ES2312719T3 - Medidor con sensor de glucosa de respuesta rapida. - Google Patents

Abstract

Un medidor que comprende: una caja (81); un visualizador (82) para la visualización de los resultados; una ranura para la inserción de un sensor electroquímico desechable para la detección y/o cuantificación de un analito en una muestra líquida; y un circuito de medición de tiempo adaptado para controlar la medición de la corriente indicativa de analito en la muestra después de la detección de la aplicación de la muestra al sensor cuando el sensor está insertado en el medidor, caracterizado porque el circuito de medición de tiempo está adaptado además para dar lugar a que la medición de corriente se produzca en un tiempo de 15 segundos o menor después de la detección de la aplicación de la muestra.

Description

Medidor con sensor de glucosa de respuesta rápida.

Campo de la invención

Esta solicitud se refiere a un sensor de glucosa electroquímico desechable del tipo usado para diabéticos para controlar los niveles de glucosa en sangre.

Antecedentes de la invención

Los sensores de glucosa electroquímicos en tiras desechables han estado disponibles comercialmente durante unos 10 años, y han sido descritos en diversas patentes incluyendo las Patentes de EE.UU. Nos. 4.711.245, 5.708.247 y 5.802.551. Estos sensores usan mediadores redox para facilitar el intercambio de carga entre la enzima y el electrodo. Estos dispositivos ofrecen ventajas significativas sobre la tecnología óptica más antigua, tal como el hecho de que la sangre no penetra dentro del medidor y los propios medidores tienden a ser mucho más ligeros y menos engorrosos; pero adolecen igualmente de ciertos inconvenientes. Los resultados de los ensayos electroquímicos están típicamente afectados por otras especies electro-activas presentes en la muestra, así como por el contenido en oxígeno y hematocrito de la muestra.

La razón de la interferencia por especies electro-activas es muy clara. Las especies que son fácilmente oxidables dan como resultado un incremento de corriente lo que conduce a una lectura elevada. El incremento de corriente puede ser debido a oxidación directa en la superficie del electrodo o producirse mediante catálisis redox. Algunos fabricantes han tratado de hacer frente a este problema usando un electrodo auxiliar para eliminar el valor de fondo. Aunque esta vía es útil, agrega una etapa de fabricación extra; agregando costes y una medición extra con sus errores asociados, degradando, de esta forma, la precisión. Igualmente, la eliminación del valor de fondo puede conducir a una sobrecorrección dado que las eficacias de la catálisis redox del interferente pueden ser diferentes sobre los dos electrodos, dependiendo de la concentración del analito.

Los efectos del oxígeno y del hematocrito están unidos. El oxígeno es el cofactor natural para la glucosa oxidasa, por lo tanto, en la presencia de oxígeno existirá una fuerte competencia entre el oxígeno y el mediador redox lo que da como resultado una señal disminuida. De manera similar, puesto que la hemoglobina es un medio de suministro de oxígeno altamente eficaz, altos contenidos en hematocrito en las muestras darán como resultado señales disminuidas. Se han propuesto membranas de exclusión que mantienen las células de sangre alejadas de la superficie del electrodo para reducir el efecto del hematocrito (Patente de EE.UU. No. 5.658.444). Esta vía agrega etapas de fabricación adicionales, y es, en cualquier caso, únicamente eficaz para una parte del efecto basado en el oxígeno.

De acuerdo con ello, existe una necesidad de dispositivos electroquímicos desechables que proporcionen lecturas para niveles de analito en sangre, particularmente glucosa, que estén influidos lo más mínimamente por la presencia de interferentes.

Sumario de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un sensor electroquímico desechable para la detección de un analito tal como glucosa en una muestra líquida. El sensor comprende un electrodo de trabajo y un electro de referencia dispuesto de una cavidad receptora de la muestra, una capa de reactivo dispuesta dentro de la cavidad receptora de la muestra y sobre el electrodo de trabajo, comprendiendo dicha capa de reactivo al menos una enzima para la producción de una señal electroquímica en la presencia del analito, en el que la cavidad receptora de la muestra tiene un volumen menor de 1,5 \mul, y en el que el sensor proporciona una medición que se corresponde suficientemente bien (por ejemplo R^{2}>0,95) con la cantidad de analito en un período de 10 segundos o menor para permitir el uso de la medición en la detección y cuantificación precisa y exacta del analito.

