ES2334893T3 - Biosensores electroquimicos. - Google Patents

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Abstract

Un biosensor electroquímico para determinar la concentración de un analito en una muestra que consta de: un sustrato base (400) y un sustrato de cubierta (300); un espaciador para la introducción de la muestra (200) que tiene una parte de introducción de muestras (100), dicho espaciador que introduce la muestra está posicionado entre el sustrato base y el sustrato de cubierta; y, por lo menos un electrodo de trabajo (104) impreso sobre el sustrato base (400) y por lo menos un electrodo de referencia (105) impreso por lo menos sobre un sustrato base y la superficie interior del sustrato de cubierta y una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica aportado sobre el sustrato base, caracterizado porque la parte de introducción de muestras (100) está formada en un extremo del espaciador que introduce la muestra (200), la parte de introducción de muestras consta de: un pasaje de introducción de muestras (101), un pasaje de descarga de aire (102) y un hueco (103), dicho pasaje de introducción de muestras (101) y el pasaje de descarga de aire (102) están conectados formando un ángulo de 45-135º, con preferencia un ángulo de 75-105º, en el extremo del pasaje de introducción de muestras, y el hueco (103) es un espacio adicional formado en el extremo del pasaje de introducción de muestras en dirección opuesta al flujo de entrada de la muestra y la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire (103) y la del pasaje de introducción de muestras (101) no es superior a 1:2.

Description

Biosensores electroquímicos.
Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a biosensores electroquímicos. Más en particular, la presente invención se refiere a biosensores electroquímicos que tienen una parte ampliada de introducción de muestras; la parte de introducción de muestras consta de un pasaje de introducción de muestras, un pasaje de descarga de aire y un hueco; el pasaje de introducción de muestras se comunica con el pasaje de descarga de aire y el hueco está formado en el punto de comunicación. La presente invención proporciona además un método para determinar la fluidez de muestras de sangre utilizando dicha parte de introducción de muestras.
Antecedentes de la invención
El seguimiento periódico de los niveles de glucosa en la sangre es necesario para el diagnóstico y la profilaxis de la diabetes mellitus. Los analizadores convencionales para detectar el nivel de glucosa en la sangre son analizadores de tipo cinta, basados en métodos colorimétricos o electroquímicos.
El método colorimétrico depende de la reacción colorimétrica de la oxidasa de la glucosa.
El método colorimétrico se basa en la reacción colorimétrica de la oxidasa de la glucosa:
glucosa + O_{2} \rightarrow ácido glucónico + H_{2}O_{2} \hskip0.5cm (catalizador: oxidasa de la glucosa)
H_{2}O_{2} + colorante \rightarrow producto \hskip0.5cm (catalizador: peroxidasa)
Tal como se muestra en la reacción, la glucosa reacciona con el oxígeno y se oxida a ácido glucónico y peróxido de hidrógeno en presencia de la oxidasa de la glucosa. Con la peroxidasa, el peróxido de hidrógeno se reduce después a agua, oxidando al mismo tiempo a un receptor cromóforo de oxígeno. Esta reacción produce un cambio de color proporcional al nivel de la glucosa en la sangre.
Sin embargo, este método colorimétrico requiere una actuación precisa, porque el cambio de color (o la intensidad) depende del grado de transporte y tratamiento previo de la muestra, de la cantidad de muestra, del tiempo de reacción y del tiempo de coloración. Además, la coagulación de la sangre o la presencia de materiales interferentes (por ejemplo, ácido úrico, ácido ascórbico y bilirrubina) pueden falsear el análisis colorimétrico.
El método electroquímico puede soslayar los problemas anteriores, proporcionando una selectividad y sensibilidad elevadas. Por ejemplo, un biosensor electroquímico permite introducir las muestras sin tratamiento previo, incluso cuando las muestras son turbias y permite analizar cuidadosamente el nivel de glucosa en un período corto de tiempo.
Tanto el método colorimétrico como el electroquímico, que utilizan oxígeno como mediador de la transferencia electrónica, se denominan biosensores de la primera generación. El método electroquímico de segunda generación adopta compuestos organometálicos (que contienen derivados p.ej. de Fe, Os, Ru), quinonas, derivados de quinona, sales orgánicas conductoras o viológeno como mediador de la transferencia electrónica. Los sensores electroquímicos de segunda generación se basan en la siguiente reacción:
glucosa + GOx_{-FAD} \rightarrow ácido glucónico + GOx_{-FADH2}
GOx_{-FADH2} + M_{ox} \rightarrow GOx_{-FAD} + M_{red}
(en la que, GOx significa la oxidasa de la glucosa; GOx_{-FAD} y GOx_{-FADH2} significan un estado oxidado y un estado reducido de la oxidasa de la glucosa, respectivamente; y M_{ox} y M_{red} significan el medio de la transferencia electrónica oxidado y reducido, respectivamente).
Tal como se indica en la reacción, la glucosa se oxida a ácido glucónico reduciendo la GOx_{-FAD} a GOx_{-FADH2}. La oxidasa de la glucosa reducida transfiere un electrón o electrones al mediador de la transferencia electrónica M_{ox} y después vuelve a su estado inicial. Durante esta reacción se mide en la superficie del electrodo la corriente redox así generada.
