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GEBIET DER ERFINDUNG
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Das
Gebiet dieser Erfindung ist eine Analytbestimmung, insbesondere
eine elektrochemische Analytbestimmung und insbesondere die elektrochemische
Bestimmung von Blutanalyten.
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Stand der Technik
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Eine
Analytbestimmung in physiologischen Fluiden oder Proben, z. B. Blut
oder von Blut abgeleiteten Produkten, gewinnt eine immer zunehmendere
Bedeutung für
die heutige Gesellschaft. Analytdetektionsuntersuchungen finden
Verwendung in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließend ein
klinisches Labortesten, ein Testen zu Hause, etc., wo die Ergebnisse
eines solchen Tests eine wichtige Rolle in der Diagnose und der Handhabung
einer Vielzahl von Erkrankungszuständen spielen. Analyte von Interesse
schließen
Glucose zur Diabeteshandhabung, Cholesterol und dergleichen ein.
Als Reaktion auf diese wachsende Bedeutung der Analytdetektion ist
eine Vielzahl von Analytdetektionsprotokollen und -vorrichtungen
sowohl zur Verwendung in einer Klinik als auch zu Hause entwickelt
worden.
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Eine
Verfahrensart, die zur Analytdetektion eingesetzt worden ist, ist
ein elektrochemisches Verfahren. In solchen Verfahren wird eine
wässrige
Flüssigkeitsprobe
in einer Reaktionszone in einer elektrochemischen Zelle angeordnet,
die wenigstens zwei Elektroden umfasst, d. h. eine Bezugs- und eine
Arbeitselektrode, wobei die Elektroden eine Impedanz aufweisen,
die sie für
eine amperometrische Messung geeignet machen. Die zu analysierende
Komponente kann direkt mit einer Elektrode reagieren oder direkt
oder indirekt mit einem Redoxreagens, um eine oxidierbare (oder
reduzierbare) Substanz in einer Menge zu bilden, die der Konzentration der
zu analysierenden Komponente, d. h. dem Analyt, entspricht. Die
Menge der oxidierbaren (oder reduzierbaren) Substanz, die vorhanden
ist, wird dann elektrochemisch abgeschätzt und mit der Menge eines
in der anfänglichen
Probe vorhandenen Analyts in Beziehung gesetzt.
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In
vielen solchen elektrochemischen Ansätzen zur Analytdetektion wird
ein Analyt oxidierendes Signalerzeugungssystem, das eine Enzymkomponente
und eine Mediatorkomponente umfasst, eingesetzt, wobei die Enzymkomponente
das interessierende Analyt oxidiert und dann ein Elektron zu einem
Mediator transferiert, der wiederum das Elektron zu einer Elektrode
in der elektrochemischen Zelle überführt, wodurch
ein elektrisches Signal erzeugt wird, aus dem die Analytkonzentration
bestimmt werden kann.
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Bei
elektrochemischen Teststreifen werden diese Streifen typischerweise
eine gewisse Zeit vor ihrer Verwendung hergestellt. Zwischen ihrer
Herstellung und der Verwendung werden die Teststreifen gelagert. Während dieser
Lagerdauer kann sich ein Teil des Mediators in seine reduzierte
Form umwandeln. In solchen Situationen können ungenaue Ergebnisse erhalten
werden, wenn der Streifen schließlich eingesetzt wird, da etwas
des Mediators bereits reduziert ist.
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Es
besteht daher ein Interesse in der Entwicklung von elektrochemischen
Reagenszubereitungen, in denen der Mediator lagerstabilisiert ist.
Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf.
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Relevante Literatur
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- US: 5,723,284 ; 5,834,224 ; 5,942,102 ; 5,972,199 ; 5,997,817 ; 6,059,946 ; 6,083,710 ; 6,121,009 ; 6,134;461 ; 6,179,979 ; 6,193,973 und 6,284,125 ; sowie andere Patentdokumente: WO 99/49307 ; WO 97/18465 ; WO 01/57510 ; WO 01/57238 ; WO 02/48707 ; WO 02/50609 ; EP 0 969 097A2 ; JP091403378A ;
und GB 2 304 628 .
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Zusätzlich zu
den obigen Dokumenten offenbart
EP
1 146 332 einen Glucosesensor, von dem gesagt wird, eine
Lagerstabilität
und eine verbesserte Reaktionscharakteristik zu besitzen. Dieser
Sensor umfasst: eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein Elektrodensystem
einschließend
wenigstens eine Arbeitselektrode und eine auf der Basisplatte gebildete
Gegenelektrode; und eine Reaktionsschicht enthaltend wenigstens
Pyrrolo-Chinolin-Chinon-abhängige Glucosedehydrogenase.
Die Reaktionsschicht wird in Kontakt mit oder in der Nähe des Elektrodensystems
gebildet, und sie enthält
wenigstens eine Art eines Additivs, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Gluconsäure
und Salzen derselben.
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In ähnlicher
Weise offenbart
WO 02/50609 elektrochemische
Teststreifenkarten, die vereinzelt werden können, um elektrochemische Teststreifen
herzustellen. Die elektrochemischen Testkarten sind hergestellt
aus zwei oder mehreren elektrochemischen Teststreifenvorstufen,
wobei jede Vorstufe durch die Gegenwart einer ein trockenes Reagenz
aufnehmenden Reaktionskammer gekennzeichnet ist, die durch gegenüberliegende Elektroden
gebunden ist. Dieses Dokument offenbart ebenfalls Verfahren zur
Verwendung der elektrochemischen Teststreifenkarten sowie von Kits.
Für die
Teststreifen und -karten wird gesagt, dass sie insbesondere geeignet
sind, wenn eine Anzahl unterschiedlicher Analyte, einschließend der
Glucose, detektiert wird.
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Schließlich offenbart
EP 1 239 048 einen Biosensor
umfassend ein Cholesterol-oxidierendes Enzym und Cholesterolesterase.
Spezifischerweise umfasst der Biosensor: eine elektrisch isolierende
Basisplatte; ein Elektrodensystem einschließend eine auf der Basisplatte
gebildete Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode. Der Biosensor
umfasst ebenfalls ein Deckelement, welches mit der Basisplatte verbunden
ist, um einen Probenversorgungsweg zu definieren, durch den eine
Lösung
aus einer Probenversorgungsöffnung
zum Elektrodensystem geliefert wird. Der Probenversorgungsweg wird
zwischen dem Deckelement und der Basisplatte gebildet; und eine
Reagenzschicht wird in dem Probenversorgungsweg gebildet, wobei
die Reagenzschicht ein Cholesterol oxidierendes Enzym, Cholesterolesterase,
einen Elektronenmediator und einen Puffer mit einer Pufferkapazität in einem
sauren pH-Bereich enthält.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Mediator-stabilisierte
Reagenszusammensetzungen und Verfahren für ihre Verwendung in elektrochemischen
Analytbestimmungsuntersuchungen werden bereitgestellt. Die vorliegenden
Reagenszusammensetzungen schließen
ein Enzym, einen Redoxmediator und einen Mediator-stabilisierenden
Puffer ein. Der Mediator-stabilisierende Puffer umfasst eine Polycarbonsäure mit
mehr als zwei Carbonsäureeinheiten,
die so konfiguriert sind, dass sie sterisch eine Polydentatbindung
von zweiwertigen Metallionen verhindern, wobei die Polycarbonsäure in einer
Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um den Redoxpuffer bei
Lagerung zu stabilisieren. Optional können die Reagenszusammensetzungen
ferner ein oder mehrere Benetzungsagentien, Detergentien, Enzymcofaktoren
und Kombinationen derselben einschließen. Ebenfalls bereitgestellt
werden elektrochemische Teststreifen, die die vorliegende Reagenszusammensetzungen
einschließen,
Systeme und Kits, die dieselbe ebenfalls einschließen, sowie
Verfahren zur Verwendung derselben in Analytdetektionsuntersuchungen.