El sensor se usa en combinación un medidor para detección del analito en una muestra líquida. Un medidor adecuado comprende un circuito de medición de tiempo para controlar la medición de la corriente indicativa del analito en la muestra después de la detección de la aplicación de la muestra a una tira de ensayo insertada en el medidor, en el que el circuito de medición de tiempo da lugar a que la medición de la corriente se produzca en un tiempo de 15 segundos o menor después de la detección de la aplicación de la muestra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el movimiento de difusión de las especies reactantes en la proximidad de un electro desechable;

la Figura 2 muestra una vista en sección transversal de un biosensor de acuerdo con una primera realización de la invención;

la Figura 3 muestra una vista en sección transversal de un biosensor de acuerdo con una segunda realización de la invención;

la Figura 4 muestra un aparato para la impresión en húmedo de un dispositivo sensor cara contra cara;

la Figura 5 muestra un dispositivo sensor cara contra cara construido parcialmente;

la Figura 6 muestra una vista en sección transversal de un sensor de acuerdo con la invención;

la Figura 7 muestra una gráfica del coeficiente de correlación frente al tiempo de ensayo;

la Figura 8 muestra una vista exterior de un medidor de acuerdo con la invención;

las Figuras 9A-C muestra la construcción de un sensor de acuerdo con la invención; y

la Figura 10 muestra una comparación de una tira comercial con una tira de respuesta rápida de acuerdo con la invención.

Descripción detallada de la invención

La clave para mejorar el resultado de la tira electroquímica se basa en el diseño de la tira, de manera tal que reacción mediada esté favorecida frente a las reacciones interferentes. En el caso de la detección de glucosa, la reacción específica del analito es una reacción mediada que implica la generación enzimática de mediador reducido después de la oxidación del mediador en la superficie del electrodo. De acuerdo con ello, los presentes autores han llegado a la conclusión que el ensayo debería construirse de manera tal que estas reacciones tuvieran lugar en íntima proximidad con la superficie del electrodo con el fin de proporcionar la máxima eficacia de recogida.

Es importante considerar los procesos de difusión que se producen durante un ensayo. Considérese la aplicación de una muestra a la tira de ensayo tal como se muestra en la Figura 1. La tira de ensayo, en su estado seco, incluye un electrodo recubierto con una capa de reactivo que contiene la enzima, E, y el mediador, M. La muestra de ensayo contiene glucosa, G, interferentes electroquímicos, I, y oxígeno, O_{2}, el cual puede unirse a la hemoglobina, Hb. Durante la aplicación de la muestra, se produce un flujo de difusión neto de E y M fuera del electrodo hacia la muestra de ensayo y un flujo de difusión neto de G e I hacia el electrodo. En consecuencia, en tiempos muy cortos después de la aplicación de la muestra la mayor parte de la enzima está aún cerca del electrodo y la reacción con la glucosa tiene una alta probabilidad de dar como resultado la generación de una molécula mediadora reducida suficientemente cerca del electrodo como para ser capturada. En tiempos más largos, mucha parte de la enzima se ha difundido "más profundamente" dentro de la muestra y puede reaccionar con la glucosa ahora. Esto tiene dos efectos. En primer lugar, existe una alta probabilidad de que la enzima reducida sea oxidada por O_{2} en lugar de por M, puesto que la concentración de M disminuirá adicionalmente a partir del electrodo y la concentración de O_{2} se incrementará adicionalmente a partir del electrodo (debido a esta misma reacción). Incluso si la enzima reducida no reacciona con M, la probabilidad de que la M reducida se vuelva a difundir hacia el electrodo para ser nuevamente oxidada con la producción simultánea de una señal detectable es baja. En segundo lugar, la secuencia de reacciones anteriormente descrita tiene el efecto de agotar la difusión interiormente de G, de manera tal que la cantidad de G que realmente llega a la proximidad del electrodo en el cual puede detectarse con alguna eficacia es reducida. Claramente ambos de estos factores contribuyen a una señal reducida en la presencia de oxígeno en la muestra.

De manera similar, los interferentes comunes son materiales fácilmente oxidados tales como ascorbato, acetaminofeno y ácido úrico, los cuales una vez que han alcanzado la superficie del electrodo, son oxidados conjuntamente con el mediador reducido que puede estar presente. Puesto que este efecto puede ocurrir únicamente cuando I está presente cerca de la superficie del electrodo, estará en su mínimo en tiempos cortos antes de que se produzca la difusión de I al electrodo.

Tal como resulta evidente a partir de esta explicación mecánica, una solución a ambos de los problemas de niveles de interferentes y hematocrito/oxigeno es realizar las medidas en tiempos muy cortos. Una solución alternativa es restringir el volumen de la muestra de manera tal que el área superficial del electrodo sea muy grande en comparación con el volumen de la muestra. Una buena configuración es una que asegure que la capa de muestra sobre el electrodo es muy fina (por ejemplo, <200 micrómetros). Un beneficio de limitar el volumen de la muestra es que las características hidrodinámicas de la solución se fijan más rápidamente. Con un volumen de muestra más grande, los efectos de convección en la muestra inducen a ruido en la medición. Mediante el mantenimiento de un bajo volumen de muestra en la forma de una película fina se minimizan los efectos de convección. Esto significa que con un bajo volumen de muestra es posible hacer mediciones más fácilmente.

