本発明によるさらに別な実施形態として、前記酵素がヒ
ドロゲルまたはポリアクリルアミドからなるセンサ層に
存在しているものがある。
ドロゲルまたはポリアクリルアミドからなるセンサ層に
存在しているものがある。
その際酵素がゲル内への埋め込みによって物理的に固定
化される。
化される。
さらに、前記酵素が直接担体部材の表面に化学的固定化
により結合されることも可能である。
により結合されることも可能である。
この化学的固定化は、例えばイオン内在膜への結合など
により、静電的方法あるいは交差架橋された血清アルブ
ミンなどの材料あるいはセルローゼまたはポリアミドな
どのような膜への共有結合により行うことができる。
により、静電的方法あるいは交差架橋された血清アルブ
ミンなどの材料あるいはセルローゼまたはポリアミドな
どのような膜への共有結合により行うことができる。
従って、FMNやFADを含有する酵素はまず固い担体
材料に塗布されたり、その表面に物理的にまたは化学的
に固定化される。酵素層が試料に向き合っており、蛍光
ビームの励起や衰弱がこの固くて光学的に透明な担体部
材の裏側から行われる。試料媒体の自己蛍光によって干
渉を避けるために、酵素を含有するセンサ層の表面を光
学的に不透明であるが特定の基質に対しては透過性であ
る媒体で覆うこともできる。
材料に塗布されたり、その表面に物理的にまたは化学的
に固定化される。酵素層が試料に向き合っており、蛍光
ビームの励起や衰弱がこの固くて光学的に透明な担体部
材の裏側から行われる。試料媒体の自己蛍光によって干
渉を避けるために、酵素を含有するセンサ層の表面を光
学的に不透明であるが特定の基質に対しては透過性であ
る媒体で覆うこともできる。
そのような材料は、例えば、活性炭で暗色にされるヒド
ロゲルである。例えば、アルコールのような種々の揮発
性の酵素基質の場合、例えば男いテフロンまたはシリコ
ンのような疎水性層で覆うことも可能である。
ロゲルである。例えば、アルコールのような種々の揮発
性の酵素基質の場合、例えば男いテフロンまたはシリコ
ンのような疎水性層で覆うことも可能である。
最後に、本発明により、酵素が光ケーブルの端部に直接
固定化されることも提案される。
固定化されることも提案される。
[実施例]
第1図と第2図は光学センサを2つの典型的な構成で示
している。担体部材、例えば、アクリル板がそれぞれ参
照図番1で、そして励起ビームと蛍光ビームは2と3で
示されている。
している。担体部材、例えば、アクリル板がそれぞれ参
照図番1で、そして励起ビームと蛍光ビームは2と3で
示されている。
第1図で示された実施例ではセンサ4は担体部材1の試
料側の凹部5に酵素Eを有し、酵素溶液または酵素ゲル
として備えており、これは酵素を通過させない膜6によ
って機械的に固定化されている。膜6は溝8に係合する
O−リング7によって担体部材1の側面9に固定される
。
料側の凹部5に酵素Eを有し、酵素溶液または酵素ゲル
として備えており、これは酵素を通過させない膜6によ
って機械的に固定化されている。膜6は溝8に係合する
O−リング7によって担体部材1の側面9に固定される
。
第2図による光学センサは試料に面した側10にセンサ
層4を形成した酵素膜11を備えておリ、この膜は第1
図のところで述べたやり方で固定されている。酵素Eは
膜の表面または膜内に固定化されている。
層4を形成した酵素膜11を備えておリ、この膜は第1
図のところで述べたやり方で固定されている。酵素Eは
膜の表面または膜内に固定化されている。
第3a図〜第3C図は典型的な構成例を示しており、そ
こでは光ケーブルの端部12が担体部材1として利用さ
れている。光ケーブルの中核部は13で、そしてその被
覆材は14で示されている。第3a図では酵素がO−リ
ング7で光ケーブルの端部に固定されている酵素膜11
に存在している。第3b図では酵素溶液またはfil素
ゲルが透#[6とO−リング7を用いて光ケーブル端の
凹部5内に固定されている。第3C図では酵素Eは直接
光ケーブルの端部15に固定化されている。
こでは光ケーブルの端部12が担体部材1として利用さ
れている。光ケーブルの中核部は13で、そしてその被
覆材は14で示されている。第3a図では酵素がO−リ
ング7で光ケーブルの端部に固定されている酵素膜11
に存在している。第3b図では酵素溶液またはfil素
ゲルが透#[6とO−リング7を用いて光ケーブル端の
凹部5内に固定されている。第3C図では酵素Eは直接
光ケーブルの端部15に固定化されている。
その他の考えられる実施形態において、分析信号は、酵
素が光ケーブルの末端に固定化されるのではなく、光ケ