La cinta del biosensor electroquímico consta de: a) por lo menos un sustrato, sobre el que se ha impreso un sistema de electrodo (un electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar y/o un electrodo de referencia); b) una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica inmovilizado sobre el sistema de electrodo y c) una parte de introducción de muestras. La cinta del biosensor electroquímico puede clasificarse en cuatro tipos: (1) un biosensor de tipo plano sobre cuyo sustrato base se imprimen un electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar (o electrodo de referencia); (2) un biosensor de tipo opuesto, en el que el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar están enfrentados; (3) un biosensor diferencial de tipo plano; y (4) un biosensor diferencial de tipo opuesto.
La mayor parte de biosensores comerciales tienen una parte de introducción de muestras que puede clasificarse como de tipo i o como de tipo de línea horizontal.
La parte de introducción de muestras de tipo i consta de un sustrato base, un espaciador de película fina (por ejemplo, 100-500 \mum) con una porción de corte (cut-out) en forma de U y una placa de cubierta con un orificio de ventilación para la descarga de aire. El orificio de ventilación puede estar también dispuesto en la placa base. Este tipo de biosensor proporciona una introducción rápida de la muestra líquida a través del capilar de tipo i, que adolece del inconveniente de que la cantidad de muestra introducida no se controla con precisión, porque el canal en forma de U se halla a menudo demasiado lleno o poco lleno alrededor del orificio de ventilación; el llenado del canal de muestras depende de forma significativa de la fluidez de sangre, que varían en gran manera según el nivel de hematocrito. Otro inconveniente del tipo i es que el manejo inadecuado de la cinta contamina fácilmente al usuario con la sangre despedida por el orificio de ventilación.
La parte de introducción de muestras de tipo línea horizontal está formada por el espaciador dispuesto en forma de canal estrecho de flujo que cruza la cinta entre los sustratos de base y de cubierta; se introduce la muestra por la entrada existente en una cara lateral, mientras que el aire del espacio se descarga a través de una salida existente en otra cara lateral. Este tipo de biosensor adolece también del inconveniente de que la muestra debe introducirse lateralmente, obligando a menudo al usuario a colocar la cinta en una posición incómoda sobre la zona de muestreo.
En US-6,299,757, de Feldman y col., se describe un sensor que incluye un espaciador y un canal de muestras. Aunque se describen algunas formas de ejecución, en las que existe una zona ampliada en el espaciador, la función de la zona está limitada a obtener cámaras grandes de muestras.
Por lo tanto, según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un biosensor electroquímico equipado con una parte de introducción de muestras que permite una introducción rápida de una muestra de sangre en la punta de la cinta, en una cantidad precisa, para la determinación electroquímica.
La sangre humana contiene partículas sólidas (hematocritos), por ejemplo eritrocitos, leucocitos y otras proteínas, que pueden separarse del plasma. Estas partículas cambian la fluidez y la conductividad eléctrica de la sangre. Hay que advertir que la muestra se introduce con diferente velocidad en el canal capilar de la cinta del biosensor y que el tiempo de llenado de la muestra es una función del nivel de hematocrito.
Por consiguiente, según el segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un biosensor electroquímico equipado con un electrodo para determinar la fluidez, que mide el tiempo de llenado de la muestra en el capilar y un método para corregir los valores con respecto a los obtenidos con un nivel determinado de hematocrito.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un biosensor electroquímico con una parte de introducción de muestras que permite la introducción rápida y precisa de muestras fisiológicas, sin ningún tratamiento previo de las muestras de sangre.
Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un biosensor electroquímico equipado con un electrodo que determina la fluidez de la muestra, que permite corregir eficazmente la influencia de los componentes que modifican la fluidez. El electrodo que determina la fluidez discrimina además las muestras anómalas, por ejemplo las muestras de sangre que tienen una viscosidad inusual (demasiado elevada o demasiado baja, si se compara con la viscosidad de la sangre humana normal) o las muestras que contienen burbujas de aire (US-5,284,658).
Estos y otros objetos pueden lograrse aportando la parte de introducción de muestras que consta de un pasaje de introducción de muestras, un pasaje de descarga de aire y un hueco, dicho pasaje de introducción de muestras se comunica con el pasaje de descarga de aire y dicho hueco está formado en el punto de comunicación, tal como se reivindica en la reivindicación 1, y dicho hueco puede utilizarse también para colocar un electrodo para determinar la fluidez.
Breve descripción de las figuras
La solicitud de las formas preferidas de ejecución de la presente invención se comprenderá mejor con referencia a las figuras adjuntas, cuyos números de referencia indican las partes correspondientes, en las que:
la figura 1 es una perspectiva en despiece que representa un biosensor electroquímico con una parte de introducción de muestras según la presente invención;
la figura 2 es una perspectiva en despiece que representa un biosensor de tipo plano, con arreglo a la primera forma de ejecución de la presente invención;
la figura 3 es una perspectiva en despiece que representa un biosensor de tipo opuesto, con arreglo a una segunda forma de ejecución de la presente invención;
la figura 4 es una perspectiva en despiece que representa un biosensor diferencial de tipo plano, con arreglo a una tercera forma de ejecución de la presente invención;
la figura 5 es una perspectiva en despiece que representa un biosensor diferencial de tipo opuesto, con arreglo a una cuarta forma de ejecución de la presente invención;
la figura 6 es una perspectiva en despiece, que representa un biosensor electroquímico con una parte de introducción de muestras y un electrodo para determinar la fluidez según la presente invención;
la figura 7 es una gráfica que representa la influencia de los distintos materiales que interfieren en un sensor de glucosa de tipo opuesto;
a: glucosa
b: glucosa + acetoaminofeno (660 \muM)
c: glucosa + ácido ascórbico (570 \muM)
d: glucosa + ácido úrico (916 \muM)
la figura 8 es una gráfica que representa una curva de calibrado de un sensor de glucosa de tipo opuesto, para la sensibilidad a una solución patrón de glucosa;
la figura 9 es una gráfica que representa curvas dinámicas obtenidas por un método cronoamperométrico, de un sensor de glucosa de tipo opuesto, para soluciones patrón de glucosa;
la figura 10 es una gráfica que representa la relación entre la fluidez de la muestra (en función del tiempo) y el nivel de hematocrito.
