JP2007178446A

JP2007178446A - バイオセンサ

Info

Publication number: JP2007178446A
Application number: JP2007054413A
Authority: JP
Inventors: Masao Goto; 正男後藤
Original assignee: Therasense Inc
Current assignee: Therasense Inc
Priority date: 2007-03-05
Filing date: 2007-03-05
Publication date: 2007-07-12

Abstract

【課題】酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを平面状基板の同一面上に配置したバイオセンサにおいて、測定サンプルの採取および測定が容易であり、かつ素子製作が容易であるものを提供する。
【解決手段】酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを同一基板上の先端部に設け、これら電極形成部分より後方に設けられた接着剤層を介して他方の基板を接着させることにより、各基板の先端部間に測定サンプル保持空間を形成せしめたバイオセンサ。
【選択図】図１

Description

本発明は、バイオセンサに関する。更に詳しくは、酸化還元酵素を電極上に固定化したバイオセンサに関する。

グルコースオキシダーゼを作用極上に固定化せしめた従来のグルコースバイオセンサにあっては、作用極以外に対極あるいは対極と参照極とが平面状基板の同一面上に配置されている。このような電極配置のグルコースバイオセンサにおいて、測定サンプルを電極に接触させるには２つの方法がとられている。

その第１の方法は、直接測定サンプルを電極上に滴下する方法であるが、この方法ではサンプリングから滴下迄手間と時間を要するという問題がある。その第２の方法は、電極基板の上に溝を有するスペーサを配置し、その上に更に空気孔を設けたカバーを配置した構造のものを用いるという方法である。この方法では、測定サンプルが直接電極上に導かれるため手間や時間がとられないという利点がある反面、空気孔の設置を必要とするなど、素子製作において煩雑な工程を必要とするという欠点を有している。

本発明の目的は、酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを平面状基板の同一面上に配置したバイオセンサにおいて、測定サンプルの採取および測定が容易であり、かつ素子製作が容易であるものを提供することにある。

かかる本発明の目的は、酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを同一基板上の先端部に設け、これら電極形成部分より後方に設けられた接着剤層を介して他方の基板を接着させることにより、各基板の先端部間に測定サンプル保持空間を形成せしめたバイオセンサによって達成される。

図１は、本発明に係るバイオセンサの一態様の斜視図であり、図２は、酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを先端部に設けた基板の平面図である。
基板１には、作用極２およびその対極３が、その先端部であるテーパー部４に設けられており、作用極２上には酸化還元酵素５が固定化されている。これらの電極形成部分より後方、より具体的にはこれら先端部に設けられた各電極２，３およびそれらのリード部末端部６，７の間の基板部分を、他方の基板８と接着剤層９を介して接着させることにより、各基板１，８の先端部間に測定サンプル保持空間10を形成せしめている。なお接着剤層は粘着剤層であってもよい。

基板としては、ポリエチレンテレフタレートによって代表されるプラスチック、生分解性プラスチック、ガラス、セラミックス、紙等の絶縁性基板であって、フィルム、シートまたは板状のものが用いられる。作用極、対極およびこれらのリード部の形成は、カーボン、銀、金等のペーストを用いるスクリーン印刷法あるいはカーボン箔、パラジム箔を用いる箔付け法などによって行われ、これらは不織布などによって研磨処理された上で用いられることが好ましい。更に、必要に応じて作用極および対極を設けた基板上に参照極を配置することもでき、参照極の形成は、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦銀電極を形成させた後、それを塩化銀化する方法などによって行われる。

固定化せしめる酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビル酸オキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビル酸デヒドロゲナーゼ等があり、これらによってグルコース、乳酸、アルコール、ピルビン酸、抗原等の有機物質の濃度測定が可能であるが、最も一般的に用いられるグルコースオキシダーゼによるグルコース濃度の測定法について、以下では塗布乾燥法（吸着法）を例にして説明することとする。尚、塗布乾燥法以外に、共有結合法、イオン結合法、架橋法などが、グルコースオキシダーゼの固定化方法として用いられる。

グルコースオキシダーゼは、一般には作用極上に固定化せしめるが、グルコースオキシダーゼは測定サンプルである水溶液中に溶解され、作用極上で反応するようになるため、作用極周辺、対極またはその周辺などに固定化させていてもよい。

グルコースオキシダーゼの電極への固定化、好ましくは作用極上への固定化は、以下に列挙される如く、グルコースオキシダーゼ単体としてばかりではなく、電子伝達体( メディエータ) およびアルブミンの少なくとも一種を添加した混合物層としても形成される。(1) グルコースオキシダーゼ層
(2) グルコースオキシダーゼ- 電子伝達体混合物層
(3) グルコースオキシダーゼ- アルブミン混合物層
(4) グルコースオキシダーゼ- 電子伝達体- アルブミン混合物層
グルコースオキシダーゼ層(1) の形成は、グルコースオキシダーゼ(GOD) を、例えば165800単位/gのGOD の場合その約1 〜50mg、好ましくは約5 〜30mgを蒸留水またはクエン酸緩衝液( 約0.05〜0.2M濃度) １mlに溶解させ、その溶液(GOD溶液) 約0.5 〜10μl 、好ましくは約1 〜3 μl を滴下法、スピンコート法などによって滴下し、室温で乾燥させて、膜厚約1 〜200 μm 、好ましくは約50〜150 μm の層を形成させることにより行われる。