Die vorliegende Erfindung findet Anwendung in einer Vielzahl unterschiedlicher
Verwendungen, einschließlich
Glucosekonzentrationsbestimmungsanwendungen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 liefert
eine Explosionsansicht eines elektrochemischen Teststreifens gemäß der vorliegenden Erfindung.
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2 zeigt
den gleichen Teststreifen in zusammengesetzter Form.
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3 liefert
die Ergebnisse eines Linearitätstest
umfassend Zitronen-, Äpfel- und Weinsäurezubereitungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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4 und 5 liefern
Ergebnisse, die den Hämatokrit-Effekt
für tintengestrahlte
Zitrat und Mellithsäurezubereitungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigen.
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6 und 7 liefern
Ergebnisse, die die Hämatokritleistung
für Zitronensäure- und
Citraconsäurereagenszubereitungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigen.
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8 liefert
Ergebnisse eines Linearitätstests
für Citracon-
und Maleinsäurereagenszubereitungen gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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9 und 10 zeigen
Stabilitätsdaten
für elektrochemische
Glucosesensoren, die mit den Citraconat- und Mellithatreagenszubereitungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt sind.
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BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN
AUSFÜHRUNGSFORM
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Mediator-stabilisierte
Reagenszusammensetzungen und Verfahren für deren Verwendung in elektrochemischen
Analytbestimmungsuntersuchungen werden bereitgestellt. Die vorliegenden
Reagenszusammensetzungen schließen
ein Enzym, einen Redoxmediator und einen Mediator-stabilisierenden
Puffer ein. Optional können
die Reagenszusammensetzungen ferner eines oder mehrere eines Benetzungsagens,
eines Detergens, eines Enzymcofaktors und Kombinationen derselben
einschließen.
Ebenfalls bereitgestellt werden elektrochemische Teststreifen, die
die vorliegenden Reagenszusammensetzungen einschließen, Systeme
und Kits, die dieselben einschließen, sowie Verfahren zur Verwendung
derselben in Analyt detektionsuntersuchungen. Die vorliegende Erfindung
findet Verwendung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen,
einschließend
Glucosekonzentrationsbestimmungsuntersuchungen.
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Bevor
die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, ist es zu verstehen,
dass die Erfindung nicht auf die unten beschriebenen bestimmten
Ausführungsformen
der Erfindung begrenzt, da Variationen der besonderen Ausführungsformen
durchgeführt
werden können
und noch in den Umfang der beigefügten Ansprüchen fallen können. Es
ist ebenfalls zu verstehen, dass die verwendete Terminologie zum
Zwecke der Beschreibung der bestimmten Ausführungsformen ist und nicht
beabsichtigt ist, begrenzend zu sein. Stattdessen wird der Umfang
der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche definiert.
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In
dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen schließen die Singularformen „ein", „eine" und die Pluralform „die" Pluralverweise ein,
sofern es im Kontext nicht anderweitig klar bezeichnet wird. Sofern nicht
anderweitig definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen
Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf,
wie sie üblicherweise
von Fachleuten auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht,
verstanden wird.
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Wo
ein Bereich von Werten bereitgestellt wird, ist zu verstehen, dass
jeder der dazwischen liegende Wert, zu einem Zehntel der Einheit
der unteren Grenze, sofern der Kontext nicht klar etwas anderes
bezeichnet, zwischen der oberen und unteren Grenze dieses Bereichs,
und jeder andere genannte oder dazwischen liegende Wert in diesem
genannten Bereich, innerhalb der Erfindung eingeschlossen ist. Die
oberen und unteren Grenzen dieser kleineren Bereiche können unabhängig in
den kleineren Bereichen eingeschlossen sein und sind ebenfalls innerhalb
der Erfindung eingeschlossen, unterliegend irgendeiner spezifisch
ausgeschlossenen Grenze im genannten Bereich. Wo der genannte Bereich
eine oder beide der Grenzen einschließt, sind Bereiche, die eine
oder beide solcher eingeschlossenen Grenzen ausschließen, ebenfalls
in der Erfindung eingeschlossen.
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Sofern
nicht anderweitig definiert, weisen alle technischen und wissenschaftlichen
Begriffe, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf,
wie sie üblicherweise
von Fachleuten auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht,
verstanden wird. Obwohl jegliche Verfahren, Vorrichtungen und Materialien,
die ähnlich
oder äquivalent
sind zu denjenigen, die hierin beschrieben werden, verwendet werden
können
in der Praxis oder beim Testen der Erfindung, werden nun bevorzugte
Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
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Alle
hierin erwähnten
Veröffentlichungen
werden in Bezug genommen zu Zwecken der Beschreibung und Offenbarung
der Zelllinien, Vektoren und Methodologien, welche in den Veröffentlichungen
beschrieben werden, die in Verbindung mit der vorliegend beschriebenen
Erfindung verwendet werden können.
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Wie
oben zusammengefasst, liefert die vorliegende Erfindung Mediator-stabilisierte
elektrochemische Reagenszusammensetzungen und Verfahren für deren
Verwendung in elektrochemischen Analytdetektionsanwendungen. Bei
der weiteren Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die
vorliegenden Reagenszubereitungen zunächst im größeren Detail beschrieben, gefolgt
von einer Übersicht
der elektrochemischen Reagensteststreifen, die die vorliegenden
Zubereitungen einschließen,
und der Verfahren zur Verwendung derselben, um elektrochemisch die
Gegenwart eines Analyts, z. B. quantitativ, in einer Probe zu detektieren. Schließlich wird
ein Überblick
der repräsentativen
Systeme und Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
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MEDIATOR-STABILISIERTE REAGENSZUSAMMENSETZUNGEN
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Wie
oben zusammengefasst, liefert die vorliegende Erfindung Mediator-stabilisierte
elektrochemische Reagenszusammensetzungen. Die vorliegenden elektrochemischen
Reagenszusammensetzungen sind Zusammensetzungen, die Anwendung finden
in elektrochemischen Analytdetektionsvorrichtungen, z. B. Teststreifen,
und sind typische Redoxreagenszusammensetzungen. Mit einer Mediator-stabilisierten
Reagenszusammensetzung ist eine Zusammensetzung gemeint, in der
die Mediatorkomponente der Zusammensetzung nicht zu einer reduzierten
Form für
eine ausgewählte
Zeitdauer unter typischen Lagerbedingungen umgewandelt wird. Mit
typischen Lagerbedingungen ist eine Temperatur im Bereich von etwa –20 bis
etwa 55, üblicherweise
von etwa 5 bis etwa 40°C,
und eine Feuchtigkeit im Bereich von etwa 5 bis 90%, üblicherweise
von etwa 10 bis etwa 60%, gemeint. Die vorliegenden Mediator-stabilisierten
Reagenszusammensetzungen sind für
Lagerdauern im Bereich von etwa größer als 18 Monaten stabil.
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Die
vorliegenden Mediator-stabilisierten elektrochemischen Reagenszusammensetzungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung schließen
wenigstens die folgenden Komponenten ein: ein Enzym, einen Redoxmediator
und einen Mediator-stabilisierenden Puffer. Die vorliegenden Redoxreagenszusammensetzungen können ferner
eine oder mehrere zusätzliche
Komponenten, einschließend
Benetzungsmittel, Detergentien, Enzymcofaktoren und dergleichen,
einschließen.
Jede dieser Komponenten wird nun getrennt im größeren Detail beschrieben.