En la práctica, estas soluciones están relacionadas y ambas son efectuadas en los biosensores de la presente invención. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona sensores electroquímicos desechables y medidores asociados los cuales están adaptados para la toma de mediciones electroquímicas de la cantidad de un analito en una muestra, por ejemplo para la cuantificación de los niveles de glucosa en sangre, en un tiempo más corto que el de los sistemas previamente conocidos. Los sensores de la invención se aprovechan de la relación sinérgica entre tiempos de medición cortos y pequeños volúmenes de muestra para lograr un rendimiento superior. El volumen de muestra pequeño permite una medición más pronto debido a la fijación anticipada de los efectos hidrodinámicos y, de esta forma, se facilita las mediciones en tiempos cortos. Igualmente, un volumen de muestra bajo necesita mediciones de tiempo cortas debido a que la pequeña señal disminuye a tiempos más largos y, por ello, no puede proporcionar una lectura fiable. Mediante la elección de este tipo de configuración los presentes autores aseguran que la concentración del mediador se mantiene alta, de manera tal que el mediador compite más eficazmente con el oxígeno por la enzima reducida.

El lograr un dispositivo que usa un pequeño volumen de muestra es altamente deseable desde el punto de vista del paciente. El desafío es la creación de un dispositivo que use un pequeño volumen de muestra para producir mediciones fiables de la concentración del analito. La primera parte de este procedimiento es la definición de una cavidad que reciba la muestra de pequeño volumen. El volumen de esta cavidad está definido por el área de los electrodos y el espesor del espacio entre los electrodos. Existe un límite inferior al área de los electrodos que puede lograrse mediante cualquier procedimiento de impresión, determinado por la definición del borde y las tolerancias de la impresión. Una vía para mejorar esta precisión cuando se usan tintas de impresión de electrodos conocidas es con la metodología de impresión comúnmente asignada a la Publicación de Patente Internacional No. WO00/42422.

Una vez que se ha minimizado el "área" de los electrodos, el volumen de la muestra está definido posteriormente por la separación entre las superficies de los electrodos. El primer objetivo es una separación fina, pero conveniente. No obstante, debería recordarse que si se logra un volumen de muestra pequeño mediante el uso de una separación muy fina (es decir, <200 \mum), no se cumplen las condiciones usuales de difusión semi-infinita. Por ello, la capa de difusión puede extenderse a través de la separación total, y agotar significativamente la muestra. Bajo estas circunstancias, la precisión de los dispositivos empieza estar influida por el factor adicional de la precisión del procedimiento de montaje que determina el tamaño de la separación. Existe una relación entre el tiempo de medición y el tamaño en el cual la precisión en el tamaño de la separación llega a ser importante, la cual puede entenderse considerando la fórmula

L = \surd(Dt)

en la que L es la longitud de difusión, D es el coeficiente de difusión y t es el tiempo. Cuando el tiempo de ensayo se reduce desde 15 segundos hasta 5 segundos, la longitud de difusión se reduce por un factor de 3. Esto quiere decir en términos prácticos que acortando el tiempo de medición, se puede reducir aun el tamaño del espacio, sin entrar dentro de la condición límite en la que la precisión en la separación llega a ser un factor substancial en la precisión del dispositivo. De acuerdo con ello, por ejemplo, suponiendo un coeficiente de difusión de 10^{-5} cm^{2}seg^{-1} un ensayo a los 5 segundos requeriría una separación mayor de 70 \mum, comparada con los 125 \mum que se requerirían para un segundo ensayo a los 15 segundos. Considerando estos factores, una configuración adecuada para un sensor de acuerdo con la invención tiene una cavidad de recepción de muestra con un volumen menor de 1,5 \mul. Combinado con las consideraciones sobre el tamaño de la separación, esto significa que el electrodo de trabajo está de manera deseable dimensionado de manera tal que la relación del área superficial del electrodo de trabajo al tamaño de la separación es aproximadamente de 0,5 hasta 100 mm. En una configuración preferida específica, el área de cada electrodo es de
0,8 mm^{2} y la separación es de 100-150 \mum, para definir un compartimento de recepción de la muestra con un volumen de 0,5 hasta 0,8 \mul.

La Figura 2 muestra un sensor electroquímico 10 de acuerdo con una primera realización de la invención. Los electrodos 11 y 12 están formados sobre un substrato base 13. El substrato base 13 en combinación con los espaciadores 14,15 y la cubierta superior 16 definen una cavidad 17, en la cual tienen lugar las reacciones electroquímicas. En una realización a modo de ejemplo, los electrodos tienen un área superficial de 5 mm^{2} y el volumen de la cavidad es de manera adecuada menor de 1,5 \mul, preferiblemente menor de 1 \mul y lo más preferiblemente menor de 0,5 \mul.

