JPH1194790A

JPH1194790A - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH1194790A
Application number: JP9267812A
Authority: JP
Inventors: Masao Goto; 正男後藤
Original assignee: Nok Corp
Current assignee: Nok Corp
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 1999-04-09

Abstract

(57)【要約】【課題】酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極
とを対面構造をとるように配置したバイオセンサにおい
て、製作工程を容易化し、その製作コストを低減せしめ
たものを提供する。【解決手段】酸化還元酵素を固定化した作用極とその
対極とを対面構造をとるように配置したバイオセンサに
おいて、これらの各電極を内側に設けた各基板を接着剤
層を介して接着せしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素を電
極上に固定化したバイオセンサに関する。更に詳しく
は、酸化還元酵素を電極上に固定化し、作用極と対極と
を対面構造をとるように配置したバイオセンサに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】グルコースオキシダーゼを作用極上に固
定化せしめた従来のグルコースバイオセンサにあって
は、作用極以外に対極あるいは対極と参照極とが平面状
基板の同一面上に配置されている。このような電極配置
のグルコースバイオセンサにおいて、測定サンプルを電
極に接触させるには２つの方法がとられている。

【０００３】その第１の方法は、直接測定サンプルを電
極上に滴下する方法であるが、この方法ではサンプリン
グから滴下迄手間と時間を要するという問題がある。そ
の第２の方法は、電極基板の上に溝を有するスペーサを
配置し、その上に更に空気孔を設けたカバーを配置した
構造のものを用いるという方法である。この方法では、
測定サンプルが直接電極上に導かれるため手間や時間が
とられないという利点がある反面、空気孔の設置を必要
とするなど、素子製作において煩雑な工程を必要とする
という欠点を有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本出願人は先
に、グルコースオキシダーゼを電極上に固定化せしめた
グルコースバイオセンサであって、製作および測定が容
易であり、従って使い捨てグルコースバイオセンサとし
て好適なものとして、作用極および対極とを対面構造を
とるように配置し、より具体的には作用極を配置した基
板と対極を配置した基板との間にスペーサを介在させる
ことにより対面構造をとるように配置したものを提案し
ている(特願平8-175585号)。

【０００５】しかしながら、作用極-対極間の対面構造
を実現するために、これらの電極を配置した基板の間に
スペーサを介在させることは、製作工程が煩雑になるば
かりではなく、コストアップにもつながるという問題が
みられた。

【０００６】本発明の目的は、酸化還元酵素を固定化し
た作用極とその対極とを対面構造をとるように配置した
バイオセンサにおいて、製作工程を容易化し、その製作
コストを低減せしめたものを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを対面構
造をとるように配置したバイオセンサにおいて、これら
の各電極を内側に設けた各基板を接着剤層を介して接着
せしめることによって達成される。

【０００８】

【発明の実施の形態】図1は、本発明に係るバイオセン
サの一態様の斜視図であり、図2は、作用極を設けた基
板の平面図である。基板1には作用極2が、また基板3に
はその対極4が設けられており、基板テーパー部8側の作
用極2上には酸化還元酵素-電子伝達体混合物層5が形成
されている。そして、作用極2の混合物層5およびリード
部6を除く部分には、接着剤層7が形成されている。

【０００９】基板としては、ポリエチレンテレフタレー
トによって代表されるプラスチック、生分解性プラスチ
ック、ガラス、セラミックス、紙等の絶縁性基板であっ
て、フィルム、シートまたは板状のものが用いられる。
作用極、対極およびこれらのリード部の形成は、カーボ
ン、銀、金等のペーストを用いるスクリーン印刷法ある
いはカーボン箔、パラジム箔を用いる箔付け法などによ
って行われ、これらは不織布などによって研磨処理され
た上で用いられることが好ましい。更に、必要に応じて
作用極側あるいは対極側の基板上に参照極を配置するこ
ともでき、参照極の形成は、スクリーン印刷法、蒸着
法、スパッタリング法などによって一旦銀電極を形成さ
せた後、それを塩化銀化する方法などによって行われ
る。

