ES2247094T3 - Sensor de glucosa con respuesta rapida. - Google Patents

Abstract

Un sensor electroquímico desechable para la detección de un analito en una muestra líquida que comprende un electrodo activo y un electrodo de referencia dispuestos dentro de una cavidad receptora de muestra, una capa reactiva dispuesta dentro de la cavidad receptora de muestra y sobre el electrodo activo, comprendiendo dicha capa reactiva una enzima para producir una señal electroquímica en presencia del analito, teniendo la cavidad receptora de muestra un volumen de menos de 1, 5 µl y proporcionando el sensor una medida que se corresponde con la cantidad de analito en un período de 10 segundos o menos.

Description

Sensor de glucosa con respuesta rápida.

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a un sensor de glucosa electroquímico desechable del tipo utilizado por los diabéticos para vigilar los niveles de glucosa en sangre.

Antecedentes de la invención

Los sensores de glucosa electroquímicos de tira desechables se llevan comercializando más de 10 años, y se describen en diversas patentes incluyendo las patentes EE.UU. Nº 4.711.245; 5.708.247; 5.802.551. Estos sensores utilizan mediadores redox para facilitar el intercambio de carga entre enzima y electrodo. Dichos dispositivos ofrecen importantes ventajas con respecto a la tecnología óptica anterior, como es el hecho de que la sangre no pasa al medidor y los propios medidores suelen ser mucho más ligeros y menos aparatosos; sin embargo, presentan también ciertas desventajas. Los resultados de la prueba electroquímica se ven típicamente afectados por otras especies electroactivas presentes en la muestra, así como por el contenido en oxígeno y el hematocrito de la muestra.

La razón de la interferencia que producen las especies electro-activas es muy sencilla. Las especies que se pueden oxidar fácilmente tienen como resultado un aumento de la corriente y eso lleva a una lectura elevada. La mayor corriente puede ser debida a la oxidación directa en la superficie del electrodo y puede tener lugar a través de catálisis rédox. Algunos fabricantes han tratado de abordar el problema mediante el uso de un electrodo auxiliar para realizar una sustracción de fondo. Si bien este método es útil, añade una etapa de fabricación extra; la adición de costes junto con medidas extra con errores asociados degrada de este modo la precisión. La sustración de fondo también puede conducir a una sobre corrección ya que la eficacia de la catálisis rédox de interferencia puede ser diferente en los dos electrodos dependiendo de la concentración del analito.

Los efectos del oxígeno y el hematocrito están relacionados. El oxígeno es el co-factor natural para la glucosa oxidasa, de manera que en presencia de oxígeno habrá una fuerte competencia entre el oxígeno y el mediador redox con el resultado de una disminución de la señal. De manera similar, dado que la hemoglobina es un medio de suministro de oxígeno altamente eficaz, hematocritos de muestra altos también tendrán como resultado una disminución de la señal. Se han propuesto membranas de exclusión que mantienen alejadas las células sanguíneas de la superficie del electrodo, para reducir el efecto de hematocrito (patente EE.UU. Nº 5.658.444). Este planteamiento supone etapas de fabricación adicionales y es en cualquier caso eficaz únicamente para parte del efecto producido por el oxígeno.

Así pues, sigue existiendo la necesidad de contar con dispositivos electroquímicos desechables que proporcionen lecturas de los niveles de analito en sangre, en particular glucosa, que como mucho reciban un impacto mínimo por la presencia de los agentes de interferencia.

Compendio de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un sensor electroquímico desechable para detectar un analito, como glucosa, en una muestra líquida. El sensor consiste en un electrodo activo y un electrodo de referencia dispuesto dentro de la cavidad receptora de muestra, una capa reactiva dispuesta dentro de la cavidad receptora de muestra y sobre el electrodo activo, consistiendo dicha capa reactiva en al menos una enzima para producir una señal electroquímica en presencia del analito, teniendo la cavidad receptora de muestra un volumen inferior a 1,5 \mul, y proporcionando el sensor una medida que se corresponde suficientemente bien (por ejemplo R^{2}>0,95) con la cantidad de analito durante un período de 10 segundos o menos, para permitir el uso de la medida en la detección precisa y exacta y la determinación cuantitativa del analito.

El sensor se emplea en combinación con un medidor para detectar el analito en una muestra líquida. Un medidor adecuado consiste en un circuito cronometrado para controlar la medida de la corriente que indica el analito en la muestra seguido de la detección de la aplicación de la muestra en una tira de ensayo insertada en el medidor, causando que el circuito cronometrado haga que tenga lugar la medida de corriente en un período de 15 segundos o menos tras la detección de la aplicación de la muestra.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 ilustra el movimiento de difusión de especies de reactivos en la proximidad de un electrodo desechable;

La figura 2 muestra una sección transversal de un biosensor de acuerdo con un primer modo de realización de la invención;

La figura 3 muestra una vista transversal de un biosensor de acuerdo con un segundo modo de realización de la invención;

La figura 4 muestra un aparato para la impresión de red de un dispositivo de sensor cara con cara;

La figura 5 muestra un dispositivo de sensor cara con cara parcialmente construido;

La figura 6 muestra una vista transversal de un sensor según la invención;

La figura 7 muestra un gráfico del coeficiente de correlación en relación con el tiempo de ensayo;

La figura 8 muestra una vista exterior de un medidor con arreglo a la invención.

