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Bereich der
Erfindung
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Diese
Anmeldung betrifft einen elektrochemischen Einmal-Glukosesensor
von dem Typ, der durch Diabetiker angewendet wird, um Blutglukosespiegel
zu überwachen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Elektrochemische
Einmal-Glukosesensoren in Form von Streifen sind seit über 10 Jahren
kommerziell verfügbar
und werden in verschiedenen Patenten, einschließlich den US-Patenten Nr. 4,711,245,
5,708,247 und 5,802,551 beschrieben. Diese Sensoren verwenden Redoxmediatoren,
um den Ladungsaustausch zwischen Enzym und Elektrode zu erleichtern.
Diese Vorrichtungen bieten erhebliche Verbesserungen gegenüber der älteren optischen
Technologie, wie etwa die Tatsache, dass das Blut nicht in das Messvorrichtung
eintritt und die Messvorrichtung selbst dazu neigen, viel leichter
und weniger sperrig zu sein; aber sie leiden auch an einigen Nachteilen.
Die elektrochemischen Testergebnisse werden üblicherweise durch andere elektroaktive
Spezies, die in der Probe vorhanden sind, und auch durch den Sauerstoffgehalt
und den Hämatokrit der
Probe beeinflusst.
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Der
Grund für
die Interferenz durch elektroaktive Spezies ist sehr einfach. Spezies,
die leicht zu oxidieren sind, führen
zu einem erhöhten
Strom, der zu einem erhöhten
abgelesenen Messwert führt.
Der erhöhte
Strom kann auf eine direkte Oxidation an der Oberfläche der
Elektrode zurückzuführen sein
oder durch Redoxkatalyse auftreten. Einige Hersteller haben versucht,
sich diesem Problem zuzuwenden, indem eine Hilfselektrode verwendet
wurde, um eine Subtraktion des Hintergrundes durchzuführen. Während dieser
Ansatz nützlich
ist, fügt
er einen weiteren Herstellungsschritt hinzu, wodurch zusätzliche
Kosten und eine weitere Messung mit den damit verbundenen Fehlern
hinzugefügt
werden, wodurch die Präzision
abnimmt. Eine Subtraktion des Hintergrunds kann auch zu einer Überkorrektur
führen,
da die Wirksamkeiten der interferierenden Redoxkatalyse an den beiden
Elektroden in Abhängigkeit
von der Analytenkonzentration unterschiedlich sein können.
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Die
Wirkungen von Sauerstoff und Hämatokrit
sind verknüpft.
Sauerstoff ist der natürliche
Cofaktor der Glukoseoxidase, so dass in Gegenwart von Sauerstoff
eine starke Kompetition zwischen Sauerstoff und einem Redoxmediator
auftreten wird, was zu einem unterdrückten Signal führt. Ähnlich werden, da
Hämoglobin
ein hochwirksamer Sauerstoff abgebendes Medium ist, hohe Hämatokrite
in einer Probe ebenfalls zu unterdrückten Signalen führen. Es
sind Ausschlussmembranen, die Blutzellen von der Elektrodenoberfläche fernhalten,
vorgeschlagen worden, die Hämatokritwirkung
zu reduzieren (US-Patent Nr. 5,658,444). Dieser Ansatz fügt zusätzliche
Herstellungsschritte hinzu und ist in jedem Fall nur bei einem Teil
der auf Sauerstoff beruhenden Wirkung wirksam.
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Deshalb
besteht ein Bedarf an elektrochemischen Einmal-Vorrichtungen, welche
Messwerte für Blutanalytenspiegel,
insbesondere Glukose, verfügbar
machen, die so wenig wie möglich
durch die Anwesenheit von interferierenden Substanzen beeinflusst
werden.
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Kurzfassung
der Erfindung
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In Übereinstimmung
mit der Erfindung wird ein elektrochemischer Einmal-Sensor zum Nachweis eines
Analyten, wie etwa Glukose, in einer flüssigen Probe verfügbar gemacht.
Der Sensor umfasst eine Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode,
die in einem Proben aufnehmenden Hohlraum angeordnet sind, eine
Reagenzschicht, die in dem Proben aufnehmenden Hohlraum und über der
Arbeitselektrode angeordnet ist, wobei die Reagenzschicht mindestens
ein Enzym zum Erzeugen eines elektrochemischen Signals in Gegenwart
des Analyten umfasst, wobei der Proben aufnehmende Hohlraum ein
Volumen von weniger als 1,5 μl
aufweist, und wobei der Sensor eine Messung verfügbar macht, die ausreichend
gut mit der Menge des Analyten in einem Zeitraum von 10 Sekunden
oder weniger korreliert (z. B. R2>0,95), um die Verwendung
der Messung zum präzisen
und akkuraten Nachweis und zur Quantifizierung des Analyten zu erlauben.
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Der
Sensor wird in Kombination mit einer Messvorrichtung zum Nachweis
des Analyten in einer flüssigen
Probe verwendet. Eine geeignete Messvorrichtung umfasst einen Zeitschaltkreis
zum Steuern der Messung von Strom, der auf den Analyten in der Probe
hinweist, gefolgt vom Nachweis einer Probenaufgabe auf einem Teststreifen,
der in die Testvorrichtung eingeführt ist, wobei der Zeitschaltkreis
veranlasst, dass eine Messung von Strom zu einer Zeit von 15 Sekunden
oder weniger nach dem Nachweis des Probenauftrags vorgenommen wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 veranschaulicht
die Diffusionsbewegung von Reaktionspartnerspezies in der Nachbarschaft
einer Einmal-Elektrode;
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2 zeigt
einen Querschnitt eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer ersten
Ausführung der
Erfindung;
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3 zeigt
einen Querschnitt eines Biosensors in Übereinstimmung mit einer zweiten
Ausführüng der Erfindung;
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4 zeigt
eine Vorrichtung zum Rollendruck einer „Face-to-Face"-Sensorvorrichtung;
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5 zeigt einen teilweisen Aufbau einer „face-to-face"-Sensorvorrichtung.