Un dispositivo del tipo mostrado en la Figura 2 puede fabricarse tal como sigue. Los electrodos 11 y 12 se depositan sobre el substrato 13. La manera específica de depositarlos estará determinada por la naturaleza de los electrodos, aunque la impresión mediante pantalla es una técnica preferida para muchos materiales. El área del electrodo a exponer a la muestra en la cámara se define depositando una máscara aislante sobre los electrodos. (Véase la Publicación de Patente Internacional cedida en común No. WO00/42422). A continuación, se deposita la capa de reactivo. Esta capa puede cubrir ambos electrodos, o puede estar confinada al área sobre el electrodo de trabajo. A continuación, se forman los espaciadores 14 y 15 de acuerdo con un patrón alrededor de los electrodos. En una realización preferida, estos espaciadores se forman mediante la impresión de una capa de adhesivo que tiene una altura en seco de aproximadamente 150 pm. Este espaciador define la separación capilar sin necesidad de usar un material sólido preformado y, de esta forma, se facilita de manera substancial la producción de los dispositivos de la invención. La etapa final es la aplicación de una cubierta 16 para completar la cámara 17. En una realización preferida, la cubierta 16 se fija al dispositivo mediante los espaciadores adhesivos 14,15.

Las Figuras 9A-C ilustran una realización específica de una técnica de fabricación para la producción de un sensor de acuerdo con la invención. La figura muestra un único sensor, pero se da por entendido que generalmente se prepararán más de un sensor. La Figura 9A muestra la estructura del dispositivo antes de la laminación de la cubierta. El sensor, en esta fase, tiene dos electrodos 11,12 depositados sobre un substrato (no mostrado por motivos de claridad). No se muestran las conexiones eléctricas a estos electrodos. Sobre ambos electrodos, se deposita una almohadilla de reactivo 100 conteniendo, por ejemplo, una enzima apropiada para el analito. Las almohadillas adhesivas 101, 102 y 103 se depositan sobre tres lados de la almohadilla de reactivo. A continuación, se colocan en dos sitios dos piezas 104, 105 de una película hidrófila (tal como 9962 de 3M, una película de poliéster ópticamente transparente tratada con un tensioactivo de 100 micrómetros de espesor), una abrazando las almohadillas adhesivas 101 y 102 y cubriendo los electrodos y la almohadilla de reactivo, y una cubriendo una porción de la almohadilla adhesiva 103 para proporcionar un soporte de altura conveniente para recibir la cubierta 116. (Figura 9B). Las posiciones de estas piezas de película hidrófoba crean una cámara capilar sobre los dos electrodos. El recubrimiento hidrófilo de la película incita el movimiento, mediante acción capilar, del líquido de ensayo dentro de la cámara de muestra creada. La separación 106, formada en el área en el que no existe espaciador o película, permite escapar el aire procedente de la parte posterior de la cámara conforme el líquido de ensayo se mueve dentro de la cámara de ensayo creada. Sobre las películas hidrófobas se aplica una cinta sensible a la presión como una cubierta superior 116. La cubierta superior 116 está formada de manera adecuada por una película de poliéster y puede estar recubierta o bien con un adhesivo activado por calor o bien un adhesivo sensible a la presión. La etapa final es el cortado del dispositivo para crear la cámara de muestra de abertura apropiada, por ejemplo mediante cortado a lo largo de la línea de rayas C-C en la Figura 9B. La Figura 9C muestra una vista final del dispositivo después del corte a lo largo de esta línea C-C. Tal como se muestra, la entrada capilar 110 a la cámara de muestra está definida por el substrato 13, las almohadillas adhesivas 101, 102 y la película hidró-
fila 104 y la cubierta superior 116. Las películas 104 y 105 están soportadas por las almohadillas adhesivas 101 y 102.

La Figura 3 muestra un sensor electroquímico 20 de acuerdo con una segunda realización de la invención. Los electrodos 21 y 22 están formados respectivamente sobre un substrato base 23 y una cubierta superior 26. El substrato base 23 en combinación con los espaciadores 24,25 y la cubierta superior 26 definen una cavidad 27, en la cual se producen las reacciones electroquímicas. El sensor está construido con un bajo volumen y un fino espacio entre el substrato base 23 y la cubierta superior 26, por ejemplo desde 50 hasta 200 pm. Es preciso indicar que el área superficial de los electrodos puede ser doble para el dispositivo del mismo tamaño, debido a la configuración cara contra cara, plegada.