Descripción detallada de la invención
Con referencia a la figura 1, un biosensor electroquímico consta de un espaciador 200 y un sustrato inferior 400 (base) y un sustrato superior (cubierta) 300 que forman los sensores electroquímicos y el canal de introducción de muestras. Formados en un extremo del espaciador 200 son un pasaje de introducción de muestras 101, un pasaje de descarga de aire 102 y un hueco 103. Hay que notar que el pasaje de introducción de muestras 101 comunica con el pasaje de descarga de aire 102 de manera aproximadamente perpendicular y el hueco 103 está formado en el punto de comunicación, lo cual significa que el pasaje de introducción de muestras (101) y el pasaje de descarga de aire (102) están conectados formando un ángulo de 45-135º, con preferencia un ángulo de 75-105º, en el extremo del pasaje de introducción de muestras y el hueco (103) es un espacio adicional formado en el extremo del pasaje de introducción de muestras en dirección opuesta al caudal de entrada de las muestras. En su conjunto, el pasaje de introducción de muestras 101, el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 constituyen una parte de la introducción de muestras 100.
El pasaje de introducción de muestras 101 es un pasaje capaz de introducir las muestras en el biosensor y el pasaje de descarga de aire 102 es un pasaje para el aire. Debido a la acción capilar, la muestra a ensayar se introduce en la parte de introducción de muestras 100 y el aire se descarga a través del pasaje de descarga de aire 102.
El hueco 103 proporciona una posición vacante y reduce el fenómeno de las bolsas de aire, que surge a menudo en el punto de comunicación entre el pasaje de introducción de muestras 101 y el pasaje de descarga de aire 102. La aparición del fenómeno de las bolsas de aire se traduce en mediciones falseadas, de modo que el hueco 103 asegura que el muestreo será preciso y reproducible.
La proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire 102 con la del pasaje de introducción de muestras 101 se sitúa con preferencia en un valor no superior a 1:2. El intervalo más preferido va desde 1:5 hasta 1:2. Una proporción inferior a 1:2 asegura el confinamiento de una cantidad exacta de muestra en el canal 101 con un rebose mínimo a través del pasaje de descarga de aire 102.
En la figura 1, el ángulo de comunicación (\phi) entre el pasaje de introducción de muestras 101 y el pasaje de descarga de aire 102 se representa como 90º. Pero, según otra forma de ejecución de la presente invención, este ángulo puede variar en un intervalo comprendido entre aprox. 45º y aprox. 135º, con preferencia entre 75º y 105º.
Se representa también en la figura 1 que el hueco 103 se extiende más allá del punto de comunicación del pasaje de introducción de muestras 101. Para asegurar la introducción de una cantidad exacta de muestra sin formación de burbujas es deseable el tratamiento hidrófilo del pasaje de introducción de muestras 101, incluido el hueco 103.
La parte de introducción de muestras 100 de la presente invención tiene capacidad para introducir 0,1-3,0 \mul de muestra. Con mayor preferencia, esta capacidad es de 0,1-1,0 \mul; con preferencia especial, la capacidad es de 0,3-0,7 \mul. Las muestras de menos de 0,1 \mul son demasiado pequeñas para permitir una medición cuidadosa dentro del intervalo de error del biosensor actual. Sin embargo, las muestras mayores que 3,0 \mul son excesivas. En las formas de ejecución preferidas se pueden obtener mediciones correctas con muestras que tengan precisamente 0,5 \mul.
Por prensado de una lámina polimérica orgánica, formada por poliéster, poli(cloruro de vinilo) o policarbonato, se puede fabricar la introducción del espaciador 200 entre la base y el sustrato superior. Puede fabricarse por prensado de una película adhesiva por ambas caras, formada por un polímero orgánico o por serigrafiado de una capa de adhesivo con el modelo representado en la figura 1.
El principio de trabajo de la parte de introducción de muestras 100 se describe a continuación con detalle.
En primer lugar se introduce la muestra en el pasaje de introducción de muestras 101 mediante el efecto capilar tan pronto la muestra entra en contacto con la boca del pasaje de introducción de muestras 101 y el pasaje 101 se llena con la muestra hasta el espacio del hueco 103. Después se acarrea la muestra en exceso hasta el pasaje de descarga de aire 102. En este punto puede minimizarse el exceso de muestra introducida controlando la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire 102 y la del pasaje de introducción de muestras 101 hasta un valor inferior a 1:2 y el hueco hidrófilo 103 elimina el fenómeno de formación de bolsas de aire que se produce en el punto de comunicación entre el pasaje de introducción de muestras 101 y el pasaje de descarga de aire 102.
Según la forma preferida de ejecución de la presente invención, suponiendo una capacidad de muestra de 0,5 \mul, la parte de introducción de muestras 100 se llena con sangre en aprox. 200-2000 ms en función del nivel de hematocrito, de las condiciones de almacenaje de las muestras y del tipo de anti-coagulante empleado. Las muestras de sangre fresca normalmente llenan los 0,5 \mul del canal de muestras en aprox. 200-800 ms en función del nivel de hematocrito.