ーブルの端部領域の保護層と被覆14を取り除いてから
直接光ケーブルの中核部に固定化されることによって得
られる。
素が光ケーブルの末端に固定化されるのではなく、光ケ
ーブルの端部領域の保護層と被覆14を取り除いてから
直接光ケーブルの中核部に固定化されることによって得
られる。
この場合、いわゆる消えていく波を用いて、つまり境界
面での全反射において光学的に薄い位相に消えていく電
界ベクトルで測定される。その電界ベクトルがそこでは
侵入深さ内で酵素の蛍光を励起させることができる。そ
の蛍光ビームが光学導波管に結合され、その他端部で検
出される。
面での全反射において光学的に薄い位相に消えていく電
界ベクトルで測定される。その電界ベクトルがそこでは
侵入深さ内で酵素の蛍光を励起させることができる。そ
の蛍光ビームが光学導波管に結合され、その他端部で検
出される。
第3図によるセンサを試料部域Pに設けている第4図に
示された測定システムは、350〜500nmの光を供
給することのできる光源16と、励起光を狭帯域なもの
とする光学フィルタないしはモノクロメータ17と、2
枝状の光ケーブルの一端12のところにあるセンサに励
起光を送る第1光ケーブル手段18と、酵素から放射さ
れた蛍光をモノクロメータ20を介して光検出器21に
送る第2光ケーブル手段と、増幅装置22と、さらに評
価装置に接続可能な表示ユニント23とから構成されて
いる。
示された測定システムは、350〜500nmの光を供
給することのできる光源16と、励起光を狭帯域なもの
とする光学フィルタないしはモノクロメータ17と、2
枝状の光ケーブルの一端12のところにあるセンサに励
起光を送る第1光ケーブル手段18と、酵素から放射さ
れた蛍光をモノクロメータ20を介して光検出器21に
送る第2光ケーブル手段と、増幅装置22と、さらに評
価装置に接続可能な表示ユニント23とから構成されて
いる。
光源として次のものが挙げられる:ハロゲンランプ、キ
セノランプ(パルス駆動されるか連続駆動される)、発
光ダイオード、レーザ、金属蒸気ランプ。光学ランプと
しては、干渉フルタ、エツジフィルタ、プリズム、ある
いは格子モノクロメータが適している。光ケーブルとし
ては、好ましくは、破損の危険が少ない点からブラスチ
ンクまたはガラス製のものが用いられ、このことが侵入
方式の場合に大きな利点となる。
セノランプ(パルス駆動されるか連続駆動される)、発
光ダイオード、レーザ、金属蒸気ランプ。光学ランプと
しては、干渉フルタ、エツジフィルタ、プリズム、ある
いは格子モノクロメータが適している。光ケーブルとし
ては、好ましくは、破損の危険が少ない点からブラスチ
ンクまたはガラス製のものが用いられ、このことが侵入
方式の場合に大きな利点となる。
ファイバ及びファイバ束を用いることができる。
自己放射した光と逝光との分離のための構成は以前から
知られている。
知られている。
センサから放射されたビームは、自己の蛍光ビームと、
センサ領域での励起光の弾性的または非弾性的な散乱に
よって作られる散乱光成分から構成されている。実質的
な分析的情報を含まず、せいぜい参照信号として用いら
れる散乱光を分離するために、適当なフィルタが用いら
れる。そのようなフィルタは、例えばモノクロメータ、
2色性フィルタ、または急勾配エツジフィルタである。
センサ領域での励起光の弾性的または非弾性的な散乱に
よって作られる散乱光成分から構成されている。実質的
な分析的情報を含まず、せいぜい参照信号として用いら
れる散乱光を分離するために、適当なフィルタが用いら
れる。そのようなフィルタは、例えばモノクロメータ、
2色性フィルタ、または急勾配エツジフィルタである。
光検出器としてはフォトダイオード、フォトトランジス
タまたはフォトマルチプライヤが挙げられる。
タまたはフォトマルチプライヤが挙げられる。
第5図はmMでのグルコーゼ濃度に対する蛍光強度の関
係を示しており、これは第1図によるセンサによって測
定された。この測定は、pH=7、温度22.507:
貫流させて行われた。
係を示しており、これは第1図によるセンサによって測
定された。この測定は、pH=7、温度22.507:
貫流させて行われた。
酸素4度との関係はaとbで記された2つの曲線で示さ
れ、そこでは試料溶液がaでは空気飽和され、bでは7
.88%の0□を有するO t / N を混合体で飽
和されている。
れ、そこでは試料溶液がaでは空気飽和され、bでは7
.88%の0□を有するO t / N を混合体で飽
和されている。
第6図は、溶液でのグルコーゼ酸化酵素を有するグルコ
ーゼセンサの貫流させての種々のグルコーゼ濃度に対す