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6 zeigt
einen Querschnitt eines Sensors in Übereinstimmung mit der Erfindung;
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7 zeigt
eine Darstellung des Korrelationskoeffizienten gegen die Testzeit;
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8 zeigt
eine Außenansicht
einer Messvorrichtung in Übereinstimmung
mit der Erfindung;
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9A–C zeigt
den Aufbau eines Sensors in Übereinstimmung
mit der Erfindung; und
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10 zeigt
einen Vergleich eines kommerziellen Streifens mit einem Schnellantwortstreifen
in Übereinstimmung
mit der Erfindung.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Der
Schlüssel
zum Verbessern der Leistungsfähigkeit
eines elektrochemischen Streifens liegt im Entwerfen des Streifens,
derart, dass die vermittelte Reaktion gegenüber den interferierenden Reaktionen
bevorzugt wird. Im Fall des Nachweises von Glukose ist die Analyten
spezifische Reaktion eine vermittelte Reaktion, an der die enzymatische Erzeugung
eines reduzierten Mediators, gefolgt durch Oxidation des Mediators
an der Elektrodenoberfläche,
beteiligt ist. Wir schlußfolgerten
deshalb, dass der Test derart konstruiert sein sollte, dass diese
Reaktionen in enger Nachbarschaft zu der Elektrodenoberfläche stattfinden,
um die maximale Abscheideleistung verfügbar zu machen.
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Es
ist erwägenswert,
dass die Diffusionsprozesse während
eines Tests stattfinden. Man berücksichtige
das Auftragen einer Probe auf den Testreifen, wie in 1 gezeigt.
In seinem trockenen Zustand schließt der Teststreifen eine Elektrode
ein, die mit einer Reagenzschicht beschichtet ist, die ein Enzym
E und einen Mediator M enthält.
Die Testprobe enthält
Glukose G elektrochemisch interferierende Substanzen I und Sauerstoff
O2 der an Hämoglobin Hb gebunden sein kann.
Auf das Auftragen der Probe findet ein Netto-Diffusionsfluss von
E und M weg von der Elektrode hin zur Testprobe und einen Netto-Diffusionsfluss
von G und I hin zur Elektrode. Folglich befindet sich zu sehr kurzen
Zeiten nach Probenauftrag das meiste Enzym noch nahe der Elektrode,
und es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die Reaktion mit
Glukose zur Erzeugung eines reduzierten Mediatormoleküls führt, das
nahe genug an der Elektrode ist, um eingefangen zu werden. Zu späteren Zeiten
ist viel von dem Enzym „tiefer" in die Probe diffundiert
und kann hier mit der Glukose reagieren. Dies hat zwei Wirkungen.
Erstens gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass das reduzierte
Enzym durch O2 anstelle von M oxidiert wird,
da die Konzentration von M sich weiter von der Elektrode vermindern
wird und die Konzentration von O2 weiter
von der Elektrode zunehmen wird (aufgrund derselben Reaktion). Selbst
wenn das reduzierte Enzym mit M reagiert, ist die Wahrscheinlichkeit,
dass der reduzierte M zurück
zu der Elektrode diffundiert, um unter gleichzeitiger Erzeugung
eines nachweisbaren Signals reduziert zu werden, gering. Zweitens
hat die gerade beschriebene Abfolge von Reaktionen die Wirkung,
die nach innen diffundierende G zu depletieren, so dass die Menge
an G, die tatsächlich
in dem Hohlraum der Elektrode ankommt, wo sie mit einiger Wirksamkeit
nachgewiesen werden kann, reduziert ist. Eindeutig tragen beide
Faktoren zu einem reduzierten Signal in Gegenwart von Sauerstoff
in der Probe bei.
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Auf ähnliche
Weise sind gängige
interferierende Substanzen leicht oxidierbare Materialien, wie etwa
Ascorbat, Acetaminophen und Harnsäure, die nach Erreichen der
Elektrodenoberfläche
zusammen mit dem reduzierten Mediator, der vorhanden sein kann,
oxidiert werden. Da diese Wirkung nur auftreten kann, wenn in der
Nähe der
Elektrodenoberfläche I
vorhanden sind, wird sie eine kurze Zeit, bevor eine Diffusion von
I zur Elektrode aufgetreten ist, minimal sein.
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Wie
von dieser mechanistischen Erklärung offensichtlich
ist, ist eine Lösung
sowohl der Probleme mit den interferierenden Substanzen als auch
den Hämatokrit-/Sauerstoff-Spiegeln,
die Messung zu sehr kurzen Zeiten durchzuführen. Eine alternative Lösung ist,
das Probenvolumen zu begrenzen, damit der Oberflächenbereich der Elektrode im
Vergleich zum Probenvolumen sehr groß ist. Eine gute Gestaltung
ist eine, die sicherstellt, dass die Probenschicht über der
Elektrode sehr dünn
ist (z. B. <200 μm). Ein Vorteil,
das Probenvolumen zu begrenzen ist, dass sich die Hydrodynamiken
der Lösung
schneller einstellen. Bei einem großen Probenvolumen führen konvektive
Wirkungen in der Probe zu einem Rauschen bei der Messung. Indem
ein kleines Probenvolumen in Form eines dünnen Films aufrechterhalten wird,
werden konvektive Wirkungen minimiert. Dies bedeutet, dass es bei
einem kleinen Probenvolumen möglich
ist, Messungen früher
durchzuführen.