La parte de introducción de muestras 100 de la presente invención puede aplicarse a varios tipos de biosensores, incluidos el biosensor de tipo plano, el biosensor de tipo opuesto, el biosensor diferencial de tipo plano, el biosensor diferencial de tipo opuesto, o el biosensor opuesto con electrodo para determinar la fluidez.
Con respecto a la figura 2, un biosensor de tipo plano con la parte de introducción de muestras 100 de la presente invención consta de un sustrato base 400 en el que se ha impreso un sistema de electrodo (un electrodo de trabajo 104 y un electrodo de referencia 105), en el que hay una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica inmovilizado sobre el sistema de electrodo; un espaciador que introduce la muestra 200 que tiene la parte de introducción de muestras 100; y un sustrato superior 300 que incluye la parte de introducción de muestras y protege al biosensor de contaminantes externos. La parte de introducción de muestras 100 puede estar formada del modo que se indica, pero la presente invención se cumple en el supuesto de que el pasaje de introducción de muestras 101 comunique con el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 se forme en el punto de comunicación; la estructura del hueco 103 puede modificarse también del modo que se ha indicado anteriormente.
En el anterior biosensor de tipo plano, el material de carbón o de metal conductor puede imprimirse o depositarse sobre el sustrato base 400 por ejemplo por serigrafiado, deposición de plasma o mordentado para formar el electrodo de trabajo 104 y el electrodo de referencia 105. Los dos electrodos se forman simétricamente y se extienden a lo largo de la base 400. Una vez la porción de electrodo se ha construido de esta guisa, se extienden sobre los electrodos una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica.
Excepto la porción que conecta con el electrodo, el sustrato base 400 se adhiere al espaciador que introduce la muestra 200 con un adhesivo. El espaciador que introduce la muestra 200 se fabrica con preferencia con un polímero aislante, pero no se limita a esta opción.
El sustrato base 400 y el sustrato superior 300 se fijan mediante adhesivos o una cinta adhesiva por ambas caras. Empleando medios adhesivos similares, la fabricación del biosensor puede completarse presionando el sustrato superior 300, que sirve de cubierta, sobre el espaciador que introduce la muestra 200.
La figura 3 ilustra un biosensor de tipo opuesto con una parte de introducción de muestras 100, caracterizado porque un sustrato base 400' sobre el que se han impreso un electrodo de trabajo 104' y un electrodo conector 106, mientras que sobre el electrodo de trabajo 104' se han inmovilizado una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica; un espaciador que introduce la muestra 200' que tiene la parte de introducción de muestras 100; y un sustrato superior 300' sobre la cara inferior del cual se han impreso un electrodo de referencia 105 y un electrodo conector 106. La parte de introducción de muestras 100 puede formarse del modo indicado, pero la presente invención se cumple en el supuesto de que el pasaje de introducción de muestras 101 comunique con el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 esté formado en el punto de comunicación; la estructura del hueco 103 puede modificarse también del modo indicado anteriormente.
La fabricación del biosensor de tipo opuesto con la parte de introducción de muestras 100 puede realizarse de igual manera que el biosensor de tipo plano con la parte de introducción de muestras 100.
\newpage
Tal como se representa en la figura 4, un biosensor diferencial de tipo plano consta de un sustrato base 400a, en ambas superficies del cual se han impreso un electrodo de trabajo 104 y un electrodo de referencia 105 y se proporcionan una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica; un par de espaciadores para la introducción de la muestra 200a y 200b, cada uno de ellos tiene una parte de introducción de muestras 100, fijada en la superficie superior e inferior, respectivamente, del sustrato base 400a; y un par de placas de cubierta 300a y 300b, que se fijan respectivamente a las superficies exteriores del espaciador que introduce la muestras 200a y 200b. La parte de introducción de muestras 100 puede formarse del modo indicado, pero la presente invención se cumple en el supuesto de que el pasaje de introducción de muestras 101 comunique con el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 se forme en el punto de comunicación; la estructura del hueco 103 puede modificarse también del modo que se ha indicado antes.
Tal como se representa en la figura 5, un biosensor diferencial de tipo opuesto consta de un sustrato base 400b, sobre cuyas dos superficies se han impreso un electrodo de trabajo 104 y un electrodo conector 106 y se han proporcionado una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica; un par de espaciadores para la introducción de muestra 200a' y 200b', cada uno de ellos tiene un sustrato para la introducción de la muestra 100, fijado a la superficie superior e inferior, respectivamente del sustrato base 400b; y un par de placas de cubierta 300a' y 300b', fijadas respectivamente a las superficies exteriores del espaciador que introduce la muestras 200a' y 200b', sobre las caras interior de los cuales se imprimen un electrodo de referencia 105' y un electrodo conector 106. La parte de introducción de muestras 100 puede formarse del modo indicado, pero la presente invención se cumple en el supuesto de que el pasaje de introducción de muestras 101 comunique con el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 se forma en el punto de comunicación; la estructura del hueco 103 puede modificarse también del modo antes indicado.