【００１０】固定化せしめる酸化還元酵素としては、グ
ルコースオキシダーゼ乳酸オキシダーゼ、アルコールオ
キシダーゼ、ピルビル酸オキシダーゼ、グルコースデヒ
ドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビル
酸デヒドロゲナーゼ等があり、これらによってグルコー
ス、乳酸、アルコール、ピルビン酸、抗原等の有機物
質、塩素イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、
水素イオン、溶存酸素等の電解質や無機物質の濃度測定
が可能であるが、最も一般的に用いられるグルコースオ
キシダーゼによるグルコース濃度の測定法について、以
下では塗布乾燥法（吸着法）を例にして説明することと
する。尚、塗布乾燥法以外に、共有結合法、イオン結合
法、架橋法などが、グルコースオキシダーゼの固定化方
法として用いられる。

【００１１】グルコースオキシダーゼは、一般には作用
極上に固定化せしめるが、グルコースオキシダーゼは測
定サンプルである水溶液中に溶解され、作用極上で反応
するようになるため、作用極周辺、対極またはその周辺
などに固定化させていてもよい。

【００１２】グルコースオキシダーゼの電極への固定
化、好ましくは作用極上への固定化は、以下に列挙され
る如く、グルコースオキシダーゼ単体としてばかりでは
なく、電子伝達体(メディエータ)およびアルブミンの少
なくとも一種を添加した混合物層としても形成される。 (1)グルコースオキシダーゼ層 (2)グルコースオキシダーゼ-電子伝達体混合物層 (3)グルコースオキシダーゼ-アルブミン混合物層 (4)グルコースオキシダーゼ-電子伝達体-アルブミン混
合物層

【００１３】グルコースオキシダーゼ層(1)の形成は、
グルコースオキシダーゼ(GOD)を、例えば165800単位/g
のGODの場合その約1〜50mg、好ましくは約5〜30mgを蒸
留水またはクエン酸緩衝液(約0.05〜0.2M濃度)１mlに溶
解させ、その溶液(GOD溶液)約0.5〜10μl、好ましくは
約1〜3μlを滴下法、スピンコート法などによって滴下
し、室温で乾燥させて、膜厚約1〜200μm、好ましくは
約50〜150μmの層を形成させることにより行われる。

【００１４】混合物層(2)〜(4)の場合にも、この場合と
同様の形成方法が行われ、ただしGOD水溶液中に更に次
の各成分が添加された溶液が用いられる。混合物層(2)の場合：フェリシアン化カリウム、パラベ
ンゾキノン等が電子伝達体として用いられ、フェリシア
ン化カリウムにあっては約1〜100mg、好ましくは約30〜
60mgを、パラベンゾキノンにあっては約1〜200mg、好ま
しくは約50〜150mgを更に添加した溶液を使用混合物層(3)の場合：牛血清アルブミンを約1〜100mg、
好ましくは約5〜30mgを更に添加した溶液を使用混合物層(4)の場合：混合物層(2)の形成に用いられた量
の電子伝達体および混合物層(3)の形成に用いられた量
の牛血清アルブミンを更に添加した溶液を使用

【００１５】添加された電子伝達体は下記の如く作用
し、またアルブミンやクエン酸緩衝液の添加は、測定液
(グルコース水溶液)のpH変化に対して出力誤差を抑制
し、バラツキのより少ない測定結果を与える。また、ノ
ニオン系界面活性剤を電極付近に塗布することにより、
測定液の吸引、それに引続く混合層の溶解に寄与し、測
定精度を向上させるという効果も得られる。

【００１６】グルコースがGODの作用により酵素の存在
下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき
発生するH₂O₂を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値
を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求め
る方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈
されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素
濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl程
度迄しか直線検量範囲を示さない。

【００１７】そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代
わりに、電子伝達体がGODと共に用いられる。メディエ
ータがフェリシアン化カリウムK₃Fe(CN)₆の場合、この
反応は次のように進行する。この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化さ
れて酸化電流を生ずる。