Un dispositivo con esta estructura puede realizarse usando la tecnología de impresión en húmedo. Esta tecnología usa un aparato del tipo mostrado esquemáticamente en la Figura 4. Sobre un rodillo de suministro 32 se dispone una tela en movimiento de substrato 31 que es transportada sobre una pluralidad de estaciones de impresión 33, 34 y 35, cada una de las cuales imprime una capa diferente sobre el substrato. El número de estaciones de impresión puede ser cualquier número y dependerá del número de capas requeridas para el dispositivo en particular a fabricar. Entre estaciones de impresión sucesivas, la tela es transportada preferiblemente a través de un secador 36, 37 y 38, para secar cada capa antes de proceder a la deposición de la siguiente. Después del secador final 38, la tela impresa es recogida sobre un rodillo de recogida o introducida directamente dentro del aparato de post-tratamiento 39. Para realizar un dispositivo con la estructura mostrada en la Figura 3 en este aparato, se depositan pistas conductoras paralelas 71 y 72, capa(s) de reactivo 73 y una capa aislante 74 sobre un substrato 70 tal como se muestra en la Figura 5. A continuación, el substrato se pliega a lo largo de una línea de pliegue dispuesta entre las dos pistas conductoras para producir un sensor en el cual dos electrodos cara contra cara están separados por una capa de reactivo. Una geometría de electrodo con los electrodos dispuestos sobre superficies opuestas dentro de la cavidad es beneficiosa, dado que la caída de voltaje debida a la resistencia de la solución es baja como resultado de la capa fina de solución que separa los electrodos.

En cada una de las realizaciones de la invención descritas anteriormente, la cavidad está definida por materiales aislantes. Los materiales aislantes adecuados para este fin incluyen nailon, poliéster, policarbonato y cloruro de polivinilo. Los materiales adecuados para uso como el substrato incluyen películas de poliéster, por ejemplo una película de poliéster de 300 micrómetros, y otros materiales substrato aislantes tales como cloruro de polivinilo (PVC) y policarbonato. Un material dieléctrico imprimible a base de poliéster a partir del cual puede formarse la máscara aislante es ERCON R488-B(HV)-B2 Blue. Dentro de la cavidad, se forman un electrodo de trabajo y uno de referencia a partir de un material conductor. Los materiales conductores apropiados incluyen carbono conductor, oro, platino, aluminio o materiales semiconductores dopados tal como SnO_{2} del tipo n. Los materiales de carbono conductor preferidos son ERCON ERC1, ERCON ERC2 y Acheson Carbon Electrodag 423. El carbono con esta especificación está disponible de Ercon, Inc. (Waltham, Massachusetts, USA), o Acheson Colloids (Princes Rock, Plymouth, Inglaterra). Los electrodos semiconductores ofrecen una opción atractiva dado que pueden funcionalizarse con el fin de permitir la unión de la superficie de enzimas u otros componentes de la capa de reactivo. Esto proporciona los beneficios asociados con la inmovilización, y permite igualmente dirigir la transferencia de electrones entre el reactivo y el electrodo.

Los electrodos pueden obtenerse a partir de diferentes materiales o pueden ser del mismo material. Las realizaciones en las cuales los electrodos son de la misma composición, por ejemplo un electrodo de carbono, pueden ofrecer ventajas. Específicamente, el uso de un único material de electrodo permite depositar los electrodos de trabajo y de referencia en una única etapa, eliminando, de esta forma, una impresión del electrodo a partir del procedimiento de producción. Los dos electrodos pueden imprimirse muy próximos entre sí puesto que la separación entre ellos está determinada únicamente por la impresión sobre una pantalla (tolerancia de aproximadamente 200 \mum) y no por la alineación que pueda lograrse entre operaciones de impresión separadas (tolerancia aproximada de 0,5 mm). Esto permite que el área de reacción sea más compacta y, de esta forma, conduzca a una reducción en el volumen de sangre requerido para cubrir los electrodos.

El electrodo de trabajo tiene una o más capas de reactivo dispuestas sobre el electrodo que contiene la enzima y el mediador usado en la detección del analito diana. De acuerdo con ello, por ejemplo, en un sensor de glucosa, la capa(s) de reactivo incluirían una enzima tal como glucosa oxidasa y un mediador tal como ferricianuro, compuestos metaloceno, quinonas, sales fenacinio, indicador redox DCPIP, y compuestos de osmio substituidos con imidazol. La capa de reactivo puede ser una única capa que incluya tanto enzima como mediador, o puede estar constituida a partir de una pluralidad de sub-capas, algunas conteniendo enzima o enzima y mediador y algunas conteniendo únicamente mediador.