Las figuras 9A-C muestran la construcción de un sensor según la invención; y

La figura 10 muestra una comparación entre una tira comercial y una tira de respuesta rápida según la invención.

Descripción detallada de la invención

La clave para mejorar el comportamiento de la tira electroquímica radica en el diseño de la tira, de manera que la reacción mediada esté favorecida con respecto a las reacciones de interferencia. En el caso de detección de glucosa, la reacción específica de analito es una reacción mediada que implica la generación enzimática de mediador reducido seguido de oxidación del mediador en la superficie del electrodo. Los autores de la invención han concluido por lo tanto que es necesario construir el ensayo para que estas reacciones tengan lugar en íntima proximidad con la superficie del electrodo con el fin de proporcionar una eficacia de recogida máxima.

Es importante considerar los procesos de difusión que tienen lugar durante el ensayo. Hay que considerar la aplicación de la muestra sobre la tira de ensayo, tal como se muestra en la figura 1. La tira de ensayo, en su estado seco, incluye un electrodo revestido con una capa reactiva que contiene enzima, E, y mediador, M. La muestra de ensayo contiene glucosa, G, agentes de interferencia electroquímicos, I, y oxígeno, O_{2}, que pueden unirse a hemoglobina, Hb. Al aplicar la muestra existe un flujo de difusión neto de E y M alejándose de electrodo hacia la muestra de ensayo y un flujo de difusión neto de G e I hacia el electrodo. Por tanto, en períodos de tiempo muy cortos tras la aplicación de la muestra, la mayor parte de la enzima sigue cerca del electrodo y la reacción con glucosa tiene una alta probabilidad de tener como resultado la generación de una molécula mediadora reducida lo suficientemente cerca del electrodo como para ser capturada. A tiempos más largos, gran parte de la enzima se ha difundido "a más profundidad" en la muestra y puede reaccionar con la glucosa aquí. Esto tiene dos efectos. En primer lugar, existe una alta probabilidad de que la enzima reducida se oxide con el O_{2} en lugar de M, ya que la concentración de M disminuirá aún más desde el electrodo y la concentración de O_{2} aumentará más desde el electrodo (debido a esta misma reacción). Incluso en el caso de que la enzima reducida no reaccione con M, la probabilidad de que M reducido vuelva por difusión al electrodo para reoxidarse con la producción concomitante de una señal detectable es baja. En segundo lugar, la secuencia de reacción que se acaba de describir tiene el efecto de agotar G que se difunde hacia dentro, de manera que se reduce la cantidad de G que llega realmente a la proximidad del electrodo donde se puede detectar con cierta eficacia. Claramente, ambos factores contribuyen a una señal reducida en presencia de oxígeno en la muestra.

De manera similar, los agentes de interferencia comunes son materiales fácilmente oxidados como ascorbato, acetaminofeno y ácido úrico que se oxidan al alcanzar la superficie del electrodo junto con el mediador reducido que pueda estar presente. Dado que este efecto tan sólo puede producirse cuando está presente I cerca de la superficie del electrodo, estará en el mínimo en períodos de tiempo cortos antes de que se produzca la difusión de I al electrodo.

Tal como se puede deducir de esta explicación mecánica, una solución a ambos problemas: los agentes de interferencia y los niveles de hematocrito/oxígeno consiste en realizar la medida en tiempos muy cortos. Una solución alternativa consiste en restringir el volumen de la muestra para que el área superficial del electrodo sea muy grande en comparación con el volumen de la muestra. Una buena configuración consiste en una configuración que asegure que la capa de la muestra sobre el electrodo sea muy fina (v.g., <200 micrómetros). Una ventaja de limitar el volumen de la muestra es que la solución se sedimenta por hidrodinámica más rápidamente. Con un volumen de muestra grande los efectos de convección de la muestra llevan a ruido en la medida. Al mantener un volumen de muestra bajo en forma de una película delgada se reducen al mínimo los efectos de convección. Estos significa que con un volumen de muestra bajo es posible realizar medidas más pronto.

En la práctica, estas soluciones están relacionadas y se implementan ambas en los biosensores de la presente invención. Según esto, la presente invención proporciona sensores electroquímicos desechables y medidores asociados que están adaptados para tomar medidas electroquímicas de la cantidad de analito en una muestra, por ejemplo, para la cuantificación de los niveles de glucosa en sangre, en tiempos más cortos que los de los sistemas conocidos anteriormente. Los sensores de la invención aprovechan la relación sinérgica entre tiempos de medida cortos y pequeños volúmenes de muestra para conseguir un rendimiento superior. El volumen de muestra bajo permite una medida más temprana gracias a una sedimentación más temprana por el efecto hidrodinámico y, por lo tanto, facilita las medidas en períodos de tiempo breves. El volumen de muestra bajo también requiere medidas de tiempos cortos pues la pequeña señal disminuye en tiempos más largos y, por lo tanto, no puede proporcionar una lectura fiable. Al optar por este tipo de configuración, los autores de la invención aseguran que la concentración del mediador se mantiene alta, de manera que el mediador compite más eficazmente con oxígeno para la enzima reducida.

