JP2006512571A - 乳酸バイオセンシング・ストリップの調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
医師は、本人の検査と臨床検査室の結果に基づいて重症医療患者における生物学的な分析物の存在及び濃度を決定する。臨床検査室は良く管理された質の高い環境で大量の検査と分析をサポートする多様な自動化されたシステムを完備している。しかし、臨床検査室は外傷や多臓器失調/疾患患者を適切に治療するために必要な早急な結果を迅速に提供できない。早急な検査結果を求める臨床的なニーズに応えて、患者のベッドサイドで信頼できる自動化された分析機器を用いて検査するためのいくつかのテクノロジーが生まれている、例えば、電気化学バイオセンサー、光学的蛍光センサー、凝固検査システム用の常磁性粒子、及び化学及び免疫化学検査のためのマイクロマシン装置、などである。これらのテクノロジーによって、多項目化学検査を迅速に実行することが可能になり、従来は障害になっていた検査装置の校正などの問題にも対処できるようになっている。
本発明の主たる目的は、水性媒質中の乳酸の測定のための新しい乳酸バイオセンシング・ストリップを提供することである。
乳酸バイオセンシング・ストリップは従来の方法に比べていろいろな利点、例えば速い応答、サイズが小さい利便性、応答の特異性、サンプル調製の必要がないこと、低コスト、及び測定の感度の高さ、などの利点がある。従来の方法と比べて、このセンサーの主たる利点は、普通の人にもできるサンプル操作である。
i. 外側表面、
ii. スクリーン印刷された基準電極、及び
iii. スクリーン印刷された作業電極、
を有する。
(a) 電気的に絶縁されたベースサポートに一対の銀層を任意の従来の方法によりデポジットするステップ;
(b) 前記銀層の上に一対のグラファイト層を任意の従来の方法によりデポジットするステップ、前記銀層の各々に一つのグラファイト層がデポジットされ、第一のグラファイト層は第一の銀層を完全に覆い、第二のグラファイト層は第二の銀層のベースサポートに向いた表面から遠い方の表面の一部だけを覆う;
(c) 第二の銀層上のグラファイト層がデポジットされていない部分に塩化銀層をデポジットするステップ;
(d) 乳酸オキシダーゼをエレクトロン・メディエーターと共に第一のグラファイトがデポジットされた銀層上に物理的に吸着させて作業電極を得るステップ;及び
(e) 前記第一の基準電極と第二の作業電極の上に、外側の親水性の膜をかぶせて、電気的に絶縁されたベースサポート上に所望の一対の電極を単一センサーとして得るステップ;
を含む。
図1に示されているように、本発明は、電極アセンブリ(2)、(3)、(4)、及び(5)を支持する電気的に絶縁されたベースサポート(1)を含む。電極アセンブリは、二つの電極システム、銀層とその上にデポジットされたグラファイト層、及び無機マトリックスに吸着された酵素とメディエーターの層から成る作業電極システム(2)、(3)、及び(5)、を含む。他の電極アセンブリは、銀層に部分的にグラファイト層がデポジットされ、その上に銀/塩化銀層がデポジットされた基準電極から成る。図1は、電極の支持基板を含むPVCシート(i)を示す。導電性銀トラッキング(ii)は、センサーを読取装置に結合するための導電性銀トラッキングの表面に導電性グラファイト層(iii)をスクリーン印刷したものである。
i. 導電性トラッキングの印刷
ii. 基準電極の印刷
iii. 作業電極の印刷
iv. 電極上に膜を固定。
L-乳酸 + LOD (ox) --------ピルビン酸 + LOD (red)
LOD (red) + Me (ox) ---------LOD (ox) + Me (re)
メディエーターとグラファイトのペーストの調製
100 mgのグラファイト粉末とポリビニル・ピロリドン(結合剤)を0.01 Mフェリシアン化カリウム(メディエーター)とエチレングリコール・モノブチル・エーテル中で混合してスクリーン印刷可能な作業電極グラファイト・ペーストを調製した。
ドライ・ストリップの調製
商業的に入手した2 Uの乳酸オキシダーゼを含む乳酸オキシダーゼ溶液(2 μL)をメディエーターを混合したグラファイト電極ストリップに物理的に吸着させ、一晩保持して25℃で乾燥させた。ドライ・ストリップ電極は親水性のナイロン膜で覆った。膜を貼り付ける前に、蒸留水中10%の表面活性剤(Tween 80)溶液にしばらく入れて、次に乾燥した膜をストリップに固定した。
乳酸標準乳酸溶液の調製
0.1 Mリン酸バッファー中に10 mMのストック乳酸溶液を調製した。このストック溶液をリン酸バッファーで希釈して2 mM, 4 mM, 6 mM, 及び8 mMの標準溶液を調製した。
酵素ストック溶液の調製
酵素乳酸オキシダーゼ15 mgを100 μLの0.1Mリン酸バッファーに溶解して5 U/μLの濃度にして、作業用の酵素溶液を得た。このストック溶液をさらに1 U/μLに希釈した。
メディエーター混合グラファイト・ドライ・ストリップへの酵素の固定
2 Uの乳酸オキシダーゼを含む2μLの酵素溶液をメディエーター混合グラファイト電極ストリップに吸着させ、一晩保持して25℃で乾燥させた。前記ドライ・ストリップ電極を親水性ナイロン膜で覆った。膜を貼付する前に、蒸留水中10%の表面活性剤(Tween 80)溶液にしばらく入れて、次に乾燥した膜をストリップに固定した。
酵素活性
乳酸オキシダーゼの活性を調べるSigmaプロトコルを用いて乳酸オキシダーゼの活性を評価した。基本原理は、乳酸オキシダーゼがl-乳酸をピルビン酸とH2O2に変換するということである。H2O2はその後4-アミノアンチピリン(4AAP)とジメチルアニリン(DMA)の存在下で着色した色素に変換される。
LOD
L-乳酸 + O2 → ピルビン酸 + H2O2
LOD