Dado que los dispositivos de la invención están destinados a ser usados en intervalos de tiempo cortos, una característica importante de los electrodos es la capacidad para hidratarse rápidamente. La velocidad de hidratación está determinada por la composición de la capa de reactivo. Un sistema de electrodo que usa una capa de reactivo a base de sílice del tipo descrito en la Patente de EE.UU. No. 5.708.247, y la Publicación de Patente Internacional No. WO00/42422, permite la rápida humectación e hidratación y, por ello, es adecuado para uso en los sensores de la invención. El material óptimo para las capas de reactivo de los electrodos de los sensores de la presente invención es uno que se hidrata rápidamente para formar un gel, el cual permanece en contacto con la superficie del electrodo y retiene los reactivos en la proximidad del electrodo. Si la capa de reactivo se dispersa rápidamente después de la hidratación, los reactivos (y en particular el reactivo enzima) son rápidamente alejados de la proximidad de la superficie del electrodo en donde son lo más beneficioso para el desarrollo de una señal que refleje la concentración de analito en una muestra.

La capa de reactivo debe, igualmente, comprender un mediador en una forma disponible para participación inmediata en la generación de una señal que refleje la concentración de analito. En el caso de un analito tal como glucosa que es oxidada por la enzima, esto significa que el mediador debe ser rápidamente soluble y estar presente en la forma oxidada. En una tira de glucosa comercial comercializada por Medisense bajo los nombres comerciales QID™ y EXACTECH™, el mediador está realmente presente en la forma reducida y debe ser oxidado in situ antes de que pueda participar en una reacción de control de glucosa. Esto limita el tiempo de respuesta de la tira, y excluye su uso en tiempos de ensayo cortos.

En el caso del electrodo de referencia, el electrodo necesita ser hidratarse rápidamente, e igualmente capaz de estabilizarse suficiente rápidamente para suministrar la corriente demandada por el electrodo de trabajo instantáneamente, es decir, dentro de los 200 mseg de hidratación. Un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata convencional no se estabiliza lo suficiente rápidamente. Por otra parte, puede crearse una referencia de ferri-ferrocianuro para equilibrar muy rápidamente. En este diseño, se usa una capa que contiene mediador que se solubiliza o dispersa rápidamente. En una realización específica de la invención, se usan electrodos de tinta de carbono con una capa de reactivo que contiene ferricianuro potásico como el mediador. La glucosa oxidasa se usa como la enzima en una base de hidroxi etilcelulosa-sílice con polímeros agregados para incrementar la naturaleza hidrófila de la formulación. Este sistema tiene un área superficial muy afta y se humecta muy rápidamente.

Además del electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, el dispositivo de la invención puede construirse para incluir un tercer electrodo. El tercer electrodo puede ser un electrodo fingido, destinado a compensar las reacciones de fondo de base, o un electrodo contador de un sistema de tres electrodos convencional. El tercer electrodo podría ser también un electrodo de trabajo idéntico.

En las realizaciones de la invención expuestas anteriormente, todas las capas son rápidamente solubilizadas o hidratadas. Aunque la rápida solubilización o al menos hidratación del mediador oxidado no es un problema para el consumo de interferente, y posiblemente ayude a lograr esta exigencia, no es completamente una buena característica para una capa que contiene enzima, tal como se ha descrito anteriormente, puesto que esto facilita la difusión de la enzima fuera del área próxima al electrodo en donde es lo más beneficioso. De acuerdo con ello, en la Figura 6 se-muestra una configuración útil que combina ambos aspectos. En esta realización de la invención, el sensor 60 tiene una cavidad 67 formada a partir de un substrato inferior 63, espaciadores 64, 65 y una cubierta superior 66. Dos electrodos de carbono 61, 62 se encuentran dispuestos sobre el substrato inferior 63 dentro de la cavidad 67. El electrodo 62 está recubierto con una capa de gel viscoso relativamente fina (por ejemplo, 5 \mum) 68 que contiene enzima y mediador. A continuación, ambos electrodos 61, 62 son recubiertos con una capa de dispersión relativamente fina (por ejemplo,
25 \mum) 69 que contiene mediador, pero no enzima.

En otra realización de la invención, están configuradas dos capas separadas para reducir adicionalmente los efectos de los interferentes. Una vía para aprovechar el consumo químico de interferentes es proporciona una capa de reactivo con un exceso de mediador oxidado sobre la parte exterior. En una configuración particularmente atractiva, un electrodo está recubierto con una capa fina de reactivo que contiene enzima y mediador y, a continuación, una capa fina que contiene únicamente mediador. Ambas capas están depositadas en una matriz que limita la difusión, pero que es rápidamente hidratada de manera tal que puede transportar una corriente. Confinando la enzima a una capa fina, la enzima se mantiene en gran medida en íntima proximidad con el electrodo de manera tal que las reacciones parásitas descritas anteriormente no son importantes. La capa de mediador gruesa exterior proporciona una barrera a la difusión interior de los interferentes y se mantiene en la posición deseada a causa de la matriz que limita la difusión. Puede incluirse una tercera capa opcional fuera de las primera y segunda capas que contienen el mediador en una matriz dispersable rápidamente hidratada. Una vez más, al asegurar que el volumen de la muestra es pequeño, la cantidad total de interferente en la muestra se mantiene en un mínimo, y la concentración del mediador oxidado durante la re-constitución es tan alta que el mediador elimina de manera eficaz el interferente. Obviamente, a tiempos más largos la concentración local del mediador cae conforme se difunde dentro de la muestra y la interferencia llega a ser más significativa.
En la experiencia de los presentes autores, un volumen de muestra menor de 1 \mul, preferiblemente 0,5 \mul, es ideal.