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In
der Praxis stehen diese Lösungen
in Beziehung zueinander und sind beide in die Biosensoren der vorliegenden
Erfindung implementiert. Folglich macht die vorliegende Erfindung
elektrochemische Einmal-Sensoren und zugehörige Messvorrichtungen verfügbar, die
daran angepasst sind, elektrochemische Messungen der Menge eines
Analyten in einer Probe, beispielsweise zur Quantifizierung von Blutglukosespiegeln,
in einer kürzeren
Zeit als bei zuvor bekannten Systemen vorzunehmen. Die Sensoren
der Erfindung ziehen einen Nutzen aus der synergistischen Beziehung
zwischen kurzen Messzeiten und kleinen Probenvolumen, um eine überlegene Leistungsfähigkeit
zu erreichen. Kleine Probenvolumen erlauben aufgrund des frühen Einstellens
hydrodynamischer Effekte eine frühere
Messung und erleichtern dadurch Messungen in kurzen Zeiten. Ein kleines
Probenvolumen erfordert auch Kurzzeitmessungen, da das kleine Signal
bei längeren
Zeiten verschwindet und deshalb einen zuverlässigen Messwert nicht verfügbar machen
kann. Durch die Wahl dieser Art von Gestaltung haben wir sichergestellt, dass
die Mediatorkonzentration so hoch gehalten wird, dass der Mediator
wirksamer mit Sauerstoff um das reduzierte Enzym kompetiert.
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Eine
Vorrichtung zu erhalten, die ein kleines Probenvolumen verwendet,
ist aus der Sicht des Patienten in höchstem Maße wünschenswert. Die Herausforderung
ist, eine Vorrichtung zu schaffen, die ein kleines Probenvolumen
verwendet, um zuverlässige
Messungen der Analytenkonzentration hervorzubringen. Der erste Teil
dieses Verfahren ist die Definition eines kleine Proben aufnehmenden
Hohlraumes. Das Volumen dieses Hohlraumes ist definiert durch die
Fläche
der Elektroden und der Breite des Abstands zwischen den Elektroden.
Es gibt eine untere Begrenzung der Fläche der Elektroden, die durch
jedes vorgegebene Druckverfahren erreicht werden kann, bestimmt
durch eine Definition von Rändern
sowie von Drucktoleranzen. Eine Möglichkeit, diese Präzision zu
verbessern, wenn bekannte Elektrodendrucktinten verwendet werden,
ist durch die Druckmethodik, beschrieben in der Offenlegungsschrift
der allgemein übertragenen
internationalen Patentanmeldung Nr. WO 00/42422.
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Wenn
die „Fläche" der Elektroden erst
einmal minimiert worden ist, wird das Probenvolumen weiter durch
den Abstand zwischen den Elektrodenoberflächen definiert. Das vorrangige
Ziel ist ein geringer, aber einheitlicher Abstand. Man sollte sich
jedoch daran erinnern, dass, wenn ein kleines Probenvolumen durch
Verwendung eines sehr geringen Abstands (d. h. <200 μm)
erhalten wird, die üblichen
Bedingungen einer semi-unendlichen Diffusion nicht erfüllt sein.
Aus diesem Grund kann sich die Diffusionsschicht über die
gesamte Lücke
erstrecken und die Probe erheblich depletieren. Unter diesen Umständen wird
die Präzision
der Vorrichtungen durch den zusätzlichen
Faktor der Präzision
des Verfahrens zum Zusammenbau, das die Größe des Abstands bestimmt, beeinflusst.
Es gibt eine Beziehung zwischen der Messzeit und der Größe, bei
der die Größe des Abstands
wichtig wird, was unter Berücksichtigung
der folgenden Formel verstanden werden kann: L
= √Dt wobei L die Diffusionslänge, D der
Diffusionskoeffizient und t die Zeit ist. Wenn die Testzeit von
15 Sekunden auf 5 Sekunden reduziert wird, wird die Diffusionslänge durch
einen Faktor von √3 reduziert. Was dies unter
praktischen Gesichtspunkten bedeutet, ist, dass man durch Verkürzen der
Messzeit die Größe des Abstands
weiter reduzieren kann ohne unter die begrenzende Bedingung zu geraten,
unter der der Abstand ein wesentlicher Faktor in der Präzision der Vorrichtung
wird. Folglich würde
beispielsweise, wenn man einen Diffusionskoeffizienten von 10–5 cm2sec–1 annimmt, eine Testzeit
von 5 Sekunden einen Abstand von mehr als 70 μm erfordern im Vergleich zu
125 μm,
die bei einer Testzeit von 15 Sekunden erforderlich wären. Unter
Berücksichtigung dieser
Faktoren weist eine geeignete Gestaltung eines Sensors in Übereinstimmung
mit der Erfindung einen Proben aufnehmenden Hohlraum mit einem Volumen
von weniger als 1,5 μl
auf. In Kombination mit Überlegungen
zu der Größe des Abstands
bedeutet dies, dass die Größe der Arbeitselektrode wünschenswerter
Weise derart ist, dass das Verhältnis
der Oberflächenfläche der
Arbeitselektrode zu der Größe des Abstands
ungefähr
0,5 bis 100 mm beträgt.
In einer speziell bevorzugten Gestaltung beträgt die Fläche jeder Elektrode 0,8 mm2, und der Abstand beträgt 100 bis 150 μm, um ein
Proben aufnehmendes Kompartiment mit einem Volumen von 0,5 bis 0,8 μl zu definieren.
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2 zeigt
einen elektrochemischen Sensor 10 in Übereinstimmung mit einer ersten
Ausführung der
Erfindung. Die Elektroden 11 und 12 werden auf einem
Grundsubstrat 13 gebildet. Dieses Grundsubstrat 13 in
Kombination mit Abstandhaltern 14, 15 und einer
oberen Abdeckung 16 definiert einen Hohlraum 17,
in dem die elektrochemischen Reaktionen ablaufen. In einer beispielhaften
Ausführung
weisen die Elektroden eine Oberfläche mit einer Flä che von 5
mm2 auf, und das Volumen des Hohlraums beträgt geeigneter
Weise weniger als 1,5 μl,
vorzugsweise weniger als 1 μl
und besonders bevorzugt weniger als 0,5 μl Eine Vorrichtung von dem in 2 gezeigten
Typ kann wie folgt hergestellt werden. Die Elektroden 11 und 12 werden
auf das Substrat 13 abgeschieden. Die spezielle Art des
Abscheidens wird durch die Natur der Elektroden bestimmt werden,
obwohl der Siebdruck eine bevorzugte Technik für viele Materialien ist. Die
Fläche
der Elektrode, die in der Kammer der Probe ausgesetzt wird, wird
durch Abscheiden einer Isoliermaske über den Elektroden definiert
(Siehe die Offenlegungsschrift der allgemein überschriebenen Internationalen
Patentanmeldung Nr. WO 00/424422). Als nächstes wird die Reagenzschicht
abgeschieden. Diese Schicht kann beide Elektroden bedecken oder
kann sich auf die Fläche über der
Arbeitselektrode beschränken.