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Enzymkomponente
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Die
Enzymkomponente der vorliegenden Reagenszusammensetzungen ist in
vielen Ausführungsformen
ein Enzym oder eine Vielzahl von Enzymen, das bzw. die zusammenarbeiten,
um das Analyt von Interesse zu oxidieren. Mit anderen Worten kann
das Enzymelement aus einem einzelnen Analyt oxidierenden Enzym oder
einer Ansammlung von zwei oder mehreren Enzymen aufgebaut sein,
die zusammenarbeiten, um das interessierende Analyt zu oxidieren,
was die Erzeugung des detektierten elektrochemischen Signals erlaubt. Enzyme
von Interesse schließen
Oxidasen, Dehydrogenasen, Lipasen, Kinasen, Diaphorasen, Chinoproteine und
dergleichen ein.
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Das
in der Reaktion ausgewählte
Enzym hängt
von dem bestimmten Analyt ab, für
das der elektrochemische Teststreifen, der das Enzym umfasst, ausgelegt
ist, um es zu detektieren.
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Veranschaulichende
Enzyme schließen
ein: Glucoseoxidase, Glucosedehydrogenase, Cholesterolesterase,
Cholesteroloxidase, Lipoproteinlipase, Glycerolkinase, Glycerol-3-phosphatoxidase,
Lactatoxidase, Lactatdehydrogenase, Pyruvatoxidase, Alkoholoxidase,
Bilirubinoxidase, Uricase und der gleichen.
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Redoxmediator
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Eine
weitere Komponente der Reagenszusammensetzung ist ein Redoxmediator,
der ein oder mehrere Mediatoragentien umfassen kann. Der Mediator
wirkt als ein Vermittler, der den Transfer von Elektronen von dem
Enzym (das ein oder mehrere Elektronen von dem Analyt während der
Analytoxidation genommen hat) zur Elektrode vereinfacht. Eine Vielzahl
unterschiedlicher Mediatoragentien, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind, kann verwendet werden, einschließend Ferricyanid, Phenazinethosulphat,
Phenazinmethosulfat, Phenylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethylphenylendiamin,
1-Methoxyphenazinmethosulfat, 2,5-Dimethyl-1,4-benzochinon, 2,6-Dimethyl-1,4-benzochinon,
2,5-Dichlor-1,4-benzochinon, Ferrocenderivate, Osmiumbipyridylkomplexe,
Rutheniumkomplexe und dergleichen. In vielen Ausführungsformen
ist der Redoxmediator Ferricyanid.
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Mediator-stabilisierende Pufferkomponente
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Eine
weitere Komponente der Reagenszusammensetzung ist eine Mediator-stabilisierende
Pufferkomponente. Die vorliegenden Mediator-stabilisierenden Pufferkomponenten
können
aufgebaut sein aus einem oder mehreren, z. B. zwei, drei, vier oder
mehr, unterschiedlichen Pufferagentien, wobei die Pufferkomponente
den Mediator während
der Lagerung der Zusammensetzung in trockner Form stabilisiert,
so dass wenig, wenn überhaupt,
des Mediators vor der Verwendung, z. B. während der Lagerung, reduziert
wird. Ein Puffer wird als einen Mediator stabilisierend angesehen,
wenn, in der Gegenwart des Puffers, wenig, wenn überhaupt, des Mediators in
eine reduzierte Form über
eine gegebene Lagerdauer, wie es oben beschrieben wird, umgewandelt
wird. Geeignete Puffer sind Puffer, die nicht dafür sorgen,
dass das Untergrundsignal in einem elektrochemischen Test mit der
Zeit zunimmt, wie es unter Verwendung der im experimentellen Abschnitt
unten beschriebenen Untersuchungen bestimmt wird. Das Hintergrundsignal
ist das Signal, das erhalten wird, wenn die analytfreie Probe in
das elektrochemische Testsystem eingeführt wird.
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Die
Pufferkomponente, wenn sie in einer fluiden Reaktionsmischung vorhanden
ist, die hergestellt wird durch Kombinieren der Reagenszusammensetzung
mit der zu untersuchenden Probe, ist eine Komponente, die den pH-Wert
der Reaktionsmischung in einem annehmbaren Bereich hält, wobei
in vielen Ausführungsformen
die Pufferkomponente den pH-Bereich der Reaktionsmischung in einem
Wertebereich von etwa 4,0 bis 8,0, beispielsweise von etwa 5,0 bis
7,5, wie von etwa 5,5 bis etwa 7,0, hält.
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Das
eine oder die mehreren Pufferagentien der Pufferkomponente weisen
einen pKa auf, der die obengenannten pH-Bereiche in Reaktionsmischungen
bereitstellt, die mit den vorliegenden Reagenszubereitungen hergestellt
werden. Geeignete Pufferagentien weisen typischerweise pKa-Werte
von etwa 4 bis etwa 8, beispielsweise von etwa 4,5 bis etwa 7,5,
einschließend
von etwa 5,0 bis 7,0, einschließend
von etwa 5,5 bis 7,0, auf. Bestimmte Pufferagentien können mehr
als einen pKa-Wert aufweisen, und solche Typen können eingesetzt werden, solange
wenigstens einer ihrer pKa-Werte in die oben beschriebenen Bereiche
fällt.
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Die
in den vorliegenden Reagenszusammensetzungen eingesetzten Pufferagentien
sollten wenig, wenn überhaupt,
Bindungsaffinität
für zweiwertige
Metallkationen, z. B. Ca2+, Mg2+,
etc., aufweisen, so dass sie eine geringe Neigung dazu haben, polydentate
Bindungskomplexe mit zweiwertigen Metallkationen zu bilden. Für ein gegebenes
Pufferagens wird angenommen, eine geringe Bindungsaffinität für zweiwertige
Metallkationen aufzuweisen, wenn seine Bindungsaffinität für zweiwertige
Metallkationen kleiner ist als die Bindungsaffinität irgendeines
Enzym/Cofaktor-Komplexes in der Reaktionsmischung für die gleichen
zweiwertigen Metallkationen, wo die Bindungsaffinität geeigneter
Pufferagentien typischerweise wenigstens etwa das zweifache, üblicherweise
wenigstens etwa das Fünffache
und noch üblicher
wenigstens etwa das Zehnfache, z. B. Fünfundzwanzigfache, Fünfzigfache,
etc. geringer ist als die Bindungsaffinität eines Enzym/Cofaktorkomplexes
in der Reaktionsmischung für
das gleiche zweiwertige Metallkation. Die Stabilitätskonstante
für die
Komplexierung geeigneter Pufferagentien für zweiwertige Metallkationen,
insbesondere Ca2+, gemessen unter Verwendung
der in Annali di Chimica, Band 73, (1983), S. 619 beschriebenen
Untersuchung, übersteigt
typischerweise nicht etwa 1.500, üblicherweise nicht etwa 100
und noch üblicher
nicht etwa 5 mol–1dm3.
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In
bestimmten Ausführungsformen
sind die Pufferagentien kleine organische Moleküle. Mit klein ist gemeint,
dass das Molekulargewicht der vorliegenden Agentien etwa 5.000 Dalton
nicht übersteigt
und typischerweise etwa 2.500 Dalton und noch typischerweise etwa
1.000 Dalton nicht übersteigt,
wobei in vielen Ausführungsformen
das Molekulargewicht der Pufferagentien in einem Bereich von etwa
50 bis 750 Dalton, z. B. von etwa 75 bis 500 Dalton, liegt.