Tal como se representa en la figura 6, se ilustra un biosensor de tipo opuesto con capacidad para determinar la fluidez de la muestra, caracterizado porque se inmovilizan un sustrato base 400', sobre el que se han impreso un electrodo de trabajo 104', un electrodo conector 106 y un electrodo que determina la fluidez 107, y una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica sobre el electrodo de trabajo 104'; un espaciador que introduce la muestra 200' que tiene la parte de introducción de muestras 100; y un sustrato superior 300' sobre cuya cara de fondo se han impreso un electrodo de referencia 105' y un electrodo conector 106. La parte de introducción de muestras 100 puede formarse del modo indicado, pero la presente invención se cumple en el supuesto de que el pasaje de introducción de muestras 101 comunique con el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 esté formado en el punto de comunicación; la estructura del hueco 103 puede modificarse también del modo que se ha detallado antes. La fluidez de una muestra se determina en función de la velocidad de llenado de la muestra entre el primer punto de contacto del electrodo 105' junto a la boca de introducción de la muestra y el electrodo que determina la fluidez 107 que está colocado en el hueco 103 o en el pasaje de descarga de aire 102.
Los sustratos de cualquiera de las placas base o de las placas de cubierta que se emplean en los biosensores antes descritos pueden fabricarse de materiales cerámicos, vidrio o poliméricos, con preferencia de un polímero orgánico de poliéster, poli(cloruro de vinilo) o policarbonato.
La fabricación de los electrodos, por ejemplo los electrodos de referencia, los electrodos de trabajo y los electrodos de referencias puede realizarse empleando un material conductor, p.ej. plata-epoxi, plata/cloruro de plata, carbón, pares redox o una pasta de carbón conductora modificada que contenga un ligante resínico. Estos materiales pueden incorporarse a los electrodos de referencia, el opuesto y el de trabajo por un método de serigrafiado, una deposición en fase vapor y un mordentado posterior o por adhesión de una cinta conductora.
Los biosensores recién descritos con parte de introducción de muestras 100 tienen diversas ventajas.
(1) Se elimina el fenómeno de las bolsas de aire, que surge en el punto de comunicación entre el pasaje de introducción de muestras y el pasaje de descarga de aire, al tiempo que la muestra se introduce rápidamente en el biosensor.
(2) La parte de introducción de muestras 100 queda bien confinada en la boca estrecha y el pasaje de descarga de aire, por ello los biosensores de la presente invención mantienen una concentración consistente de muestra con una evaporación mínima, mejorando de este modo la reproducibilidad analítica. Además la muestra está mejora contenida según la presente invención que con otros tipos de esquemas de introducción de muestra, ya que las cintas se adaptan a y se arrancan de los instrumentos, reduciendo considerablemente la posibilidad de contaminación.
(3) Los biosensores equipados con la parte de introducción de muestras 100, en la que el pasaje de introducción de muestras y el pasaje de descarga de aire se comunican de modo aproximadamente perpendicular, son capaces de introducir rápidamente una cantidad predeterminada de sangre extraída y de aumentar la precisión y la reproducibilidad. Esto es lo que los distingue del biosensor de tipo i convencional.
(4) La presente invención permite una introducción más fácil de la sangre por la punta del biosensor, cuando este se aplica a una parte del cuerpo.
El mediador de transferencia electrónica aportado como electrodo de trabajo puede emplear ferroceno o sus derivados, quinona o sus derivados, sales orgánicas conductoras o viológeno. Con preferencia, el mediador de transferencia electrónica es un compuesto de valencia mixta, capaz de formar pares redox, incluidos el cloruro de hexaaminorrutenio (III), ferricianuro potásico, ferrocianuro potásico, dimetilferroceno, ferricinio, ácido ferrocenomonocarboxílico, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, tetratiafulvaleno, niqueloceno, N-metilacidinio, tetratiatetraceno, N-metilfenazinio, hidroquinona, ácido 3-dimetilaminobenzoico, 3-metil-2-benzotiozolinona-hidrazona, 2-metoxi-4-alilfenol, 4-aminoantipirina, dimetilanilina, 4-aminoantipireno, 4-metoxinaftol, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina; sulfonato de 2,2-azino-di-[3- etilbenzotiazolina], o-dianisidina, o-toluidina, 2,4-dicloro-fenol, 4-aminofenazona, bencidina y azul Prusia.
De ellos, el mediador preferido para el sistema de biosensor propuesto es el cloruro de hexaaminorrutenio (III), porque cumple varios requisitos: (1) tanto el estado oxidado como el reducido del mismo son estables y reversibles en solución acuosa; (2) el mediador de transferencia electrónica reducido no reacciona con el oxígeno; (3) su potencial formal es lo suficientemente bajo para minimizar la influencia de los materiales que interfieren, por ejemplo el ácido ascórbico, el ácido úrico y el acetaminofeno; (4) la oxidación del mediador de transferencia electrónica reducido no es sensible al pH; y (5) no reacciona con materiales electroquímicamente interferentes, por ejemplo el ácido ascórbico, el acetaminofeno y el ácido úrico.
Aquí se da por supuesto que la presente invención, aunque describe biosensores para el análisis de niveles de glucosa en la sangre, puede introducir las enzimas y los mediadores de transferencia electrónica apropiados en el sistema de electrodo de modo que pueden analizarse cuantitativamente una gran variedad de muestras, incluidos biomateriales, por ejemplo metabolitos, p.ej. colesterol, lactato, creatinina, proteínas, peróxido de hidrógeno, alcoholes, aminoácidos y enzimas, p.ej. la GPT (glutamato-piruvato-transaminasa) y la GOT (glutamato-oxaloacetato-transaminasa), materiales medioambientales, materiales agrícolas e industriales y materiales alimentarios. Por ejemplo pueden analizarse cuantitativamente el colesterol, lactato, glutamato, peróxido de hidrógeno, y alcohol empleando la oxidasa de la glucosa, lactato-oxidasa, colesterol-oxidasa, glutamato-oxidasa, peroxidasa de rábano rusticano y alcohol-oxidasa, respectivamente.