Es muy deseable conseguir un dispositivo que utilice un pequeño volumen de muestra desde el punto de vista del paciente. El desafío consiste en crear un dispositivo que utilice un pequeño volumen de muestra para producir medidas fiables de la concentración de analito. La primera parte de este proceso consiste en definir una cavidad receptora de muestra de pequeño volumen. El volumen de esta cavidad se define por el área de los electrodos y el grosor del hueco entre los electrodos. Existe un límite inferior para el área de los electrodos que se puede conseguir a través de cualquier proceso de impresión dado, determinado por la definición marginal y tolerancias de impresión. Una forma de mejorar esta precisión cuando se utilizan tintas de impresión de electrodo conocidas es la metodología de impresión descrita en la publicación de patente internacional comúnmente asignada Nº WO 00/42422.

Una vez reducida al mínimo el "área" de los electrodos, se define además el volumen de la muestra por el hueco entre las superficies de electrodo. El objetivo primordial es conseguir un espacio fino pero consistente. Debe recordarse, no obstante, que si se consigue un bajo volumen de muestra utilizando un espacio muy fino (es decir <200 \mum), no se satisfacen las condiciones normales de difusión semi-infinita. Por esta razón, se puede extender la capa de difusión por todo el hueco, y agotar significativamente la muestra. En tales circunstancias, la precisión de los dispositivos queda influida por el factor adicional de la precisión del proceso de ensamblaje que determina el tamaño del hueco. Existe una relación entre el tiempo de medida y el tamaño en el que se hace importante la precisión en el tamaño del hueco, lo que puede entenderse considerando la fórmula:

L = \surdDt

en la que L es la duración de difusión, D es el coeficiente de difusión y t es el tiempo. Cuando se reduce el tiempo de ensayo de 15 segundos a 5 segundos, se reduce la duración de difusión en un factor de \surd3. Lo que esto significa en términos prácticos es que al acortar el tiempo de medida, es posible reducir aún más el tamaño del hueco, sin toparse con la condición limitativa en la que la presión del hueco se convierte en un factor sustancial en la precisión del dispositivo. Según esto, por ejemplo, suponiendo que un coeficiente de difusión de 10^{-5} cm^{2}seg^{-1}, un ensayo de 5 segundos requeriría un hueco superior a 70\mum, en comparación con los 125 \mum que se requerirían para un ensayo de 15 segundos. Teniendo en cuenta estos factores, una configuración adecuada para un sensor según la invención tiene una cavidad de recepción de muestra con un volumen inferior a 1,5 \mul. Conjuntamente con las consideraciones relativas al tamaño de hueco, esto significa que el electrodo activo tiene un tamaño deseable suficiente para que la relación entre el área superficial del electrodo activo y el tamaño del hueco sea aproximadamente de 0,5 a 100 mm. En una configuración preferible específica, el área de cada electrodo es 0,8 mm^{2} y el hueco es de 100-150 \mum, para definir el compartimiento receptor de muestra con un volumen de 0,5 a 0,8 \mul.

la figura 2 presenta un sensor electroquímico 10 de acuerdo con un primer modo de realización de la invención. Los electrodos 11 y 12 están formados sobre un sustrato base 13. El sustrato base 13 en combinación con los espaciadores 14, 15 y la cubierta superior 16 definen una cavidad 17 en la que se producen las reacciones electroquímicas. En un modo de realización ilustrativo, los electrodos tienen un área superficial de 5 mm^{2} y el volumen de la cavidad es adecuadamente inferior a 1,5 \mul, preferiblemente inferior a 1 \mul siendo sobre todo preferible inferior a 0,5 \mul.

Un dispositivo del tipo que se presenta en la figura 2 se puede fabricar del siguiente modo. Se depositan los electrodos 11 y 12 sobre el sustrato 13. La manera específica en la que se depositen se determinará según la naturaleza de los electrodos, si bien la impresión de pantalla es una técnica preferible para muchos materiales. El área del electrodo que se expondrá a la muestra en la cámara se define depositando una máscara aislante sobre los electrodos. (Ver la publicación de patente internacional comúnmente asignada Nº WO 00/42422). A continuación, se deposita la capa reactiva. Esta capa puede cubrir ambos electrodos, o se puede confinar al área que hay sobre el electrodo activo. Los espaciadores 14 y 15 se forman después en un patrón entorno a los electrodos. En un modo de realización preferible, estos espaciadores se forman por impresión de una capa de adhesivo que tiene una altura en seco de aproximadamente 150 \mum. Este espaciador define el hueco capilar sin necesidad de utilizar un material sólido preformado y facilita así sustancialmente la producción de los dispositivos de la invención. El paso final consiste en la aplicación de una cubierta 16 para completar la cámara 17. En el modo de realización preferible, la cubierta 16 se fija sobre el dispositivo a través de los espaciadores adhesivos 14 y 15.