【００１８】また、メディエータとしてフェリシアン化
カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合に
は、GOD存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの
反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキ
ノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値
が測定される。

【００１９】一方、対極上には、特に何も固定化しなく
とも使用し得るが、アルブミンおよび電子伝達体の少な
くとも一種からなる混合物層を形成させて用いてもよ
い。この場合には、作用極上のみに混合物層を設けた場
合にみられる測定液による混合物層の溶解、拡散に生じ
勝ちな傾きがみられなくなる利点があり、測定精度も上
昇する。

【００２０】なお、固定化せしめたGODへの測定サンプ
ル液の接触を円滑に行わしめるために、作用極上、対極
上、作用極周辺、対極周辺、作用極上およびその周辺、
対極上およびその周辺などに、ノニオン系界面活性剤を
塗布したり、不織布、ロ紙等の含浸促進剤をスペーサ間
隙を利用して挾着させるなどの手段を適用することも可
能である。

【００２１】作用極を設けた基板および対極を設けた基
板の接着は、一般に両面接着不織布などの両面接着テー
プによって行われる。形成された接着剤層の厚さは、当
然作用極および対極が接触しない間隔を保ち得るもので
なければならず、約100〜500μm(約0.1〜0.5mm)、好ま
しくは約150〜350μm(約0.15〜0.35mm)に設定される。

【００２２】両面接着テープの代りに、アクリル樹脂等
からなる等からなる接着剤を一方または両方の基板上の
所定位置にスクリーン印刷法で塗布し、これら両基板を
上記間隔を保った状態で接着させることもできる。更
に、接着剤層7の下には、その長さより長い長さで、熱
硬化性ポリエステル樹脂等からなる絶縁膜9を、約5〜25
μmの厚さで設けることもできる[図3参照]。

【００２３】また、作用極または対極が設けられる基板
の一端側8は、図1に示されるように、とがった形状のテ
ーパー状とし、それによって測定液が微小量ではあって
もそれを直接採取することができ、従って電極との接触
も速やかに行われるようにされるが、図4に示されるよ
うに、電極が設けられる基板の一端側をテーパー状とは
せず、凸部形状10とすることもできる。

【００２４】グルコース濃度の測定は、このようにして
作製されたグルコースバイオセンサの両電極間に形成さ
れる空間に、所定濃度のグルコース水溶液約0.1〜10μl
を吸引して電極と接触させ、約1〜120秒間程度反応させ
た後、そこに約0.05〜1.5V、好ましくは約0.4〜1.1Vの
電圧を印加し、印加0.5〜50秒後の電流値を測定するポ
テンシャルステップクロノアンペロメトリー法によって
行われる。測定には、ポテンショガルバノスタットおよ
びファンクションジェネレータが用いられる。

【００２５】

【発明の効果】酸化還元酵素を固定化した作用極とその
対極とを、これらの各電極を内側に設けた各基板を接着
剤層を介して接着させることにより、対面構造をとるよ
うに配置した本発明のバイオセンサは、製作が容易であ
り、またその製作コストも低減される。

【００２６】

【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。

【００２７】実施例１一端側がテーパー状のポリエチレンテレフタレート基板
2枚を用意し、それぞれの基板上にカーボン製電極をス
クリーン印刷法によって、膜厚10μmで形成させた。そ
の一方のカーボン製電極上に、水1mlにグルコースオキ
シダーゼ(165800U/g)10mgおよびフェリシアン化カリウ
ム48mgよりなる混合液(ドープ液)を1.5μl滴下して室温
条件下で乾燥させ、グルコースオキシダーゼ-フェリシ
アン化カリウム混合物層(厚さ約100μm)を形成させて作
用極とした。