Se conseguirá una mejor comprensión de la presente invención a la luz de los siguientes ejemplos que se facilitan para ilustrar, pero con ellos no se pretende limitar la presente invención.
Ejemplo 1 Fabricación de un biosensor de tipo plano
Se serigrafía pasta de carbón conductor para formar plantillas simétricas sobre una placa base de poliéster 400, obteniéndose el electrodo de trabajo 104 y el electrodo de referencia (o electrodo de referencia) 105. El intervalo entre los dos electrodos es 125 \mum. Por reticulación (curado) de los electrodos impresos a 140ºC durante cinco minutos se obtiene un cuerpo único de electrodo para el biosensor de tipo plano.
A continuación se fija la parte de introducción de muestras 100, que consta del pasaje de introducción de muestras 101, el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 formado en ella, presionando la cinta de doble cara, fabricada de poliéster. El pasaje de introducción de muestras 101 comunica perpendicularmente con el pasaje de descarga de aire 102 y la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire 102 y la del pasaje de introducción de muestras 101 se controla para que sea 1:2. El hueco 103 se forma para que se extienda por detrás del pasaje de introducción de muestras 101. La cantidad total de muestra de sangre dentro la parte de introducción de muestras 100 es de 0,5 \mul.
Se prepara el marco del biosensor insertando a cada placa base de poliéster 400 y presionando la cinta de doble cara fabricada con poliéster como espaciador de introducción de muestra 200 que tiene la parte de introducción de muestras 100. Se aplica una solución, que contiene 0,015 mg de cloruro de hexaaminorrutenio (III), 0,015 mg de un dispersante (carboximetilcelulosa), 0,01 mg de un tensioactivo (Triton X-100) y 40 mg de oxidasa de la glucosa, a los electrodos para formar el biosensor y se seca el depósito resultante a 45ºC durante treinta minutos.
Presionando la placa de cubierta 300 sobre el espaciador que introduce la muestra 200 se completa la formación del biosensor de tipo plano de la figura 2.
Ejemplo 2 Fabricación de un biosensor de tipo opuesto
Tal como se representa en la figura 3, se serigrafían un electrodo de trabajo 104' y un electrodo conector 106 con pasta conductora de carbón y se efectúa el curado a 140ºC durante cinco minutos. Después se serigrafía el conector de circuito con la pasta de plata en un extremo del electrodo conector 106. Se serigrafía la placa de cubierta con el electrodo impreso como electrodo de referencia (auxiliar) 105' con pasta de carbón y se cura (se reticula). Finalmente se fabrica el biosensor de modo que se serigrafía el extremo del electrodo de referencia 105' con pasta de plata, para que sea el conector de circuito.
El espaciador que introduce la muestra 200' que consta del pasaje de introducción de muestras 101, el pasaje de descarga de aire 102 y el hueco 103 se coloca sobre el sustrato base presionando la cinta de doble cara fabricada con poliéster. La proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire 102 y la del pasaje de introducción de muestras 101 es de 1:4 y la cantidad total de muestra de sangre dentro de la parte de introducción de muestras 100 se ajusta a 0,5 \mul.
Se aplica a los electrodos que forman el biosensor 1 ml de una solución que contiene 0,015 mg de cloruro de hexaaminorrutenio (III), 0,015 mg de un dispersante (carboximetilcelulosa), 0,01 mg de un tensioactivo (Triton X-100) y 40 mg de oxidasa de la glucosa y se deja secar la capa de reacción a 45ºC durante treinta minutos.
Presionando la placa de cubierta 300' sobre el espaciador de introducción de la muestra 200', para que se conecte con el conector de circuito del sustrato base 400', se completa la formación del biosensor representado en la figura
3.
Ejemplo 3 Fabricación de un sensor diferencial de glucosa de tipo plano
Se prepara el sensor diferencial de glucosa de tipo plano de igual manera que en el ejemplo 1. Tal como se representa en la figura 4, el biosensor diferencial de tipo plano se fabrica aportando una pequeña cantidad de albúmina de suero bovino (BSA) al electrodo diferencial de trabajo 104 del sustrato base 400a, en lugar del cloruro de hexaaminorrutenio (III) y oxidasa de la glucosa empleados en el ejemplo 1 y presionando las placas de cubierta 300a y 300b.
Ejemplo 4 Fabricación de un biosensor diferencial de tipo opuesto
El sensor diferencial de glucosa de tipo opuesto se prepara de igual manera que en el ejemplo 2. Tal como se representa en la figura 5, el biosensor diferencial de tipo opuesto se fabrica aportando una pequeña cantidad de albúmina de suero bovino (BSA) al electrodo diferencial de trabajo 104' del sustrato base 400b, en lugar del cloruro de hexaaminorrutenio (III) y oxidasa de la glucosa empleados en el ejemplo 1 y presionando las placas de cubierta 300a' y 300b'.
Ejemplo 5 Fabricación de un biosensor con electrodo que determina la fluidez
El biosensor con electrodo que determina la fluidez es el biosensor de tipo opuesto que se prepara de igual manera que en el ejemplo 2 excepto el uso del electrodo que determina la fluidez 107; tal como se ilustra en la figura 6, se serigrafía con la misma pasta de carbón. Se coloca la punta del electro que determina la fluidez en el hueco 103 de la parte de introducción de muestras.