La figura 9A-C ilustra un modo de realización específico de una técnica de fabricación para la producción de un sensor según la invención. La figura presenta un único sensor, si bien se podrá apreciar que, por lo general, se prepararán más de un sensor. La figura 9A presenta la estructura del dispositivo antes del estratificado de la cubierta. El sensor en esta etapa tiene dos electrodos 11, 12, depositados sobre un sustrato (no se muestra con claridad). Las conexiones eléctricas de estos electrodos no se muestran. Se deposita una almohadilla de reactivo 100, por ejemplo, con un contenido en una enzima apropiada para el analito, sobre ambos electrodos. Las almohadillas adhesivas 101, 102 y 103 se depositan en los tres laterales de la almohadilla de reactivo. A continuación, se colocan dos piezas 104, 104 de una película hidrófila (como por ejemplo 3M 9962, una película de poliéster ópticamente transparente tratada con agente tensioactivo de 100 micrómetros de grosor) en dos localizaciones, una que abarca las almohadillas adhesivas 101 y 102 y cubre los electrodos y la almohadilla de reactivo, y una que cubre una porción de la almohadilla adhesiva 103 para proporcionar un soporte de altura correspondiente para recibir la cobertura 116. (Fig. 9B). Las posiciones de estas piezas de película hidrófoba crea una cámara capilar sobre los dos electrodos. El recubrimiento hidrófilo de la película favorece el movimiento, por acción capilar, del líquido de ensayo hacia la cámara de muestra creada. El hueco 106, formado en el área en la que no hay ningún espaciador o película, permite escapar el aire desde la parte trasera de la cámara a medida que se desplaza el líquido de ensayo hasta la cámara de muestra creada. Se aplica una cinta sensible a la presión como cubierta superior 116 sobre las películas hidrófilas. La cubierta superior 116 está formada adecuadamente de una película de poliéster y puede estar revestida con o bien un adhesivo activado por calor o bien por una adhesivo sensible a la presión. La etapa final consiste en cortar el dispositivo para crear la cámara de muestra de apertura apropiada, por ejemplo, cortando la línea de puntos C-C de la figura 9B. En la figura 9C se muestra una vista frontal del dispositivo después de cortarlo por dicha línea C-C. Tal como se muestra, la entrada capilar 110 a la cámara de muestra se define por el sustrato 13, las almohadillas adhesivas 101, 102 y la película hidrófila 104 y la cubierta superior 116. Las películas 104 y 105 están soportadas por las almohadillas adhesivas 101 y 102.

En la figura 3 se muestra un sensor electroquímico 20 de acuerdo con un segundo modo de realización de la invención. Se forman los electrodos 21 y 22 respectivamente sobre un sustrato base 23 y una cubierta superior 26. El sustrato base 23 en combinación con los espaciadores 24, 25 y la cubierta superior 26 definen una cavidad 27 en la que tienen lugar las reacciones electroquímicas. Se construye el sensor con un bajo volumen y un hueco fino entre el sustrato base 23 y la cubierta superior 26, por ejemplo de 50 a 200 \mum. Debe advertirse que el área superficial de los electrodos pueden ser dobles para un dispositivo del mismo tamaño, gracias a la configuración cara con cara doblada.

Un dispositivo con esta estructura se puede obtener empleando tecnología de impresión de red tal como se describe en la solicitud de patente EE.UU. comúnmente asignada 09/537.599, registrada el 28 de marzo de 2000. En dicha tecnología, se utiliza un aparato del tipo que se muestra de manera esquemática en la figura 4. Se introduce una red en marcha de sustrato 31 en el rodillo de alimentación 32 y se transporta a lo largo de varias estaciones de impresión 33, 34, y 35, cada una de las cuales imprime una capa diferente en el sustrato. El número de estaciones de impresión puede ser cualquiera y dependerá del número de capas necesarias para el dispositivo que se esté fabricando en particular. Entre las estaciones de impresión sucesivas, preferiblemente la red se transporta a través de la secadora 36, 37 y 38 para secar cada capa antes de proseguir con el depósito de la siguiente. Tras la secadora final 38, se recoge la red impresa en un rodillo de extracción o se introduce directamente en un aparato de post-tratamiento 39. Para conseguir que el dispositivo adquiera la estructura que se muestra en la figura 3 en este aparato, se depositan pistas conductoras paralelas 71 y 72; capas reactivas 73 y una capa de aislamiento 74 sobre el sustrato 70 tal como se muestran en la figura 5. A continuación, se dobla el sustrato a lo largo de la línea de pliegue dispuesta entre las dos pistas conductoras para producir un sensor en el que los electrodos cara con cara están separados por una capa reactiva. La geometría de electrodo con los electrodos dispuestos en superficies opuestas dentro de la cavidad es beneficioso, ya que la caída de voltaje debida a la resistencia de la solución es baja gracias a la fina capa de solución que separa los electrodos.