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In
einer Ausführungsform
sind die Pufferagentien Polycarbonsäuren. Mit Polycarbonsäuren ist
gemeint, dass die Pufferagentien zwei oder mehr funktionelle Carbonsäureeinheiten
einschließen,
wobei die Anzahl an unterschiedlichen funktionellen Carbonsäureeinheiten
im Bereich von etwa 2 bis etwa 10, z. B. von etwa 2 bis etwa 8,
einschließend
von etwa 2 bis etwa 6, liegen kann. Die Carbonsäuregruppen oder funktionellen
Einheiten der vorliegenden Pufferagentien können an eine Anzahl unterschiedlicher
Strukturen angefügt werden,
einschließend
aliphatische, alicyclische, aromatische und heterocyclische Strukturen.
Die Gegenwart von mehr als einer Carbonsäuregruppe kann den vorteilhaften
Effekt aufweisen, wenigstens einen pKa-Wert für den Puffer im gewünschten
Bereich bereitzustellen.
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In
vielen Ausführungsformen
sind die zwei oder mehr Carbonsäuregruppen
der vorliegenden Polycarbonsäurepufferagentien
so konfiguriert, dass sie sterisch die Polydentatbindung von zweiwertigen
Metallionen, wie Ca2+ und dergleichen, behindern.
Beispielsweise sind Pufferagentien mit zwei oder mehr Carbonsäuregruppen,
die in einer cis-Position an einer stabilen Hauptkette, die keine
Bewegung der cis-Gruppen relativ zueinander, z. B. eine an einer
Ethylenhauptkette, etc., erlaubt, von Interesse, wobei die stabile
Hauptkette ein Teil einer längeren
Struktur sein kann, z. B. ein aromatischer Ring, etc.
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In
bestimmten Ausführungsformen
werden die Pufferagentien durch die folgende Formel:
beschrieben, wobei R
1 und R
2 unabhängig H oder
organische Einheiten von einem oder mehreren Kohlenstoffatomen sind,
die linear oder verzweigt und substituiert mit einem oder mehreren
Heteroatomen sein können, wobei
R
1 und R
2 zusammengenommen
werden können,
um eine Ringstruktur zu bilden, z. B. eine aromatische Ringstruktur
und dergleichen.
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Spezifische
Polycarbonsäuren
von Interesse schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Mellithsäure, Citraconsäure, Maleinsäure und
dergleichen, etc.
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In
Bezug auf die obigen Pufferagentien können die Pufferagentien in
den vorliegenden Reagenszubereitungen als ihre freien Säuren oder
Salze derselben oder in beiden Formen vorliegen.
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Ein
Merkmal der vorliegenden Pufferkomponente ist, dass das bzw. die
Agens bzw. Agentien, das bzw. die die Pufferkomponente ausbildet
bzw. ausbilden, in einer Menge vorhanden ist bzw. sind, die ausreichend ist,
um die oben beschriebene Mediatorstabilisierungskapazität bereitzustellen.
In fluiden Zusammensetzungen der vorliegenden Reagenszubereitungen
reicht die Konzentration der Pufferkomponente typischerweise von
etwa 0,1 bis etwa 1.000 mM, z. B. von etwa 0,5 bis 500 mM. In bestimmten
Ausführungsformen
ist die Pufferkomponente in einer geringen Konzentration, z. B.
von etwa 0,5 bis etwa 250 mM, üblicherweise
von etwa 0,5 bis etwa 100 mM, vorhanden. In bestimmten Ausführungsformen
ist die Pufferkomponente in einer höheren Konzentration vorhanden,
z. B. von etwa 50 bis etwa 500 mM. Wo die Reagenszusammensetzung eine
trockene Reagenszubereitung ist, wie sie z. B. vorhanden sein kann
in einem elektrochemischen Teststreifen, wie es im größerem Detail
unten beschrieben wird, reicht die Menge der vorhandenen Pufferkomponente
in der trockenen Zusammensetzung typischerweise von etwa 0,01 bis
40,00, üblicherweise
von etwa 1 bis 10% Gewicht/Gewicht.
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Optionale Komponenten
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Wie
oben angegeben, kann die Reagenszusammensetzung ferner eine oder
mehrere der folgenden zusätzlichen
Komponenten einschließen:
Benetzungsagens, Detergens, Coenzym, Enzymcofaktor, Stabilisator,
Viskositätsmodifizierer
oder Kombinationen derselben.
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Benetzungsagns und Detergentien
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Ein
Benetzungsagens kann in einigen Ausführungsformen in Kombination
mit einem Detergens zur Reagenszusammensetzung zugegeben werden,
um eine einheitliche Beschichtung der Reagenszusammensetzung auf
einem elektrochemischen Teststreifen zu verbessern. Eine Vielzahl
einer oder mehrerer Agentienkombinationen kann ebenfalls verwendet
werden. Die verwendeten Agentien können eine Auflösung der
Untersuchungsreagentien sowie eine Verbesserung der Aufsaugeigenschaften
eines Kapillarfüllstreifens
verbessern. Die Agentien schließen
solche ein, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. Polymere,
Antischäumungsmittel
und oberflächenaktive
Mittel. Veranschaulichende Typen von oberflächenaktiven Mitteln/Detergentien
von Interesse schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Tritons, Macols, Tetronics,
Silwets, Zonyls und Pluronics.
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Geeignete
Agentien schließen
Pluronic-Materialien ein, welches Block-Copolymere von Polyethylenoxid
und Polypropylenoxid sind. Beispiele von Pluronic-Materialien schließen Pluronic
P103 ein, welches gute Benetzungseigenschaften aufweist, und Pluronic
F87-Pril, welches gute Detergenseigenschaften aufweist. Sowohl Pluronic
P103 als auch F87 Pril weisen ebenfalls eine Trübungspunkttemperatur von größer als
80°C auf,
was wünschenswert
ist, da diese Eigenschaft eine Phasenänderung in der Zusammensetzung
während des
Trocknungsverfahrens vermeidet.
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Enzym-Coenzyme
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Coenzyme,
die die Enzymkomponente der vorliegenden Zubereitungen aktivieren,
können
ebenfalls zur Reagenszusammensetzung zugegeben werden, wenn es gewünscht ist.
Ein Beispiel eines Coenzyms von Interesse ist Pyrrolochinolinchinon
(PQQ). Andere Cofaktoren von Interesse schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt
auf: Nikotinamidadenindinukleotid (NAD), Flavinadenindinukleotid
(FAD), Cytochrom und dergleichen, abhängig von der Art des Enzyms,
das auf das Testreagens aufgetragen wird.
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Enzymcofaktoren
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In
bestimmten Ausführungsformen
können
die vorliegenden Zusammensetzungen ferner ein oder mehrere Enzymcofaktoren
einschließen.
Enzymcofaktoren von Interesse schließen zweiwertige Metallkationen,
z. B. Ca2+, Mg2+,
etc. ein.
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Stabilisatoren
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Stabilisatoren
können
zur Reagenszusammensetzung zugegeben werden, um dabei zu helfen,
das Enzym zu stabilisieren und die Denaturierung des Proteins zu
verhindern. Der Stabilisator kann ebenfalls dazu dienen, den Redoxzustand
des Mediators zu stabilisieren, insbesondere des oxidierten Redoxmediators.
Beispiele von Stabilisierungsmitteln schließen ein, sind jedoch nicht
begrenzt auf: Kohlenhydrate (z. B. Sucrose, Trehalose, Mannitol
und Lactose), Aminosäuren,
Proteine (wie BSA und Albumin) und organische Verbindungen, wie
EDTA und dergleichen.
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Viskositätsmodifizierer
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Viskositätsmodifizierer
können
ebenfalls zum Reagens zugegeben werden, um die Rheologie des flüssigen Reagens
zu modifizieren. Beispiele solcher Agentien schließen Poly(acrylsäure), Poly(vinylalkohol), Dextran,
BSA und dergleichen ein.