Los sensores realizados de acuerdo con la invención permiten la toma de mediciones de ensayo en tiempos mucho más cortos que los logrados usando sensores conocidos. Al acortar el tiempo de ensayo, pueden reducirse los efectos del hematocrito. Si el sensor comprende un electrodo recubierto con una capa de reactivo que tiene un efecto retardante sobre ciertos componentes de la sangre tal como glóbulos blancos y eritrocitos, en ese caso, en tiempos cortos el fluido que llega al electrodo contendrá significativamente menos de estos componentes que en tiempos largos.

La Figura 7 muestra un gráfico del coeficiente de correlación frente al tiempo de ensayo. A tiempos de ensayos extremadamente cortos la correlación es pobre dado que el sistema no está aún estabilizado. A tiempos de ensayo muy largos la correlación comienza igualmente a degradarse. Teniendo en cuenta el objetivo de la limitación de interferencias mediante el acortamiento del tiempo de ensayo, el ensayo se llevará a cabo de manera adecuada en el régimen indicado por las líneas de trazos, el cual para los sensores descritos más adelante será menor de 10 segundos y preferiblemente alrededor de 5 segundos. Los sensores desechables de la invención trabajan en combinación con un medidor del ensayo para proporcionar mediciones exactas de glucosa dentro de este régimen de tiempo. De acuerdo con ello, el sensor se configura para proporcionar señales que proporcionen información exacta y fiable en tiempos cortos, y el medidor dentro del cual se inserta el sensor está adaptado para recoger información durante este tiempo.

La Figura 8 muestra una vista exterior de un medidor portátil a modo de ejemplo de acuerdo con la invención. Al igual que los medidores convencionales, el medidor de la invención tiene una caja 81 con un visualizador 82 para visualizar los resultados, y una ranura 83 para la inserción del sensor desechable. Pueden incluirse botones 85 y/o conmutadores para manipular el medidor, incluyendo la recuperación de los resultados almacenados, comprobaciones de calibración y similares. En lo que el medidor de la invención difiere del medidor convencional, es en la electrónica de dentro de la caja. En el medidor convencional, la adición de una muestra líquida, tal como una gota de sangre, a un sensor desechable en la caja comienza un ciclo de medición durante el cual los reactivos se disuelven y se toma una lectura. El comienzo del ciclo puede igualmente ser iniciado al apretar un botón el usuario, aunque esto no es lo preferido. El microprocesador en un medidor está, típicamente, en un modo "dormido" y "despierta" periódicamente (por ejemplo cada ½ segundo) para comprobar las interrupciones. Si el programa detecta que aparece una bandera de interrupción, lo que indica que se ha insertado una tira en el medidor o que se ha presionado el botón de comenzar, el programa entra en el modo RUN. En este modo, se aplica típicamente un potencial a la tira y el microprocesador controla la salida (ciclo de rendimiento) de un controlador de la anchura del impulso, lo cual indica el nivel de cualquier corriente consumida por la tira. Tan pronto como la muestra se aplica a la tira, fluye una corriente puesto que la tira está previamente sometida a un potencial de polarización. La detección de esta corriente de comienzo inicia una secuencia de medición de tiempo. La medición de tiempo está controlada por el microprocesador. Existen dos cristales: un reloj de 4 MHz para la función de operación (es decir, la realización de las mediciones) y un reloj de 32 MHz el cual mantiene el tiempo en el modo OFF. Al iniciarse el proceso de medición de tiempo, el potencial aplicado puede, o bien (1) mantenerse a un nivel constante, o bien (2) variar siguiendo un perfil predeterminado. En ambos casos, la corriente se mide después de un tiempo predeterminado para evaluar la cantidad de analito en la muestra. A modo de ejemplo, los datos mostrados en la Figura 7 se recogieron en un sistema en el cual la aplicación de la muestra se detectó a t=0, el potencial detectado se interrumpió durante 2 segundos, durante cuyo tiempo la tira es un circuito abierto y, a continuación, se volvió a aplicar el mismo potencial. La corriente se midió a numerosos puntos de tiempo y se determinó la correlación de corriente con la concentración de analito a cada punto de tiempo.