混合物層(2) 〜(4) の場合にも、この場合と同様の形成方法が行われ、ただしGOD 水溶液中に更に次の各成分が添加された溶液が用いられる。
混合物層(2) の場合：フェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が電子伝達体として用いられ、フェリシアン化カリウムにあっては約1 〜100mg 、好ましくは約30〜60mgを、パラベンゾキノンにあっては約1 〜200mg 、好ましくは約50〜150mg を更に添加した溶液を使用
混合物層(3) の場合：牛血清アルブミンを約1 〜100mg 、好ましくは約5 〜30mgを更に添加した溶液を使用
混合物層(4) の場合：混合物層(2) の形成に用いられた量の電子伝達体および混合物層(3) の形成に用いられた量の牛血清アルブミンを更に添加した溶液を使用
添加された電子伝達体は下記の如く作用し、またアルブミンやクエン酸緩衝液の添加は、測定液( グルコース水溶液) のpH変化に対して出力誤差を抑制し、バラツキのより少ない測定結果を与える。また、ノニオン系界面活性剤を電極付近に塗布することにより、測定液の吸引、それに引続く混合層の溶解に寄与し、測定精度を向上させるという効果も得られる。

グルコースがGO D の作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生するH₂O₂を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl程度迄しか直線検量範囲を示さない。

そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、電子伝達体がGOD と共に用いられる
。メディエータがフェリシアン化カリウムK₃Fe(CN)₆の場合、この反応は次のように進行する。

この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。

また、メディエータとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、GOD 存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。

好ましくは作用極より大きな面積( 約1.5 〜5 倍) で形成される対極上には、特に何も固定化しなくとも使用し得るが、アルブミンおよび電子伝達体の少なくとも一種からなる混合物層を形成させて用いてもよい。この場合には、作用極上のみに混合物層を設けた場合にみられる測定液による混合物層の溶解、拡散に生じ勝ちな傾きがみられなくなる利点があり、測定精度も上昇する。

なお、固定化せしめたGOD への測定サンプル液の接触を円滑に行わしめるために、作用極上、対極上、作用極周辺、対極周辺、作用極上およびその周辺、対極上およびその周辺などに、ノニオン系界面活性剤を塗布したり、不織布、ロ紙等の含浸促進剤を保持空間を利用して挾着させるなどの手段を適用することも可能である。

作用極および対極を設けた基板および他方の基板の接着は、一般に両面接着不織布などの両面接着テープあるいは両面接着剤付きスペーサなどによって行われる。形成された接着剤層の厚さは、測定サンプル保持空間を形成し得るものでなければならず、約10〜1000μm(約0.01〜1mm)、好ましくは約20〜250 μm(約0.02〜0.25mm) に設定される。

両面接着テープあるいは両面接着剤付きスペーサの代りに、アクリル樹脂等からなる接着剤を一方または両方の基板上の所定位置にスクリーン印刷法で塗布し、これら両基板を
上記間隔を保った状態で接着させることもできる。更に、接着剤層9 の下には、その長さより長い長さで、熱硬化性ポリエステル樹脂等からなる絶縁膜11を、約5 〜25μm の厚さで設けることもできる[ 図3 参照] 。

また、作用極および対極が設けられる基板の一端側4 は、図1 に示されるように、とがった形状のテーパー状とし、それによって測定液が微小量ではあってもそれを直接採取することができ、従って電極との接触も速やかに行われるようにされるが、電極が設けられる長方形基板の一端側をテーパー状とはせず、一方の短辺側を凸部形状とすることもできる。

グルコース濃度の測定は、このようにして作製されたグルコースバイオセンサの測定サンプル保持空間に、所定濃度のグルコース水溶液約0.1 〜10μl を吸引して電極と接触させ、約5 〜100 秒間程度反応させた後、そこに約0.05〜1.5V、好ましくは約0.4 〜1.2Vの電圧を印加し、印加0.5 〜50秒後の電流値を測定するポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法によって行われる。測定には、ポテンショガルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用いられる。
（発明の効果）
酸化還元酵素を固定化した作用極とその対極とを設けた基板と他の基板とを接着剤層を介して接着させることにより、各基板の先端部間に測定サンプル保持空間を形成させた本発明のバイオセンサは、測定が容易であり、かつ素子製作も容易である。また、測定サンプル量の定量性も、保持空間を接着剤層( および絶縁層) で閉塞することにより確保することができ、更に測定サンプル量自体も接着剤層( および絶縁層) の厚みを変えることで容易に調節することができる。
（実施例）次に、実施例について本発明を説明する。