Ejemplo experimental 1
Influencia de materiales interferentes en un sensor de glucosa de tipo opuesto
En la figura 7 se representan las corrientes de respuesta total a soluciones patrón de tampón fosfato (pH 7,4) que contienen 177 mg/dl de glucosa y materiales interferentes cuyas concentraciones son cinco veces mayores que los niveles clínicos máximos (p.ej. ácido ascórbico 570 \muM, acetaminofeno 660 \muM y ácido úrico 916 \muM). Se miden las corrientes de respuesta total leyendo la respuesta cronoamperométrica 5 segundos después de aplicar un potencial de +0,2 V al electrodo de trabajo 104' (frente al electrodo de referencia 105'). Se introducen las muestras en la parte de introducción de muestras 100 del biosensor fabricado del modo descrito en el ejemplo 2 y su volumen medio es de 0,5 \mul. Los histogramas de la figura 7 indican que los sensores resultan afectados de modo insignificante por la presencia de materiales interferentes cuando se aplica un potencial de +0,2 V.
Ejemplo experimental 2
Curva de calibrado de un sensor de glucosa de tipo opuesto con soluciones patrón de glucosa
El sensor de glucosa de tipo opuesto preparado en el ejemplo 2 se ensaya para determinar su sensibilidad a las soluciones patrón de glucosa. Se obtiene la curva de calibrado del modo representado en la figura 8. A este respecto, los valores de corriente se miden diez veces para cada concentración en el campo eléctrico de un potencial aplicado de 0,2 V con respecto al electrodo de referencia. La cantidad de muestra aplicada a la parte de introducción de muestras es de 0,5 \mul y el tiempo de llenado no es superior a 200 ms. Las mediciones se realizan 2 s después de la introducción de la muestra aplicando 0,2 V durante tres segundos y los valores de corriente se leen a los cinco segundos. Las curvas dinámicas así obtenidas se representan en la figura 9, en la que las curvas correspondientes indican las concentraciones de glucosa de 0 mg/dl (curva a), 50 mg/dl (curva b), 150 mg/dl (curva c), 300 mg/dl (curva d), 450 mg/dl (curva e) y 600 mg/dl (curva f).
Para demostrar que el sensor de glucosa de tipo opuesto de la presente invención es fiable se evalúa la curva y se representa, teniendo una pendiente (\muA por mg/dl) de 0,093 y una linealidad elevada, de 0,997.
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Ejemplo experimental 3
Medición de la fluidez de la sangre
Se prepara el biosensor equipado con electrodo que determina la fluidez del modo descrito en el ejemplo 5. Se aplica un potencial de 200 mV al electrodo de trabajo 104' y al electrodo que determina la fluidez 107 (frente al electrodo de referencia 105'). Si se introducen las muestras de sangre por el pasaje de introducción de muestras 101, se detecta un cambio brusco en la corriente y se inicia la medición del tiempo. Tan pronto la muestra llega al hueco 103, se detecta la segunda onda de corriente se registra el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda onda de corriente. La relación entre el tiempo de introducción de la muestra y el nivel de hematocrito se representa en la figura 10. Se realiza el ensayo con sangre total tratada con NaF que contiene 180 mg/dl de glucosa y niveles variables de hematocrito. La ecuación de ajuste obtenida es:
Y = -72,23 + 0,58691X - 0,00084073 X^{2} - 1,1211x10^{-6} X^{3 } + 5,7521x10^{-9} X^{4} - 9,1172x10^{-12} X^{5}, en la que Y es el nivel estimado de hematocrito a partir del tiempo de llenado de la muestra X medido con el electrodo que determina la fluidez. En la tabla 1 se recoge el nivel de hematocrito estimado a partir de la velocidad del tiempo de llenado de la muestra.
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TABLA 1 Nivel de hematocrito estimado a partir del tiempo de llenado de la muestra en el biosensor preparado en el ejemplo 5
1 
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En un ensayo aparte se obtienen las curvas de calibrado de sangre total con varios niveles de hematocrito y la relación entre los niveles de hematocrito y se formulan las pendientes de respuesta (tabla 2).
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3 
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Los factores de corrección derivados de esta manera se emplean para recalibrar el nivel de glucosa medido con respecto a la sangre total que tiene un 40% de nivel de hematocrito, resultando de ello biosensores que proporcionan el hematocrito con independencia de las concentraciones de glucosa. El instrumento mide en primer lugar la velocidad de introducción de la muestra, determina el nivel de hematocrito de la muestra de sangre, después consulta la tabla que proporciona las correspondientes curvas de calibrado y determina el nivel de glucosa a partir de las corrientes medidas. En la tabla 3 se recogen los resultados de los ensayos realizados del modo recién descrito. Se constata que la corrección del nivel de hematocrito proporciona niveles de glucosa muy similares a los obtenidos con el YSI 2300.
TABLA 3 Concentración de glucosa en sangre total; la velocidad de introducción de la muestra medida con el electrodo que determina la fluidez y la curva de calibrado de la tabla 2 se emplean para estimar el nivel de glucosa en la sangre total
4
El electrodo que determina la fluidez permite además descriminar las muestras de sangre de fluidez anómala, es decir, muestras que tienen niveles de hematocrito demasiado altos o demasiado bajos y la mala introducción muestras de sangre debida a la formación de burbujas de aire. En tales casos puede programarse un dispositivo de medida que emita un mensaje de aviso o un código de error para tales mediciones.