Die Abstandhalter 14 und 15 werden dann in einem
Muster um die Elektroden herum gebildet. In einer bevorzugten Ausführung werden
diese beiden Abstandhalter durch Drucken einer Schicht eines Adhäsivs, die
in trockenem Zustand eine Höhe
von ungefähr
150 μm aufweist,
gebildet. Diese Abstandhalter definieren den Kapillarabstand ohne
die Notwendigkeit, ein vorgeformtes, festes Material zu verwenden
und erleichtern deshalb die Herstellung der Vorrichtungen der Erfindung
wesentlich. Der letzte Schritt ist das Auftragen einer Abdeckung 16,
um die Kammer 17 zu vervollständigen. In einer bevorzugten
Ausführung
ist die Abdeckung 16 an der Vorrichtung durch die adhäsiven Abstandhalter 14, 15 befestigt.
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Die 9A–C veranschaulichen
eine spezielle Ausführung
einer Herstellungstechnik zur Herstellung eines Sensors in Übereinstimmung
mit der Erfindung. Die Figur zeigt einen einzelnen Sensor, es wird
jedoch zu begrüßen sein,
dass im Allgemeinen mehr als ein Sensor hergestellt werden wird. 9A zeigt
die Struktur der Vorrichtung vor der Laminierung der Abdeckung.
In diesem Stadium weist der Sensor zwei Elektroden 11, 12 auf,
die auf ein Substrat (zugunsten der Klarheit nicht gezeigt) abgeschieden werden.
Die elektrischen Verbindungen dieser Elektroden werden nicht gezeigt.
Ein Reagenzkissen 100, das beispielsweise ein geeignetes
Enzym für
den Analyten enthält,
wird über
beiden Elektroden abgeschieden. Adhäsive Kissen 101, 102 und 103 werden auf
drei Seiten des Reagenzkissens abgeschieden. Zwei Stücke 104, 105 eines
hydrophiles Films (wie etwa 3M 9962, ein 100 μm dicker, mit einem oberflächenaktiven
Mittel behandelter, optisch klarer Polyesterfilm) werden dann an
zwei Stellen plaziert, wobei eines die adhäsiven Kissen 101 und 102 überspannt
und die Elektroden und das Reagenzkissen bedeckt, und eines einen
Teil eines adhäsiven
Kissens 103 bedeckt, um eine Stütze von einheitlicher Höhe zur Aufnahme
der Abdeckung 116 verfügbar
zu machen (9B). Die Positionen dieser Stücke des hydrophoben
Films schaffen eine Kapillarkammer über den beiden Elektroden.
Die hydrophile Beschichtung des Films fördert durch Kapillarwirkung die
Bewegung der Testflüssigkeit
in die geschaffene Probenkammer. Die Lücke 106, gebildet
in dem Bereich, wo sich kein Abstandhalter oder Film befindet, erlaubt,
dass Luft aus dem hinteren Bereich der Kammer entweicht, so wie
wenn die Testflüssigkeit
sich in die geschaffene Kammer bewegt. Ein druckempfindliches Band
wird als eine obere Abdeckung 116 über die hydrophilen Filme angelegt.
Die obere Abdeckung 116 ist geeigneter Weise aus einem
Polyesterfilm gebildet und kann mit entweder einem hitzeaktivierten
Adhäsiv
oder einem druckempfindlichen Adhäsiv angeordnet sein. Der letzte
Schritt besteht in einem Schneiden der Vorrichtung, um die geeignete Öffnung der
Probenkammer zu schaffen, beispielsweise indem entlang der gestrichelten
Linie C-C in 9B geschnitten wird. 9C zeigt
eine Endansicht der Vorrichtung, nachdem sie entlang dieser Linie
C-C geschnitten worden ist. Wie gezeigt ist der Kapillareingang 110 in
die Probenkammer definiert durch das Substrat 13, die adhäsiven Kissen 101, 102 und
den hydrophilen Film 104 und die obere Abdeckung 116.
Die Filme 104 und 105 werden durch die adhäsiven Kissen 101 und 102 gestützt.
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3 zeigt
einen elektrochemischen Sensor 20 in Übereinstimmung mit einer zweiten
Aus-führung der
Erfindung. Die Elektroden 21 bzw. 22 werden auf
einem Grundsubstrat 23 und einer oberen Abdeckung 26 gebildet.
Das Grundsubstrat 23 in Kombination mit Abstandhaltern 24, 25 und
der oberen Abdeckung 26 definieren einen Hohlraum 27,
in dem die elektrochemischen Reaktionen stattfinden. Der Sensor
ist mit einem kleinen Volumen und einem kleinen Abstand zwischen
dem Grundsubstrat 23 und der oberen Abdeckung 26,
beispielsweise von 50 bis 200 μm,
gestaltet. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass der Oberflächenbereich
der Elektroden sich um die selbe Vorrichtungsgröße aufgrund der gefalteten „face-to-face"-Konfiguration verdoppeln
kann.
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Eine
Vorrichtung mit dieser Struktur kann unter Verwendung der Rollendrucktechnologie,
wie in der allgemein überschriebenen
US-Patentanmeldung 09/537,599, angemeldet am 28. März 2002,
beschrieben, hergestellt werden. Diese Technologie verwendet eine
Apparatur von dem in 2 schematisch gezeigten Typ.