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Zusätzliche Merkmale
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Die
Reagenszusammensetzung kann in einer trocknen oder flüssigen Form
vorliegen. Die Mengen der verschiedenen Komponenten, wie sie oben
beschrieben werden, können
variieren, und die folgenden, spezifisch bereitgestellten Mengen
sind lediglich zu Veranschaulichungszwecken dargelegt.
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In
flüssigen
Zubereitungen der vorliegenden Reagenszusammensetzungen ist die
Enzymkomponente typischerweise in einem Konzentrationsbereich von
etwa 35 bis etwa 450, üblicherweise
von etwa 130 bis 270 μM
vorhanden. Der Mediator ist typischerweise in einer Menge im Bereich
von 250 bis etwa 1.000, üblicherweise
von etwa 500 bis etwa 1.000 mM vorhanden. Die stabilisierende Pufferkomponente
ist in Bereichen vorhanden, wie sie oben beschrieben werden. Die
Konzentration irgendeines Coenzyms reicht typischerweise von etwa
60 bis etwa 670 μM, üblicherweise
von etwa 200 bis 430 μM.
Die Konzentration irgendwelcher Cofaktoren reicht typischerweise
von etwa 0,5 bis etwa 5 mM.
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In
trockenen Zubereitungen reicht die Menge der Enzymkomponente typischerweise
von etwa 1,5 bis etwa 15, üblicherweise
von etwa 5 bis etwa 10% Gewicht/Gewicht (trocken). Der Mediator
ist typischerweise in einer Menge im Bereich von etwa 60 bis etwa
85, üblicherweise
von etwa 75 bis etwa 85% Gewicht/Gewicht (trocken) vorhanden. Die
stabilisierende Pufferkomponente ist in Bereichen vorhanden, wie
sie oben dargelegt werden. Die Menge irgendwelcher Coenzyme reicht
typischerweise von etwa 0,01 bis etwa 0,1, üblicherweise von etwa 0,03
bis etwa 0,06% Gewicht/Gewicht (trocken). Die Menge irgendwelcher
Cofaktoren reicht typischerweise von etwa 0,02 bis etwa 0,2% Gewicht/Gewicht
(trocken).
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Veranschaulichende spezifische Zubereitung
von Interesse:
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In
einer veranschaulichenden spezifischen Zubereitung von Interesse
schließt
die Zubereitung Glucosedehydrogenase als das Enzym und PQQ als ein
Coenzym ein. Ebenfalls vorhanden ist ein Enzymcofaktor Ca2+. In diesen Zubereitungen bindet PQQ mit
GDH und Ca2+, um das aktivierte Enzym zu
bilden, oder ein Holo-Enzym. Es ist bekannt, dass zwei PQQ-Moleküle pro GDH-Dimermolekül erforderlich
sind, um das Enzym vollständig
zu aktivieren. In einigen Ausführungsformen
liegt das Molverhältnis
von PQQ zu GDH in den Reagenszusammensetzungen zwischen etwa 2 bis
etwa 4. In weiteren Ausführungsformen
ist das Molverhältnis von
PQQ zu GDH zwischen etwa 2,2 bis etwa 2,5. Die Aktivität des GDH-PQQ-Holoenzyms in
diesen veranschaulichenden Zubereitungen liegt typischerweise im
Bereich von etwa 10 bis 1.000 kU/ml, üblicherweise wenigstens etwa
50 bis 300 kU/ml. Die Enzymaktivität wird bestimmt unter Verwendung
einer spektrophotometrischen Untersuchung, die bei 30°C durchgeführt wird.
Typischerweise werden 3 Teile Enzymlösung mit 100 Teilen Substratlösung vermischt.
Als nächstes
wird das Extinktionsverhältnis
bei 600 nm über
eine 5-sekündige
Dauer überwacht.
Die Substratbildung umfasst 112 mM Glucose, 2 mM Phenazinethosulfat,
60 nM 2,6-Dichlorindophenol und 50 mM Piperazin, N,N'-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)
bei pH 6,8. Die Enzymlösung umfasst
etwa 0,25 bis 0,50 mg/ml GDH, 1,25 μM PQQ, 1,25 mM CaCl2, 0,1% (w/v)
Rinderserumalbumin und 50 mM PIPES bei pH 6,8. Die Menge an Ca2+, wie sie z. B. durch CaCl2 bereitgestellt
wird, reicht typischerweise von etwa 0 bis 10 mM. Der Mediator in
dieser spezifischen Zubereitung von Interesse ist Ferricyanid, das
typischerweise in Mengen im Bereich von etwa 0,1 bis 10 M, überlicherweise
von etwa 0,3 bis etwa 1,0 M vorhanden ist. Wenn vorhanden, ist die
Benetzungsagens/Detergenskomponente in einer Menge im Bereich von etwa
0,01 bis 1,0% Gewicht/Gewicht vorhanden. Wenn vorhanden, ist Sucrose
in einer Menge im Bereich von etwa 10 bis etwa 1.000 mM vorhanden.
Die Pufferagentien von spezifischem Interesse sind Citraconsäure und oder
Mellithsäure,
und diese sind in den oben angegebenen Bereichen vorhanden.
-
ELEKTROCHEMISCHE ZELLEN
-
Wie
oben zusammengefasst, werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls
elektrische Zellen bereitgestellt, die die vorliegenden Reagenszusammensetzungen
einschließen.
Eine Vielzahl unterschiedlicher Arten elektrochemischer Zellkonfigurationen
sind bekannt, einschließend
solche, die in den
US-Patenten: 5,723,284 ;
5,834,224 ;
5,942,102 ,
5,972,199 ;
5,997,817 ;
6,083,710 ;
6,121,009 ;
6,134,461 ; und
6,193,873 ; sowie anderen Patentdokumenten:
WO 99/49307 ;
WO 97/18465 ;
WO 01/57510 ;
WO/01/57238 ;
WO 02/48707 ;
WO 02/50609 ;
EP 0 969 097 A2 und
GB 2 304 628 beschrieben
werden. Jede dieser und anderer elektrochemischer Zellen, die Fachleuten
auf dem Gebiet bekannt sind, kann modifiziert werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen
aufzunehmen.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
ist die elektrochemische Zelle in einem elektrochemischen Teststreifen
vorhanden. Eine Darstellung eines elektrochemischen Teststreifens
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist in 1 und 2 bereitgestellt. 1 liefert
eine Explosionsansicht eines elektrochemischen Teststreifens, der
aufgebaut ist aus einer Arbeitselektrode 12 und einer Bezugselektrode 14,
die durch eine Abstandsschicht 16 getrennt sind, die einen
Aufschnittsabschnitt 18 aufweist, der die Reaktionszone
oder den -bereich im zusammengesetzten Streifen definiert. 2 zeigt
den gleichen Teststreifen in zusammengesetzter Form. Jede der verschiedenen
Komponenten wird nun in größerem Detail
unten beschrieben.
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Elektroden
-
Die
vorliegenden elektrochemischen Teststreifen, die die Reagenszusammensetzungen
umfassen, schließen
eine Arbeitselektrode und eine Bezugselektrode ein. Im allgemeinen
sind die Arbeits- und Bezugselektroden in der Form von länglichen
rechteckigen Streifen konfiguriert. Typischerweise reicht die Länge der Elektroden
von etwa 1,9 bis etwa 4,5 cm, üblicherweise
von etwa 2 bis etwa 2,8 cm. Die Breite der Elektroden reicht von
etwa 0,38 bis etwa 0,76 cm, üblicherweise
von etwa 0,51 bis etwa 0,67 cm. Die Bezugselektroden weisen typischerweise
eine Dicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 nm und üblicherweise
von etwa 18 bis etwa 22 nm auf. In bestimmten Ausführungsformen
ist die Länge
einer der Elektroden kürzer
als die Länge
der anderen Elektrode, wobei in bestimmten Ausführungsformen sie etwa 0,32
cm kürzer
ist.