2 H2O2 + 4-AAP + DMA → キノンジイミン色素 + H2O
温度=37℃及びpH = 6.5という最適条件で色素は565 nmで,光路(light path)1 cmで吸収する。
固定された酵素の活性は次の式で計算された:
U cm-2 = AV/εts
ここで、Aは、インキュベーションの前と後の吸収率の差であり、
Vは、全体積であり、
εは、565 nmでのキノンジイミン色素のミリモル消光係数(35.33),
tは、反応時間(10分)であり、
Sは、酵素電極の表面積である。
動作するグラファイト・ストリップにおける固定されたLODの酵素活性は75%であることが見出された。
作業電極としてグラファイトに固定された酵素(LOD)とAG/AgCl基準電極を含む乳酸バイオセンシング・ストリップを、バイアス電圧0.4 Vで分極した電位計の入力に結合し、乳酸(1-8 mM)に対する電流計校正応答が測定された(図2)。8 mMという乳酸溶液で60 μAの最大電流が得られ、それより上では電流の顕著な変化は認められなかった。乳酸溶液(1-8 mM)に対する反応時間は、乳酸の各濃度で40秒であることが見出された(図3)。結果は、5%以内で再現性があることが見出された。電流計測定には以下の原理が関わっていた:
乳酸 + LOD(ox) → ピルビン酸 + LOD (red)
LOD (red) + Fe3+ → LOD(ox) + Fe2+
0.4 V
Fe2+ → Fe3+
1. この乳酸バイオセンシング・ストリップはサンプル中の乳酸の速やかな定量を与える。
2. 冷蔵条件下でサンプルの貯蔵寿命は4ヶ月である。
3. 1から8 mMまでの乳酸濃度でストリップの応答は線形である。
4. このストリップは環境に害を及ぼさずに使い捨てできる。
5. このストリップは正式の医学トレーニングを受けていない人でも容易に使用できる。
Claims (9)
- 乳酸バイオセンシング・ストリップの調製方法であって、該乳酸バイオセンシング・ストリップは、電気的に絶縁されたベースサポート(1)と、その上にデポジットされた一対の隔離された第一及び第二の銀層(2)と、一対のグラファイト層とを含み、前記一対のグラファイト層の各々はそれぞれ一つの銀層にデポジットされて前記それぞれの銀層(2)と電気的に結合され、第一の銀層はそのグラファイト層によって完全に覆われ、第二の銀層は部分的にその中央がそのグラファイト層で覆われて結合及び作業ゾーン領域を覆われずに残し、前記第二の銀電極層の作業ゾーン領域の上にAg/AgCl電極(4)が設けられ、乳酸オキシダーゼがメディエーターと共に第一の銀層を覆うグラファイト層の作業ゾーン領域にデポジットされ(5)、前記銀/塩化銀基準電極(4)と酵素とメディエーターの作業電極は前記サポート(1)に支持され、銀/塩化銀基準電極(4)の作業ゾーンと作業電極(5)は親水性の膜で覆われ、本方法により得られる前記乳酸バイオセンシング・ストリップは75%の活性及び30乃至40秒という乳酸検出の応答時間を示し、貯蔵寿命が冷蔵条件下で約4ヶ月、周辺条件(25乃至30℃)で約2ヶ月であり、本方法により得られるストリップは使い捨て可能である乳酸バイオセンシング・ストリップの調製方法は:
(a)電気的に絶縁されたベースサポートに一対の銀層をデポジットするステップ;
(b)前記銀層の上に一対のグラファイト層をデポジットするステップであって、前記銀層の各々に一つのグラファイト層がデポジットされ、第一のグラファイト層は第一の銀層を完全に覆い、第二のグラファイト層は第二の銀層のベースサポートに向いた表面から遠い方の表面の一部だけを覆う、ステップ;
(c)第二の銀層上の、グラファイト層がデポジットされていない部分に塩化銀層をデポジットして、銀/塩化銀電極を得るステップ;
(d)乳酸オキシダーゼをエレクトロン・メディエーターと共に第一のグラファイトがデポジットされた銀層上に物理的に吸着させて作業電極を得るステップ;及び
(e)前記第一の基準電極と第二の作業電極の上に、外側の親水性の膜をかぶせて、電気的に絶縁されたベースサポート上に所望の一対の電極を単一アセンブリとして得るステップ;
を含む方法。 - 用いられる電気的に絶縁されたベースサポートがポリ塩化ビニルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記銀層がスクリーン印刷工程によって適用されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記グラファイト層がスクリーン印刷工程によって適用されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 検査されるサンプルが25乃至30μLという量の水性乳酸溶液又は血液サンプルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 用いられる該エレクトロン・メディエーターがフェリシアン化カリウム又はフェロセンから選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 電極の該作業ゾーン領域が分析物サンプルを小出しするのに用いられる標的領域であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 電極の該結合端末ゾーン領域が電極を電位計に結合するために用いられる領域であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 該親水性の膜がナイロン又はポリエステルから作られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
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