Ein fortlaufendes Netz von Substrat 31 wird auf einer Transportrolle 32 verfügbar gemacht
und wird über
eine Vielzahl von Druckstationen 33, 34 und 35,
wobei jede eine andere Schicht auf das Substrat druckt, transportiert.
Die Anzahl an Druckstationen kann jede Anzahl aufweisen und wird von
der Anzahl an Schichten, die für
die besondere, herzustellende Vorrichtung erforderlich sind, abhängen. Zwischen
aufeinanderfolgenden Druckstationen wird das Netz vorzugsweise durch
einen Trockner 36, 37 und 38 transportiert,
um jede Schicht zu trocknen, bevor mit der Abscheidung der nächsten fortgefahren
wird. Nach dem letzten Trocknungsschritt 38 wird das gedruckte
Netz auf einer Aufnahmerolle aufgenommen oder direkt in eine Apparatur 39 zur Nachbehandlung
eingeführt.
Um eine Vorrichtung mit der in 3 gezeigten
Struktur in dieser Apparatur herzustellen, werden leitfähige Bahnen 71 und 72, eine
Reagenzschicht oder mehrere Reagenzschichten 73 und eine
Isolierschicht 74 auf ein Substrat 70, wie in 5 gezeigt, abgeschieden. Das Substrat wird
dann entlang einer Faltlinie gefaltet, die zwischen den beiden Leitungsbahnen
angeordnet ist, um einen Sensor herzustellen, bei dem zwei „face-to-face"-Elektroden durch eine Reagenzschicht voneinander
getrennt sind. Eine Elektrodengeometrie, bei der die Elektroden
an entgegengesetzten Oberflächen
in dem Hohlraum angeordnet sind, ist vorteilhaft, da der Spannungsverlust,
der auf den Lösungswiderstand
zurückzuführen ist,
als Ergebnis der dünnen
Lösungsschicht,
welche die Elektroden trennt, gering ist.
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In
jeder der Ausführungen
der oben beschriebenen Erfindung wird der Hohlraum durch Isoliermaterialien
definiert. Geeignete Isoliermaterialien für diesen Zweck schließen Nylon,
Polyester, Polycarbonat und Polyvenylchlorid ein. Geeignete Materialien
zur Verwendung als Substrat schließen Polyesterfilme, beispielsweise
einen Polyesterfilm von 300 μm
ein und andere isolierende Substratmaterialien, wie etwa Polyvenylchlorid
(PVC) und Polycarbonat. Ein spezielles druckfähiges dielektrisches Material auf
der Grundlage von Polyester, aus dem die isolierende Maske gebildet
werden kann, ist ERCON R488-B(HV)-B2 Blue. In dem Hohlraum wird
eine Arbeits- und eine Referenzelektrode aus einem leitfähigen Material
gebildet. Geeignete leitfähige
Materialien schließen
leitfähigen
Kohlenstoff, Gold, Platin, Aluminium oder dotierte Halbleitermaterialien,
wie etwa n-Typ SnO2 ein. Bevorzugte leitfähige Kohlenstoffmaterialien
sind ERCON ERC1, ERCON ERC2 und Acheson Carbon Electrodag 423. Kohlenstoff
mit dieser Beschreibung ist verfügbar
von Ercon, Inc. (Waltham, Massachusetts, USA) oder Acheson Colloids
(Princes Rock, Plymouth, England). Halbleiterelektroden bieten eine
attraktive Möglichkeit,
da sie funktionalisiert werden können,
um die Oberflächenanheftung
von Enzymen oder anderen Bestandteilen der Reagenzschicht zu ermöglichen.
Dies macht die Vorteile verfügbar,
die mit einer Immobilisierung verbunden sind, und erlaubt auch einen
direkten Elektrodentransfer zwischen dem Reagenz und der Elektrode.
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Die
Elektroden können
aus verschiedenen Materialien oder aus demselben Material hergestellt sein.
Ausführungen,
bei denen die Elektroden die selbe Zusammensetzung aufweisen, beispielsweise eine
Kohlenstoffelektrode, können
Vorteile bieten. Speziell die Verwendung eines einzelnen Elektrodenmaterials
erlaubt, dass die Arbeits- und die Referenzelektroden in einem einzigen
Schritt abgeschieden werden, wodurch ein Elektrodendruck aus dem
Herstellungsverfahren ausgeschlossen wird. Die zwei Elektroden können sehr
nahe beieinander gedruckt werden, da die Trennung dazwischen lediglich
durch die Druckvorlage auf einem Schirm (Toleranz um ungefähr 200 μm) bestimmt
wird und nicht auf der Anordnung, die zwischen getrennten Druckvorgängen erhalten
werden kann (Toleranz mehr als 0,5 mm). Dies erlaubt, dass der Reaktionsbereich
kompakter ist und dadurch zu einer Reduktion des Volumens an Blut
führt,
das erforderlich ist, um die Elektroden zu bedecken.
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Die
Arbeitselektrode weist eine oder mehrere Reagenzschichten auf, die über der
Elektrode angeordnet sind, die das Enzym und den Mediator, die bei
dem Nachweis des Zielanalyten verwendet werden, enthalten. Deshalb
würde beispielsweise
bei einem Glukosesensor die Reagenzschicht oder die Reagenzschichten
ein Enzym, wie etwa Glukoseoxidase und einen Mediator, wie etwa
Ferricyanid, metallozene Verbindungen, Chinone, Phenaziniumsalze,
der Redoxindikator DCPIP und Imidazol-substituierte Osmiumverbindungen
einschließen.
Die Reagenzschicht kann eine Einzelschicht sein, die sowohl Enzym
als auch Mediator einschließt,
oder kann aus einer Vielzahl von Unterschichten aufgebaut sein, von
denen einige ein Enzym oder ein Enzym und einen Mediator enthalten
und einige nur einen Mediator enthalten.