En cada uno de los modos de realización de la invención que se han descrito, la cavidad se define por materiales aislantes. Entre los materiales aislantes adecuados para este propósito se incluyen nilón, poliéster, policarbonato y policloruro de vinilo. Entre los materiales adecuados para su uso como sustrato se incluyen películas de poliéster, por ejemplo una película de poliéster de 300 micrómetros y otros materiales de sustrato aislantes como policloruro de vinilo (PVC) y policarbonato. Un material dieléctrido imprimible a base de poliéster específico del que se puede formar la máscara aislante es ERCON R488-B(HV)-B2 Blue. Dentro de la cavidad, se forman un electrodo activo y un electrodo de referencia a partir de un material conductor. Entre los materiales conductores adecuados se incluyen carbono conductor, oro, platino, aluminio o materiales semiconductores impurificados como SnO_{2} tipo n. Entre los materiales de carbono conductor preferibles se incluyen ERCON ERC1, ERCON ERC2 y Acheson Carbon Electrodag 423, Carbono con estas especificaciones está distribuido por Ercon Inc. (Waltham, Massachusetts, EE.UU.) o Acheson Colloids (Princes Rock, Plymouth, Inglaterra). Los electrodos semiconductores ofrecen una atractiva opción ya que pueden funcionalizarse para dar cabida a la unión superficial de enzimas u otros componentes de la capa reactiva. Esto proporciona las ventajas asociadas con la inmovilización y también permite una transmisión de electrones directa entre el reactivo y el electrodo.

Los electrodos pueden estar hechos de diferentes materiales o pueden ser del mismo material. Los modos de realización en los que los electrodos son de la misma composición, por ejemplo, un electrodo de carbono, pueden ofrecer ciertas ventajas. Específicamente, el uso de un solo material de electrodo permite que los electrodos activo y de referencia se depositen en una sola etapa, eliminando así una impresión de electrodo del proceso de producción. Es posible imprimir los dos electrodos muy próximos entre sí, pues la separación entre ellos se determina solamente por la obra en una pantalla (tolerancia aproximadamente 200 \mum) y no sobre la alineación que se puede conseguir entre ciclos de impresión distintos (tolerancia por encima de 0,5 mm). Esto permite que el área de reacción sea más compacta y conduce así a la reducción del volumen de la sangre necesaria para cubrir los electrodos.

El electrodo activo tiene una o más capas reactivas dispuestas sobre el electrodo que contiene la enzima y el mediador utilizados en la detección del analito objetivo. Así pues, por ejemplo, en un sensor de glucosa, la capa reactiva incluiría una enzima, como por ejemplo glucosa oxidasa, y un mediador como ferricianuro, compuestos de metaloceno, quinonas, sales de fenazinio, indicador de redox DCPIP, y compuestos de osmio sustituidos con imidazol. La capa reactiva puede ser una capa simple que incluya tanto la enzima como el mediador, o puede estar constituida por varias subcapas, conteniendo algunas de ellas enzima o enzima y mediador y otras solamente mediador.

Dado que los dispositivos de la invención están destinados a un uso en intervalos de tiempo cortos, una importante característica de los electrodos es la capacidad para hidratarse rápidamente. La velocidad de hidratación se determina por la composición de la capa reactiva. El sistema de electrodo que utiliza una capa reactiva a base de sílice del tipo descrito en la patente EE.UU. Nº 5.708.247 y la publicación de patente internacional Nº WO 00/42422 permite una rápida humectación e hidratación y, por lo tanto, es adecuada para su uso en los sensores de la invención. El material óptimo para las capas reactivas de los electrodos de los sensores de la invención es aquel que se hidrata rápidamente para formar un gel que permanece en contacto con la superficie del electrodo y retiene los reactivos en las proximidades del electrodo. Si la capa reactiva se dispersa rápidamente tras la hidratación, los reactivos (y en particular el reactivo de enzima) se pierden rápidamente de la proximidad de la superficie de electrodo donde son más propicios para que se forme una señal que refleja la concentración de analito en una muestra.

La capa reactiva debe comprender además un mediador en una forma disponible para su participación inmediata en la generación de una señal que refleje la concentración de analito. En el caso de un analito como glucosa que se oxida mediante la enzima, esto significa que el mediador debe ser rápidamente soluble y estar presente en la forma oxidada. En una tira de glucosa comercial distribuida por Medisense bajo las marcas registradas QID^{TM} y EXACTECH^{TM}, el mediador está presente realmente en la forma reducida y debe oxidarse in situ antes de poder participar en una reacción de control de glucosa. Esto limita el tiempo de respuesta de la tira y excluye su uso en tiempos de ensayo cortos.

En el caso del electrodo de referencia, el electrodo ha de hidratarse rápidamente y también debe ser capaz de estabilizarse con la suficiente rapidez para originar la corriente demandada por el electrodo activo instantáneamente, es decir, a los 200 mseg de hidratación. Un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata convencional no se estabiliza con suficiente rapidez. Por otra parte, se puede hacer referencia a ferri-ferrocianuro para equilibrar con mucha rapidez. En este diseño, se utiliza una capa que contiene mediador que se solubiliza o se dispersa con rapidez. En un modo de realización específico de la invención, se utilizan electrodos de tinta de carbono con una capa reactiva que contiene ferricianuro potásico como mediador. Se utiliza glucosa oxidasa como enzima en una base de hidroxi etil celulosa -sílice añadiendo polímeros para aumentar la naturaleza hidrófila de la formulación. Este sistema tiene un área superficial muy alta y se humedece con mucha rapidez.

Además del electrodo activo y el electrodo de referencia, el aparato de la invención se puede construir para incluir un tercer electrodo. El tercer electrodo puede ser un electrodo simulado, destinado a compensar las reacciones de fondo, o un contra-electrodo de un sistema de tres electrodos convencional. El tercer electrodo podría ser también un electrodo activo idéntico.