る典型的な応答曲線を示している。この測定は、pH=
7、温度22.5°C1空気飽和で行われた。
ーゼセンサの貫流させての種々のグルコーゼ濃度に対す
る典型的な応答曲線を示している。この測定は、pH=
7、温度22.5°C1空気飽和で行われた。
第7図は、グルコーゼセンサのビーク−インテグラルP
IのmMでのグルコーゼ濃度との関係を示しており、そ
の際試料溶液はそれぞれ貫流室を通って65秒流入され
た。測定システムは第1図によるものが選ばれた。この
測定は、pH=7、温度22.5’C5空気飽和で行わ
れた。
IのmMでのグルコーゼ濃度との関係を示しており、そ
の際試料溶液はそれぞれ貫流室を通って65秒流入され
た。測定システムは第1図によるものが選ばれた。この
測定は、pH=7、温度22.5’C5空気飽和で行わ
れた。
まとめとして、本発明による光学バイオセンサはこれま
での光学バイオセンサと比べ次の点で異なっていると言
える; 1) 付加的な指示薬をセンサ層に入れる必要がなく、
そのためトランスジューサ素子を必要としないので測定
量の直接検定が可能である。
での光学バイオセンサと比べ次の点で異なっていると言
える; 1) 付加的な指示薬をセンサ層に入れる必要がなく、
そのためトランスジューサ素子を必要としないので測定
量の直接検定が可能である。
2) 多くの公知の光学バイオセンサと違ってただ1つ
の反応室があるだけであり、指示薬室から反応室への大
ff1B送がない。
の反応室があるだけであり、指示薬室から反応室への大
ff1B送がない。
3) 化学反応によって生成されるかあるいは消費され
る種を測定するのではなく、酵素自体が測定される。
る種を測定するのではなく、酵素自体が測定される。
4) このセンサは、NADHを基本としたセンサとは
異なり完全に可逆的に応答し、そして長時間の励起と放
射の目的でバイオ医療で要求されるプラスチックケーブ
ルに適合する。
異なり完全に可逆的に応答し、そして長時間の励起と放
射の目的でバイオ医療で要求されるプラスチックケーブ
ルに適合する。
尚、特許請求の範囲の項に図面との対照を便利にする為
に符号を記すが、該記入により本発明は添付図面の構造
に限定されるものではない。
に符号を記すが、該記入により本発明は添付図面の構造
に限定されるものではない。
第1図と第2図は本発明による光学センサの断面図、第
3a図〜第3c図は光ケーブルの端部に設けられたセン
サの概略図、第4図は本発明によるセンサを用いた測定
システムの構成図、第5図〜第7図は測定結果のグラフ
である。 (1)・・・・・・担体部材、(2)・・・・・・励起
ビーム、(3)・・・・・・蛍光ビーム、(6)・・・
・・・膜、(E)・・・・・・酵素。 7・グ \ Q 膿 (〕 輸 (〕 〜 (〕 一
3a図〜第3c図は光ケーブルの端部に設けられたセン
サの概略図、第4図は本発明によるセンサを用いた測定
システムの構成図、第5図〜第7図は測定結果のグラフ
である。 (1)・・・・・・担体部材、(2)・・・・・・励起
ビーム、(3)・・・・・・蛍光ビーム、(6)・・・
・・・膜、(E)・・・・・・酵素。 7・グ \ Q 膿 (〕 輸 (〕 〜 (〕 一
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、試料中の酵素基質の濃度を検定するための方法であ
って、試料が相応な酵素と接触させられて蛍光励起の後
その蛍光スペクトルが測定され、蛍光スペクトルの変化
が酵素基質の濃度の変化のための値として利用されるも
のにおいて、 酵素基質の濃度を連続的にそして可逆的に 検定するためにフラヴィン補助酵素:FMN、FADと
結合されている酸素化酵素と酸化酵素とからなるグルー
プから選択された酵素が用いられ、この補助酵素が酵素
基質によって還元された形にそして試料中に溶けている
酸素分子によって酸化された形になるものであり、フラ
ヴィン補助酵素の還元によって生じたフラヴィン補助酵
素の固有蛍光の変化が測定されることを特徴とする方法
。 2、試料にその測定の前に酸素分子が既知の濃度で供給
されて酵素基質のわずかな濃度変化が蛍光強度の大きな
変化を導くところの応答領域が前もって設定された濃度
領域にシフトされることを特徴とする請求項1に記載の
方法。 3、グルコーゼ濃度を検定するためフラヴィンアデニン
ジヌクレオチド:FADを有するグルコーゼ酸化酵素が
用いられることを特徴とする請求項1または2に記載の
方法。 4、アルコール濃度を検定するためフラヴィンアデニン
ジヌクレオチド:FADを有するアルコール酸化酵素が
用いられることを特徴とする請求項1または2に記載の