（実施例１）
一端側がテーパー状のポリエチレンテレフタレート基板上に、2 本のカーボン製電極をスクリーン印刷法によって、膜厚15μm で形成させた。その一方のカーボン製電極上に、水1ml にグルコースオキシダーゼ(165800U/g)10mg およびフェリシアン化カリウム48mgよりなる混合液( ドープ液) を2 μl 滴下して室温条件下で乾燥させ、グルコースオキシダーゼ- フェリシアン化カリウム混合物層( 厚さ約100 μm)を形成させて作用極とし、他方のカーボン製電極を対極とした。これらの各電極の測定サンプル接触面積は、いずれも2mm²である。

このようにして得られた混合物層形成作用極および対極を設けた基板とこれより短かく、その先端部をテーパー状とした基板とを用い、両面接着テープ( 日東電工製品500 番; 厚さ160 μm)を接着剤層として貼り合せた。

これらのグルコースバイオセンサに、濃度20,50,100,300,600 または1000mg/dl のグルコース水溶液(pH7.4)1μl を吸引させ、20秒間静置した後、作用極- 対極間に1.0Vの電圧を印加し、印加10秒後の電流値を10回測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット( 北斗電工製HA-501) およびファンクションジェネレータ( 同社製HB-104) が用いられた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時での出力は2.5 μA 、CV値( 平均値に対する標準偏差の割合) は5.0%(n=10)であった。なお、センサは、一試料毎に使い捨てとした。

（実施例２）
実施例1 において、ドープ液を作用極および対極に拡げて塗布したものが用いられた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は4.8%(n=10)であった。

（実施例３）
実施例1 において、対極面積を作用極の2 倍の面積で形成させた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は4.6%(n=10)であった。

（実施例４）
実施例1 において、作用極および対極を設けた基板上に銀塩化銀参照極をスクリーン印刷法で形成させたものが用いられ、作用極- 参照極間の電位を1.0Vとした。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は4.5%(n=10)であった。

（実施例５）
実施例1 において、ノニオン系界面活性剤(UCC社製品トリトンX-100)の0.5 重量% 水溶液を測定サンプル保持空間周辺に塗布し、乾燥させたものが用いられた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は4.7%(n=10)であった。

（実施例６）
実施例1 において、アクリル樹脂接着剤を用いるスクリーン印刷法による重ね塗りを行ない、同様の厚さに調整した接着剤層を形成させたものが用いられた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は5.1%(n=10)であった。

（実施例７）
実施例1 において、ポリエチレンテレフタレートフィルム( 厚さ0.19mm) の両面にアクリル樹脂接着剤( 片面厚さ25μm)を塗布したスペーサが接着剤層として用いられた。このようなスペーサを用いたため、全体として剛性の高まったものが得られた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は5.5%(n=10)であった。

（実施例８）
実施例1 において、電極形成基板と接着剤層との間に、熱硬化性ポリエステル絶縁層をスクリーン印刷法によって形成させたものが用いられた。グルコース水溶液濃度20〜600mg/dlの範囲内で直線性が得られ、100mg/dl濃度時でのCV値は4.8%(n=10)であった。

本発明に係るバイオセンサの一態様の斜視図である。作用極および対極を設けた基板の平面図である。絶縁層を設けたバイオセンサの斜視図である。

符号の説明

１…基板、２…作用極、３…対極、４…テーパー部、５…酸化還元酵素層、６…作用極リード部、７…対極リード部、８…他方の基板、９…接着剤層、10…測定サンプル保持空間、11…絶縁膜。

Claims

基板の先端部に設けた作用極と前記基板の先端部に設けた対極を有するバイオセンサと、前記作用極はその上に固定化された酸化還元酵素を備えることと、前記電極の位置の近傍に設けられた接着剤層によって前記基板と接着された他の基板と、前記基板の先端部の間には測定サンプルを保持するための空間が形成されていることと、それぞれの基板の一端は前記空間に測定サンプルを吸引し、および保持するためにテーパー状に形成されていることとからなる、バイオセンサ。
接着剤層の形成が両面接着テープによって行われた請求項１記載のバイオセンサ。
電極形成基板と接着剤層との間に絶縁層が形成された請求項１記載のバイオセンサ。
作用極上に酸化還元酵素−電子伝達体混合物層が形成された請求項１記載のバイオセンサ。
前記接着剤層は前記基板の間の空間の少なくとも一部を形成する請求項１記載のバイオセンサ。
基板の先端部に設けた作用極と前記基板の先端部に設けた対極を有するバイオセンサと、前記作用極はその上に固定化された酸化還元酵素を備えることと、前記電極の位置の近傍に設けられた接着剤層によって前記基板と接着された他の基板と、前記基板の先端部の間には測定サンプルを保持するための空間が形成されていることと、それぞれの基板の一端は前記空間に測定サンプルを吸引し、および保持するために凸部形状に形成されていることとからなる、バイオセンサ。