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Die
Arbeits- und Bezugselektroden sind ferner dadurch gekennzeichnet,
dass wenigstens die Oberfläche
der Elektroden, die dem Reaktionsbereich im Streifen zugewandt ist,
ein leitfähiges
Material ist, z. B. ein Metall oder ein anderes leitfähiges Material,
wobei veranschaulichende Materialien von Interesse einschließen, jedoch
nicht begrenzt sind auf: Palladium, Gold, Platin, Silber Iridium,
Kohlenstoff Zinnoxid, rostfreier Stahl und dergleichen. In bestimmten
Ausführungsformen
ist das leitfähige
Material Gold oder Palladium. Während
im Prinzip die gesamte Elektrode aus dem leitfähigen Material aufgebaut sein
kann, wird jede der Elektroden üblicherweise
gebildet aus einem inerten Trägermaterial,
auf dessen Oberfläche
eine dünne
Schicht der leitfähigen
Materialkomponente der Elektrode vorhanden ist. Jegliches herkömmliches
inertes Rückenmaterial kann
in den vorliegenden Elektroden eingesetzt werden, wobei das Material
typischerweise ein starres Material ist, das eine strukturelle Stütze für die Elektrode
und ebenfalls für
den elektrochemischen Teststreifen als ein Ganzes bereitstellen
kann. Geeignete Materialien, die als das Rückensubstrat eingesetzt werden
können, schließen Kunststoffe
ein, z. B. PET, PETG, Polyimid, Polycarbonat, Polystyrol, Silicium,
Keramik, Glas und dergleichen.
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Abstandsschicht
-
Ein
Merkmal der vorliegenden elektrochemischen Teststreifen ist, dass
die oben beschriebenen Arbeits- und Bezugselektroden einander zugewandt
sind und getrennt sind durch lediglich einen kurzen Abstand 10,
so dass der Abstand zwischen der Arbeits- und Bezugselektrode in
der Reaktionszone oder dem -bereich des elektrochemischen Teststreifens äußerst klein
ist. Dieser minimale Abstand der Arbeits- und Bezugselektroden in
den vorliegenden Teststreifen ist ein Ergebnis der Gegenwart einer
dünnen
Abstandsschicht, die zwischen den Arbeits- und Bezugselektroden
angeordnet oder sandwichartig positioniert ist. Die Dicke dieser
Abstandsschicht reicht im allgemeinen von etwa 1 bis etwa 500 μm, üblicherweise
von etwa 100 bis etwa 200 μm. Die
Abstandsschicht ist so geschnitten, um eine Reaktionszone oder einen
-bereich mit wenigstens einer Einlassöffnung in die Reaktionszone
bereitzustellen, und im allgemeinen ebenfalls einer Auslassöffnung aus
der Reaktionszone heraus. Eine veranschaulichende Abstandsschichtkonfiguration
kann in 1 und 2 erkannt
werden. Während
die Abstandsschicht in diesen Figuren mit einem kreisförmigen Reaktionsbereichsschnitt
mit Seiteneinlass- und -auslassdurchlässen oder -öffnungen gezeigt ist, sind
andere Konfigurationen möglich,
z. B. quadratisch, oval, dreieickig, rechteckig, unregelmäßig geformte
Reaktionsbereiche, etc. Die Abstandsschicht kann aus irgendeinem
herkömmlichen
Material hergestellt sein, wobei veranschaulichende geeignete Materialien
PEG, PETG, Polyimid, Polycarbonat und dergleichen einschließen, wobei
die Oberflächen der
Abstandsschicht so behandelt werden können, um in Bezug auf ihre
entsprechenden Elektroden hauend zu sein und dadurch die Struktur
des elektrochemischen Teststreifens halten. Von besonderem Interesse
ist die Verwendung eines stanzgeschnittenen, doppelseitigen Klebstoffstreifens
als die Abstandsschicht.
-
Reaktionszone
-
Die
vorliegenden elektrochemischen Teststreifen schließen eine
Reaktionszone oder einen Reaktionsbereich ein, die bzw. der durch
die Arbeitselektrode, die Bezugselektrode und die Abstandsschicht
definiert ist, wobei diese Elemente oben beschrieben wurden. Spezifischerweise
definieren die Arbeits- und Bezugselektroden die Oberseite und Unterseite
des Reaktionsbereichs, während
die Abstandsschicht die Wände
des Reaktionsbereichs definiert. Das Volumen des Reaktionsbereichs
ist wenigstens etwa 0,1 μl, üblicherweise
wenigstens 1 μl
und mehr, üblicherweise
wenigstens 1,5 μl,
wobei das Volumen so groß sein
kann wie 10 μl
oder größer. Wie
oben erwähnt,
schließt
der Reaktionsbereich im allgemeinen wenigstens eine Einlassöffnung ein, und
in vielen Ausführungsformen
ebenfalls eine Auslassöffnung.
Der Querschnittsbereich der Einlass- und Auslassöffnungen kann variieren, solange
er ausreichend groß ist,
um einen effektiven Eingang oder Ausgang von Fluid aus dem Reaktionsbereich
bereitzustellen, erreicht jedoch im allgemeinen etwa 9 × 10–5 bis
etwa 5 × 10–3 cm2, überlicherweise
etwa 5 × 10–4 bis
etwa 2,5 × 10–3 cm–2.
-
Vorhanden
in der Reaktionszone ist eine Reagenszubereitung gemäß der vorliegenden
Erfindung, wobei die Reagenszubereitung typischerweise in einer
trockenen Form vorhanden ist.
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ANALYTDETEKTIONSVERFAHREN
-
Ebenfalls
bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren
zur Verwendung der vorliegenden Reagenszusammensetzungen, um die
Konzentration eines Analyts in einer physiologischen Probe zu bestimmen.
Aus praktischen Gründen
werden die Verfahren in Bezug auf die oben veranschaulichten Teststreifen
beschrieben. Jedoch ist die Erfindung nicht darauf begrenzt, da
jegliches Verfahren zum Detektieren eines Analyts unter Verwendung
der vorliegenden Reagenszusammensetzungen in einer elektrochemischen Zelle
innerhalb der Erfindung eingeschlossen ist.
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Die
Verfahren schließen
ein Aufbringen der Probe auf einen elektrochemischen Teststreifen
ein, der die Reagenszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
einschließt,
ein Detektieren eines elektrischen Signals, das durch den Teststreifen
erzeugt wird und ein Inbeziehungsetzen des detektierten elektrischen
Signals mit der Konzentration des Analyts in der Probe. Eine Vielzahl
unterschiedlicher Analyte kann unter Verwendung der vorliegenden
Teststreifen detektiert werden, wobei veranschaulichende Analyte
Glucose, Cholesterol, Lactat, Alkohol und dergleichen einschließen. In
vielen bevorzugten Ausführungsformen
werden die vorliegenden Verfahren eingesetzt, um die Glucosekonzentration
in einer physiologischen Probe zu bestimmen. Während im Prinzip die vorliegenden
Verfahren verwendet werden können,
um die Konzentration eines Analyts in einer Vielzahl unterschiedlicher
physiologischer Proben, wie Urin, Tränenflüssigkeit, Speichel und dergleichen,
zu bestimmen, sind sie insbesondere geeignet zur Verwendung in der
Bestimmung der Konzentration eines Analyts in Blut oder Blutfraktionen
und insbesondere in Vollblut.