En los modos de realización de la invención que se han explicado, todas las capas se solubilizan o se hidratan con rapidez. Si bien la solubilización rápida, o al menos la hidratación del mediador oxidado, no es un problema para el consumo de agente de interferencia, y posiblemente ayuda a conseguir este requisito, no es una característica completamente positiva para una capa que contiene enzima, como se ha descrito anteriormente, ya que facilita la difusión de la enzima alejándose del área cerca del electrodo donde es sobre todo beneficiosa. Una configuración útil que combina ambos aspectos, por lo tanto, se muestra en la figura 6. En dicho modo de realización de la invención, el sensor 60 tiene una cavidad 67 formada de un sustrato inferior 63, espaciadoras 64, 65 y una cubierta superior 66. Hay dos electrodos de carbono 61, y 62 dispuestos en el sustrato inferior 63 dentro de la cavidad 67. El electrodo 62 está recubierto con una capa de gel viscoso relativamente fina (v.g., 5 \mum) 68 que contiene enzima y mediador. Ambos electrodos 61, 62 están recubiertos entonces con una capa de dispersión relativamente gruesa (v.g., 25 \mum) 69 que contiene mediador, pero no enzima.

En otro modo de realización de la invención, hay dos capas distintas configuradas para reducir aún más los efectos de los agentes de interferencia. Una forma de capitalizar el consumo químico de los agentes de interferencia consiste en proporcionar una capa reactiva con un exceso de mediador oxidado en la parte exterior. En una configuración particularmente atractiva se recubre un electrodo con una fina capa reactiva que contiene enzima y mediador y después una capa gruesa que contiene solamente mediador. Se depositan ambas capas en una matriz que limita la difusión pero que se hidrata rápidamente de manera que puede transportar la corriente. Al confinar la enzima a una capa fina se mantiene la enzima en gran medida en íntima proximidad con el electrodo de manera que las reacciones parásitas antes descritas no son importantes. La capa de mediador exterior gruesa proporciona una barrera a los agentes de interferencia que se difunden hacia dentro y permanece en la posición deseada gracias a la matriz limitadora de la difusión. Se puede incluir una tercera capa opcional en la parte exterior de las capas primera y segunda que contienen mediador en una matriz dispersable que se hidrata rápidamente. Una vez más, al asegurar que el volumen de la muestra es reducido, se mantiene en un mínimo la cantidad total de agente de interferencia en la muestra, y la concentración del mediador oxidado en la reconstitución es alta con lo cual el mediador elimina eficazmente el agente de interferencia. Evidentemente, con tiempos más prolongados, la concentración local del mediador caerá a medida que se difunda fuera y dentro de la muestra y la interferencia se hará más significativa. Según la experiencia de los autores de la invención, un volumen de muestra inferior a 1 \mum, preferiblemente 0,5 \mul es ideal.

Los sensores hechos de acuerdo con la invención permiten tomar medidas de ensayo en tiempos mucho más cortos que los conseguidos utilizando sensores conocidos. Al acortar el tiempo de ensayo, se pueden reducir los efectos del hematocrito. Si el sensor consiste en un electrodo cubierto con una capa reactiva que tiene un efecto retardante sobre determinados componentes de la sangre, como por ejemplo los glóbulos blancos y los eritrocitos, entonces con períodos de tiempo cortos el fluido que llega al electrodo contendrá significativamente menos de estos componentes que con tiempos largos.

En la figura 7 se muestra un gráfico del coeficiente de correlación en relación con el tiempo de ensayo. A tiempos de ensayo extremadamente cortos la correlación es escasa ya que el sistema no ha sido estabilizado. A tiempos de ensayo muy largos la correlación también empieza a degradarse. Dado el objetivo de limitar las interferencias acortando el tiempo de ensayo, el ensayo se llevará a cabo adecuadamente en el régimen indicado por las líneas discontinuas, que para los sensores que se describen más adelante será menos de 10 segundos y preferiblemente, en torno a los 5 segundos. Los sensores desechables de la invención funcionan en combinación con un medidor de ensayo para proporcionar medidas exactas de la glucosa dentro de este régimen de tiempo. Por lo tanto, el sensor estará configurado para proporcionar señales que proporcionan una información precisa y fiable en tiempos cortos, y el medidor en el que está insertado el sensor está adaptado para recoger información durante este tiempo.