方法。 5、グルタミン酸濃度を検定するためフラヴィン補助酵
素を有するグルタミン酸酸化酵素が用いられることを特
徴とする請求項1または2に記載の方法。 6、励起光と蛍光を透過させる担体部材の試料側にセン
サ層を固定化した酵素基質の濃度を定めるための光学セ
ンサにおいて、 前記センサ層(4)がフラヴィン補助酵素と結合されて
いる酸素化酵素と酸化酵素とからなるグループから選択
された酵素(E)を備えていることを特徴とする光学セ
ンサ。 7、前記酵素(E)が30,000以下の除外分子量を
有する膜(6)により担体部材(1)に機械的に固定化
されている酵素ゲルまたは酵素溶液で存在していること
を特徴とする請求項6に記載の光学センサ。 8、前記酵素(E)がヒドロゲルまたはポリアクリルア
ミドからなるセンサ層(4)に存在していることを特徴
とする請求項6に記載の光学センサ。 9、前記酵素(E)が直接担体部材(1)の表面(15
)に化学的固定化により結合されていることを特徴とす
る請求項6に記載の光学センサ。 10、前記酵素(E)が直接光ケーブルの端部(12)
に固定化されていることを特徴とする請求項6〜9のい
ずれかに記載の光学センサ。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AT0209388A AT390803B (de) | 1988-08-24 | 1988-08-24 | Verfahren zur bestimmung der konzentration eines enzymsubstrates und sensor zur durchfuehrung des verfahrens |
AT2093/88 | 1988-08-24 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02113897A true JPH02113897A (ja) | 1990-04-26 |
JPH0695955B2 JPH0695955B2 (ja) | 1994-11-30 |
Family
ID=3527597
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1218411A Expired - Fee Related JPH0695955B2 (ja) | 1988-08-24 | 1989-08-24 | 酵素基質濃度の測定方法とその方法に用いる光学センサ |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0356418A3 (ja) |
JP (1) | JPH0695955B2 (ja) |
AT (1) | AT390803B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009168671A (ja) * | 2008-01-17 | 2009-07-30 | Tokyo Medical & Dental Univ | バイオセンサシステム |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5246867A (en) * | 1992-01-17 | 1993-09-21 | University Of Maryland At Baltimore | Determination and quantification of saccharides by luminescence lifetimes and energy transfer |
US20060281187A1 (en) | 2005-06-13 | 2006-12-14 | Rosedale Medical, Inc. | Analyte detection devices and methods with hematocrit/volume correction and feedback control |
US8801631B2 (en) | 2005-09-30 | 2014-08-12 | Intuity Medical, Inc. | Devices and methods for facilitating fluid transport |
US8382681B2 (en) | 2005-09-30 | 2013-02-26 | Intuity Medical, Inc. | Fully integrated wearable or handheld monitor |