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Da
beabsichtigt ist, die Vorrichtungen der Erfindung in kurzen Zeitintervallen
zu verwenden, ist ein wichtiges Kennzeichen der Elektroden die Fähigkeit,
rasch zu hydratisieren. Die Hydratisierungsrate wird bestimmt durch
die Zusammensetzung der Reagenzschicht. Ein Elektrodensystem, welches
eine Reagenzschicht auf der Grundlage von Silika von dem in dem
US-Patent Nr. 7,708,247 und in der Offenlegungsschrift der Internationalen
Patentanmeldung Nr. WO 00/42422 verwendet, erlaubt rasches Befeuchten
und Hydratisierung und ist deshalb zur Verwendung bei den Sensoren
der Erfindung geeignet. Das optimale Material für die Reagenzschichten der
Elektroden der Sensoren der Erfindung ist eines, das rasch hydratisiert,
um ein Gel zu bilden, das mit der Elektrodenoberfläche in Kontakt
bleibt und Reagenzien in der Nachbarschaft der Elektrode zurückhält. Falls
die Reagenzschicht nach der Hydratisierung dispergiert, gehen die
Reagenzien (und insbesondere das Enzymreagenz) rasch aus der Nach barschaft
der Elektrodenoberfläche
verloren, wo sie für die
Entwicklung eines Signals, das die Analytenkonzentration in einer
Probe reflektiert, am vorteilhaftesten ist.
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Die
Reagenzschicht muss auch einen Mediator in einer Form enthalten,
die für
die sofortige Beteiligung an der Erzeugung eines Signals, das die Analytenkonzentration
reflektiert, zur Verfügung steht.
Im Fall eines Analyten, wie etwa Glukose, der durch ein Enzym oxidiert
wird, bedeutet dies, dass der Mediator rasch löslich und in der oxidierten
Form vorhanden sein muss. In einem kommerziellen Glukosestreifen,
vertrieben durch Medisense unter dem Markennamen QIDTM und
EXACTECHTM, ist der Mediator wirklich in
der reduzierten Form vorhanden und muss in situ oxidiert werden,
bevor er sich an einer Glukose überwachenden
Reaktion beteiligen kann. Dies begrenzt die Antwortzeit des Streifens
und schließt
seine Verwendung zu kurzen Testzeiten aus.
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Im
Fall der Referenzelektrode muss die Elektrode rasch hydratisiert
werden und auch in der Lage sein, sich rasch genug zu stabilisieren,
um den Strom, der durch die Arbeitselektrode sofort angefordert
wird, zu liefern, z. B. innerhalb von 200 μsec Hydratisierung. Eine herkömmliche
Silber-/Silberchlorid-Referenzelektrode stabilisiert sich nicht
schnell genug. Eine Ferri-Ferrocyanid-Referenz auf der anderen Seite
kann veranlasst werden, sehr rasch zu äquilibrieren. In diesem Entwurf
wird eine einen Mediator enthaltende Schicht verwendet, die in Lösung geht
oder rasch dispergiert. In einer besonderen Ausführung der Erfindung werden
Kohlenstofftintelektroden mit einer Reagenzschicht verwendet, die
Kaliumferricyanid als Mediator enthält. Glukoseoxidase wird als
Enzym in einer Hydroxyethylzellulose-Silica-Grundlage mit Polymeren, die zugegeben
werden, verwendet, um das hydrophile Wesen der Formulierung zu steigern.
Dieses System weist einen hohen Oberflächenbereich auf und wird rasch
durchfeuchtet.
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Zusätzlich zu
der Arbeitselektrode und der Referenzelektrode kann die Vorrichtung
der Erfindung derart aufgebaut sein, dass sie eine dritte Elektrode
einschließt.
Die dritte Elektrode kann eine „Dummy"-Elektrode darstellen mit der Absicht,
Hintergrundreaktionen zu kompensieren oder eine Zählelektrode
eines herkömmlichen
Dreielektrodensystems. Die dritte Elektrode könnte auch eine identische Arbeitselektrode
sein.
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In
den Ausführungen
der oben diskutierten Erfindung gehen alle Schichten rasch in Lösung oder werden
hydratisiert. Während
ein rasches Löslichmachen
oder wenigstens eine Hydrati sierung des oxidierten Mediators kein
Problem für
einen Verbrauch der interferierenden Substanzen darstellt und möglicherweise
dazu beiträgt,
dieses Erfordernis zu erreichen, ist es nicht ganz eine gute Eigenschaft
einer anzymhaltigen Schicht, wie früher beschrieben, da dies die
Enzym-Diffusion weg von dem Bereich in der Nähe der Elektrode, wo er am
vorteilhaftesten ist, erleichtert. Eine nützliche Gestaltung, die beide
Aspekte kombiniert, wird deshalb in 6 gezeigt.
In dieser Ausführung
der Erfindung weist der Sensor 60 einen Hohlraum 67 auf,
der aus einem unteren Substrat 63, Abstandhaltern 64, 65 und
einer oberen Abdeckung 66 gebildet ist. Zwei Kohlenstoffelektroden 61, 62 werden
auf dem unteren Substrat 63 in dem Hohlraum 67 angeordnet.
Die Elektrode 62 ist mit einer relativ dünnen (z.
B. 5 μm)
viskösen
Gelschicht 68 beschichtet, die ein Enzym und einen Mediator
enthält. Beide
Elektroden 61, 62 werden dann mit einer relativ dicken
(z. B. 25 μm)
Dispersionsschicht 69, die einen Mediator, jedoch kein
Enzym enthält,
beschichtet.
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In
einer anderen Ausführung
der Erfindung werden zwei getrennte Schichten aufgebaut, um die Wirkungen
interferierender Substanzen weiter zu reduzieren. Eine Möglichkeit,
den chemischen Verbrauch von interferierenden Substanzen auszunutzen,
ist, eine Reagenzschicht mit einem Überschuss an oxidiertem Mediator
an der Außenseite
verfügbar zu
machen. In einer besonders attraktiven Gestaltung ist eine Elektrode
mit einer dünnen
Reagenzschicht, die ein Enzym und einen Mediator enthält, und
dann mit einer dicken Schicht, die nur einen Mediator enthält, beschichtet.