【００２８】このようにして得られた混合物層形成作用
極を設けた基板Aと対極を設けた基板Bとを用い、下記の
如き種々の態様で両面接着テープ(日東電工製品500番;
厚さ160μm)を接着剤層として貼り合せた。 (1)混合物層形成作用極を設けた基板Aと対極を設けた基
板Bとを、基板A側に設けた接着剤層によって貼り合せた
もの (2)混合物層形成作用極を設けた基板Aと基板Bとを、基
板A側に設けた接着剤層によって貼り合せたもの (3)混合物層形成作用極を設けた基板A同志を接着剤層に
よって貼り合せたもの（一方が対極となる） (4)上記(1)で各電極と各基板との間に絶縁層(熱硬化性
ポリエステル樹脂を用いたスクリーン印刷法で膜厚20μ
mで形成)を設けたもの (5)上記(1)で各電極が不織布で研磨処理されたもの

【００２９】これらのグルコースバイオセンサに、濃度
250mg/dlのグルコース水溶液(pH5.0)1μlを吸引させ、2
0秒間静置した後、作用極-対極間に0.9Vの電圧を印加
し、印加10秒後の電流値を10回測定した。測定には、ポ
テンショガルバノスタット(北斗電工製HA-501)およびフ
ァンクションジェネレータ(同社製HB-104)が用いられ
た。その測定値からCV値(平均値に対する標準偏差の割
合)を算出すると、それぞれ(1)4.5%、(2)4.3%、(3)4.1
%、(4)4.4%、(5)4.0%という値が得られた。なお、セン
サは、一試料毎に使い捨てとした。また、グルコース濃
度を種々変更して測定を行ったところ、0〜1000mg/dlの
範囲内で直線性が得られた。

【００３０】実施例２実施例1の(1)で、pHを7.0に調整したグルコース水溶液
を用い、またドープ液中にアルブミン10mgを添加したも
のが用いられた。CV値は、4.8%であった。

【００３１】実施例３実施例1の(1)で、pHを7.0に調整したグルコース水溶液
を用い、またドープ液として水の代りに0.1Mクエン酸緩
衝液(pH5.0)を用いて調製されたものが用いられた。CV
値は、4.7%であった。

【００３２】実施例４実施例1の(1)で、pHを7.0に調整したグルコース水溶液
を用い、またドープ液中にアルブミン10mgを添加すると
共に、水の代りに0.1Mクエン酸緩衝液(pH5.0)を用いて
調製されたものが用いられた。CV値は、4.6%であった。

【００３３】実施例５実施例4で、ドープ液中に更にノニオン系界面活性剤(UC
C社製品トリトンX-100)を0.5重量%の濃度で添加したも
のが用いられた。CV値は、4.5%であった。

【００３４】実施例６実施例1の(1)で、界面活性剤(トリトンX-100)の0.5重量
%水溶液を作用極の周辺に塗布し、乾燥させたものが用
いられた。CV値は、4.4%であった。

【００３５】なお、実施例2〜6の各グルコースバイオセ
ンサについても、グルコース濃度0〜1000mg/dlの範囲内
で直線性が得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るバイオセンサの一態様の斜視図で
ある。

【図２】作用極を設けた基板の平面図である。

【図３】絶縁層を設けた基板の平面図である。

【図４】先端部を凸部形状とした基板の平面図である。

【符号の説明】

１作用極側基板２作用極３対極側基板４対極５酸化還元酵素-電子伝達体混合物層６リード部７接着剤層８基板テーパー部９絶縁膜 10 凸部形状

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酸化還元酵素を固定化した作用極とその
対極とを対面構造をとるように配置したバイオセンサに
おいて、これらの各電極を内側に設けた各基板を接着剤
層を介して接着せしめてなるバイオセンサ。
【請求項２】接着剤層の形成が両面接着テープによっ
て行われる請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項３】接着剤層が一方の基板上に塗布された接
着剤によって形成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項４】接着剤層が両方の基板上に塗布された接
着剤によって形成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項５】電極形成基板と接着剤層との間に絶縁層
が形成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項６】各基板の一端側がそれぞれテーパー状に
形成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項７】各基板の一端側がそれぞれ凸部形状に形
成された請求項1記載のバイオセンサ。
【請求項８】作用極上に酸化還元酵素-電子伝達体混
合物層が形成された請求項1記載のバイオセンサ。