CA2725264C (en) | 2008-05-30 | 2017-06-20 | Intuity Medical, Inc. | Body fluid sampling device -- sampling site interface |
JP5642066B2 (ja) | 2008-06-06 | 2014-12-17 | インテュイティ メディカル インコーポレイテッド | 体液の試料内に含まれている検体の存在または濃度を決定する検定を行う方法および装置 |
CA2726071C (en) | 2008-06-06 | 2024-01-02 | Intuity Medical, Inc. | Blood glucose monitoring device |
US8919605B2 (en) | 2009-11-30 | 2014-12-30 | Intuity Medical, Inc. | Calibration material delivery devices and methods |
JP6223337B2 (ja) | 2011-08-03 | 2017-11-08 | インテュイティ メディカル インコーポレイテッド | 体液抽出測定器 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE382467C (de) * | 1921-04-30 | 1923-11-01 | Koeln Rottweil Akt Ges | Verfahren zur Behandlung von Kunstfasern aus Zellulose fuer eine weitere Verarbeitung in Kaemm- und Spinnprozessen |
ZA76233B (en) * | 1976-01-15 | 1977-08-31 | Chembro Holdings Pty Ltd | Measurement of alcohol levels in body fluids |
US4344438A (en) * | 1978-08-02 | 1982-08-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health, Education And Welfare | Optical sensor of plasma constituents |
AT367796B (de) * | 1979-10-29 | 1982-07-26 | List Hans | Verfahren zur bestimmung einer stoffkonzentration in einer loesung |
DE2948904C2 (de) * | 1979-12-05 | 1986-06-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Vorrichtung zur optischen Messung von Konzentrationen von Stoffen |
-
1988
- 1988-08-24 AT AT0209388A patent/AT390803B/de not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-07-31 EP EP19890890205 patent/EP0356418A3/de not_active Withdrawn
- 1989-08-24 JP JP1218411A patent/JPH0695955B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANALYTICAL LETTERS=1988 * |
BIOCHEMISTRY=1974 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009168671A (ja) * | 2008-01-17 | 2009-07-30 | Tokyo Medical & Dental Univ | バイオセンサシステム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AT390803B (de) | 1990-07-10 |
EP0356418A2 (de) | 1990-02-28 |
JPH0695955B2 (ja) | 1994-11-30 |
ATA209388A (de) | 1989-12-15 |
EP0356418A3 (de) | 1991-01-02 |
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