Beide Schichten werden in einer Matrix, welche die Diffusion begrenzt,
die jedoch rasch hydratisiert wird, damit sie einen Strom leiten
kann, abgeschieden. Um das Enzym auf eine dünne Schicht zu begrenzen, wird
das Enzym in großem
Umfang in enger Nähe
zu der Elektrode gehalten, so dass die oben beschriebenen parasitischen Reaktionen
unwichtig sind. Die dicke äußere Mediatorschicht
macht eine Barriere für
nach innen diffundierende interferierende Substanzen verfügbar und bleibt
aufgrund der diffusionsbegrenzenden Matrix in der gewünschten
Position. Eine optionale dritte Schicht kann außen von den ersten und zweiten Schichten,
die einen Mediator enthalten, in einer rasch hydratisierten dispersionsfähigen Matrix
eingeschlossen sein. Noch einmal wird durch Sicherstellen, dass
das Probenvolumen klein ist, eine Gesamtmenge an einer interferierenden
Substanz in der Probe auf einem Minimum gehalten und die Konzentration
eines oxidierten Mediators zur Rekonstitution ist hoch, damit der
Mediator wirksam die interferierende Substanz entfernt. Offensichtlich
wird nach längerer Zeit
die lokale Konzentration des Mediators abfallen, da er in die Probe
diffundiert und eine Interferenz wird bedeutsamer werden. Nach unserer
Erfahrung ist ein Probenvolumen von weniger als 1 μl, vorzugsweise 0,5 μl, ideal.
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Sensoren,
die in Übereinstimmung
mit der Erfindung hergestellt werden, erlauben das Aufnehmen von
Testmessungen in sehr viel kürzeren
Zeiten, als durch die Verwendung bekannter Sensoren erreicht werden.
Durch Verkürzung
der Testzeit können die
Hämatokrit-Effekte
reduziert werden. Falls der Sensor eine Elektrode umfasst, die mit
einer Reagenzschicht bedeckt ist, die eine Verzögerungswirkung auf bestimmte
Blutbestandteile aufweist, wie etwa weiße Blutzellen und Erythrozyten,
dann wird die Flüssigkeit,
welche die Elektrode erreicht, in kurzer Zeit erheblich weniger
dieser Bestandteile enthalten als nach einer langen Zeit.
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7 zeigt
eine Darstellung eines Korrelationskoeffizienten gegen die Testzeit.
Zu extrem kurzen Testzeiten ist die Korrelation gering, da sich
das System noch nicht stabilisiert hat. Nach sehr langen Testzeiten
beginnt die Korrelation ebenfalls nachzulassen. Angesichts des Ziels,
die Interferenzen durch Verkürzung
der Testzeit zu begrenzen, wird der Test geeigneter Weise in dem
durch die gestrichelten Linien angegebenen System durchgeführt werden,
was für
die unten beschriebenen Sensoren weniger als 10 Sekunden und vorzugsweise
ungefähr
5 Sekunden bedeutet. Die Einmal-Sensoren der Erfindung arbeiten
in Kombination mit einer Testmessvorrichtung, um genaue Messungen
von Glukose in diesem Zeitsystem verfügbar zu machen. Folglich ist
der Sensor derart gestaltet, dass Signale verfügbar gemacht werden, welche
eine genaue und zuverlässige
Information nach kurzer Zeit verfügbar macht, und die Messvorrichtung,
in das der Sensor eingeführt
ist, ist entsprechend angepasst, um während dieser Zeit Informationen
zu sammeln.
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8 zeigt
eine Außenansicht
eines beispielhaften Handmessgeräts
in Übereinstimmung
mit der Erfindung. Wie herkömmliche
Messvorrichtung weist die Messvorrichtung der Erfindung ein Gehäuse 81 mit
einer Anzeige 82 zum Anzeigen der Ergebnisse und einen
Schlitz 83 zum Einführen
des Einmal-Sensors auf. Die Knöpfe 85 und/oder
Schalter können
zur Bedienung der Messvorrichtung eingeschlossen sein, einschließlich zum
Abrufen gespeicherter Ergebnisse, Überprüfen der Kalibrierung und derartiges.
Dort, wo die Messvorrichtung der Erfindung sich von der herkömmlichen
Messvorrichtungt unterscheidet, befindet sich die innere Elektronik
innerhalb des Gehäuses.