En medidores comercialmente disponibles conocidos en la técnica, el ciclo de medición se establece para obtener la medición de corriente a los 20 a 60 segundos después de la detección de la muestra. En los medidores de la invención, los cuales están particularmente adaptados para uso con tiras de respuesta rápida de la invención, el ciclo de medición se establece para obtener mediciones de corriente en un tiempo de 15 segundos o menor después de la detección de la muestra, y preferiblemente en un tiempo de desde 5 hasta 10 segundos después de la detección de la muestra.

La invención se describirá a continuación con más detalle con referencia a los ejemplos siguientes no limitativos.

Ejemplo 1

Se prepararon sensores de respuesta rápida de acuerdo con la invención usando los procedimientos descritos en las Figuras 9A-C y los materiales siguientes:

substrato: película de poliéster;

formulación de tinta de carbono: carbón conductor Ercon;

composición de la capa de reactivo: tal como se describe más adelante;

adhesivo: adhesivo de copolímero acrílico al agua (Apollo Adhesives);

película hidrófila: película hidrófila 9962 de 3M de 100 micrómetros;

cubierta superior: tira de poliéster recubierta de adhesivo sensible a la presión (Tape Specialties).

La capa de reactivo se formuló tal como sigue. 100 ml de citrato trisódico acuoso 100 mM se ajustaron a pH 5 mediante la adición de ácido cítrico 1 M. A esos, se agregaron 5 g de hidroxietilcelulosa (HEC), 1 g de alcohol polivinílico, 1 g de PVP-VA S-630 poli(vinil pirrolidona acetato de vinilo), y 0,5 ml de antiespuma DC 1500 de Dow Corning, y se mezclaron mediante homogeneización. La mezcla se dejó reposar durante una noche para permitir que las burbujas de aire se dispersaran y, a continuación, se usó como una solución madre para la formulación de la composición de recubrimiento. Se agregaron gradualmente 7,5 g de Cab-o-Sil TS610 de manera manual a la solución de HEC hasta que se agregó aproximadamente 4/5 de la cantidad total. El resto se agregó con mezclado mediante homogeneización. A continuación, la mezcla se volteó durante 12 horas. A continuación, se agregaron 11 g de ferricianuro potásico y se mezclaron mediante homogeneización hasta completa disolución. Finalmente, se agregaron 2,8 g de preparación de enzima glucosa oxidasa (250 unidades/mg) y, a continuación, se mezclaron intensamente dentro de la solución. La formulación resultante estaba lista para impresión, o podía almacenarse con refrigeración.

Los sensores se usaron para ensayar soluciones de glucosa convencionales y se midió la corriente a diferentes tiempos después de la adición de la glucosa al sensor. Se determinó el coeficiente de correlación entre la concentración de glucosa real y la concentración de glucosa medida para cada intervalo de tiempo. La Figura 7 muestra un gráfico de los resultados. Tal como se muestra, se logró un coeficiente de correlación máximo y un alto valor a los 5 segundos después de la adición de glucosa al sensor.

Ejemplo 2

Se prepararon sensores de glucosa de respuesta rápida de acuerdo con la invención tal como en el Ejemplo 1. Estos sensores se usaron para determinar la cantidad de corriente a los cinco segundos después de exposición a diferentes concentraciones de glucosa. Para fines comparativos, se ensayó un sensor de glucosa Medisense QID bajo las mismas condiciones. La Figura 10 muestra los resultados de este experimento gráficamente. Tal como se muestra, la linealidad de la respuesta del sensor de respuesta rápida de acuerdo con la invención es muy buena (R^{2} = 0,999). La linealidad del sensor QID a los cinco segundos no fue tan buena (R^{2} = 0,863).

Claims (4)

1. Un medidor que comprende:

una caja (81);

un visualizador (82) para la visualización de los resultados;

una ranura para la inserción de un sensor electroquímico desechable para la detección y/o cuantificación de un analito en una muestra líquida; y

un circuito de medición de tiempo adaptado para controlar la medición de la corriente indicativa de analito en la muestra después de la detección de la aplicación de la muestra al sensor cuando el sensor está insertado en el medidor,

caracterizado porque el circuito de medición de tiempo está adaptado además para dar lugar a que la medición de corriente se produzca en un tiempo de 15 segundos o menor después de la detección de la aplicación de la muestra.

2. El medidor de la reivindicación 1, en el que el circuito de medición de tiempo produce la medición de la corriente en un tiempo de 10 segundos o menor después de la detección de la aplicación de la muestra.

3. El medidor de la reivindicación 1, en el que el circuito de medición de tiempo produce la medición de la corriente en un tiempo de 5 segundos o menor después de la detección de la aplicación de la muestra.

4. El medidor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medidor comprende una caja portátil en la cual está dispuesto el circuito de medición de tiempo, conteniendo dicha caja una abertura en ella para la recepción del sensor.