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Bei
der Durchführung
der vorliegenden Verfahren besteht der erste Schritt darin, eine
Menge der physiologischen Probe in den Reaktionsbereich des Teststreifens
einzuführen,
wobei der elektrochemische Teststreifen oben beschrieben wird. Die
Menge der physiologischen Probe, z. B. Blut, die in den Reaktionsbereich des
Teststreifens eingeführt
wird, kann variieren, reicht jedoch im allgemeinen von etwa 0,05
bis etwa 10 μl, üblicherweise
von etwa 0,5 bis etwa 1,6 μl.
Die Probe kann in den Reaktionsbereich unter Verwendung eines herkömmlichen
Protokolls eingeführt
werden, wobei die Probe in den Reaktionsbereich injiziert werden
kann, in den Reaktionsbereich aufgesaugt werden kann und dergleichen,
wie es praktisch ist.
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Folgend
der Auftragung der Probe auf die Reaktionszone wird eine elektrochemische
Messung unter Verwendung der Bezugs- und Arbeitselektroden durchgeführt. Die
elektrochemische Messung, die durchgeführt wird, kann variieren abhängig von
der bestimmten Natur der Untersuchung und der Vorrichtung, mit der der
elektrochemische Teststreifen eingesetzt wird, z. B. abhängig davon,
ob die Untersuchung coulometrisch, amperiometrisch oder potentiometrisch
ist. Im allgemeinen wird die elektrochemische Messung Ladung (coulometrisch),
Strom (amperometrisch) oder Potential (potentiometrisch) messen, üblicherweise über eine
gegebene Zeitdauer folgend der Probeneinführung in den Reaktionsraum.
Verfahren zum Durchführen
der oben beschriebenen elektrochemischen Messung werden weiter in
US 4,224,125 ;
4,545,382 ; und
5,266,179 ; sowie in
WO 97/18465 ;
WO 99/49307 beschrieben.
-
Folgend
der Detektion des elektrochemischen Signals, das in der Reaktionszone
wie oben beschrieben erzeugt wird, wird dann die Menge des Analyts,
die in der Probe, die in die Reaktionszone eingeführt wurde,
vorhanden ist, durch Inbeziehungsetzen des elektrochemischen Signals
mit der Menge des Analyts in der Probe bestimmt. Beim Bilden dieser
Ableitung wird das gemessene elektrochemische Signal typischerweise mit
dem Signal verglichen, das aus einer Reihe von zuvor erhaltenen
Kontrollen oder Standardwerten erzeugt wurde, und wird aus diesem
Vergleich bestimmt. In vielen Ausführungsformen werden die elektrochemischen Messschritte
und Analytkonzentrationsableitschritte, wie oben beschrieben, automatisch
durch eine Vorrichtung durchgeführt,
die so ausgelegt ist, um mit dem Teststreifen zu arbeiten, um einen
Wert der Analytkonzentration in einer Probe, die auf den Teststreifen
aufgetragen ist, zu erzeugen. Eine veranschaulichende Ablesevorrichtung
zum automatischen Durchführen
dieser Schritte, so dass ein Verwender lediglich die Probe auf die Reaktionszone
auftragen muss und dann das Endanalytkonzentrationsergebnis aus
der Vorrichtung ablesen muss, ist ferner in der
US 6,193,873 beschrieben.
-
Die
Verfahren können
eingesetzt werden, um die Konzentration einer Vielzahl unterschiedlicher
Analyte zu bestimmen, wobei veranschaulichende Analyte Glucose,
Cholesterol, Lactat, Alkohol und dergleichen einschließen. In
vielen bevorzugten Ausführungsformen
werden die vorliegenden Verfahren eingesetzt, um die Glucosekonzentration
in einer physiologischen Probe zu bestimmen. Während im Prinzip die vorliegenden Verfahren
verwendet werden können,
um die Konzentration eines Analyts in einer Vielzahl unterschiedlicher physiologischer
Proben, wie Urin, Tränenflüssigkeit,
Speichel und dergleichen, zu bestimmen, sind sie insbesondere geeignet
zur Verwendung in der Bestimmung der Konzentration eines Analyts
in Blut oder Blutfraktionen, zum Beispiel von Blut abgeleiteten
Proben, und insbesondere bei Vollblut.
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SYSTEME
-
Ebenfalls
bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung werden Systeme zur
Verwendung in der Detektion von Analyten, wobei die Systeme eine
Reagenszusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung einschließen,
z. B. vorhanden in einem oben beschriebenen Teststreifen, und eine
Vorrichtung zur Verwendung in der elektrochemischen Untersuchung
einer Probe unter Verwendung der vorliegenden Reagenszusammensetzungen.
-
Die
Vorrichtungen oder Messgeräte
der vorliegenden Systeme sind typischerweise elektrochemische Messvorrichtungen.
Die vorliegenden Messgeräte
schließen
typischerweise ein: (a) ein Mittel zum Beaufschlagen eines elektrischen
Potentials an eine elektrochemische Zelle, in die die Probe eingeführt worden
ist; (b) ein Mittel zum Messen eines Zellstroms in der Zelle; und
(c) ein Mittel zum Inbeziehungsetzen des Stroms zur Konzentration
eines Analyts in der Zelle. Veranschaulichende elektrochemische
Messgeräte
oder Vorrichtungen werden in den
US:
5,723,284 ;
5,834,224 ;
5,942,102 ;
5,972,199 ;
5,997,817 ;
6,083,710 ;
6,121,009 ;
6,134,461 ; und
6,193,873 ; sowie anderen Patentdokumenten:
WO 99/49307 ;
WO 97/18465 ;
WO 01/57510 ;
WO 01/57238 ;
WO 02/48707 ;
WO 02/50609 ;
EP 0 969 097 A2 und
GB 2304628 beschrieben.
-
KITS
-
Ebenfalls
bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung werden Kits zur Verwendung
in der Durchführung
der vorliegenden Verfahren. Die Kits der vorliegenden Erfindung
schließen
die oben beschriebenen Reagenszusammensetzungen ein, wobei die Zusammensetzungen
häufig
in einem oben beschriebenen Teststreifen vorliegen. Die vorliegenden
Kits können
ferner ein Erzielungselement zum Erzielen einer physiologischen
Probe einschließen.
Wo beispielsweise die physiologische Probe Blut ist, können die
vorliegenden Kits ferner ein Element zum Erhalten einer Blutprobe
einschließen,
wie eine Lanze zum Einstechen eines Fingers, ein Lanzenbetätigungsmittel
und dergleichen. Zusätzlich
können
die vorliegenden Kits einen Analytstandard einschließen, z.
B. eine Kontrolllösung,
die eine standardisierte Konzentration an Glucose enthält. In bestimmten
Ausführungsformen
schließen
die Kits ebenfalls ein automatisiertes Instrument ein, wie es oben
beschrieben wird, zur Verwendung mit den Reagenszusammensetzungen
und den Teststreifen, die dasselbe einschließen.
-
Schließlich können die
Kits Instruktionen zur Verwendung der vorliegenden Zusammensetzungen
in der Bestimmung einer Analytkonzentration in einer physiologischen
Probe einschließen.
Die Instruktionen können
auf einem Substrat, wie Papier oder Kunststoff, etc. gedruckt sein.
Als solche können
die Instruktionen in den Kits als ein Verpackungseinsatz, in der
Bezeichnung des Behälters
des Kits oder der Komponenten derselben (d. h. in Verbindung mit
der Verpackung oder der Sub-Verpackung), etc. vorhanden sein. In
anderen Ausführungsformen
sind die Instruktionen als eine elektronische Speicherdatendatei
vorhanden, die auf einem geeigneten computerlesbaren Speichermedium,
z. B. CD-ROM, Diskette etc., vorhanden sind.
-
Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Abgrenzung
angeboten.