In der herkömmlichen
Messvorrichtung löst
das Hinzufügen
einer flüssigen
Probe, wie etwa einem Bluttropfen, zu einem Einmal-Sensor in dem
Gehäuse
einen Messzyklus aus, während
dem Reagenzien in Lösung
gebracht werden und ein Messwert aufgenommen wird. Der Beginn des
Zyklus kann auch durch das Drücken
eines Knopfes durch den Anwender ausgelöst werden, obwohl dies nicht
bevorzugt ist. Der Mikro prozessor in einer Messvorrichtung befindet
sich üblicherweise
in einem „Schlaf`-Modus und „wacht periodisch auf" (beispielsweise
alle 0,5 Sekunden), um Unterbrechungen zu überprüfen. Falls das Programm feststellt,
dass ein Unterbrechungsschalter aktiviert ist, was anzeigt, dass
ein Streifen in die Messvorrichtung eingeführt worden ist, oder dass der
Startknopf gedrückt
worden ist, steigt das Programm in den RUN-Modus ein. In diesem
Modus wird üblicherweise
ein Potential an den Streifen angelegt und der Mikroprozessor überwacht
die Ausgabe (Abgabezyklus) eines Impulsbreitemonitors, der die Stärke jedes Stroms,
der durch den Streifen geleitet wird, anzeigt. Sobald die Probe
auf den Streifen aufgegeben wird, fließt ein Strom, da der Streifen
bereits einem Polarisationspotential unterworfen worden ist. Der
Nachweis dieses Anfangsstroms löst
eine Zeitsteuerungssequenz aus. Die Zeitsteuerung wird durch den
Mikroprozessor gesteuert. Es gibt zwei Kristalle: eine 4 MHz-Uhr
für eine
betriebsbereite Funktion (d. h. Durchführung von Messungen) und eine
32 MHz-Uhr, welche die Zeit in dem „Aus"-Modus hält. Nach Auslösen des
Zeitsteuerungsprozesses kann das angelegte Potential entweder (1)
auf einem konstanten Wert gehalten werden oder (2) nach einem vorgegebenen
Profil variiert werden. In jedem Fall wird der Strom nach einer
vorgegebenen Zeit gemessen, um die Menge an dem Analyten in der
Probe zu beurteilen. Beispielhaft wurden die in 7 gezeigten
Werte in einem System gesammelt, in dem die Probenaufgabe zum Zeitpunkt
t = 0 nachgewiesen wurde, das angelegte Potential wurde 2 Sekunden lang
unterbrochen, wobei der Steifen während dieser Zeit einen offenen
Stromkreis darstellt, und dann wurde das selbe Potential wieder
angelegt. Der Strom wurde zu einer Vielzahl von Zeitpunkten gemessen,
und die Korrelation des Stroms mit der Analytenkonzentration wurde
zu jedem Zeitpunkt bestimmt.
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Bei
kommerziell verfügbaren
Messvorrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind, wird der
Messzyklus festgelegt, um die Strommessung bei 20 bis 60 Sekunden
nach dem Nachweis der Probe durchzuführen. Bei den Messvorrichtungen
der Erfindung, die insbesondere an die Verwendung mit Schnellteststreifen
(„rapid-response") der Erfindung angepasst
sind, wird der Messzyklus festgelegt, um Strommessungen zu einer
Zeit von 15 Sekunden oder weniger nach dem Nachweis der Probe, und vorzugsweise
zu einer Zeit von 5 bis 10 Sekunden nach dem Nachweis der Probe
durchzuführen.
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Die
Erfindung wird jetzt weiter beschrieben werden unter Bezugnahme
auf die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele.
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Beispiel 1
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Schnelltest-Glukosesensoren
in Übereinstimmung
mit der Erfindung wurden unter Verwendung der in den 9A–C dargestellten
Verfahren und den folgenden Materialien hergestellt:
Substrat:
Polyesterfilm
Zusammensetzung mit Kohlenstofftinte: Ercon leitfähiger Kohlenstoff
Reagenzschicht-Zusammensetzung:
wie unten beschrieben
Adhäsiv:
Acrylcopolymer-Adhäsiv
auf Wasserbasis (Apollo Adhesives)
Hydrophiler Film: 3M 100 μm hydrophiler
Film 9962
Obere Abdeckung: Mit druckempfindlichem Adhäsiv beschichtete
Polyesterstreifen (Tape Specialities)
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Die
Reagenzschicht wurde wie folgt formuliert. 100 ml von 100 mM wässrigem
Trinatriumcitrat wurden auf pH 5 durch Zugabe von 1 M Zitronensäure eingestellt.
Hierzu wurden 5g Hydroxyethylzellulose (HEC), 1g Polyvinylalkohol,
1g PVP-VA S-630 Poly(vinylpyrrolidonvinylacetat) und 0,5 ml DC 1500 Dow
Corning Antischaum zugegeben und durch Homogenisierung gemischt.
Die Mischung wurde über Nacht
stehengelassen, um Luftblasen die Möglichkeit zu geben, zu dispergieren,
und dann als eine Stammlösung
für die
Formulierung der Zusammensetzung für die Beschichtung verwendet.
7,5 g Cab-o-Sil TS610 wurden stufenweise mit der Hand zu der HEC-Lösung gegeben,
bis ungefähr
4/5 der Gesamtmenge zugesetzt war. Der Rest wurde durch Mischen
durch Homogenisierung zugesetzt. Die Mischung wurde dann 12 Stunden
gerollt. 11g Kaliumferricyanid wurden dann zugesetzt und durch Homogenisierung
gemischt, bis sie vollständig
gelöst
waren. Schließlich
wurden 2,8g einer Glukoseoxidase-Enzympräparation (250 Units/mg) zugesetzt
und dann sorgfältig
unter die Lösung
gemischt. Die sich ergebende Formulierung war fertig zum Drucken oder
konnte unter Kühlung
gelagert werden.
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Die
Sensoren wurden verwendet, um Standard-Glukoselösungen zu testen, und es wurde
der Strom zu verschiedenen Zeitpunkten nach Aufgabe der Glukose
auf den Sensor gemessen. Der Korrelationskoeffizient zwischen der
aktuellen Glukosekonzentration und der gemessenen Glukosekonzentration
wurde für
jedes Zeitintervall bestimmt. 7 zeigt eine
Darstellung der Ergebnisse. Wie gezeigt, hat der Korrelationskoeffizient
ein Maximum und hohe Werte bis zu 5 Sekunden nach Zugabe von Glukose
zu dem Sensor erreicht.
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Beispiel 2
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Schnelltest-Glukosesensoren
in Übereinstimmung
mit der Erfindung wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Diese Sensoren
wurden verwendet, um die Menge an Strom 5 Sekunden nach Kontakt
mit verschiedenen Konzentrationen an Glukose zu bestimmen. Zum Vergleich
wurde ein Medisense QID-Glukosesensor unter denselben Bedingungen getestet. 10 zeigt
die Ergebnisse dieses Experiments graphisch. Wie gezeigt, ist die
Linearität
der Antwort des Schnelltestensors in Übereinstimmung mit der Erfindung
sehr gut (R2 = 0,999). Die Linearität des QID-Sensors
nach 5 Sekunden war nicht so gut (R2 = 0,863).