Claims (14)

1. Un biosensor electroquímico para determinar la concentración de un analito en una muestra que consta de:
un sustrato base (400) y un sustrato de cubierta (300);
un espaciador para la introducción de la muestra (200) que tiene una parte de introducción de muestras (100), dicho espaciador que introduce la muestra está posicionado entre el sustrato base y el sustrato de cubierta; y,
por lo menos un electrodo de trabajo (104) impreso sobre el sustrato base (400) y por lo menos un electrodo de referencia (105) impreso por lo menos sobre un sustrato base y la superficie interior del sustrato de cubierta y una oxidasa y un mediador de transferencia electrónica aportado sobre el sustrato base, caracterizado porque la parte de introducción de muestras (100) está formada en un extremo del espaciador que introduce la muestra (200), la parte de introducción de muestras consta de:
un pasaje de introducción de muestras (101), un pasaje de descarga de aire (102) y un hueco (103), dicho pasaje de introducción de muestras (101) y el pasaje de descarga de aire (102) están conectados formando un ángulo de 45-135º, con preferencia un ángulo de 75-105º, en el extremo del pasaje de introducción de muestras, y el hueco (103) es un espacio adicional formado en el extremo del pasaje de introducción de muestras en dirección opuesta al flujo de entrada de la muestra y la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire (103) y la del pasaje de introducción de muestras (101) no es superior a 1:2.
2. El biosensor electroquímico según la reivindicación 1, que consta de un electrodo de trabajo (104) y un electrodo de referencia (105) impresos sobre la superficie superior del sustrato base (400).
3. El biosensor electroquímico según la reivindicación 1, que comprende además un electrodo conector (106) impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400') y sobre la superficie interior del sustrato de cubierta (300'), que consta de un electrodo de trabajo (104') impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400') y un electrodo de referencia (105') impreso sobre la superficie interior del sustrato de cubierta (300').
4. El biosensor electroquímico según la reivindicación 2, que comprende además:
un segundo espaciador para la introducción de la muestra (200b) con la parte de introducción de muestras (100) descrita en la reivindicación 1 y unida a la superficie inferior del sustrato base (400a);
un segundo sustrato de cubierta (300b), prensado sobre la superficie exterior del segundo espaciador de introducción de muestra (200b);
un segundo electrodo de trabajo (104) y un segundo electrodo de referencia (105) impresos sobre la superficie inferior del sustrato base (400a); y
BSA y un segundo mediador de transferencia electrónica aportado sobre la superficie inferior del sustrato base (400a).
5. El biosensor electroquímico según la reivindicación 3, que comprende además:
un segundo espaciador para la introducción de muestra (200b') con la parte de introducción de muestras (100) descrita en la reivindicación 1 y unido a la superficie inferior del sustrato base (400b);
un segundo sustrato de cubierta (300b'), prensado sobre la superficie exterior del segundo espaciador de introducción de muestra (200b');
un segundo electrodo de trabajo (104') impreso sobre la superficie inferior del sustrato base (400b);
BSA y un segundo mediador de transferencia electrónica aportado sobre la superficie inferior del sustrato base (400b);
un segundo electrodo de referencia (105') impreso sobre la superficie interior del segundo sustrato de cubierta (300b'); y
un segundo electrodo conector (106) impreso sobre la superficie inferior del sustrato base (400b) y sobre la superficie interior del segundo sustrato de cubierta (300b').
6. El biosensor electroquímico según la reivindicación 3 que consta además de un electrodo para determinar la fluidez (107) impreso sobre la superficie superior del sustrato base (400').
\newpage
7. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que la proporción entre la anchura del pasaje de descarga de aire y la del pasaje de introducción de muestras se sitúa entre 1:5 y 1:2.
8. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras tiene capacidad para introducir de 0,1 a 3,0 \mul de muestra.
9. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras (100) tiene capacidad para introducir de 0,1 a 1,0 \mul de muestra.
10. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la parte de introducción de muestras tiene capacidad para introducir de 0,3 a 0,7 \mul de muestra.
11. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, en el que el pasaje de introducción de muestras está conectado al pasaje de descarga de aire de manera aproximadamente perpendicular, con preferencia en un ángulo de 90º.
12. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11, en el que la oxidasa se elige entre el grupo formado por la oxidasa de la glucosa, la lactato-oxidasa, la colesterol-oxidasa, la glutamato-oxidasa, la peroxidasa de rábano rusticano y la oxidasa de alcohol.
13. El biosensor electroquímico según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 12, en el que el mediador de transferencia electrónica se elige entre el grupo formado por el cloruro de hexaaminorrutenio (III), ferricianuro potásico, ferrocianuro potásico, dimetilferroceno, ferricinio, ácido ferrocenomonocarboxílico, 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano, tetratiafulvaleno, niqueloceno, N-metilacidinio, tetratiatetraceno, N-metilfenazinio, hidroquinona, ácido 3-dimetilaminobenzoico, 3-metil-2-benzotiozolinona-hidrazona, 2-metoxi-4-alilfenol, 4-aminoantipirina, dimetilanilina, 4-aminoantipireno, 4-metoxinaftol, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, sulfonato de 2,2-azino-di-[3-etilbenzotiazolina], o-dianisidina, o-toluidina, 2,4-dicloro-fenol, 4-aminofenazona, bencidina y azul Prusia.
14. El biosensor electroquímico según la reivindicación 13, en el que el mediador de transferencia electrónica es el cloruro de hexaaminorrutenio (III).
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