-
EXPERIMENTELLES
-
Beispiel 1. Glucoselinearitätsergebnisse
unter Verwendung von Citrat, Malat und Tartrat
-
Zitronensäure-, Äpfelsäure- und
Weinsäurepufferzubereitungen
wurden getrennt mit einer Konzentration von 100 mM und einem pH
von 5,5 zubereitet. Alle 3 Zubereitungen enthielten ebenfalls äquivalente
Mengen von 0,1% Entschäumungsmittel
(RNA Equilibrator), 1 mM CaCl2, PQQ (zweifaches
Molverhältnis
zu GDH), 200 mM Kaliumferricyanid und 45 mg/mL GDH. Die Zubereitung
wurde auf ein Pd-Substrat mittels Tintenstrahl gedruckt. Die Sensoren
wurden mit Glucose enthaltendem Blut unter Verwendung einer Chronoamperometrie
durch Beaufschlagung eines Potentials von –0,3 V für 10 sec getestet und dann
ein Potential von +0,3 V für
5 Sek. beaufschlagt. Das Testen mit Blut zeigte eine gute Linearität für Glucose
für alle
Fälle (3). Der
Hintergrund für
Zitrat- und Malatpuffer war vergleichbar, während derjenige von Weinsäurepuffer
höher war.
Zusätzlich
bildete Weinsäurepuffer
ein unlösliches
Salz mit Ca2+, was es weniger wünschenswert
macht.
-
Beispiel 2. Glucoselinearität und Hämatokritergebnisse
unter Verwendung von Citrat und Mellithat
-
Zitratpuffer
wurde mit 400 mM und pH 5,5 zubereitet. Mellithpuffer wurde mit
160 mM und pH 6,4 zubereitet. Beide Zubereitungen enthielten ebenfalls äquivalente
Mengen von 0,1% Entschäumungsmittel
(RNA Equilibrator), 1 mM CaCl2, PQQ (zweifaches
Molverhältnis
zu GDH), 200 mM Kaliumferricyanid und 32 mg/mL GDH. Das Bluttesten
wurde unter Verwendung von 3 Hämatokritgehalten
(20, 42 und 70%) und 4 Glucosegehalten (4 und 5)
durchgeführt.
Die Glucosereaktion war nicht linear, sondern nahm mit zunehmender Glucosekonzentration
zu. Hämatokritleistung
für Zitratpuffer
war leicht besser als für
Mellithat. Die Ergebnisse sind in 4 und 5 gezeigt.
-
Beispiel 3. Hämatokrit- und Stabilitätsergebnisse
unter Verwendung von Zitrat und Citraconat
-
Zitrat-
und Citraconat wurden getrennt mit einer Konzentration von 300 mM
und einem pH von 6,5 zubereitet. Beide Zubereitungen enthielten
ebenfalls äquivalente
Mengen an 0,1% Entschäumungsmittel
(RNA Equilibrator), 4 mM CaCl
2, PQQ (zweifaches
Molverhältnis
zu GDH), 800 mM Kaliumferricyanid und 46 mg/mL GDH. Zubereitungen
wurden auf Pd mittels Tintenstrahldruckens abgeschieden. Die Hämatokritleistung
für sowohl
Zitrat- als auch Citraconatpuffer war ähnlich (
6 und
7).
Eine beschleunigte Alterung bei 56°C für 14 Tage zeigte, dass Citraconat
einen ausgezeichneten Hintergrund und eine ausgezeichnete Leistungsstabilität verglichen
mit Zitrat (Tabelle 1) aufwies. Die in Tabelle 1 dargestellte Vorspannung
ist als eine absolute Antwortsdifferenz bei einer Glucosekonzentration
von 40 mg/dL gegeben, und als eine prozentuale Vorspannung für eine Glucosekonzentration
von größer als
100 mg/dL. Tabelle 1
| | CITRACONAT | ZITRAT |
| GLUCOSEGEHALT | Vorspannung
zu YSI am Tage 0 | Vorspannung
zu YSI am 14. Tag bei 56°C | Vorspannung
zu YSI am Tage 0 | Vorspannung
zu YSI am 14. Tag bei 56°C |
| 40 | 6,98 | 5,38 | 4,57 | –7,06 |
| 240 | 6,52 | 3,69 | 1,44 | –25,77 |
| 540 | 0 | 1,45 | 0 | –35,35 |
-
Beispiel 4. Linearitäts- und Stabilitätsergebnisse
unter Verwendung von Citraconat und Maleat
-
Citraconat-
und Maleinsäurepuffer
wurden getrennt in einer Konzentration von 300 mM und einem pH von
6,5 hergestellt. Beide Zubereitungen enthielten ebenfalls äquivalente
Mengen an 0,066% Pluronic 25R2, 0,033% Pluronic L62, 4 mM CaCl
2, PQQ (zweifaches Molverhältnis zu
GDH), 800 mM Kaliumferricyanid und 26 mg/mL GDH. Zubereitungen wurden
auf Pd mittels Tintenstrahldruckens abgeschieden. Eine anfängliche Leistungstestung
mit nominellem Hämatokrit
zeigte eine gute Linearität
(
8). Stabilitätsdaten
zeigten einen stabilen Hintergrund in beiden Fällen an; jedoch nahm die Leistung
für Maleinsäurepufferzubereitung
mit den hohen Glucosegehalten ab – ein Anzeichen für Enzyminstabilität (Tabelle
2). Tabelle 2
| | CITRACONAT | MALEAT |
| GLUCOSEGEHALT | Vorspannung
zu YSI am Tage 0 | Vorspannung
zu YSI am 14. Tag bei 56°C | Vorspannung
zu YSI am Tage 0 | Vorspannung
zu YSI am 14. Tag bei 56°C |
| 40 | 6,17 | 4,52 | 0,03 | –0,93 |
| 240 | 7,29 | 3,93 | –0,26 | –10,93 |
| 540 | –3,41 | –0,08 | –12,20 | –25,37 |
-
Beispiel 5 Hämatokrit- und Stabilitätsergebnisse
unter Verwendung von Citraconat und Mellithatpuffern
-
Streifen
wurden in einer ähnlichen
Weise zu Beispiel 4 hergestellt, außer dass das Reagens durch eine
manuelle Pipette abgeschieden und unter einer heißen Platte
mit einem heißen
Luftstrahl getrocknet wurde. 9 und 10 zeigen
die Stabilitätsdaten
für Glucosesensoren,
die mit Citraconat- und Mellithatpuffern hergestellt wurden. Ein
pH von 6,5 wurde mit einer Pufferkonzentration von 105 und 40 mM
für Mellithsäure bzw.
Citraconsäure
gewählt.
Die Sensoren wurden bei 5°C
oder 56°C
für 2 Wochen
gelagert und dann mit 18, 37 und 63% Hämatokritblut getestet.
-
Die
obigen Ergebnisse und die Diskussion zeigen, dass die vorliegende
Erfindung elektrochemische Reagenszusammensetzungen bereitstellt,
in denen der Mediator bei Lagerung stabilisiert ist. Vorteile der
vorliegenden Erfindung schließen
genauere Ergebnisse sowie eine Überwindung
der Notwendigkeit, weniger wünschenswerte
Stabilisierungsmittel einzuschließen und/oder ein Durchführungs-
und Ableseprotokoll zu führen,
ein. Als solche stellt die vorliegende Erfindung einen beträchtlichen
Beitrag zum Stand der Technik dar.
-
Obwohl
die vorangehende Erfindung in gewissem Detail durch Veranschaulichung
und Beispiel zu Zwecken des klaren Verständnisses beschrieben worden
ist, ist es leicht für
Fachleute auf dem Gebiet angesichts der Lehre dieser Erfindung offensichtlich,
dass bestimmte Änderungen
und Modifikationen durchgeführt werden
können,
ohne vom Umfang der beigefügten
Ansprüche
abzuweichen.