La figura 8 muestra una vista exterior de un medidor manual ilustrativo de acuerdo con la invención. Al igual que los medidores convencionales, el medidor de la invención tiene una carcasa 81 con una pantalla 82 para exponer los resultados, y una ranura 83 para insertar el sensor desechable. Los botones 85 y/o conmutadores pueden incluirse para operar el medidor, incluyendo la recuperación de resultados almacenados, comprobaciones de calibración y similares. El punto en el que el medidor de la invención difiere del medidor convencional es en el sistema electrónico dentro de la carcasa. En el medidor convencional, la adición de una muestra líquida, como por ejemplo una gota de sangre, en un sensor desechable en la carcasa arranca un ciclo de medida durante el cual se disuelven los reactivos y se toman lecturas. El arranque del ciclo también puede dispararse al presionar el usuario un botón, si bien esto no es preferible. El microprocesador en un medidor está típicamente en un modo "dormido" y se "despierta" periódicamente (por ejemplo cada ½ segundo) para controlar las interrupciones. Si el programa detecta que una pestaña de interrupción, que indica que se ha insertado una tira en el medidor o que ha sido presionado el botón de arranque, el programa entra en modo RUN. En este modo, típicamente, se aplica un potencial en la tira y el microprocesador controla la salida (ciclo de trabajo) de un monitor de anchura de impulso que indica el nivel de cualquier corriente emitida por la tira. En cuanto se aplica la muestra sobre la tira, fluye una corriente ya que la tira está ya sujeta a un potencial de polarización. La detección de esta corriente de arranque inicia una secuencia de cronometraje. El tiempo es controlado por el microprocesador. Existen dos cristales: un reloj de 4 MHz para la función operativa (es decir, las medidas de comportamiento) y un reloj de 32 MHz que mantiene el tiempo en el modo Off. Al iniciarse el proceso de cronometraje, es posible (1) o bien mantener el potencial aplicado a un nivel constante o bien (2) variarlo siguiendo un perfil determinado previamente. En cualquier caso, se mide la corriente tras un tiempo predeterminado para valorar la cantidad de analito de la muestra. A modo de ejemplo, se recogieron los datos mostrados en la figura 7 en un sistema en el que se detectó la aplicación de la muestra a t = 0, se eliminó el potencial aplicado durante 2 segundos, durante lo cual la tira es un circuito abierto, y después se volvió a aplicar el mismo potencial. Se midió la corriente en numerosos puntos de tiempo y se determinó la correlación de la corriente con la concentración de analito determinada en cada punto de tiempo.

En los medidores comerciales conocidos en la especialidad, el ciclo de medida se establece para realizar la medida de corriente a 20 - 60 segundos tras la detección de la muestra. En los medidores de la invención, que están particularmente adaptados para su uso con tiras de rápida respuesta según la invención, el ciclo de medidas se establece para realizar medidas de corriente 15 segundos o menos después de la detección de la muestra, preferiblemente de 5 a 10 minutos después de la detección de la muestra.

A continuación, se describirá mejor la invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1

Se prepararon sensores de glucosa de respuesta rápida con arreglo a la invención aplicando los procedimientos señalados en las figuras 9A-C y los siguientes materiales:

Sustrato : película de poliéster

Formulación de tinta de carbono: carbono conductor Ercon

Composición de capa adhesiva: se describe más adelante

Adhesivo: copolímero acrílico de base acuosa adhesivo (Apollo Adhesives)

Película hidrófila: película hidrófila de 100 micrómetros 3M 9962

Cubierta superior: Tira de poliéster revestida con adhesivo sensible a la presión (Tape Specialities)

Se formuló la capa reactiva del siguiente modo. Se ajustaron a un pH 5 100 ml de citrato trisódico acuoso 100 mM por adición de ácido cítrico 1M. Se añadieron a esto 5 g de hidroxietil celulosa (HEC), 1 g de polialcohol vinílico, 1 g de poli(vinil pirrolidona acetato de vinilo) PVP-VA S-630 y 0,5 ml de antiespumante de Dow Corning DC 1500 y se mezcló por homogenización. Se dejó en reposo la mezcla durante toda la noche para dejar que se dispersaran las burbujas de aire y después se utilizó como solución de reserva para la formulación de la composición de revestimiento. Se añadieron gradualmente 7,5 g de Cab-o-Sil TS610 a mano a una solución de HEC hasta añadir 4/5 de la cantidad total. Se añadió el resto por mezclado por homogenización. A continuación, se pasó por rodillo la mezcla durante 12 horas. Se añadieron después 11 g de ferricianuro potásico y se mezcló por homogenización hasta que se disolvió completamente. Finalmente, se añadieron 2,8 g de preparación de enzima glucosa oxidasa (250 unidades/mg) y después se mezcló a fondo en la solución. La formulación resultante quedó lista para impresión, o se pudo almacenar con refrigeración.

Se utilizaron los sensores para someter a ensayo soluciones de glucosa normales y se midió la corriente a diferentes tiempos seguido de la adición de glucosa al sensor. Se determinó en cada intervalo de tiempo el coeficiente de correlación entre la concentración de glucosa real y la concentración de glucosa medida. En la figura 7 se muestra un gráfico de los resultados. Tal como se muestra, el coeficiente de correlación ha alcanzado un máximo y un valor alto a los 5 segundos tras la adición de glucosa al sensor.

Ejemplo 2

Se prepararon sensores de respuesta rápida con arreglo a la invención como en el ejemplo 1. Se utilizaron estos sensores para determinar la cantidad de corriente a los cinco segundos de la exposición a diferentes concentraciones de glucosa. Con fines comparativos, se sometió a ensayo un sensor de glucosa Medisense QID en las mismas condiciones. En la figura 10 se muestran los resultados de este experimento gráficamente. Tal como se muestra, la linearidad de la respuesta del sensor de respuesta rápida de acuerdo con la invención es muy buena (R^{2}=0,999). La linearidad del sensor QID a los cinco segundos no fue tan buena (R^{2}=0,863).

Claims (12)

1. Un sensor electroquímico desechable para la detección de un analito en una muestra líquida que comprende un electrodo activo y un electrodo de referencia dispuestos dentro de una cavidad receptora de muestra, una capa reactiva dispuesta dentro de la cavidad receptora de muestra y sobre el electrodo activo, comprendiendo dicha capa reactiva una enzima para producir una señal electroquímica en presencia del analito, teniendo la cavidad receptora de muestra un volumen de menos de 1,5 \mul y proporcionando el sensor una medida que se corresponde con la cantidad de analito en un período de 10 segundos o menos.

2. El sensor de la reivindicación 1, en el que la capa reactiva comprende además un mediador de transferencia de electrones.

3. El sensor de la reivindicación 2, en el que el analito es glucosa y la enzima es glucosa oxidasa y el mediador es ferricianuro.

4. El sensor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa reactiva comprende sílice.

5. El sensor de cualquiera de las reacciones anteriores, en el que el electrodo de referencia es un electrodo de ferri-ferrocianuro.

6. El sensor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el electrodo activo se forma a partir de un material semiconductor impurificado.

7. El sensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además tres almohadillas adhesivas formadas sobre el sustrato, estando dispuesta una primera almohadilla adhesiva en un primer lado de la capa reactiva, estando dispuesta una segunda almohadilla adhesiva en un segundo lado de la capa reactiva opuesta a la primera almohadilla adhesiva, en virtud de lo cual la capa reactiva y los electrodos subyacentes quedan dispuestos entre la primera y la segunda almohadilla adhesiva, y estando dispuesta la tercera almohadilla adhesiva sobre un tercer lado de la capa reactiva diferente de los lados primero y segundo y separada de la capa reactiva, definiendo dichas almohadillas adhesivas el grosor de la cavidad receptora de muestra.

8. El sensor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el electrodo activo y el electrodo de referencia están dispuestos en una configuración cara con cara en superficies opuestas dentro de la cavidad receptora de muestra.

9. El sensor de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la capa reactiva cubre tanto el electrodo activo como el electrodo de referencia.

10. Un sistema para la detección electroquímica de un analito en una muestra líquida que comprende:

(a) un sensor electroquímico desechable que comprende un electrodo activo y un electrodo de referencia dispuestos dentro de una cavidad receptora de muestra, una capa reactiva dispuesta dentro de la cavidad receptora de muestra y sobre el electrodo activo, comprendiendo dicha capa reactiva una enzima para producir una señal electroquímica en presencia del analito, teniendo la cavidad receptora de muestra un volumen inferior a 1,5 \mul y proporcionando el sensor una medida que se corresponde con la cantidad de analito en un período de 10 segundos o menos; y

(b) un medidor de ensayo para recibir el sensor electroquímico desechable, comprendiendo dicho medidor un circuito cronometrado para controlar la medida de la corriente indicativa del analito en la muestra tras la detección de la aplicación de la muestra en una tira de ensayo insertada en el medidor, haciendo el circuito cronometrado que tenga lugar la medida de la corriente en un tiempo de 15 segundos o menos tras la detección de la aplicación de la muestra.

11. Un método para fabricar un sensor electroquímico desechable para la detección de un analito, siendo el sensor capaz de proporcionar una medida que se corresponde con la cantidad de analito en un período de 10 segundos o menos, que comprende las etapas de:

(a) formar un electrodo activo y uno de referencia sobre un sustrato;

(b) formar una capa aislante sobre los electrodos activo y de referencia, teniendo dicho aislamiento una apertura formada a través de la cual quedan expuestos al menos una porción de los electrodos activo y de referencia,

(c) formar una capa reactiva sobre al menos la porción expuesta del electrodo activo, comprendiendo dicha capa reactiva al menos una enzima para producir una señal electroquímica en presencia del analito en una matriz que se hidrata rápidamente;

(d) formar tres almohadillas adhesivas sobre el sustrato, estando dispuesta la primera almohadilla de adhesivo en un primer lado de la capa reactiva, estando dispuesta la segunda almohadilla adhesiva en un segundo lado de la capa reactiva opuesta a la primera almohadilla adhesiva, en virtud de lo cual la capa reactiva y los electrodos subyacentes quedan dispuestos entre las primera y segunda almohadilla adhesiva, y estando dispuesta una tercera almohadilla adhesiva en un tercer lado de la capa reactiva diferente de los lados primero y segundo y separada de la capa reactiva;

(e) estratificar una primera película hidrófila sobre la primera y segunda almohadilla adhesiva, extendiéndose la primera película hidrófila entre la primera y segunda almohadilla adhesiva, y la segunda película hidrófila sobre la tercera almohadilla adhesiva; y

(f) adherir una cubierta superior sobre las películas hidrófilas, en virtud de lo cual se forma una cámara de muestra que se define por el sustrato, las almohadillas adhesivas primera y segunda y la primera película hidrófila, de manera que la cámara de la muestra tiene un volumen inferior a 1,5 \mul.

12. El método de la reivindicación 11 que comprende además la etapa de cortado del dispositivo a lo largo de una línea que se extiende a través de la primera y segunda capa adhesiva en una localización adyacente al cuarto lado de la capa reactiva opuesto al tercer lado de la capa reactiva.